JPS6152279A - リゾビウム・ジヤポニカムのnifプロモ−タ− - Google Patents
リゾビウム・ジヤポニカムのnifプロモ−タ−Info
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- JPS6152279A JPS6152279A JP60124999A JP12499985A JPS6152279A JP S6152279 A JPS6152279 A JP S6152279A JP 60124999 A JP60124999 A JP 60124999A JP 12499985 A JP12499985 A JP 12499985A JP S6152279 A JPS6152279 A JP S6152279A
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- Japan
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- gene
- promoter
- rhizobium
- japonicum
- nif
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
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- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(従来技術)
豆科植物の根粒における生物学的窒素固定は。
世界の食糧生産の主要な成分であり、それゆえに当分野
の実際的な応用は非常に興味深い。
の実際的な応用は非常に興味深い。
原核生物は細胞の窒素の単−源として広範囲の窒素化合
物を使うことができる。この範囲は、無機化合物ではア
ンモニア、N2.硝酸塩、そして複合有機化合物ではプ
ロリン、アルギニン、グルタミンを含む。それぞれの種
は異なる系列の窒素化合物を利用できる。グルタミン、
グルタミン酸。
物を使うことができる。この範囲は、無機化合物ではア
ンモニア、N2.硝酸塩、そして複合有機化合物ではプ
ロリン、アルギニン、グルタミンを含む。それぞれの種
は異なる系列の窒素化合物を利用できる。グルタミン、
グルタミン酸。
アスパラギン酸は中間代謝において鍵となる窒素化合物
である。後者の2つはアミノ酸生合成の多くの経路の出
発化合物であり、多くの反応のアミノ基供与体として働
く。すべての他の場合は、アミノ基はグルタミンにより
供給される。N2固定により生じるアンモニアの同化に
要求される主要な酵素はグルタミンシンセターゼで、こ
れは次の反応を触媒する。
である。後者の2つはアミノ酸生合成の多くの経路の出
発化合物であり、多くの反応のアミノ基供与体として働
く。すべての他の場合は、アミノ基はグルタミンにより
供給される。N2固定により生じるアンモニアの同化に
要求される主要な酵素はグルタミンシンセターゼで、こ
れは次の反応を触媒する。
グルタミン酸 十 NH3+ ATP → グルタ
ミン酸伝子ADP + Pi高Ntlt” T7A
度(>1mM)では、グルタメートデヒドロゲナーゼも
見られる。同化アンモニアの利用はグルタメートシンタ
ーゼの触媒活性に依存する。
ミン酸伝子ADP + Pi高Ntlt” T7A
度(>1mM)では、グルタメートデヒドロゲナーゼも
見られる。同化アンモニアの利用はグルタメートシンタ
ーゼの触媒活性に依存する。
グルタミン+2−ケトグルタル酸+N A D P H
→ 2グルクミン酸+NADP” ATPが加水分解されるので、これらの反応は好都合の
平衡を有し、培地中のアンモニア、あるいは他の窒素源
より酵素的に生じたアンモニアが利用される( Mee
rs、 J、+ Tempest、 T1. and
C。
→ 2グルクミン酸+NADP” ATPが加水分解されるので、これらの反応は好都合の
平衡を有し、培地中のアンモニア、あるいは他の窒素源
より酵素的に生じたアンモニアが利用される( Mee
rs、 J、+ Tempest、 T1. and
C。
Brown (1970) J、 Gen、 Micr
obio+、 64 : 187−194)。
obio+、 64 : 187−194)。
アンモニアの形成は、このように生物学的窒素循環の鍵
となるステップである。
となるステップである。
生物学的窒素固定は様々な微生物により行われ。
大気中の窒素をアンモニアに変換する酵素複合体。
すなわちニトロゲナーゼの誘導を通して起こる。
この変換は1通性嫌気性菌(例えば、タレデシエラ0ニ
ユーモニエ(Klebsiella pneumoni
ae)やロドスピリラム・ルブラン(Rhodospi
rillum rubrum))。
ユーモニエ(Klebsiella pneumoni
ae)やロドスピリラム・ルブラン(Rhodospi
rillum rubrum))。
絶対嫌気性菌(例えば、クロストリディウム・バスツー
リアナム(Clostridium pasterui
anum))。
リアナム(Clostridium pasterui
anum))。
絶対好気性菌(例えば、アゾトバクタ−・ビネランディ
(Azotobacter vinelandii))
そして藍藻類の数珠(例えば、アナベナ・シリンドリカ
(八na−baena cylindrica))を含
む、生理学的に多様な原核生物のあるグループで起こる
(Sprent、 J、 I。
(Azotobacter vinelandii))
そして藍藻類の数珠(例えば、アナベナ・シリンドリカ
(八na−baena cylindrica))を含
む、生理学的に多様な原核生物のあるグループで起こる
(Sprent、 J、 I。
(1979) The biology of nit
rogen fixing organ−isms、
London、 McGraw−Hill+ pp8−
11)。この酵素複合体はすべての特徴を持った窒素固
定生物に共通であるにもかかわらず9発現する条件が種
によりかなり変わる(BurnslR,C0+ Har
dy+ R,W、 F。
rogen fixing organ−isms、
London、 McGraw−Hill+ pp8−
11)。この酵素複合体はすべての特徴を持った窒素固
定生物に共通であるにもかかわらず9発現する条件が種
によりかなり変わる(BurnslR,C0+ Har
dy+ R,W、 F。
(1975) : Nitrogen fixatio
n in bacteria andhigher p
lants、 Sprjnger−Verlag+ B
erlin)、窒素固定の第1段階、窒素のアンモニア
への変換、はりゾビウム(Rhizobium)属とい
う窒素固定菌を含む豆科植物の根粒で共生的に成される
。いくつかの非豆科植物9例えば、はんのき、ちまた窒
素固定者である共生細菌と相互作用する。さらに、遊離
に存在している細菌2例えば、タレプシエラ・ニューモ
ニエ(Klebsiella pneumoniae)
や光合成藍藻細菌、も窒素を固定する。豆科植物の根粒
における生物学的窒素固定は2世界の食糧生産の主要な
成分である(Burris、 R,tl、 (1980
) In FreeLiving Systems a
nd Chemical Models ; Nitr
ogenfixation、 Newton、 W、
E、、 0rne−、Iohnson、 fil、 I
l、+eds、 vol I Baltimore、
University Park I’ress。
n in bacteria andhigher p
lants、 Sprjnger−Verlag+ B
erlin)、窒素固定の第1段階、窒素のアンモニア
への変換、はりゾビウム(Rhizobium)属とい
う窒素固定菌を含む豆科植物の根粒で共生的に成される
。いくつかの非豆科植物9例えば、はんのき、ちまた窒
素固定者である共生細菌と相互作用する。さらに、遊離
に存在している細菌2例えば、タレプシエラ・ニューモ
ニエ(Klebsiella pneumoniae)
や光合成藍藻細菌、も窒素を固定する。豆科植物の根粒
における生物学的窒素固定は2世界の食糧生産の主要な
成分である(Burris、 R,tl、 (1980
) In FreeLiving Systems a
nd Chemical Models ; Nitr
ogenfixation、 Newton、 W、
E、、 0rne−、Iohnson、 fil、 I
l、+eds、 vol I Baltimore、
University Park I’ress。
pp7−16)。
植物とりゾビウム(Rhizobium)属の細菌との
間の共生関係は、細菌とその宿主の間の複雑な相互作用
の結果であり、細菌と植物の両方の遺伝子が互いにきっ
ちりと整合した仕方で発現することを要する( Vin
cent、 J、 M、 (1980) In Sym
hioticAssociations and Cy
anobacteria、 Nitrogen Fix
−ation vol、2 (W、 IE、 Newt
on、 (11,H,0rne−Johnson+ed
s、) Baltimore+ University
