CN107632095B - 一种作物糖脂和磷脂的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种作物糖脂和磷脂的检测方法。所述检测方法利用高效液相与质谱联用技术对样品溶液进行分析；其中，正离子检测模式中流动相A为甲醇、乙腈、水和挥发性酸的混合溶液，所述混合溶液中甲醇、乙腈和水的体积比为42.5:42.5:15；流动相B为异丙醇和挥发性酸的混合溶液；负离子检测模式中流动相A为甲醇、乙腈、水和挥发性碱的混合溶液，所述混合溶液中甲醇、乙腈和水的体积比为42.5:42.5:15；流动相B为异丙醇和挥发性碱的混合溶液。本发明提供的检测方法可实现作物糖脂和磷脂的高准确度和高灵敏度的定性定量，质荷比可精确到小数点后第三位；同时能够降低对作物磷脂含量的检出限，定量更精确。
Description
技术领域
本发明属于糖脂和磷脂检测领域，具体涉及一种作物糖脂和磷脂的检测方法。
背景技术
脂质一般分为以下八大类：脂肪酸类（fatty acids）、甘油脂类（glycerolipids）、甘油磷脂类（glycerophospholipids）、鞘脂类（sphingolipids）、固醇脂类（sterollipids）、孕烯醇酮脂类（prenollipids）、糖脂类（saccharolipids）、多聚乙烯类（polyketides）。糖脂是糖通过其半缩醛羟基以糖苷键与脂质连接的化合物。鉴于脂质部分的不同, 糖脂可分为鞘糖脂、甘油糖脂以及由类固醇衍生的糖脂, 其中脂类部分为甘油脂的称甘油糖脂，其包括硫代异鼠李糖单酰基甘油（SQMG），硫代异鼠李糖甘油二酯（SQDG），单半乳糖二酰基甘油（MGDG，Monogalaetosyldiacylglycerol），双半乳糖二酰基甘油（DGDG，Digalactosyldiacylglycerol）。甘油糖脂主要存在于植物界和微生物中, 是细菌原生质膜、植物叶绿体类囊膜的主要组成成分，参与细胞膜的识别活动。甘油磷脂分子由1个磷酸、1个甘油骨架、1个亲水头部R和1个疏水尾部等4 部分组成。亲水头部R是磷脂分子的极性端，可以是胆碱、乙醇胺、肌醇、丝氨酸、甘油，构成不同种类的甘油磷脂化合物：磷脂酸（Phosphoric acid，PA）、溶血磷脂酸（LPA）、磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine，PC）、溶血性磷脂酰胆碱（Lysophosphatidylcholine，LPC）、磷脂酰乙醇胺（Lysophosphatidylethanolamine，PE）、溶血性磷脂酰乙醇胺（LPE）、磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PI）、溶血磷脂酰肌醇（LPI）、磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）、溶血磷脂酰丝氨酸（LPS）、磷脂酰甘油（Phosphatidylglycerol，PG）、溶血磷脂酰甘油（Lysophosphatidylglycerol，LPG）。疏水尾部是磷脂分子的非极性端，主要由一条或两条含有不同碳数（n= 14-22）和不同不饱和度的（n=0-6）的脂肪酸链构成。
水稻、棉花和香蕉等是极其重要的经济作物，对这些作物的发育及响应逆境胁迫的机制研究，具有十分重要的理论价值和广泛的现实意义。已有研究结果指出植物中的磷脂及其相关代谢途径参与响应植物多种逆境胁迫。因此通过提高作物中体内的磷脂水平的定性和定量检测水平研究，有利于作物磷脂的功能研究，从而提高作物育种及形状改良具有重要的实际应用价值。
