CN107630042A

CN107630042A - 一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法

Info

Publication number: CN107630042A
Application number: CN201710847172.6A
Authority: CN
Inventors: 童望宇; 曹素丽; 杨兴旺
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2018-01-26

Abstract

本发明公开了一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法，首次实现了CRISPR‑Cas I型系统四基因cas6‑7‑5‑3对原核生物基因组的基因编辑及实施例中的靶向DNA序列特征在自打靶与非自打靶基因编辑中的应用。该方法对原核生物基因组可方便、快速、有效地进行基因编辑；可望应用于其它I型CRISPR‑Cas系统介导的基因编辑中。

Description

一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域中的基因编辑技术，确切地说是一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法。

背景技术

近年来，CRISPR-Cas系统的免疫机制以及Cas蛋白质结构功能等方面的研究取得了重大的进展，而且基于CRISPR-Cas系统发展的DNA编辑新技术，在原核和真核细胞中成功地应用于基因组编辑改造，在医药、食品、农业等领域中显示出了巨大的潜力。但到目前为止，广泛应用的CRISPR-Cas系统均为CRISPR-Cas 2类系统。CRISPR-Cas 1类系统虽广泛存在，但无基因编辑的应用报道。

CRISPR-CAS系统(Clustered Regularly Interspaced short PalindromicRepeats/CRISPR-associated genes)是由间隔(Spacer/S)回文重复(Repeat/R)的CRISPR序列和蛋白Cas基因组成的针对外来质粒和噬菌体的免疫系统，该系统可以收集入侵者的部分序列形成S，当入侵者再次入侵时，S与R转录并加工成crRNA，Cascade通过扫描原间隔相邻基序(PAM)序列和碱基配对引导Cas核酸内切酶降解入侵DNA产生双链断裂(DSB)片段，进而在细胞内源性核酸酶作用下进一步降解从而达到免疫。

据报道：crRNA中Spacer的完全一致导致进攻DNA的完全降解，而部分一致可能导致从进攻DNA获取Spacer(E.Semenova,E.Savitskaya,O.Musharova(2016)A.Strotskaya,D.Vorontsova,K.A.Datsenko,M.D.Logacheva,K.Severinov,Highly efficient primedspacer acquisition from targets destroyed by the Escherichia coli type I-ECRISPR-Cas interfering complex.Proc Natl Acad Sci U S A 113,7626-7631)。CRISPR-Cas介导的免疫中，尽管在S的获取阶段(Spacer acquisition motif/SAM)与干涉阶段(Target interference motif/TIM)其作用机理不同，但PAM通常具有一致性(ShirazA.Shah,Susanne Erdmann,Francisco J.M.Mojica and Roger A.Garrett(2013)Protospacer recognition motifs-Mixed identities and functional diversity,RNABiology,10(5):891–899)。显然，基因编辑的效率与特异性和g-DAN序列中Spacer的设计与PAM的选择密切相关。

尽管我们应用维吉尼亚链霉菌IBL14中的type I-B-svi型CRISPR-Cas系统对原核微生物成功地进行了自打靶和非自打靶基因编辑(童望宇；雍德祥；李雪；邱彩花；一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法.CN2015110028173,2015；童望宇；李雪；雍德祥；一种维吉尼亚链霉菌IBL14产青霉素重组菌株的构建方法.CN2015109993334,2015；童望宇,许鑫,张雁,孙焰,曹素丽,一种维吉尼亚链霉菌IBL14type I-B-sv14型CAS基因编辑系统，申请号：CN201611113137.3，2016)；童望宇,邱彩花,杨兴旺,王安静,；一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法，申请号：CN201611089333.1，(2016))，但应用该系统4基因cas6-7-5-3进行原核基因编辑未曾进行。本发明将公开一个由该4基因构建的Cas蛋白表达质粒(plasmid-cas6-7-5-3)结合基因编辑质粒(plasmid-t/g-gene abbreviation)进行的原核生物基因编辑方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法。为达此目的，采用如下技术方案：

一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法，其特征在于：由包含导向DNA序列g-DNA与模版DNA序列t-DNA的基因编辑质粒plasmid-t/g-gene abbreviation和/或蛋白表达质粒plasmid-cas组成的基因编辑工具通过转化对原核生物的遗传物质进行基因编辑。

所述的一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法，包括蛋白表达质粒和基因编辑载体的构建及基因编辑重组子的制备与检验，具体步骤如下：

(1)基因编辑质粒plasmid-t/g-gene abbreviation的构建

根据靶向基因序列及质粒序列信息设计引物，以提取的靶向基因组为模版，通过PCR和overlapPCR合成由靶向基因上、下游同源臂和、或所需遗传功能信息组成的t-DNA片段；同时，根据生物靶向基因序列信息设计并化学合成g-DNA片段；将上述制备得到的t-DNA片段与g-DNA片段分别连接到质粒上，得基因编辑质粒plasmid-t/g-gene abbreviation；

(2)Cas6-7-5-3表达质粒的构建

基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas6-7-5-3序列信息设计引物，以提取的维吉尼亚链霉菌IBL14基因组为模版，通过PCR反应扩增得到cas6-7-5-3基因，并连接到质粒plasmid上，得蛋白Cas6-7-5-3表达载体plasmid-cas6-7-5-3；