Park Press pp、103−129;およ
びVerma+ Il、 P、 S、、 Legock
j+ R,P。
間の共生関係は、細菌とその宿主の間の複雑な相互作用
の結果であり、細菌と植物の両方の遺伝子が互いにきっ
ちりと整合した仕方で発現することを要する( Vin
cent、 J、 M、 (1980) In Sym
hioticAssociations and Cy
anobacteria、 Nitrogen Fix
−ation vol、2 (W、 IE、 Newt
on、 (11,H,0rne−Johnson+ed
s、) Baltimore+ University
Park Press pp、103−129;およ
びVerma+ Il、 P、 S、、 Legock
j+ R,P。
and S、 Auger (1981) In Cu
rrent Perspectivesin Nit
rogen Fixation (八、 H,G
ibson、 W、 E。
rrent Perspectivesin Nit
rogen Fixation (八、 H,G
ibson、 W、 E。
Newton、 eds、) Canberra
: 八ustralian Academyof
5cience、 pp−205−208)、遊離に
存在しているリゾビア(Rhizobia)では、ニト
ロゲナーゼ合成は抑制されており、共生関係が確立され
ると誘導されるだけである。さらに、いくつかのりゾビ
ウム(Rhizobium)種は限られた範囲の植物種
と相互作用し合うだけであるが、他の種は広範囲に相互
作用し合う。
: 八ustralian Academyof
5cience、 pp−205−208)、遊離に
存在しているリゾビア(Rhizobia)では、ニト
ロゲナーゼ合成は抑制されており、共生関係が確立され
ると誘導されるだけである。さらに、いくつかのりゾビ
ウム(Rhizobium)種は限られた範囲の植物種
と相互作用し合うだけであるが、他の種は広範囲に相互
作用し合う。
細菌は現れてくる植物の根毛に結合し、感染糸を形成し
て根の組織に侵入する。植物はこの感染に応答して高度
に分化した根粒を発達させる。これら根粒はニトロゲナ
ーゼ複合体合成部位である。
て根の組織に侵入する。植物はこの感染に応答して高度
に分化した根粒を発達させる。これら根粒はニトロゲナ
ーゼ複合体合成部位である。
窒素固定に続いて、固定された窒素は植物組織へ移動し
、植物由来の酵素により同化される(Scott。
、植物由来の酵素により同化される(Scott。
D、 B、、 Farnden、 K、 J、 F、
and Robertson、 J。
and Robertson、 J。
G、 (1976) Nature 263 : 70
3−705)。
3−705)。
はとんどのりゾビウム(Rh i zob i um)
の共生は豆科植物に限られている。さらに、農業的に重
要な温帯性の豆科植物と共同して窒素を固定するりゾビ
ウム(Rhizobium)株は、ふつう宿主域として
は単一の豆科属に限定されている。しかし、豆科種の広
範囲のグループで窒素を固定できるが、非豆科のものと
も、また効果的な共生を形成することができる数珠のり
ゾビウム(Rhizobium)が単離されている。
の共生は豆科植物に限られている。さらに、農業的に重
要な温帯性の豆科植物と共同して窒素を固定するりゾビ
ウム(Rhizobium)株は、ふつう宿主域として
は単一の豆科属に限定されている。しかし、豆科種の広
範囲のグループで窒素を固定できるが、非豆科のものと
も、また効果的な共生を形成することができる数珠のり
ゾビウム(Rhizobium)が単離されている。
ある植物があるリゾビウム(Rh i zob ium
)種との共生関係でニトロゲナーゼ活性を誘導する能力
があるにもかかわらず、以前より生物学的窒素固定の遺
伝解析は、遊離に生存している窒素固定生物。
)種との共生関係でニトロゲナーゼ活性を誘導する能力
があるにもかかわらず、以前より生物学的窒素固定の遺
伝解析は、遊離に生存している窒素固定生物。
特にタレプシエラ・ニューモニエ(Klebsiell
apneumon 1ae)に限られていた。17の連
関した窒素固定く旦U遺伝子が、タレブシエラ(Kle
bsiella)の」Uクラスター内の少なくとも7つ
の転写単位に並んでいる(Kennedy、 C,、C
annon、 F、、 Cannon。
apneumon 1ae)に限られていた。17の連
関した窒素固定く旦U遺伝子が、タレブシエラ(Kle
bsiella)の」Uクラスター内の少なくとも7つ
の転写単位に並んでいる(Kennedy、 C,、C
annon、 F、、 Cannon。
M、、 Dixon、 R,、Hill、 S、、 J
ensen、 J、、 Kumar。
ensen、 J、、 Kumar。
S、、McLean、P、+ Merrick、M、
+ Robson、R,andPostgate、
J、 (1981) In Current Pers
pectivesin Nitrogen Fix
ation (八、 )1. Gibsor++
W、 E。
+ Robson、R,andPostgate、
J、 (1981) In Current Pers
pectivesin Nitrogen Fix
ation (八、 )1. Gibsor++
W、 E。
Newton、eds、)Canberna :
Au5tralian Academyof 5ci
ence、 pp、146−156 ;およびRied
el、 G、 E、。
Au5tralian Academyof 5ci
ence、 pp、146−156 ;およびRied
el、 G、 E、。
八usubel、 F、 M、 and F、
M、 Cannon (1979) Pro
c。
M、 Cannon (1979) Pro
c。
Nat、八cad、 Sci、 U、S、A、 76
: 2866−2870)、この遺伝子のうちの3つ
、 nif H,nif D+ および1ifKは、ニ
トロゲナーゼ酵素複合体(すなわち、Fe−タンパク質
サブユニット(ジニトロゲナーゼレダクターゼ))の構
造タンパク質やMo−Feタンパク質(ジニトロゲナー
ゼ)のα−サブユニットおよびβ−サブユニットをそれ
ぞれコードしている。
: 2866−2870)、この遺伝子のうちの3つ
、 nif H,nif D+ および1ifKは、ニ
トロゲナーゼ酵素複合体(すなわち、Fe−タンパク質
サブユニット(ジニトロゲナーゼレダクターゼ))の構
造タンパク質やMo−Feタンパク質(ジニトロゲナー
ゼ)のα−サブユニットおよびβ−サブユニットをそれ
ぞれコードしている。
ジニトロゲナーゼは、2つの不同−なαとβのサブユニ
ットが55,000から60,000の同様の分子量を
持つα2β2の4量体である。ジニトロゲナーゼレダク
ターゼは、約35.000の分子量を持つ2つの同一サ
ブユニットからなる2量体である。
ットが55,000から60,000の同様の分子量を
持つα2β2の4量体である。ジニトロゲナーゼレダク
ターゼは、約35.000の分子量を持つ2つの同一サ
ブユニットからなる2量体である。
これらの遺伝子は、タレプシエラ・ニューモニエ(Kl
ebsiella pneumoniae)では同じオ
ペロン上に連関しており、 n1fH遺伝子近傍のプ
ロモーターから転写される。同様の状G (n1fHD
K)が2つの成長の速いリゾビア、リゾビウム・メリロ
ティ (Rhizobium meliloti)
(Ruvkun、 G、 B、、 et al。
ebsiella pneumoniae)では同じオ
ペロン上に連関しており、 n1fH遺伝子近傍のプ
ロモーターから転写される。同様の状G (n1fHD
K)が2つの成長の速いリゾビア、リゾビウム・メリロ
ティ (Rhizobium meliloti)
(Ruvkun、 G、 B、、 et al。
(1982) Ce1l 29 : 551−559)
とりゾビウム・レグミノサラム(Rhizobium
leguminosarum (Schetgens+
T、M、P、et al、(1984)Identif
ication and anal−ysis of
the expression of Rhiz
obium Iegumino−sarum PRE
Symbiotic genes+ p、699.
In C,Veegerand W、E、 Ne
wton (eds、) 八dvances i
n nitrogenfixation resea
rch、Martinus N1jhoff/Dr、W
、JunkPublishers、The Hague
)に見られる。成長の遅いリゾビウム・ジャポニカム(
Rhizobium japonicum)では、
n1fDKが1つのオペロンを形成しており。
とりゾビウム・レグミノサラム(Rhizobium
leguminosarum (Schetgens+
T、M、P、et al、(1984)Identif
ication and anal−ysis of
the expression of Rhiz
obium Iegumino−sarum PRE
Symbiotic genes+ p、699.