植物糖脂和磷脂检测方法很多，包括薄层色谱（Thin-Layer Chromatography，TLC）法、气相色谱（Gas chromatography，GC）法、毛细管电泳（Capillaryelectrophoresis，CE）法、超临界流体色谱（Supercritical fluid chromatography，SFC）法、高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）法和各种质谱（Massspectrum，MS）技术，以及色谱－质谱联用技术。但这些技术对糖脂和磷脂化合物的检测灵敏度尚不能令人满意，且定性能力也不强。
因此，开发一种高检测灵敏度的作物糖脂和磷脂的检测方法具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中植物糖脂和磷脂检测方法灵敏度低、定性能力不强的缺陷，提供一种作物糖脂和磷脂的检测方法。本发明的提供的作物糖脂和磷脂的检测方法可实现作物糖脂和磷脂的高准确度和高灵敏度的定性检测，同时能够降低对作物糖脂和磷脂含量的检出限，定量更精确。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种作物糖脂和磷脂的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
S1：向含作物糖脂和磷脂的作物样品中加入氯仿振荡至充分溶解后过滤；然后加入内标混合液、甲醇和乙酸铵得样品溶液；
S2：利用高效液相与质谱联用技术对S1中样品溶液进行分析；
其中，正离子检测模式：流动相A为甲醇、乙腈、水和挥发性酸的混合溶液，所述混合溶液中甲醇、乙腈和水的体积比为42.5:42.5:15；流动相B为异丙醇和挥发性酸的混合溶液；
负离子检测模式：流动相A为甲醇、乙腈、水和挥发性碱的混合溶液，所述混合溶液中甲醇、乙腈和水的体积比为42.5:42.5:15；流动相B为异丙醇和挥发性碱的混合溶液。
磷脂和糖脂组分共一百多种，种类不同，其链长和饱和度也不同。为了有效的全部洗脱，并且分离，需要选择合适的流动相比例。异丙醇、甲醇以及乙腈具有较好的极性，本发明的发明人研究发现，当选用体积比为42.5:42.5:15的甲醇、乙腈和水的混合溶液，并添加甲酸、乙酸等挥发性酸或甲酸铵、乙酸铵等挥发性碱提高样品离子化时，可通过液相梯度洗脱实现作物中大多数糖脂和磷脂的洗脱和分离。
优选地，流动相A和流动相B中挥发性酸为甲酸或乙酸，所述挥发性酸的体积分数为0.1%。此时可通过检测样品中糖脂和磷脂的结构等特征，选择正离子模式进行检测。
优选地，流动相A和流动相B中挥发性碱为甲酸铵或乙酸铵，所述挥发性碱的体积分数为0.1%。此时可以通过检测样品中糖脂和磷脂的结构等特征，选择负离子模式进行检测。
优选地，S2中液相梯度洗脱条件为：0~10分钟，40%流动相B；10~35分钟，40%~65%流动相B；35~42分钟，0%流动相B。
优选地，S2中色谱柱为PhenomenexKinetex C18。
优选地，S2中流动相流速为300 µL/min；柱温为40 ℃；进样量为8 µL。
优选地，S2中质谱系统为AB SCIEX TripleTOF® 5600+质谱系统，所述质谱的参数设置为：雾化气：55 psi；辅助气：55 psi；气帘气：35 psi；离子源温度：300℃；电压：-4.5KV/5.5KV。碰撞电压（CE）, 正离子模式，PE和LysoPE，+28V；PC和LysoPC，+40V；MGDG ，+21 V；DGDG ，+24 V；负离子模式，PI，-58V； PG，LysoPG和PA，-57V； PS，-34V。
优选地，S1中选用口径为0.22微米的尼龙膜进行过滤。
优选地，所述S1中含作物糖脂和磷脂的作物样品的提取方法如下：
S1：将新鲜作物样品迅速加入到73~77℃下的异丙醇和抗氧化剂的混合溶液中浸泡；
S2：加入提取剂对S1中的混合溶液进行提取至样品变白；然后萃取、离心得有机相；
S3：吹干S2中有机相即得所述含有糖脂和磷脂的作物样品。