(3)基因编辑重组子的构建与验证

制备感受态细胞或原生质体，并将按步骤(1)制备的plasmid-t/g-geneabbreviation和/或按步骤(2)制备的plasmid-cas6-7-5-3通过转化导入感受态细胞或原生质体中，得到基因编辑重组子mutant；对重组子染色体基因进行PCR和基因测序，以确证编辑后的目的重组子。

所述的基因编辑质粒中的g-DNA指顺序包含转录启动子(promoter)、重复序列Repeat/R、间隔序列(spacer/S)、重复序列(R)和转录终止子(terminator)的DNA片段。

所述蛋白表达质粒指包含编码4个维吉尼亚链霉菌IBL14中I-B-svi型Cas蛋白的基因cas6-7-5-3。

所述的基因编辑指包含对大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌或其它原核微生物的遗传物质进行基因编辑。

本发明提供了一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法，首次实现了CRISPR-Cas I型系统四基因cas6-7-5-3对原核生物基因组的基因编辑及实施例中的靶向DNA序列特征在自打靶与非自打靶基因编辑中的应用。该方法对原核生物基因组可方便、快速、有效地进行基因编辑；可望应用于其它I型CRISPR-Cas系统介导的基因编辑中。

附图说明

图1蛋白表达质粒pHT304-cas6-7-5-3的构建。

Ori/origin：DNA复制起始位点；lac promoter/lactose promoter：乳糖操纵子的启动子，与RNA聚合酶结合起动DNA转录；CAP binding site/catabolite activatorprotein binding site:cAMP受体蛋白结合位点，促进RNA酶转录活性；AmpR/ampicillinresistance：氨苄青霉素抗性；Erm/erythromycin:红霉素。

图2半乳糖异构酶基因galM基因编辑结果。(A)转化子蓝白斑筛选；(B)克隆PCR验证；泳道L：5000bp DNA ladder；泳道C：空白对照(设计：1040bp)；泳道M：转化子E.coliJM109(DE3)-ΔgalM(设计上：750bp)。敲除后条带大小与设计大小一致，说明基因编辑成功。

具体实施方式

为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明，旨在更好的解释本发明的内容，以下实施例不限制本发明的保护范围。此外，在所列实施例中如无特别说明均采用如下材料：

1)菌种

维吉尼亚链霉菌Streptomyces virginiae IBL14/SV IBL14；大肠杆菌Escherichia coli DH5α/EC DH5α；Escherichia coli JM109/EC JM109(DE3)；Corynebacterium glutamicum B253/CG B253；质粒pHT304，pKC1139，pKD46，pXMJ19；pEC-XK99E。

2)培养基

LB液体培养基

酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加入适量自来水溶解后，定容至1L，pH调至7.0～7.2，分装包扎后,121℃/20min灭菌。

LB固体培养基

酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂20g，加入适量自来水溶解后,定容至1L，pH调至7.0～7.2，分装包扎后，121℃/20min灭菌。

种子培养基(FM培养基)

NH₄Cl 3.0g，K₂HPO₄·3H₂O 1.55g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.85g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂·2H₂O 10.0mg，FeSO₄·7H₂O 1.0mg，ZnSO₄ 0.1mg；加自来水至1000ml，灭菌前pH调为7.0，然后加葡萄糖3.0g,酵母粉3.0g玉米浆3.0g,β-环糊精3.0g，115℃/30min灭菌。

LBG培养基

酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，葡萄糖5g，加入适量自来水溶解后,定容至1L，pH调至7.0，分装包扎后，115℃/30min灭菌。

EPO培养基

酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，甘氨酸30g，Tween80 1g，定容至1L，115℃/30min灭菌。

LBHIS培养基

酵母膏2.5g，蛋白胨5g，NaCl 5g，脑心浸液18.5g，山梨醇91g，定容至1L，121℃/20min灭菌。

SSCS(Generay Biotech公司)

所用试剂均为市售品。

实施例1cas6-7-5-3敲除JM109(DE3)β-半乳糖苷酶基因lacZ

(1)基因编辑质粒(pKC1139-t/g-ΔlacZ)的构建

(A)制备上、下游同源臂

根据基因lacZ序列设计上下同源臂引物lacZ-UF/lacZ-UR、lacZ-DF/lacZ-DR，且上同源臂上游引物含HindIII限制性内切酶酶切位点，下同源臂下游引物含XbaI限制性内切酶酶切位点。以纯化的lacZ基因DNA为模板，分别扩增上、下游同源臂，反应条件为：95℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃45s，2.5U Pfu DNA Polymerase(50μl反应体系)，30个循环，72℃10min。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化后的上、下游同源臂DNA片段备用。