In C,Veegerand W、E、 Ne
wton (eds、) 八dvances i
n nitrogenfixation resea
rch、Martinus N1jhoff/Dr、W
、JunkPublishers、The Hague
)に見られる。成長の遅いリゾビウム・ジャポニカム(
Rhizobium japonicum)では、
n1fDKが1つのオペロンを形成しており。
しかもn1fl(はゲノム上のいたるところに位置して
いるということがわかっている(Fuhrmann、
M。
いるということがわかっている(Fuhrmann、
M。
and +1. Hennecke (1982) M
o1. Gen、 Genet、 187:419−
425)。同様の観察が他の成長の遅い根粒菌(リゾビ
ア)、すなわちリゾビウム種バラスボニア(Rhizo
bium sp、 Parasponia)で行われ、
nif H領域はn1fDには連関していないという
ことがわかった(Scott、 K、 F、、 et
al、 (1983) DNA 2 :141−14
8)。しかし、らん藻のアナベナ種7120では順序が
異なっており、 n1fHD7!l<n1fKから分
離されているということが検出された(R4ce、 D
、。
o1. Gen、 Genet、 187:419−
425)。同様の観察が他の成長の遅い根粒菌(リゾビ
ア)、すなわちリゾビウム種バラスボニア(Rhizo
bium sp、 Parasponia)で行われ、
nif H領域はn1fDには連関していないという
ことがわかった(Scott、 K、 F、、 et
al、 (1983) DNA 2 :141−14
8)。しかし、らん藻のアナベナ種7120では順序が
異なっており、 n1fHD7!l<n1fKから分
離されているということが検出された(R4ce、 D
、。
et al、 (1982) J、 Biol、 Ch
em、 257 : 13157−13163)。
em、 257 : 13157−13163)。
共生遺伝子の残りは、細菌接着、根毛のカーリング、根
粒の開始と発達、そして共生関係の確立。
粒の開始と発達、そして共生関係の確立。
に必要な情報を含む。加えて、プロモーター、オペレー
ター、アテニュエーター、そしてリボゾーム結合部位の
ような調節配列が、コード領域近傍に見つかっている。
ター、アテニュエーター、そしてリボゾーム結合部位の
ような調節配列が、コード領域近傍に見つかっている。
このような調節配列は構造遺伝子、すなわちDNA読み
取り鎖の3゛方向の下流のコード配列の発現を制御する
。
取り鎖の3゛方向の下流のコード配列の発現を制御する
。
プラスミド、制限酵素、リガーゼ、およびDNA合成に
関する他の酵素の発見と研究により、遺伝子工学の分野
は急速的な進歩をとげた。これらの技術の使用により9
種の境界を越えて、すなわち真核生物から原核生物へ、
あるいは原核生物から真核生物へDNAを転送すること
が可能となった。他には、ヌクレオチド配列を合成した
り、この合成配列を生物体に取り込ませてそこで発現さ
せることが可能となった。例えば、大腸菌での発現は、
マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ(Chang。
関する他の酵素の発見と研究により、遺伝子工学の分野
は急速的な進歩をとげた。これらの技術の使用により9
種の境界を越えて、すなわち真核生物から原核生物へ、
あるいは原核生物から真核生物へDNAを転送すること
が可能となった。他には、ヌクレオチド配列を合成した
り、この合成配列を生物体に取り込ませてそこで発現さ
せることが可能となった。例えば、大腸菌での発現は、
マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ(Chang。
八、 C,Y、、 Nunberg+ J、
H,、Kaufman、 R,K、。
H,、Kaufman、 R,K、。
Ehrlich、 It、 A、+ Schmike、
R,T、 and Cohen。
R,T、 and Cohen。
S、N、 (1978) Nature 275 :
617−624)や肝炎Bウィルス抗原(Burrel
l、 C,J−+ Mackay、 P、。
617−624)や肝炎Bウィルス抗原(Burrel
l、 C,J−+ Mackay、 P、。
Greenaway、P、J、、1lofchneid
er、P、H,and K。
er、P、H,and K。
Murray (1979) Nature 279
: 43−47)をコードしているDNA配列で達成さ
れた。2つの哺乳動物のホルモンがまた1合成りNAを
用いて細菌内で生産された(Ttakura、 K、+
旧rose、 T、、 Crea。
: 43−47)をコードしているDNA配列で達成さ
れた。2つの哺乳動物のホルモンがまた1合成りNAを
用いて細菌内で生産された(Ttakura、 K、+
旧rose、 T、、 Crea。
R,+ R4ggs+ A、 D、、 Heyneck
er、 H,L、、 Bolivar。
er、 H,L、、 Bolivar。
F、、 ancl 11. IA、 Boyer (1
977) 5cience 198 : 1056;お
よび、 Goeddel、 D、 B、、 Kleid
、 D、 G、 Boliver。
977) 5cience 198 : 1056;お
よび、 Goeddel、 D、 B、、 Kleid
、 D、 G、 Boliver。
F、+ Heynecker、 H,L、、 Yans
ura、 n、G、、 Crea。
ura、 n、G、、 Crea。
Ro、 旧rose、 T、+ Kraszews
ki+ A、、 Itakura、 K。
ki+ A、、 Itakura、 K。
and A、 D、 Riggs (1979
) Proc、 Nat、 Acad、 Sc
i。
) Proc、 Nat、 Acad、 Sc
i。
U、S、A、 7鉦: 106 )。
DNA組み換えを実際的に応用するには、いくつかの異
なる主要点が成功しなければならない。
なる主要点が成功しなければならない。
まず第1に、興味ある化合物をコードするDNA断片を
認識することが可能でなければならないし。
認識することが可能でなければならないし。
そのD N A [、片を単離することが可能でなけれ
ばならない。2番目に、そのDNA断片の情報の発現を
制御するメカニズムを理解すること、およびその情報の
生産能力を最大限にする調節配列の制御下にその情報を
転送できることが必要である。
ばならない。2番目に、そのDNA断片の情報の発現を
制御するメカニズムを理解すること、およびその情報の
生産能力を最大限にする調節配列の制御下にその情報を
転送できることが必要である。
この増加した生産能力は同じ生物内あるいは異なる生物
間で、コード情報および制御情報を再編成することによ
り達成できる。関与する生物は原核生物あるいは真核生
物である。3番目に、コード情報の貯蔵タンパク質やホ
ルモンのような有用生産物への変換は、それらがあとで
分解されない環境で起こらなければならない。
間で、コード情報および制御情報を再編成することによ
り達成できる。関与する生物は原核生物あるいは真核生
物である。3番目に、コード情報の貯蔵タンパク質やホ
ルモンのような有用生産物への変換は、それらがあとで
分解されない環境で起こらなければならない。
(発明の背景)
リゾビウム(Rhizobium)属の細菌では、ニト
ロゲナーゼ合成はふつう遊離生存状態では抑制されてお
り、はとんど豆科植物と形成された複合共生内でだけ誘
導される。リゾビウム・トリフオリ (Rhizobi
um trifolii)は狭い宿主域を持つ成長の速
いリゾビウム(Rhizobium)の例で2通常では
培養中は窒素を固定するよう誘導され得ない。これに対
し、バラスポニア・リゾビウム(Parasponia
Rhizobium)種が単離されており、この種は非
豆科植物のパラスポニア(Parasponia)
(ウルマシー(U Imaceae) )と同様に広範
囲の熱帯性豆科植物とも効果的な共生関係を持てるよう
な非常に広い宿主域を持つ成長の遅い生物である(Tr
inick、 M。
ロゲナーゼ合成はふつう遊離生存状態では抑制されてお
り、はとんど豆科植物と形成された複合共生内でだけ誘
導される。リゾビウム・トリフオリ (Rhizobi
um trifolii)は狭い宿主域を持つ成長の速
いリゾビウム(Rhizobium)の例で2通常では
培養中は窒素を固定するよう誘導され得ない。これに対
し、バラスポニア・リゾビウム(Parasponia
Rhizobium)種が単離されており、この種は非
豆科植物のパラスポニア(Parasponia)
(ウルマシー(U Imaceae) )と同様に広範
囲の熱帯性豆科植物とも効果的な共生関係を持てるよう
な非常に広い宿主域を持つ成長の遅い生物である(Tr
inick、 M。
J、(1980) J、 八pp、、 Bacte
riol、 49 : 39−53)。 パラス
ポニア・リゾビウム(Parasponia Rhiz
obium)は、培養中窒素固定するよう誘導されるが