异丙醇极性较高可以提取极性的糖脂和磷脂组分，同时抗氧化剂的添加可防止糖脂和磷脂在空气中被氧化及磷脂酶D被激活。将新鲜作物样品迅速浸没到73~77℃℃含有BHT的异丙醇当中，异丙醇可以提取极性的糖脂和磷脂组分；另外利用极性较大的提取剂，可以很好的实现糖脂和磷脂的提取。
优选地，所述S1中混合溶液的温度为75℃。
优选地，所述氧化剂为2, 6一二叔丁基对甲酚、丁基羟基茴香醚或2-叔丁基对苯二酚中的一种。
优选地，所述S1混合溶液中的抗氧化剂为体积分数为0.01%的2, 6一二叔丁基对甲酚。
优选地，所述新鲜作物样品为水稻叶片、棉花叶片或香蕉果肉中的一种。
优选地，所述S4中离心转速为500rpm，离心时间为3分钟。
优选地，S6中氮气吹干的温度为35~40℃。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的作物糖脂和磷脂的检测方法，可实现作物糖脂和磷脂的高准确度和高灵敏度的定性定量，质荷比可精确到小数点后第三位；同时能够提高对作物磷脂含量的检出限，定量更精确。
附图说明
图1为本发明实施例1检测糖脂MGDG正离子模式检测的质谱图；
图2为本发明实施例1检测糖脂DGDG正离子模式检测的质谱图；
图3为本发明实施例1检测磷脂PC正离子模式检测的质谱图；
图4为本发明实施例1检测磷脂PE正离子模式检测的质谱图；
图5为本发明实施例1检测磷脂PI负离子模式检测的质谱图；
图6为本发明实施例1检测磷脂PS负离子模式检测的质谱图；
其中，Prec为precursor ；NL为neutral loss；“+”和“-”分别表示正离子模式和负离子模式。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1作物糖脂和磷脂的检测方法
本实施例选用如下材料及试剂进行检测：
一：材料及试剂
材料：水稻（日本晴）、棉花（陆地棉YZ1）、香蕉（巴西蕉）
提取液：氯仿以及甲醇：氯仿=2:1（v/v）
磷脂内标：6.6 nmol di14:0-PC, 6.6 nmol 13:0-lysoPC, 6.6 nmol 19:0-lysoPC, 3.6 nmol di14:0-PE, 3.6 nmol 14:0-lysoPE, 3.6 nmol 18:0-lysoPE, 3.6nmol di14:0-PG, 3.6 nmol 14:0-lysoPG, 3.6 nmol 18:0-lysoPG, 3.6 nmol di14:0-PA, 2.4 nmol di14:0-PS和1.63 nmol di18:0-PI。
糖脂内标：44.55 nmol 16:0–18:0-MGDG, 35.45 nmol di18:0-MGDG, 8.65 nmol16:0–18:0-DGDG, 和 31.28 nmol di18:0-DGDG。
流动相：A: 甲醇：乙腈：水=42.5:42.5:15，加0.1%甲酸（正离子模式）或3mM 乙酸铵（负离子模式）；B：异丙醇+0.1%甲酸（正离子模式）或3mM乙酸铵（负离子模式）
高效液相与质谱联用系统：岛津20A UFLC高效液相仪；AB SCIEX TripleTOF®5600+质谱系统；
色谱柱：PhenomenexKinetex C18 150 x 2.1 mm 2.6μ。
二、含糖脂和磷脂的作物样品的提取方法
含糖脂和磷脂的作物样品的提取方法如下：
（1）将新鲜的植物样品迅速加入到3mL 75℃预热的异丙醇（含0.01% BHT）中浸泡15分钟。
（2）加入1.5mL 氯仿和0.6mL超纯水，混匀。然后于常温摇床上摇1小时。
（3）将样品转移至一个新的玻璃瓶中，加入4mL的氯仿/甲醇（2:1）含0.01% BHT，摇30分钟，然后将样品溶液转移至新的玻璃瓶。重复此步骤几次（约三次）至所有的样品都变白。
（4）向含样品溶液的玻璃瓶中加入 1mL 1M 氯化钾，摇晃混匀，然后500rpm离心 3分钟，弃去上清液。加入2mL 超纯水，摇晃，然后500rpm离心3分钟，弃去上清液。