(B)制备编辑模板载体pKC1139-t-ΔlacZ

用lacZ上同源臂与下同源臂纯化产物为模板，lacZ-UF与lacZ-DR作引物外，取上同源臂纯化产物与下同源臂纯化产物各0.5μl混合作为模板，25μl反应体系进行overlapPCR，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性l min，58℃退火1min，72℃延伸30s，一个循环后加引物lacZ-UF与lacZ-DR各1μl，继续PCR，反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，进行30个循环，72℃10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并纯化，得基因编辑模版t-ΔlacZ；将获得的基因编辑模版通过HindIII限制性内切酶、XbaI限制性内切酶切出粘性末端，然后通过全式金生物技术有限公司生产的T4连接酶将其连接到pKC1139质粒上，得编辑模版载体pKC1139-t-ΔlacZ。

(C)制备靶向基因片段g-lacZ

靶向基因片段g-lacZ由滁州通用生物公司直接合成，首尾分别加上BamHIII及EcoRI酶切位点，中间依次是乳糖操纵子启动子，repeat(30bp)，spacer(30bp)，repeat(30bp)及终止子，选用ttc为PAM位点。

合成的靶向基因片段g-lacZ(T7-promoter、T7-terminator)序列为：

其中大写字母为酶切位点，虚线为保护碱基，单下划线为启动子promoter，斜体为spacer，黑体加粗为repeat，双下划线为终止子terminator。

(D)构建基因编辑质粒pKC1139-t/g-ΔlacZ

将按实施例(1-C)制备的靶向基因片段g-lacZ通过BamHIII及EcoRI酶按说明书方法切出粘性末端，然后通过全式金T4连接酶将其连接到按实施例(1-A、B)制备的编辑模版载体pKC1139-t-ΔlacZ上，得基因编辑质粒pKC1139-t/g-ΔlacZ。

(2)pHT304-cas6-7-5-3表达质粒的构建

根据SV IBL14全基因组测序信息及质粒pHT-304序列信息，设计带有质粒pHT-304互补序列的cas6-7-5-3基因特异性引物cas-F和cas-R。提取SV IBL14基因组DNA，使用全式金生物技术有限公司生产的TransStart FastPfu DNA Polymerase进行cas基因PCR扩增，反应条件：95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃3min，2.5U生工生物工程(上海)股份有限公司生产的Pfu DNA Polymerase(50μl反应体系)，30个循环，72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化的cas全长基因。通过一步法将cas全长基因序列与质粒pHT-304连接，得Cas6-7-5-3蛋白表达质粒pHT304-cas6-7-5-3，见图1。

(3)基因编辑重组子的构建与验证

(A)EC JM109(DE3)感受态制备

在无菌条件下用已灭过菌的牙签挑取大肠杆菌平板上的单克隆于30±10ml LB液体培养基中，37±5℃，220±100rpm过夜培养。取过夜培养的菌液300±100μl转接至新的30±10ml LB液体培养基中，37±5℃，220±100rpm培养约2±1h，至菌液OD₆₀₀值约为0.5±0.3左右。取30ml上述菌液至50ml离心管中，4℃下4000rpm离心10min，除尽上清液后，取已经在冰上预冷的来自Generay Biotech生产的SSCS溶液1ml将菌体沉淀吹打均匀，即得大肠杆菌的感受态细胞，-80℃下保存备用(此过程全程在冰上进行)。

(B)质粒pKC1139-t/g-ΔlacZ、pHT304-cas6-7-5-3及pKD46的共转化

将质粒pKC1139-t/g-ΔlacZ、pHT304-cas6-7-5-3及pKD46各10μl充分混匀后转化到100μl EC JM109感受态中，在涂有5μl异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG 200mg/ml)、40μl 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal 20mg/ml)和20μl阿拉伯糖(10mM/L)的安普霉素和卡那霉素抗性的LB固体培养基中30±5℃过夜培养24-48h，得转化子。

(C)重组子克隆PCR和基因测序分析

提取随机挑选的白色单克隆基因组为模板，用lacZ基因验证引物lacZ-UF/lacZ-DR进行PCR扩增反应，产物经DNA电泳分析及通用生物系统(安徽)有限公司测序证明lacZ基因敲除成功。

各步骤涉及的引物及其序列见表1，表中大写字母为酶切位点，虚线为保护碱基，黑体加粗为互补区。

表1引物及其序列

实施例2cas6-7-5-3敲除JM109(DE3)半乳糖异构酶基因galM

(1)基因编辑质粒(pKC1139-t/g-ΔgalM)的构建

除根据基因galM设计引物外，其余步骤与方法同实施例1步骤(1)。

合成的靶向基因片段g-galM(T7-promoter，T7-terminator)序列为：

其PAM:ttc，S:46nt，2DR:28nt。大写字母为酶切位点，虚线为保护碱基，单下划线为启动子promoter，斜体为spacer，黑体加粗为repeat，双下划线为终止子terminator。