、この固定のレベルは遊離に生存している細菌タレプシ
エラ・ニューモニエ(Klebsiella pneu
moniae)に比較して約100倍低い。他の成長の
遅いリゾビア(Rhizobia)は、商業的に重要な
、大豆に根粒を形成するりゾビウム・ジャポニカム(R
hizobiumjapon icum)を含む。
riol、 49 : 39−53)。 パラス
ポニア・リゾビウム(Parasponia Rhiz
obium)は、培養中窒素固定するよう誘導されるが
、この固定のレベルは遊離に生存している細菌タレプシ
エラ・ニューモニエ(Klebsiella pneu
moniae)に比較して約100倍低い。他の成長の
遅いリゾビア(Rhizobia)は、商業的に重要な
、大豆に根粒を形成するりゾビウム・ジャポニカム(R
hizobiumjapon icum)を含む。
生物学的窒素固定の遺伝学は、遊離に生存している生物
、タレプシエラ・ニューモニエ(Klebsi−ell
a pneumoniae)ではよく特徴づけられてい
る。
、タレプシエラ・ニューモニエ(Klebsi−ell
a pneumoniae)ではよく特徴づけられてい
る。
ニトロゲナーゼの構造遺伝子(Fe−タンパク質のサブ
ユニソ1〜.およびMo −Feタンパク質のαとβサ
ブユニットをそれぞれコードしているn1fH。
ユニソ1〜.およびMo −Feタンパク質のαとβサ
ブユニットをそれぞれコードしているn1fH。
nif D 、そしてn1fK )は遺伝的かつ物理的
に。
に。
マツプされている(Kennedy、 C,et al
、 (1981)In Current Pers
ectives in N1tro en
Fixation(eds、 Gibson、
A、 H,and W、 E、 Nei<ton
)八ustralian Acacl、 5cie
nce+ Canberra+ pp、146−1
56;および、 Re1del、 G、 F、、、 A
u5ubel、 F、 M。
、 (1981)In Current Pers
ectives in N1tro en
Fixation(eds、 Gibson、
A、 H,and W、 E、 Nei<ton
)八ustralian Acacl、 5cie
nce+ Canberra+ pp、146−1
56;および、 Re1del、 G、 F、、、 A
u5ubel、 F、 M。
and F、M、Cannon (1979)Pro
c、Nat、Acad、Sci。
c、Nat、Acad、Sci。
U、S、A、ユニ 2866−2870)、 これらの
配列を持つクローン化DNA断片が、リゾビウム(Rh
izobium)を含む広範囲の窒素固定生物において
その相同配列とハイブリダイズすることが、サザンプロ
ット分析により示された( Ruvkun、 G、 B
、 and F、 M。
配列を持つクローン化DNA断片が、リゾビウム(Rh
izobium)を含む広範囲の窒素固定生物において
その相同配列とハイブリダイズすることが、サザンプロ
ット分析により示された( Ruvkun、 G、 B
、 and F、 M。
八usubel (1980) Proc、 N
at、 Acad、 Sci、 U、S、A。
at、 Acad、 Sci、 U、S、A。
77 : 191−195)。
窒素固定生物の生態学的多様性にもかかわらず。
ニトロゲナーゼ酵素複合体の生理的構造は非常に保存さ
れているようである。酵素複合体が精製されているすべ
ての場合で、2つのタンパク質が存在している。大きい
方のタンパク質(ジニトロゲナーゼ)はモリブデン、鉄
、そして酸に不安定な硫黄を含み、窒素に対する結合部
位を持ち、nif’Dやn1fK遺伝子にそれぞれコー
ドされている2つのサンプユニットタンパク質αとβを
含む。小さい方のタンパク質(ジニトロゲナーゼレダク
ターゼ)は鉄と酸に不安定な硫黄を含み、ジニトロゲナ
ーゼの還元に、またこの還元に使われるMgATPの結
合に必要である。ジニトロゲナーゼレダクターゼは、
Iif H遺伝子にコードされている。精製したタンパ
ク質の構成成分の化学的およびスペクトル的分析は、生
物間のタンパク質の構造の保存を支持する(Scott
、 K、 F、+ Rolfe+ B、 G、 and
J、 5hine (1981) J、 Mo
1. 八pp1. Genet、 1 :
7L81)、ある場合には、精製した構成成分1例えば
。
れているようである。酵素複合体が精製されているすべ
ての場合で、2つのタンパク質が存在している。大きい
方のタンパク質(ジニトロゲナーゼ)はモリブデン、鉄
、そして酸に不安定な硫黄を含み、窒素に対する結合部
位を持ち、nif’Dやn1fK遺伝子にそれぞれコー
ドされている2つのサンプユニットタンパク質αとβを
含む。小さい方のタンパク質(ジニトロゲナーゼレダク
ターゼ)は鉄と酸に不安定な硫黄を含み、ジニトロゲナ
ーゼの還元に、またこの還元に使われるMgATPの結
合に必要である。ジニトロゲナーゼレダクターゼは、
Iif H遺伝子にコードされている。精製したタンパ
ク質の構成成分の化学的およびスペクトル的分析は、生
物間のタンパク質の構造の保存を支持する(Scott
、 K、 F、+ Rolfe+ B、 G、 and
J、 5hine (1981) J、 Mo
1. 八pp1. Genet、 1 :
7L81)、ある場合には、精製した構成成分1例えば
。
アソ゛トノマクター・ビネランディ (八zotoba
ctervinelandii)とタレプシエラ・ニュ
ーモニエ(Kle−bsiella pneumoni
ae)+の間で活性のあるハイブリッド酵素が形成され
るに充分な程類似している(Eady、 R,R,an
d B、 E、 Sm1th (1979) In :
Atreatise on dinitrogen
fixation I 、 H,eds。
ctervinelandii)とタレプシエラ・ニュ
ーモニエ(Kle−bsiella pneumoni
ae)+の間で活性のあるハイブリッド酵素が形成され
るに充分な程類似している(Eady、 R,R,an
d B、 E、 Sm1th (1979) In :
Atreatise on dinitrogen
fixation I 、 H,eds。
1(ardy、 R,ti、l Bottomley、
F、 and R,C,Burns。
F、 and R,C,Burns。
New York、 Wiley Press pp、
399−490)、それゆえに。
399−490)、それゆえに。
驚くことではないが、ジニトロゲナーゼレダクターゼと
ジニトロゲナーゼα−サブユニットをコードしている泄
オペロンの領域(n1fHとn1fD )は、少なくと
も19の他の細菌株において核酸配列レベルで、相当す
る配列に相同性がある(Ruvkun。
ジニトロゲナーゼα−サブユニットをコードしている泄
オペロンの領域(n1fHとn1fD )は、少なくと
も19の他の細菌株において核酸配列レベルで、相当す
る配列に相同性がある(Ruvkun。
G、 B、 and F、 M、 Au5ubel (
1980) Proc、Nat、 Acad。
1980) Proc、Nat、 Acad。
Sci、 U、S、A、77 : 191−195)、
この構造の保存性は一般的に真実であるが、異なる生物
由来のニトロゲナーゼ間では重要な違いもまた存在する
。これは精製後の変化しやすい安定性や、すべての場合
で活性のあるハイブリッド複合体を形成するので ・
はないという事実により示される(Eady、 R,R
。
この構造の保存性は一般的に真実であるが、異なる生物
由来のニトロゲナーゼ間では重要な違いもまた存在する
。これは精製後の変化しやすい安定性や、すべての場合
で活性のあるハイブリッド複合体を形成するので ・
はないという事実により示される(Eady、 R,R
。
and B、 E、 Sm1th (1979)上記)
。
。
タレプシエラ・ニューモニエ(Klebsiella
pneu−moniae)のn1fK 、 n1fD
およびn1fH遺伝子を持つDNA断片を皿−株lNF
341(In5:: n1fK )より単離しくCar
+r+on、 F、 C,et al、 (1979)
Mol。
pneu−moniae)のn1fK 、 n1fD
およびn1fH遺伝子を持つDNA断片を皿−株lNF
341(In5:: n1fK )より単離しくCar
+r+on、 F、 C,et al、 (1979)
Mol。
Gen、 Genet、 174 : 59−66)、
エセリシア・コリー(Escherichia col
i)のプラスミドpBR325にクローン化した。n1
fH遺伝子と622ヌクレオチドnifD遺伝子のヌク
レオチド配列が決定された(Sundaresan、
V、 and F、 M、 八usubel
(1981) J。
エセリシア・コリー(Escherichia col
i)のプラスミドpBR325にクローン化した。n1
fH遺伝子と622ヌクレオチドnifD遺伝子のヌク
レオチド配列が決定された(Sundaresan、
V、 and F、 M、 八usubel
(1981) J。
Biol、 Chem、 256 : 2808−28