（5）将提取后的植物样品在105 ℃过夜烘干，称量干重，所得干重为9~47mg。
（6）用氮气吹干溶液（温度为35-40℃）。
三、检测方法
本实施例按如下步骤检测作物糖脂和磷脂：
1. 加入1mL氯仿至氮气吹干的样品，振荡至样品充分溶解；
2. 用0.22微米的尼龙膜过滤样品溶液；
3. 取一部分样品，加10µL内标混合液，使得最终含有样品的混合液比例为氯仿：甲醇：（300mM）乙酸铵=300:665:35（v/v/v），总体积为1.8mL，置于棕色进样品待检测；
4. 用高效液相与质谱联用技术（HPLC-MS/MS）对作物磷脂进行分析。
色谱柱：PhenomenexKinetex C18 150 x 2.1 mm 2.6μ液相条件：
流动相：A: 甲醇：乙腈：水=42.5:42.5:15，加0.1%甲酸（正离子模式）或3mM 乙酸铵（负离子模式）；
B：异丙醇+0.1%甲酸（正离子模式）或3mM乙酸铵（负离子模式）流速：300 µL/min；柱温：40 ℃；进样量：8 µL。
液相梯度条件如下：
| 时间（min） | 流动相A （%） | 流动相B （%） |
| 10 | 60 | 40 |
| 35 | 35 | 65 |
| 42 | 终止 |
质谱的参数设置为：雾化气：55 psi；辅助气：55 psi；气帘气：35 psi；离子源温度：300℃；电喷雾电压：+5.5 kV或-4.5 kV；碰撞电压（CE）：正离子模式，PE和lysoPE，+28V；PC和lysoPC，+40V；MGDG ，+21 V；DGDG ，+24 V；负离子模式，PI，-58V； PG，lysoPG和PA，-57V； PS，-34V。
经验证，采用本发明的检测方法，能够在梯度洗脱过程中洗脱作物大多数的磷脂组分，15s左右的峰宽内，可检测约100多种磷脂以及30多种糖脂组分；且本发明的灵敏度和精确度更好，可以更加准确地定性测量作物的磷脂（质荷比可精确到小数点后第三位），同时能够提供更加精确的定量检出限。关于本实施例的方法在水稻（日本晴），棉花（陆地棉YZ1），香蕉（巴西蕉）中糖脂和磷脂的检测结果见表1。图1~6为几种常规的糖脂如MGDG（如图1）、DGDG（如图2）和磷脂如PC（如图3）、PE（如图4）、PI（如图5）、PS（如图6）的质谱图。
表1作物中糖脂和磷脂基础含量（nmol/mg干重）
| Lipid class | Scan Mode | 水稻（日本晴） | 棉花（陆地棉YZ1） | 香蕉（巴西蕉） |
| MGDG | +NL179 | 370.259±15.417 | 201.531±41.871 | 2.331±0.711 |
| DGDG | +NL341 | 127.068±14.765 | 55.938±7.829 | 0.741±0.371 |
| PA | -pre153 | 2.182±0.269 | 0.396±0.077 | 1.839±0.066 |
| PC | +pre184 | 20.740±2.814 | 9.440±1.748 | 7.350±0.117 |
| PE | +NL141 | 7.557±0.306 | 3.295±0.618 | 2.895±0.051 |
| PG | -pre153 | 20.583±0.806 | 4.076±1.113 | 2.118±0.025 |
| PI | -pre153 | 4.240±0.617 | 6.232±0.570 | 2.258±0.0265 |
| PS | -NL87 | 0.944±0.290 | 0.784±0.085 | 0.554±0.027 |
| LPC | +pre184 | 0.527±0.071 | 0.240±0.058 | 0.389±0.002 |