(2)pHT304-cas6-7-5-3表达质粒的构建

同实施例1步骤(2)。

(3)基因编辑重组子的构建与验证

(A)EC JM109(DE3)感受态制备

同实施例1步骤(3-A)。

(B)质粒pKC1139-t/g-ΔgalM、pHT304-cas6-7-5-3及pKD46的分步转化

将10μl质粒pKC1139-t/g-ΔgalM转化到50μl EC JM109(DE3)感受态中，在含安普霉素的LB固体培养基中30℃培养24-48h，经PCR验证得EC JM109(DE3)含pKC1139-t/g-ΔgalM的转化子，将验证后的EC JM109(DE3)含pKC1139-t/g-ΔgalM的转化子；按同实施例1步骤(3-A)方法制备EC JM109(DE3)含pKC1139-t/g-ΔgalM转化子的感受态，再将质粒pHT304-cas6-7-5-3和pKD46充分混匀后转化到EC JM109(DE3)含pKC1139-t/g-ΔgalM转化子的感受态中，在涂有5μl异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG 200mg/ml)、40μl 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal 20mg/ml)和20μl阿拉伯糖(10mM/L)的安普霉素和卡那霉素抗性的LB固体培养基中30℃过夜培养，得候选基因编辑的转化子E.coli JM109(DE3)-ΔgalM。

(C)重组子克隆PCR和基因测序分析

同实施例1步骤(1-C)，测定结果见图2。

各步骤涉及的引物及其序列见表2，表中大写字母为酶切位点，虚线为保护碱基，黑体加粗为互补区。

表2引物及其序列

实施例3双质粒敲除CG B253乳酸脱氢酶基因ldhA

(1)基因编辑质粒(pXMJ19-t/g-ΔldhA)的构建

(A)制备上、下游同源臂

除根据质粒pXMJ19与基因ldhA设计引物外，其余步骤同实施例1步骤(1-A)。

合成的靶向基因片段g-ldhA(Ptuf-promoter，rrnBT1–terminator)的序列为：

其PAM:aca，S:40nt，2DR:30nt。大写字母为酶切位点，单下划线为启动子promoter，斜体为spacer，黑体加粗为repeat，双下划线为终止子terminator。

(B)制备编辑模板载体pXMJ19-t-ΔldhA

除用质粒pXMJ19与ldhA上、下游同源臂设计引物外，其余步骤同实施例1步骤(1-B)。

(C)制备靶向基因片段g-ldhA

靶向基因片段g-ldhA由滁州通用生物公司直接合成，首尾分别加上BamHIII及EcoRI酶切位点，中间依次是Ptuf启动子，repeat(30bp)，spacer(40bp)，repeat(30bp)及rrnBT1终止子，选用aca为PAM位点。

(D)构建基因编辑质粒pXMJ19-t/g-ΔldhA

除将按实施例(3-C)制备的靶向基因片段g-ldhA连接到按实施例(3-A、B)制备的编辑模版载体pXMJ19-t-ΔldhA上外，其余步骤同实施例1步骤(1-D)。

(2)pEC-XK99E-cas6-7-5-3表达质粒的构建

除质粒用pEC-XK99E替代pHT304设计引物外，其余步骤同实施例1步骤(2)。

(3)基因编辑重组子的构建与验证

(A)CG B253感受态制备

在无菌条件下用已灭过菌的牙签从平板上挑取的CG B253单克隆于30±10ml LBG种子培养基中，30±5℃，220±100rpm过夜培养。取过夜培养的菌液300±100μl转接至新的30±10ml LBG种子培养基中，30±5℃，220±100rpm培养约4±1h，至菌液OD₆₀₀值约为0.6～0.9左右。取30ml上述菌液至50ml离心管中，冰浴15min，4℃下4000rpm离心10min，除尽上清液后，取已经在冰上预冷的10％的甘油将菌体沉淀吹打均匀，4℃下4000rpm离心10min，重复洗涤两次，用500μl冰上预冷的10％的甘油将菌体沉淀吹打均匀即得CG B253感受态细胞，-80℃下保存备用(此过程全程在冰上进行)。

(B)质粒pXMJ19-t/g-ΔldhA、pEC-XK99Ecas6-7-5-3的分步转化

将5μl质粒pXMJ19-t/g-ΔldhA转化到50μl CG B253感受态中，轻弹管壁使其混匀，冰浴10±5min，，加入预冷的0.1cm的电转杯中，1.8kv，5ms电击，加入800±100μl LBHIS培养基，混匀46℃水浴6min，30℃100rpm培养1h，在含氯霉素的LBHIS固体培养基中30℃培养24-48h，经PCR验证得CG B253含pXMJ19-t/g-ΔldhA的转化子，将验证后的CG B253含pXMJ19-t/g-ΔldhA的转化子；按同实施例3步骤(3-A)方法制备CG B253含pXMJ19-t/g-ΔldhA的转化子的感受态，再将质粒pEC-XK99E-cas6-7-5-3转化到CG B253含pXMJ19-t/g-ΔldhA的转化子的感受态中，卡那霉素和氯霉素抗性的LBHIS固体培养基中30℃过夜培养，得候选基因编辑的转化子CG B253-ΔldhA。

(C)重组子克隆PCR和基因测序分析

提取随机挑取的候选CG B253-ΔldhA单克隆基因组为模板，再以ldhA基因验证引物ldhA-F/ldhA-R进行PCR扩增，产物经DNA电泳分析及通用生物系统(安徽)有限公司测序证明ldhA基因敲除成功。