12 : 5cott、 K、 F、。
12 : 5cott、 K、 F、。
Rolfe、 B、G、 and J、 5hine
(1981)上記)、加えて。
(1981)上記)、加えて。
アナベナ(Anabaena) 7120のn1fH遺
伝子のDNA配列が決定されている(Mevarech
、 M、、 R4ce。
伝子のDNA配列が決定されている(Mevarech
、 M、、 R4ce。
D、 and R,I(aselkorn (1980
) Proc、 Nat、 Acad。
) Proc、 Nat、 Acad。
Set、 U、S、A、亘: 6476−6480)、
この2つの配列を比較すると興味ある2点がある。(1
)泄遺伝子の観察されている種間の相同性の説明となっ
ている少しの範囲(25bpまで)では保存されている
が。
この2つの配列を比較すると興味ある2点がある。(1
)泄遺伝子の観察されている種間の相同性の説明となっ
ている少しの範囲(25bpまで)では保存されている
が。
ヌクレオチド配列レベルでは2つの配列の間にはほとん
ど相同性がない(Ruvkun、 G、 B、 and
F、 M。
ど相同性がない(Ruvkun、 G、 B、 and
F、 M。
Au5ubel (1980)上記)、(2+一般に、
プロモーター領域は、ふつうの機能1例えばRNAポリ
メラーゼの認識、に関与するような短い領域を除いては
ほとんど配列に相同性はない。
プロモーター領域は、ふつうの機能1例えばRNAポリ
メラーゼの認識、に関与するような短い領域を除いては
ほとんど配列に相同性はない。
これに対し、2種および他の種について、ジニトロゲナ
ーゼレダクターゼのアミノ酸配列、そしてジニトロゲナ
ーゼのα−サブユニットの最初の207アミノ酸の配列
を比較すると、非常にきわだった保存性がわかる。この
比較に用いた3種は。
ーゼレダクターゼのアミノ酸配列、そしてジニトロゲナ
ーゼのα−サブユニットの最初の207アミノ酸の配列
を比較すると、非常にきわだった保存性がわかる。この
比較に用いた3種は。
タレプシエラ・ニューモニエ(Klebsiella
pneumoniae) (Kp) + アナベナ(八
nabaena) 7120 (Ab)とクロストリデ
ィウム・バスツーリアナム(C1ostri−dium
pasteurianum ) (Cp)である(T
anaka、 M111anio+ M、、 Yasu
nobu+ T、 and L、 Mortenson
(1977)J、 Biol、 Chem、 252
: 7093−7100) 、 Kpタンパク質とC
pタンパク質では67%のアミノ酸配列相同性を有し、
Kpタンパク質とApタンパク質では71%。
pneumoniae) (Kp) + アナベナ(八
nabaena) 7120 (Ab)とクロストリデ
ィウム・バスツーリアナム(C1ostri−dium
pasteurianum ) (Cp)である(T
anaka、 M111anio+ M、、 Yasu
nobu+ T、 and L、 Mortenson
(1977)J、 Biol、 Chem、 252
: 7093−7100) 、 Kpタンパク質とC
pタンパク質では67%のアミノ酸配列相同性を有し、
Kpタンパク質とApタンパク質では71%。
Cpタンパク質とAbタンパク質では63%のアミノ酸
配列相同性を有する。このアミノ酸配列の相同性はタン
パク質を通して平等に分布しているのではない。ある領
域では事実同一である(90%から95%の相同性)が
、他の領域ではほんの弱い相同性がある(30〜35%
の相同性)だけである。構造的な保存性は、3つのFe
タンパク質すべてに共通な5つのシスティン残基のまわ
りに集まっているようである。これらのシスティン残基
は活性中心へのりガントであると信じられている。
配列相同性を有する。このアミノ酸配列の相同性はタン
パク質を通して平等に分布しているのではない。ある領
域では事実同一である(90%から95%の相同性)が
、他の領域ではほんの弱い相同性がある(30〜35%
の相同性)だけである。構造的な保存性は、3つのFe
タンパク質すべてに共通な5つのシスティン残基のまわ
りに集まっているようである。これらのシスティン残基
は活性中心へのりガントであると信じられている。
CpとKp’のジニトロゲナーゼのα−サブユニットの
N末端のアミノ酸配列を比較すると、この領域にはほと
んど配列の相同性は見られない。このことはタンパク質
のアミノ末端領域に見られるアミノ酸配列が非常に高度
に保存されているのとは対照的である。CpとKpのα
サブユニット間でほとんど相同性がないことは、 Fe
タンパク質と同様に。
N末端のアミノ酸配列を比較すると、この領域にはほと
んど配列の相同性は見られない。このことはタンパク質
のアミノ末端領域に見られるアミノ酸配列が非常に高度
に保存されているのとは対照的である。CpとKpのα
サブユニット間でほとんど相同性がないことは、 Fe
タンパク質と同様に。
システィン残基周辺域についても認められている。
このような相同性領域は、ニトロゲナーゼ酵素複合体の
触媒機能に関与していると考えられている。
触媒機能に関与していると考えられている。
それゆえに、この構造的保存性は、 nif遺伝子の最
近の進化や分散の結果ではないと考えられており (
Postgate、 J、 R,(1974)
Sym、 Soc、 Gen。
近の進化や分散の結果ではないと考えられており (
Postgate、 J、 R,(1974)
Sym、 Soc、 Gen。
Microbiol、 24 : 263−292)、
それよりもむしろ機能の保存に関係していると提唱され
ている。
それよりもむしろ機能の保存に関係していると提唱され
ている。
(以下余白)
光訓I刈彫丘
リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium ja
ponicum)のニトロゲナーゼ複合体遺伝子のプロ
モーター、およびその制御領域の制御下にある外来構造
遺伝子を含むDNA挿入断片を有する広宿主域のベクタ
ーである組換プラスミドを開示する。制御領域および外
来遺伝子は、形質転換したりゾビウム・ジャポニカム(
Rhizobium japonicum)から欠落す
る可能性のあるプラスミド上にのっているため、これら
の遺伝子をベクターから細菌の染色体へ移す方法も述べ
る。それによって、ニトロゲナーゼ遺伝子の制御領域お
よび外来遺伝子から成る合成遺伝子が染色体に組み込ま
れた。新しいりゾビウム・ジャポニカム(Rhizob
ium japonicum)株が生成される。
ponicum)のニトロゲナーゼ複合体遺伝子のプロ
モーター、およびその制御領域の制御下にある外来構造
遺伝子を含むDNA挿入断片を有する広宿主域のベクタ
ーである組換プラスミドを開示する。制御領域および外
来遺伝子は、形質転換したりゾビウム・ジャポニカム(
Rhizobium japonicum)から欠落す
る可能性のあるプラスミド上にのっているため、これら
の遺伝子をベクターから細菌の染色体へ移す方法も述べ
る。それによって、ニトロゲナーゼ遺伝子の制御領域お
よび外来遺伝子から成る合成遺伝子が染色体に組み込ま
れた。新しいりゾビウム・ジャポニカム(Rhizob
ium japonicum)株が生成される。
本発明の細菌株は、(a)ベクター、 (blリゾビウ
ム・ジャポニカム(Rhizobium japoni
cum)細菌のニトロゲナーゼ複合遺伝子のプロモータ
ー、および(C1該プロモーターの制御下にある構造遺
伝子、を有する組換DNAプラスミドを含み、そこで複
製する。前記ベクターがpRK290である。前記構造
遺伝子が外来遺伝子である。前記プロモーターが」豆H
プロモーターである。前記n1fHプロモーターがヌク
レオチド配列5’ −T−T−T−G−G−C−T−G
−T−T−G−G−C−G−T−T−C−A−T−G−
T−T−T−G−C−G−A−T−T−G−T−T−T
−G−T−T−C−G−T−T−G−T−C−T−G−
A−C−A−G−C−C−G−G−G−C−A−G−八
−T−C−T−T−G−T−C−A−G−A−T−C−
C−へ一へ−^−へ−C−A−G−C−C−T−AmC
−G−A−T−C−G−C−G−C−G−C−C−G−
G−C−T−G−G−T−T−G−C−T−T−T−T
−G−G−八−八−A−C−G−T−へ一へ−T−C−
へ−G−A−A−G−C−T−T−A−A−G−G−T
−G−C−C−G−G−G−T−T−八−G−A−C−
C−T−T−G−G−C−^−C−G−G−C−T−G
−T−T−G−C−T−G−八−T−八−A−G−C−
G−G−C−A−G−C−A−A−C−A−C−T−G
−八−G−T−G−A−G−G−G−C−T−G−A−
G−T−G−C−A−C−G−C−C−G−A−C−G
−T−G−T−A−Δ−G−G−C−G−A−G−C−
G−A−T−G−C−G−C−T−C−C−T−T−C
−C−C−T−T−G−A−A−C−C−C−G−T−
G−T−G−C−C−C−C−C−G−TfT−T−C
−T−G−C−G−^−G−G−G−A−A−G−C−
八−^−A−G−C−T−C−G−C−八−A−^−八