| LPE | +NL141 | 0.174±0.027 | 0.048±0.013 | 0.538±0.001 |
| LPG | -pre153 | 0.125±0.021 | 0.132±0.045 | 0.047±0.001 |
注释：Prec: precursor，前体离子扫描，NL: neutral loss，中性丢失扫描，正负，表示正负离子模式。
Claims (5)
1.一种作物糖脂和磷脂的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
S1：向含糖脂和磷脂的作物样品中加入氯仿振荡至充分溶解后过滤；然后加入内标混合液、甲醇和乙酸铵得样品溶液；
S2：利用高效液相与质谱联用技术对S1中样品溶液进行分析；
其中，正离子检测模式：流动相A为甲醇、乙腈、水和挥发性酸的混合溶液，所述混合溶液中甲醇、乙腈和水的体积比为42.5:42.5:15；流动相B为异丙醇和挥发性酸的混合溶液；
负离子检测模式：流动相A为甲醇、乙腈、水和挥发性碱的混合溶液，所述混合溶液中甲醇、乙腈和水的体积比为42.5:42.5:15；流动相B为异丙醇和挥发性碱的混合溶液；
所述样品溶液中氯仿、甲醇和乙酸铵的体积比为300:665:35；
S2中液相梯度洗脱条件为：0～10分钟，40%流动相B；10～35分钟，40%→65%流动相B；35～42分钟，0%流动相B；
S2中色谱柱为PhenomenexKinetex C18；
所述S1中含糖脂和磷脂的作物样品的提取方法如下：
S11：将新鲜作物样品迅速加入到73～77℃下的异丙醇和抗氧剂的混合溶液中浸泡；
S12：加入提取剂对S11中的混合溶液进行提取至样品变白；然后萃取、离心得有机相；
S13：吹干S12中有机相即得S1中所述含糖脂和磷脂的作物样品；
S11中抗氧化剂为2, 6一二叔丁基对甲酚、丁基羟基茴香醚或2-叔丁基对苯二酚中的一种；
其中，S12中加入提取剂对S11中的混合溶液进行提取至样品变白；然后萃取、离心得有机相的具体步骤为：
加入1.5mL氯仿和0.6mL超纯水，混匀；然后于常温摇床上摇1小时；
将样品转移至一个新的玻璃瓶中，加入4mL的体积比为2:1、含0.01% BHT的氯仿/甲醇，摇30分钟，然后将样品溶液转移至新的玻璃瓶；重复此步骤三次至所有的样品都变白；
向含样品溶液的玻璃瓶中加入1mL 1M氯化钾，摇晃混匀，然后500rpm离心3分钟，弃去上清液；加入2mL超纯水，摇晃，然后500rpm离心3分钟，弃去上清液；
所述新鲜作物样品为水稻叶片、棉花叶片或香蕉果肉中的一种。
2.根据权利要求1所述作物糖脂和磷脂的检测方法，其特征在于，流动相A和流动相B中挥发性酸为甲酸或乙酸，所述挥发性酸的体积分数为0.1%。
3.根据权利要求1所述作物糖脂和磷脂的检测方法，其特征在于，流动相A和流动相B中挥发性碱为甲酸铵或乙酸铵，所述挥发性碱的体积分数为0.1%。
4.根据权利要求1所述作物糖脂和磷脂的检测方法，其特征在于，S2中流动相流速为300 µL/min；柱温为40℃；进样量为8 µL。
5.根据权利要求1所述作物糖脂和磷脂的检测方法，其特征在于，S2中质谱系统为ABSCIEX TripleTOF® 5600+质谱系统，所述质谱的参数设置为：雾化气：55 psi；辅助气：55psi；气帘气：35 psi；离子源温度：300℃；电压：-4.5KV/5.5KV；碰撞电压CE，正离子模式，磷脂酰乙醇胺PE和溶血磷脂酰乙醇胺LysoPE，+28V；磷脂酰胆碱PC和溶血磷脂酰胆碱LysoPC，+40V；单半乳糖二酰基甘油MGDG，+21 V；双半乳糖二酰基甘油DGDG，+24 V；负离子模式，磷脂酰肌醇PI，-58V；磷脂酰甘油PG，溶血磷脂酰甘油LysoPG和磷脂酸PA，-57V；磷脂酰丝氨酸PS，-34V。
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