各步骤涉及的引物及其序列见表3，表中大写字母为酶切位点，虚线为保护碱基，黑体加粗为互补区。

表3引物及其序列

实施例4单质粒敲除CG B253乳酸脱氢酶基因ldhA

(1)pEC-XK99E-cas6-7-5-3表达质粒的构建

同实施例3步骤(2)。

(2)表达编辑质粒(pEC-XK99E-cas6-7-5-3-t/g-ΔldhA)的构建

除将t-ΔldhA片段和g-ldhA片段分别连接到pEC-XK99E-cas6-7-5-3上外，其余步骤同实施例3(1)。

(3)基因编辑重组子的构建与验证

(A)谷氨酸棒状杆菌感受态制备

同实施例3步骤(3-A)

(B)质粒pEC-XK99E-cas6-7-5-3-t/g-ΔldhA的转化

将5μl质粒pEC-XK99E-cas6-7-5-3-t/g-ΔldhA转化到50μl谷氨酸棒状杆菌感受态中，轻弹管壁使其混匀，冰浴10±5min，，加入预冷的0.1cm的电转杯中，1.8kv，5ms电击，加入800±100μl LBHIS培养基，混匀46℃水浴6±5min，30℃100rpm培养1h，在含卡那霉素的LBHIS固体培养基中30℃培养24-48h，经PCR验证得候选基因编辑的转化子CG B253-ΔldhA。