へG−A−A−G−C−G−C−G−C−八−A−C−
G−T−T−T−G−G−C−A−八−^−T−C−G
−G−T−T−G−A−T−G−G−A−G−A−G−
C−^−G−C−3’または厳密な条件下で、これとハ
イブリダイズし得る機能的に等価な配列を含む。前記プ
ロモーターがn1fDプロモーターである。前記n1f
Dプロモーターがヌクレオチド配列5’ −G−八−T
−C−T−A−G−C−G−C−G−C−G−A−G−
A−T−C−G−C−八−G−T−A−C−A−T−T
−A−C−A−T−C−G−C−A−G−G−T−T−
G−A−G−C−八−C−C−T−G−T−AmG−G
−T−T−T−C−A−A−T−A−A−G−T−Δ−
T−G−八−八−GへGへ八−T−TへG−G−A−A
−G−C−C−AmG−A−C−T−T−G−C−G−
G−C−C−T−G−C−T−T−C−C−G−C−C
−T−T−八−C−A−C−C−G−C−A−G−A−
G−C−G−T−T−G−C−T−G−T−C−G−C
−G−’C−八−へ−A−A−八−へ−T−C−A−A
−A−八−A−C−T−C−C−G−C−C−G−T−
G−^−八へT−T−T−C−A−C−G−C−G−C
−G−G−C−(ニーG−C−C−T−T−G−T−T
−C−C−八−T−T−T−C−G−八−C−A−C−
C−G−C−C−八−八−A−C−C−八−A−G−A
−G−T−C−C−C−T−C−G−C−A−A−八−
G−G−C−G−八−G−T−G−T−C−G−G−^
−T−T−C−G−C−A−A−C−A−A−C−へ−
c−c−c−c−G−T−C−へ−C−C−G−T−A
−C−A−A−G−T−C−G−C−G−C−T−A−
へ−G−A−A−へ−C−T−G−T−T−G−T−T
=G−T−T−C−T−A−G−T−T−T−T−A−
G−T−G−C−T−C−A−T−G−AmG−A−C
−C−C−T−G−G−C−A−T−G−(ニーC−G
−G−T−T−G−C−A−八−八−G−T−C−T−
T−G−G−AmT−C−Δ−A−G−A−A−G−C
−C−G−C−C−C−T−C−C−C−A−へ−G−
へ−G−C−T−へ−A−C−C−T−T−T−T−八
−八−八−G−G−A−C−A−C−C−A−G−3゛
または厳密な条件下でこれとハイブリダイズし得る機能
的に等価な配列を含む。前記構造遺伝子が外来遺伝子で
ある。前記構造遺伝子がヒトのプロラクチン遺伝子であ
る。前記構造遺伝子がヒトのメタロチオネイン遺伝子で
ある。前記構造遺伝子がバシラス・チューリンギエンシ
ス(Bacil Iusthuringiensis
)の細菌毒素遺伝子である。
ム・ジャポニカム(Rhizobium japoni
cum)細菌のニトロゲナーゼ複合遺伝子のプロモータ
ー、および(C1該プロモーターの制御下にある構造遺
伝子、を有する組換DNAプラスミドを含み、そこで複
製する。前記ベクターがpRK290である。前記構造
遺伝子が外来遺伝子である。前記プロモーターが」豆H
プロモーターである。前記n1fHプロモーターがヌク
レオチド配列5’ −T−T−T−G−G−C−T−G
−T−T−G−G−C−G−T−T−C−A−T−G−
T−T−T−G−C−G−A−T−T−G−T−T−T
−G−T−T−C−G−T−T−G−T−C−T−G−
A−C−A−G−C−C−G−G−G−C−A−G−八
−T−C−T−T−G−T−C−A−G−A−T−C−
C−へ一へ−^−へ−C−A−G−C−C−T−AmC
−G−A−T−C−G−C−G−C−G−C−C−G−
G−C−T−G−G−T−T−G−C−T−T−T−T
−G−G−八−八−A−C−G−T−へ一へ−T−C−
へ−G−A−A−G−C−T−T−A−A−G−G−T
−G−C−C−G−G−G−T−T−八−G−A−C−
C−T−T−G−G−C−^−C−G−G−C−T−G
−T−T−G−C−T−G−八−T−八−A−G−C−
G−G−C−A−G−C−A−A−C−A−C−T−G
−八−G−T−G−A−G−G−G−C−T−G−A−
G−T−G−C−A−C−G−C−C−G−A−C−G
−T−G−T−A−Δ−G−G−C−G−A−G−C−
G−A−T−G−C−G−C−T−C−C−T−T−C
−C−C−T−T−G−A−A−C−C−C−G−T−
G−T−G−C−C−C−C−C−G−TfT−T−C
−T−G−C−G−^−G−G−G−A−A−G−C−
八−^−A−G−C−T−C−G−C−八−A−^−八
へG−A−A−G−C−G−C−G−C−八−A−C−
G−T−T−T−G−G−C−A−八−^−T−C−G
−G−T−T−G−A−T−G−G−A−G−A−G−
C−^−G−C−3’または厳密な条件下で、これとハ
イブリダイズし得る機能的に等価な配列を含む。前記プ
ロモーターがn1fDプロモーターである。前記n1f
Dプロモーターがヌクレオチド配列5’ −G−八−T
−C−T−A−G−C−G−C−G−C−G−A−G−
A−T−C−G−C−八−G−T−A−C−A−T−T
−A−C−A−T−C−G−C−A−G−G−T−T−
G−A−G−C−八−C−C−T−G−T−AmG−G
−T−T−T−C−A−A−T−A−A−G−T−Δ−
T−G−八−八−GへGへ八−T−TへG−G−A−A
−G−C−C−AmG−A−C−T−T−G−C−G−
G−C−C−T−G−C−T−T−C−C−G−C−C
−T−T−八−C−A−C−C−G−C−A−G−A−
G−C−G−T−T−G−C−T−G−T−C−G−C
−G−’C−八−へ−A−A−八−へ−T−C−A−A
−A−八−A−C−T−C−C−G−C−C−G−T−
G−^−八へT−T−T−C−A−C−G−C−G−C
−G−G−C−(ニーG−C−C−T−T−G−T−T
−C−C−八−T−T−T−C−G−八−C−A−C−
C−G−C−C−八−八−A−C−C−八−A−G−A
−G−T−C−C−C−T−C−G−C−A−A−八−
G−G−C−G−八−G−T−G−T−C−G−G−^
−T−T−C−G−C−A−A−C−A−A−C−へ−
c−c−c−c−G−T−C−へ−C−C−G−T−A
−C−A−A−G−T−C−G−C−G−C−T−A−
へ−G−A−A−へ−C−T−G−T−T−G−T−T
=G−T−T−C−T−A−G−T−T−T−T−A−
G−T−G−C−T−C−A−T−G−AmG−A−C
−C−C−T−G−G−C−A−T−G−(ニーC−G
−G−T−T−G−C−A−八−八−G−T−C−T−
T−G−G−AmT−C−Δ−A−G−A−A−G−C
−C−G−C−C−C−T−C−C−C−A−へ−G−
へ−G−C−T−へ−A−C−C−T−T−T−T−八
−八−八−G−G−A−C−A−C−C−A−G−3゛
または厳密な条件下でこれとハイブリダイズし得る機能
的に等価な配列を含む。前記構造遺伝子が外来遺伝子で
ある。前記構造遺伝子がヒトのプロラクチン遺伝子であ
る。前記構造遺伝子がヒトのメタロチオネイン遺伝子で
ある。前記構造遺伝子がバシラス・チューリンギエンシ
ス(Bacil Iusthuringiensis
)の細菌毒素遺伝子である。
本発明の組換DN’Aプラスミドは、(a)ベクター。
および(blリゾビウム・ジャポニカム(Rhizob
iumj apon icum)細菌のニトロゲナーゼ
複合遺伝子のプロモーター、を有する。前記ベクターが
pRK290またはpstlP204である。前記プロ
モーターが皿■プロモーターである。前記n i f
IIプロモーターがヌクレオチド配列5’ −T−T−
T−G−G−C−T−G−T−T−G−G−C−G−T
−T−C−AmT−G−T−T−T−G−C−G−A−
T−T−G−T−T−T−G−T−T−C−G−T−T
−G−T−C−T−G−AmC−A−G−C−C−G−
G−G−C−AmG−^−T−C−T−T−G−T−C
−八−G−へ−T−C−C−A−へ一へ−A−C−A−
G−C−C−T−A−C−G−八−T−C−G−C−G
−C−G−C−C−G−G−C−T−G−G−T−T−
G−C−T−T−T−T−G−G−八−A−A−C−G
−T−A−A−T−C−へ−G−A−A−G−C−T−
T−へ−A−G−G−T、G−C−C−G−G−G−T
−T−A−G−A−C−C−T−T−G−G−C−A−
C−G−G−C−T−G−T−T−G−C−T−G−A
−T−A−A−G−C−G−G−C−A−G−C−A−
A−C−A−C−T−G−A−G−T−G−Δ−G−G
−G−C−T−G−八−G−T−G−C−A−CへG−
C−C−G−AmC−G−T−G−T−A−A−G−G
−C−G−A−G−C−G−A−T−G−C−G−C−
T−C−C−T〜T−C−C−C−T−T−G−AmA
−C−C−C−G−T−G−T−G−C−C−C−C−
C−G−T−T−T−C−T−G−C−G−A−G−G
−G−AmA−G−C−A−A−A−G−C−T−C−
G−C−八−A−AmA−G−A−A−G−C−G−C
−G−C−A−A−C−G−T−T−T−G−G−C−
AmA−A−T−C−G−G−T−T−G−A−T−G
−G−A−G−A−G−C−A−G−C−3’または厳
密な条件下でこれと)%イブリダイズし得る機能的に等
価な配列を含む。前記プロモーターがn1fDプロモー
ターである。前記n1fDプロモーターがヌクレオチド
配列5’ −G−A−T−C−T−A−G−C−G−C
−G−C−G−A−G−A−T−C−G−C−A−G−
T−八−C−A−T−T−へ−C−A−T−C−G−C
−へ−G−G−T−T−G−A−G−C−A−C−C−
T−G−T−A−G−G−T−’r−T−C−^−A−
T−八−A−G−T−A−T−へ−A−A−G−G−Δ
−T−T−G−G−A−A−G−C−C−A−G−A−
C−T=T−G−C−G−G−C−C−T−G −C−
T−T−C−C−G−C−C−T−T−A −C−A−
C−C−G−C−A−G−A−G−C−G−T−T−G
−C−T−G−T−C−G−C−G−C−A−T−A−
八−^−C−T−C−A−^−A−A−A−C−T−C
−C−G−C−C−G−T−G−八−八−T−T−T−
C−A−C−G−C−G−C−G−G−C−C−G−C
−C−T−T−G−T−T−C−C−A−T−T−’T
−C−G−八−C−A−へ−C−G−C−C−A−A−
^−C−C−A−A−G−AmG−T−C−C−C−T
−C−G−C−A−A−八−G−G−C−G−八−G−
T−G−T−C−G−G−A−T−T−C−G−C−へ
−A−C−へ−へ−C−へ−G−C−C−C−G−T−
C−A−C−C−G−T−八−C−A−A−G−T−C
−G−C−G−C−T−へ一へ−G−Δ−A−へ−C−
T−G−T−T−G−T−T−G−T−T−C−T−八
−G−T−T−T−T−へ−G−T−G−C−T−C−
へ−T−G−A−G−AmC−C−C−T−G−G−C
−A−T−G−C−C−G−G−T−T−G−C−A−
A−A−G−T−C−T−T−G−G−A−T−C−A
−A−G−A−八−G−C−C−G−(ニーC−C−T
−C−C−C−A−A−G−A−G−C−T−A−A−
C−C−T−T−T−T−A−A−A−G−G−A−C
−A−C−C−A−G−3’または厳密な条件下でこれ
とハイブリダイズし得る機能的に等価な配列を含む。さ
らに前記プロモーターの制御下で発現し得るような方向
と位置に挿入された構造遺伝子を含む。前記構造遺伝子
がリゾビウム(Rhizobtum)種から得られた。
iumj apon icum)細菌のニトロゲナーゼ
複合遺伝子のプロモーター、を有する。前記ベクターが
pRK290またはpstlP204である。前記プロ
モーターが皿■プロモーターである。前記n i f
IIプロモーターがヌクレオチド配列5’ −T−T−
T−G−G−C−T−G−T−T−G−G−C−G−T
−T−C−AmT−G−T−T−T−G−C−G−A−
T−T−G−T−T−T−G−T−T−C−G−T−T
−G−T−C−T−G−AmC−A−G−C−C−G−
G−G−C−AmG−^−T−C−T−T−G−T−C
−八−G−へ−T−C−C−A−へ一へ−A−C−A−
G−C−C−T−A−C−G−八−T−C−G−C−G
−C−G−C−C−G−G−C−T−G−G−T−T−
G−C−T−T−T−T−G−G−八−A−A−C−G
−T−A−A−T−C−へ−G−A−A−G−C−T−
T−へ−A−G−G−T、G−C−C−G−G−G−T
−T−A−G−A−C−C−T−T−G−G−C−A−
C−G−G−C−T−G−T−T−G−C−T−G−A
−T−A−A−G−C−G−G−C−A−G−C−A−
A−C−A−C−T−G−A−G−T−G−Δ−G−G
−G−C−T−G−八−G−T−G−C−A−CへG−
C−C−G−AmC−G−T−G−T−A−A−G−G
−C−G−A−G−C−G−A−T−G−C−G−C−
T−C−C−T〜T−C−C−C−T−T−G−AmA
−C−C−C−G−T−G−T−G−C−C−C−C−
C−G−T−T−T−C−T−G−C−G−A−G−G
−G−AmA−G−C−A−A−A−G−C−T−C−
G−C−八−A−AmA−G−A−A−G−C−G−C
−G−C−A−A−C−G−T−T−T−G−G−C−
AmA−A−T−C−G−G−T−T−G−A−T−G
−G−A−G−A−G−C−A−G−C−3’または厳
密な条件下でこれと)%イブリダイズし得る機能的に等
価な配列を含む。前記プロモーターがn1fDプロモー
ターである。前記n1fDプロモーターがヌクレオチド
配列5’ −G−A−T−C−T−A−G−C−G−C
−G−C−G−A−G−A−T−C−G−C−A−G−
T−八−C−A−T−T−へ−C−A−T−C−G−C
−へ−G−G−T−T−G−A−G−C−A−C−C−
T−G−T−A−G−G−T−’r−T−C−^−A−
T−八−A−G−T−A−T−へ−A−A−G−G−Δ
−T−T−G−G−A−A−G−C−C−A−G−A−
C−T=T−G−C−G−G−C−C−T−G −C−
T−T−C−C−G−C−C−T−T−A −C−A−
C−C−G−C−A−G−A−G−C−G−T−T−G
−C−T−G−T−C−G−C−G−C−A−T−A−
八−^−C−T−C−A−^−A−A−A−C−T−C
−C−G−C−C−G−T−G−八−八−T−T−T−
C−A−C−G−C−G−C−G−G−C−C−G−C
−C−T−T−G−T−T−C−C−A−T−T−’T
−C−G−八−C−A−へ−C−G−C−C−A−A−
^−C−C−A−A−G−AmG−T−C−C−C−T
−C−G−C−A−A−八−G−G−C−G−八−G−
T−G−T−C−G−G−A−T−T−C−G−C−へ
−A−C−へ−へ−C−へ−G−C−C−C−G−T−
C−A−C−C−G−T−八−C−A−A−G−T−C
−G−C−G−C−T−へ一へ−G−Δ−A−へ−C−
T−G−T−T−G−T−T−G−T−T−C−T−八
−G−T−T−T−T−へ−G−T−G−C−T−C−
へ−T−G−A−G−AmC−C−C−T−G−G−C
−A−T−G−C−C−G−G−T−T−G−C−A−
A−A−G−T−C−T−T−G−G−A−T−C−A
−A−G−A−八−G−C−C−G−(ニーC−C−T
−C−C−C−A−A−G−A−G−C−T−A−A−
C−C−T−T−T−T−A−A−A−G−G−A−C
−A−C−C−A−G−3’または厳密な条件下でこれ
とハイブリダイズし得る機能的に等価な配列を含む。さ
らに前記プロモーターの制御下で発現し得るような方向
と位置に挿入された構造遺伝子を含む。前記構造遺伝子
がリゾビウム(Rhizobtum)種から得られた。
前記構造遺伝子がリゾビウム・トリフオリ (Rlli
zobiumtrifolii)またはりゾビウム・メ
リロティ(Rhizo−bium meliloti)
から得られた。前記構造遺伝子がバラスポニア・−リゾ
ビウム(ParaSponia Rhizo−bium
)から得られた。前記構造遺伝子が外来遺伝子である。
zobiumtrifolii)またはりゾビウム・メ
リロティ(Rhizo−bium meliloti)
から得られた。前記構造遺伝子がバラスポニア・−リゾ
ビウム(ParaSponia Rhizo−bium
)から得られた。前記構造遺伝子が外来遺伝子である。
前記構造遺伝子がヒトのプロラクチン遺伝子またはヒト
のメタロチオネイン遺伝子である。前記構造遺伝子が毒
素遺伝子である。前記毒素遺伝子がバシラス・チューリ
ンギエンシス(Baci−11us thuringi
ensis)の細菌毒素遺伝子である。
のメタロチオネイン遺伝子である。前記構造遺伝子が毒
素遺伝子である。前記毒素遺伝子がバシラス・チューリ
ンギエンシス(Baci−11us thuringi
ensis)の細菌毒素遺伝子である。
本発明のりゾビウム・ジャポニカム(llhizobi
umjaponicum)細菌のニトロゲナーゼ複合遺
伝子のプロモーターの制御下で構造遺伝子を発現させる
方法は、(a)ニトロゲナーゼ複合遺伝子の該プロモー
ターの単離、 (b)ニトロゲナーゼ複合遺伝子の該プ
ロモーターの1組換DNAプラスミドを生ずる広宿主域
プラスミドへのクローニング、(C)外来構造遺伝子を
有するDNA断片の単離、および該DNA断片の該組換
DNAプラスミドへの、共同取込み組換プラスミドを生
ずるニトロゲナーゼ複合読み取り鎖の該プロモーターの
3゛側の位置での挿入。
umjaponicum)細菌のニトロゲナーゼ複合遺
伝子のプロモーターの制御下で構造遺伝子を発現させる
方法は、(a)ニトロゲナーゼ複合遺伝子の該プロモー
ターの単離、 (b)ニトロゲナーゼ複合遺伝子の該プ
ロモーターの1組換DNAプラスミドを生ずる広宿主域
プラスミドへのクローニング、(C)外来構造遺伝子を
有するDNA断片の単離、および該DNA断片の該組換
DNAプラスミドへの、共同取込み組換プラスミドを生
ずるニトロゲナーゼ複合読み取り鎖の該プロモーターの
3゛側の位置での挿入。
そしてそこで該DNA断片が該ニトロゲナーゼ複合遺伝
子の該プロモーターに関し、その制御下で発現するよう
な方向にある。(d)該共同取込み組換プラスミドの、
植物細胞と共生関係を有するリゾビウム・ジャポニカム
(Rhizobium japonicum)株への形
質転換、および(e)該外来構造遺伝子によりコードさ
れるmRNAまたはタンパク質の発現が生ずる該リゾビ
ウム・ジャポニカム(Rhizobiumjaponi
cum)株による大豆植物の感染、の段階を含む。前記
プロモーターがn i f Hプロモーターである。前
記n i f I+プロモーターがヌクレオチド配列5
“−T−T−T−G−G−C−T−G−T−T−G−G
−CニーG−T−T−C−AmT−G−T−T−T−G
−C−G−AmT−T−G−T−T−T−G−T−T−