(C)重组子克隆PCR和基因测序分析

同实施例3步骤(3-C)。

以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

序列表

<110> 安徽大学

<120> 一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5574

<212> DNA

<213> S. virginiae IBL14

<400> 1

ttggtgctga cggcgcatcc gctgcagcgg gtcggggcgt acgcgctggc cgctcttgca 60

ggtgatgtgg cgccggagga tctggcgccg gtggggtttg tcagggcggt ggagcaggtc 120

actcagcatg ctgtcgcggc tgcgttggtt cgtgacagtc agggtgcgag tgggttctgg 180

ctgaaggtca gctactcgtt cttcccgaac tcgccgatga accatccggg caacggtaag 240

aagagtgatg actgcgttcg ggctgcgatc gaggcctggc gccgtctgcc tgatccggag 300

acttggcctg atgctggttg tgtcttgtgc ggtcggcggg ctgtcgggtt tttcgggaag 360

gtcgatgtcg cgctggcgga gagtgaggct taccgcaaca gcgtgccgcg tgggcatgag 420

gggatggcgt tgtgtcatcc gtgccgggcg agttttcacg cgttgccgta tggctgtcag 480

ctgacgggcg ggtcgtcgat cgccctgcac agctgggacg agcgcttttt gaagcgtgct 540

gtgacccgtc aggtggagcg caatctgccc ttggctgaga ctggtgatcc tgggcggcgg 600

caagccgatg tccgggaggt cgtcgcgctg accgctctgc ggcggtacag cgagcgggtc 660

gccggcgggg ctgagctcct ggtgttcaac aacaacaatc ggggccagtt gctggagcag 720

catggcttgg agcagtccct ggccgagtgg ctgcggcgta cttcgcgtga tcctgggctg 780

cgccgcgggt tcacggcctt gttgcaggcg catgccacga aggccgatcc gggtgtggtc 840

gctttgtccc gcaatgcctt tcgtgatccg ggtcggatcc tgggcagcgg ggtgcggcat 900

gtgggtcggc tggtgtcaga cgggtcccct gatcgtgagc gggtggccga cctggtggcc 960

ctgctctatt ccttcgccat cgaggtgatg ctgatgaatg aaaaggatct gtccgagatc 1020

cgggcgaccg cgggccggat tgcacagttg ctcagtctgg agagctctgg cgggaggctg 1080

cggcagtttc gtgccttgct caaggattcg ccgaggctgc ggcggtggct cacggaccag 1140

ggagtacggc gggcgatccg gccgcccgac ggcagtgtgg ggccgttggt gaccgagcgt 1200

ggcttcacgc ttctctttga ccctgggtcg gacaatccgg cctggttcca ccgcgatctg 1260

ctgctggtgg gggttctcga ggagctgtcg cggctcggct ggcaggccgg cgacgtggag 1320

gacagcgtcg agggtgggga cggcgacggg gatctcgatg ccgtcgacag cacgttcatt 1380

accgatgatg aagaggagta cgtgcgttga gtttcctggt ggggaagatc gttttggatg 1440

tggtcgccgg tgccccgaac aacggggagg gcgaggacaa cacggggcgt gtgaagaagc 1500

tgagggtcgg gcgggaggag ttcccgtacg tgtccgcgca ggcgttccgt cggtggttgc 1560

gtgactcgct gccggcgcag gagccgcgtt cggtggtcac tcgctcgggc agcggtgcca 1620

agcagcaggc acacaccgcg ggccggccgg acctgcacct ggacgatgat ctgttcggct 1680

acatggtcgc ggtgaagggg aaggggggaa gctaccagcg ggacaccgtg ctggctaccg 1740

ggactttagt ttcagtggtg ccgcagcgtc cgacgttgga cttcggcacg atgagccggg 1800

acttcccggc tggtgagcac ccggtgattc actcgcacga gctgtacagc gcgaccctgg 1860

ccggcgatgt tctgctggat ctgccgcggg ctggggtctt cgagacggac ggcaacgggt 1920

tgcgcgtggc gatcagccct gccgtcgctg aggaagcggc gaagaacggg gcggaggtca 1980

ccacgctgcg gggcagtgcg gccattcggt tgccgcttac tgagcggcac cggcggatcg 2040

gcacgctgtt gcggacgctg gcgtcggtgc gtggtggggc caagcaggct ctgcactacg 2100

gggaccgggc cccttcattg gtcttgttgg ctcctctcaa gggtggcgtc aatccgttca 2160

cccgtgttct gggcgcccgc gacggtaagc ctgtgttcct gagcgatgtc ctgcgcgagg 2220

agctcgaggc gtgggcggat gagctggacg ggccggtgct gctgggctgg gccccggggt 2280

ttctcggcga tcagcgtgag caggtccgcc gcgagctcaa ggatctgatt gacgagggcc 2340

gtgtcgtcct gagccatcct cgtgtgctgc tgacccagct ggccgaccgg atcgagcagg 2400

gtgatcatga cgcgtggttc gaggactccg cggcgtgacg ggtacggagg tcacggccct 2460

gcagatcacg gtgacggcgc cggttgtctc cttccgtaat ccgctgtatg ccggggtgca 2520

ggtgacgctg ccgtgtccgc cgccggccac cgtcggcggc ctcctcgccg cagcggctgg 2580

ggggtgggag caggtcaatc cggagctgcg tttcgcgatg gcgttccacg ctggcggcaa 2640

ggcggtcgat ctcgagacgt accacccgct ggacgcgtct gggaagaagg cgtcgcctgc 2700

cccgcgtaac cgggagttcc ttacggcggc cgagctcacc gtgtggctgg tcgacgaccc 2760

tgaagggtgg cagcgccgcc tgcgtcggcc ggtgtggccg ctgcggctgg gccgcagcca 2820

ggacctggtc ggtatccgca ccggcctggt tccgttgcgc gcggagcccg gcgagcagcg 2880

gtccgccgtg gtgccggaga cggcggggag gatgggaacc ctactgcggc tgccgactgc 2940

ggtctctggg ggccgggacc gtacccggtg ggacagctac cggttcgaca gctcgggccg 3000

cagtgaccat gtggtcgtag gcggctggtc gactgccggg ggacaggcag tcattctgct 3060

gccctcggcc catcccgata ccgtcgcgcg ttcctgatgg ttctgccgtc gggccgtacc 3120

gatagggagc ccatcgccac tatgacggac gtcctgtcca cgctgcgggc caagagcgct 3180

caacgggggc gttctgcgga ccttctcacc gcgcatttgt ccgagactcg tgctgcggca 3240

gctgggctgc ggcagcgtgt gggccgtctg gacgcggtgg aggacgtctt cggcggcagg 3300

ttctggcccg tcgtggaact cgctggcctc acccacgacg ccggcaagat tcccgaaggc 3360

ttccagcgga tgctggcggg atacagccgt gcctggggtg agcgtcacga agtcgcctcg 3420

ttgggcttcc tgcccgcgct catcggcgac ccggacgtgc tgttgtgggt ggcgaccgcg 3480

gtcgccaccc accatcgtcc gctgaccggc cagaacggac gcgacctgca gactctctac 3540

agcggtgtca ccatcaccga gctcgcgcac cgtttcgggc cttttgaccc acgcgctgtc 3600

cccgccttgg aggcctggct tcgtgcgagc gccatccggg tcggcctccc cgcggccgct 3660

gttccagacg acggcacgct caccgacacc ggagtggtcg ctggcgccca ccagctgctg 3720

gaggagattt tggaccgttg ggcagaccgt gtgaggcctg aggtgggctt ggccgctgta 3780

ctgctgcagg gggcggtcac cctggccgac cacttgtcct ccgcccatca ggctctgccc 3840

accgtccagc cgttgggggc cgggttccgg tcccggttgg agaaggagtt cgctgaacgc 3900

ggcaggaccc tgcgtgccca ccagctggag gccgccaccg ttaccggaca tcttctgctg 3960

cgcgggccga ccggcagtgg gaagaccgag gctgccctgc tgtgggctgc cagccaggtc 4020

gaggccctga aggcggaagg ccggggcgtg ccgcgtgtgt ttttcactct cccctacctg 4080

gcctccatca acgccatggc aacacggctg ggtgacactc tcggcgatgg tgaggctgtc 4140

ggcgttgccc actcccgcgc cgcctcctac caccttgccc aggccatcgc cccgcaggac 4200

ggcgacgagg aggacgaaca cggagccccc tgccgtgttg acgcggccgc caaggccttg 4260

tcccgggccg ctgccaccaa gctgttccgc gagagtgtcc gcgtcgccac cccctaccag 4320

cttctgcggg ccgccctggc cgggccggcc cactccggca tcctcatcga cgccgcgaac 4380

tcggtgttca tcctggacga actccacgcc tacgacgccc gcaggctcgg ctacatcctg 4440

gccagtgccc ggctgtggga acgcctcggt ggacggatca cagtcctgtc cgcgaccctg 4500

cccagggccc tggccgacct gttcgagagc accctcaccg cccccatcac cttcctcgac 4560

acccccgacc tcgggctgcc ggcgcgccac ctcctgcaca cccgaggcca ccatctcacc 4620

gacccggcca cactggagga gatccgtctg cggctgtccc gggacgagtc ggtcctggtg 4680

atcgccaaca acgtgtccca ggccatcgcc ctgtacgaac agctcgcacc cgacgtgtgt 4740

gaacgcttcg gtcaggacgc cgcgctactg ctgcactccc ggtttcgacg gatggaccgg 4800

tcccggattg agcagaagat cgccgaccgg ttcgccactg tggcacctga tgcccagaac 4860

agccgtaagc cgggcctggt cgttgccacg caggtggtcg aggtcagtct cgacgtcgac 4920

ttcgatgtgc tgttcactgg agcggctccg ctcgaggccc tcctgcagcg cttcggccgg 4980

accaaccgcg tcggggcccg cccgccggcc gacgtcatcg tccaccatcc cgcctggacc 5040

acacgccgcc gacagcccgg cgagtacgcc gacggcatct acccacggga gccggtcgag 5100

tccgcgtggc acatcctcac ccgcaatcac gggcgagtca tcgacgaagc ggacgccacc 5160

gcgtggctgg acgaggtcta cgccacggac tggggcaggc aatggcaccg cgaggtgctg 5220

gagcggcgag aaagattcga ccgtgcgttc ctgcagttcc gctacccctt cgaagaccgc 5280

actgacctgg ccgatacctt cgacgaactc ttcgacggct ccgaagccat cctcgccgaa 5340

gaccaggacg cctactcagc cgcactggcc gcaccagacg gcgaccaccc cggagctggc 5400

cggctcctcg cagaggaata cctcatcccc gttccccact gggccagccc cctcagccgc 5460

tacgagaagc agctcaaagt ccgcgtcatc aacggcgact accaccccga ccacggcctc 5520

atggcggtcc gggggctgcc ccagcccgcc taccgcgccg gggaggtctt gtga 5574

<210> 2

<211> 1183

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

acgaagccgc cctgtaaacc catgccgtgg gtttcaatat tggcttcatc caccacatac 60

aggccgtagc ggtcgcacag cgtgtaccac agcggatggt tcggataatg cgaacagcgc 120

acggcgttaa agttgttctg cttcatcagc aggatatcct gcaccatcgt ctgctcatcc 180

atgacctgac catgcagagg atgatgctcg tgacggttaa cgcctcgaat cagcaacggc 240

ttgccgttca gcagcagcag accattttca atccgcacct cgcggaaacc gacatcgcag 300

gcttctgctt caatcagcgt gccgtcggcg gtgtgcagtt caaccaccgc acgatagaga 360

ttcgggattt cggcgctcca cagtttcggg ttttcgacgt tcagacgtag tgtgacgcga 420

tcggcataac caccacgctc atatgcgggt cgcttcactt acgccaatgt cgttatccag 480

cggtgcacgg gtgaactgat cgcgcagcgg cgtcagcagt tgttttttat cgccaatcca 540

catctgtgaa agaaagcctg actggcggtt aaattgccaa cgcttattac ccagctcgat 600

gcaaaaatcc atttcgctgg tggtcagatg cgggatggcg tgggacgcgg cggggagcgt 660

cacactgagg ttttccgcca gacgccactg ctgccaggcg ctgatgtgcc cggcttctga 720

ccatgcggtc gcgttcggtt gcactacgcg tactgtgagc cagagttgcc cggcgctctc 780

cggctgcggt agttcaggca gttcaatcaa ctgtttacct tgtggagcga catccagagg 840

cacttcaccg cttgccagcg gcttaccatc cagcgccacc atccagtgca ggagctcgtt 900

atcgctatga cggaacaggt attcgctggt cacttcgatg gtttgcccgg ataaacggaa 960

ctggaaaaac tgctgctggt gttttgcttc cgtcagcgct ggatgcggcg tgcggtcggc 1020

aaagaccaga ccgttcatac agaactggcg atcgttcggc gtatcgccaa aatcaccgcc 1080

gtaagccgac cacgggttgc cgttttcatc atatttaatc agcgactgat ccacccagtc 1140

ccagacgaag ccgccctgta aacccatgcc gtgggtttca ata 1183

<210> 3

<211> 636

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gctgatggac tggggtgcga ctttactttc cgcccgtatt ccgctttccg atggcagcgt 60

ccgcgaggcg ctgctcggct gtgccagccc ggaatgctat caggatcagg ccgcgtttct 120

gggggcctct attggtcgtt atgccaaccg tatcgccaat agccgttata cctttgacgg 180

tgaaaccgtg acgctttcgc caagtcaggg cgttaaccag ctgcacggcg ggccggaagg 240

gttcgacaaa cgtcgctggc agattgtgaa ccagaacgat gatgaaggcg gcattccgca 300

cgacggcctg aaatctgtcg ccggaacgtc ttttgatttc cgcagcgcca aaatcatcgc 360

cagtgagttt cttgccgacg acgatcagcg caaagtgaaa ggttacgatc acgcattctt 420

gttacaggcc aaaggcgatg gcaagaaagt ggcggcgcat gtctggtcag cagatgaaaa 480

attgcagctg aaggtctaca ccaccgctcc ggctctgcaa ttctactccg gcaacttcct 540

cggcggcaca ccgtcgcggg gaaccgaacc ttacgccgac tggcaagggc tggctctgga 600

aagcgagttt ctaccggaca gcccgaacca ccctga 636

<210> 4

<211> 1069

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gaattcgagc tcggtacccg ttcagtcttg atctcctgga gaatgtcctg gtcaaactca 60

ttcatttgag ctccttaagc tacaaacact ctaaattcca tccaacagtt tcattgtgcc 120

cgtaaaccaa aaagttggca gcgcaagtgt tccaatgaaa cacttgcgtc gccaactagg 180

cgccaaagat ttagaagaac tgcttctgaa tttcgcgcag ggtatttgcg gaatgcttga 240

agcgttccat ctcgtggtcg gtgatttcta gttcgacaac gcggcggatg cctcggcggt 300

tcaccacagc tggggtgccg atgtagatgt cttcctcacc gtattcaccg tggagcagtg 360

cagagactgg gactgcaacg tcttggttct gcaggattgc gcgggtgatg cgagcaagac 420

ccatgccgat gccgtaggaa gtggagccct tggcgtcgat aatgtgatag gcagcgtctg 480

cgccaatgag gacaaataat gtgataggca gcgtctgcgc caatgaggac aatcttgtta 540

ccgacggttt ctttcatttt cgatcccact tcctgatttc cctaaccgga caacccacaa 600

agcagctcag aaaatcagca agagcttgtg cccggattcc tttgttacac ctttaattat 660

gcccgattat gtccgaaaat gtggtcagac caagtgttat ttttgttgaa aaaatcacat 720

tgtaaatcga gcaaaaccaa cctatgccct gcagaattgt gcatgctctg ccaagatgac 780

tcaatatggt ttcgctcccc agactagcgt ctctgctcac cactcgcctg gcaacgctta 840

aacccgcact aaaacctgcc acccacctcg cctccctcgg cgcgcaggtc attgcagagc 900

tagttccggg gatccgaatg tcgccaaacc gcaggcgaat cctccctgca aatatgggcg 960

ctggctttat cggagcggaa atcgcaatgt ggtgggctct ctcgccgtca ttgttgccga 1020

aaccgtggtg ggttacggct gctaacctgg cgacctgcag gcatgcaag 1069

Claims

1.一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法，其特征在于：由包含导向DNA序列g-DNA与模版DNA序列t-DNA的基因编辑质粒plasmid-t/g-gene abbreviation和/或蛋白表达质粒plasmid-cas组成的基因编辑工具通过转化对原核生物的遗传物质进行基因编辑。

2.根据权利要求1所述的一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法，其特征在于：包括蛋白表达质粒和基因编辑载体的构建及基因编辑重组子的制备与检验，具体步骤如下：

（1）基因编辑质粒plasmid-t/g-gene abbreviation的构建

根据靶向基因序列及质粒序列信息设计引物，以提取的靶向基因组为模版，通过PCR和overlapPCR合成由靶向基因上、下游同源臂和/或所需遗传功能信息组成的t-DNA片段；同时，根据生物靶向基因序列信息设计并化学合成g-DNA片段；将上述制备得到的t-DNA片段与g-DNA片段分别连接到质粒上，得基因编辑质粒plasmid-t/g-gene abbreviation；

（2） Cas6-7-5-3表达质粒的构建

基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas6-7-5-3序列信息设计引物，以提取的维吉尼亚链霉菌IBL14基因组为模版，通过PCR反应扩增得到cas6-7-5-3基因，并连接到质粒plasmid上，得蛋白Cas6-7-5-3表达载体plasmid -cas6-7-5-3；

（3）基因编辑重组子的构建与验证

制备感受态细胞或原生质体，并将按步骤（1）制备的plasmid-t/g-gene abbreviation和/或按步骤（2）制备的plasmid-cas6-7-5-3通过转化导入感受态细胞或原生质体中，得到基因编辑重组子mutant；对重组子染色体基因进行PCR和基因测序，以确证编辑后的目的重组子。

3.根据权利要求1或2所述的一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法，其特征在于：所述基因编辑质粒中的g-DNA指顺序包含转录启动子promoter、重复序列Repeat、间隔序列spacer、重复序列R和转录终止子terminator的DNA片段。

4.根据权利要求1或2所述的一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法，其特征在于：所述蛋白表达质粒指包含编码4个维吉尼亚链霉菌IBL14中I-B-svi型Cas蛋白的基因cas6-7-5-3。

5.根据权利要求1所述的一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法，其特征在于：所述的基因编辑指包含对大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌或其它原核微生物的遗传物质进行基因编辑。