C−G−T−T−G−T−C−T−G−八−C−八−G
−C−C−G−G−G−C−AmG−A−T−C−T−
T−G−T−C−へ−G−A−T−C−C−へ−A−A
−A−C−A−G−C−C−T−A−C−G−A−T−
C−G−C−G−C−G−C−C−G−G−C−T−G
−G−T−T−G−C−T−T−T−T−G−G−A−
A−A−C−G−T−A−A−T−C−A−G−A−A
−G−C−T−T−A−A−G−G−T−G−C−C−
G−G−G−T−T−へ−G−へ−C−C−T−T−G
−G−C−Δ−C−G−G−C−T−G−T−T−G−
C−T−G−A−T−へ−A−G−C−G−G−C−へ
−G−C−八−八−C−八−C−T−G−A−G−T−
G−Δ−G−G−G−C’−T−G−八−G−T−G−
C−AmC−G−C−C−G−A−C−G−T−G−T
−へ−A−G−G−C−G−へ−G−C−G−A−T−
G−C−G−C−T−C−C−T−T−C−C−C−T
−T−G−へ一へ−C−C−C−G−T−G−T−G−
C−C−C−C−C−G−T−T−T−C−T−G−C
−G−A−G−G−G−A−八−G−C−Δ−八へ八へ
G−C−T−C−G−C−へ一Δ−Δ−へ−G−へ−A
−G−C−G−C−G−C−八−八−C−G−T−T−
T−G−G−C−A−^−^−T−C−G−G−T−T
−G−八−T−G−G−Δ−G−A−G−C−八−G−
C−3’まへは厳密な条件下でそれとハイブリダイズし
得る機能的に等価な配列を含む。前記プロモーターが泄
Dプロモーターである。前記n1fDプロモーターがヌ
クレオチド配列5゛−G−へ−T−C−T−へ−G−C
−G−C−G−C−G−A−G−A−T−C−G−C−
A−G−T−A−C−A−T−T−AmC−A−T−C
−G−C−A−G−G−T−T−G−八−G−C−A−
C−C−T−G−T−A−G−G−T−T−T−C−へ
一へ−T−A−へ−G−T−A−T−G−へ一へ−G−
G−^−T−T−G−G−八−A−G−C−C−A−G
−^−C−T−T−G−C−G−G−C−C−T−G−
C−T−T−C−C−G−C−C−T−T−A−C−A
mC−C−G−C−A−G−A−G−C−G−T−T−
G−C−T−G−T−C−G−C−G−C−A−T−A
−A−A−C−T−C−へ一へ−へ−へ一へ−C−T−
C−C−G−C−C−G−T−G−A−八−T−T−T
−C−八−C−G−C−G−C−G−G−C−C−G−
’C−C−T−T−G−T−T−C−C−A−T−T−
T−C−G−Δ−C−^−C−C−G−C−C−A−へ
一へ−C−C−へ−A−G−へ−G−’T−C−C−C
−T−C−G−C−A−A−A−G−G−C−G−A−
G−T−G−T−C−G−G−A−T−T−(ニーG−
C−A−A−C−A−A−C−A−G−C−C−C−G
−T−C−へ−C−C−G−T−A−C−A−へ−G−
T−C−G−C−G−C−T−A−へ−G−A−へ−へ
−C−T−G−T−T−G−T−T−G−T−T−C−
T−AmG−T−T−↑−T−A−G−T−G−C−T
−C−A−T−G−A−G−^−C−C−C−T−G−
G−C−A−T−G−C−C−G−G−T−T−G−C
−八−A−八−G−T−C−T−T−G−G−A−T−
C−へ一へ−G−^−A−G−C−C−G−C−C−C
−T−C−C−C−へ−A−G−へ−G−C−T−A−
へ−C−C−T−T−T−T−A−へ一へ−G−G−A
−C−へ−C−C−八−G−3゛または厳密な条イ牛下
でそれとハイブリダイズし得る機能的に等価な配列を含
む。前記広宿主域プラスミドがpl?に290またはp
sUP204である。
子の該プロモーターに関し、その制御下で発現するよう
な方向にある。(d)該共同取込み組換プラスミドの、
植物細胞と共生関係を有するリゾビウム・ジャポニカム
(Rhizobium japonicum)株への形
質転換、および(e)該外来構造遺伝子によりコードさ
れるmRNAまたはタンパク質の発現が生ずる該リゾビ
ウム・ジャポニカム(Rhizobiumjaponi
cum)株による大豆植物の感染、の段階を含む。前記
プロモーターがn i f Hプロモーターである。前
記n i f I+プロモーターがヌクレオチド配列5
“−T−T−T−G−G−C−T−G−T−T−G−G
−CニーG−T−T−C−AmT−G−T−T−T−G
−C−G−AmT−T−G−T−T−T−G−T−T−
C−G−T−T−G−T−C−T−G−八−C−八−G
−C−C−G−G−G−C−AmG−A−T−C−T−
T−G−T−C−へ−G−A−T−C−C−へ−A−A
−A−C−A−G−C−C−T−A−C−G−A−T−
C−G−C−G−C−G−C−C−G−G−C−T−G
−G−T−T−G−C−T−T−T−T−G−G−A−
A−A−C−G−T−A−A−T−C−A−G−A−A
−G−C−T−T−A−A−G−G−T−G−C−C−
G−G−G−T−T−へ−G−へ−C−C−T−T−G
−G−C−Δ−C−G−G−C−T−G−T−T−G−
C−T−G−A−T−へ−A−G−C−G−G−C−へ
−G−C−八−八−C−八−C−T−G−A−G−T−
G−Δ−G−G−G−C’−T−G−八−G−T−G−
C−AmC−G−C−C−G−A−C−G−T−G−T
−へ−A−G−G−C−G−へ−G−C−G−A−T−
G−C−G−C−T−C−C−T−T−C−C−C−T
−T−G−へ一へ−C−C−C−G−T−G−T−G−
C−C−C−C−C−G−T−T−T−C−T−G−C
−G−A−G−G−G−A−八−G−C−Δ−八へ八へ
G−C−T−C−G−C−へ一Δ−Δ−へ−G−へ−A
−G−C−G−C−G−C−八−八−C−G−T−T−
T−G−G−C−A−^−^−T−C−G−G−T−T
−G−八−T−G−G−Δ−G−A−G−C−八−G−
C−3’まへは厳密な条件下でそれとハイブリダイズし
得る機能的に等価な配列を含む。前記プロモーターが泄
Dプロモーターである。前記n1fDプロモーターがヌ
クレオチド配列5゛−G−へ−T−C−T−へ−G−C
−G−C−G−C−G−A−G−A−T−C−G−C−
A−G−T−A−C−A−T−T−AmC−A−T−C
−G−C−A−G−G−T−T−G−八−G−C−A−
C−C−T−G−T−A−G−G−T−T−T−C−へ
一へ−T−A−へ−G−T−A−T−G−へ一へ−G−
G−^−T−T−G−G−八−A−G−C−C−A−G
−^−C−T−T−G−C−G−G−C−C−T−G−
C−T−T−C−C−G−C−C−T−T−A−C−A
mC−C−G−C−A−G−A−G−C−G−T−T−
G−C−T−G−T−C−G−C−G−C−A−T−A
−A−A−C−T−C−へ一へ−へ−へ一へ−C−T−
C−C−G−C−C−G−T−G−A−八−T−T−T
−C−八−C−G−C−G−C−G−G−C−C−G−
’C−C−T−T−G−T−T−C−C−A−T−T−
T−C−G−Δ−C−^−C−C−G−C−C−A−へ
一へ−C−C−へ−A−G−へ−G−’T−C−C−C
−T−C−G−C−A−A−A−G−G−C−G−A−
G−T−G−T−C−G−G−A−T−T−(ニーG−
C−A−A−C−A−A−C−A−G−C−C−C−G
−T−C−へ−C−C−G−T−A−C−A−へ−G−
T−C−G−C−G−C−T−A−へ−G−A−へ−へ
−C−T−G−T−T−G−T−T−G−T−T−C−
T−AmG−T−T−↑−T−A−G−T−G−C−T
−C−A−T−G−A−G−^−C−C−C−T−G−
G−C−A−T−G−C−C−G−G−T−T−G−C
−八−A−八−G−T−C−T−T−G−G−A−T−
C−へ一へ−G−^−A−G−C−C−G−C−C−C
−T−C−C−C−へ−A−G−へ−G−C−T−A−
へ−C−C−T−T−T−T−A−へ一へ−G−G−A
−C−へ−C−C−八−G−3゛または厳密な条イ牛下
でそれとハイブリダイズし得る機能的に等価な配列を含
む。前記広宿主域プラスミドがpl?に290またはp
sUP204である。
本発明のDNA配列をエセリシア・コリー(Esche
ri−chia coli )以外のりゾビウム・ジャ
ポニカム(Rhizobium japonicum)
の染色体へ組み込ませる方法は、(a)組み込まれるべ
き配列を含むDNA断片の単離、(b)組換DNAプラ
スミドを生ずるための。
ri−chia coli )以外のりゾビウム・ジャ
ポニカム(Rhizobium japonicum)
の染色体へ組み込ませる方法は、(a)組み込まれるべ
き配列を含むDNA断片の単離、(b)組換DNAプラ
スミドを生ずるための。
自殺ベクター上にあるトランスボゾン、該1−ランスポ
ゾンはそのトランスポゾン内に含まれる′Jγ択可能な
耐性遺伝子を有する。への該DNA断片の挿入、(C)
該組換DNAプラスミドの、該自殺ベクターを8亥すソ
゛ビウム・ジャポニカム(Rhizobiumjapo
nicum)へ移動させ得る。第1の細菌株への形質転
換、(d)該組換DNAプラスミドの、該第1細菌株か
ら該リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiumj
apon icum)の該染色体への、細菌の接合に続
く組み換えによる転移、(e)該リゾビウム・ジャポニ
カム(1?hizobium japonicum)の
、該選択可能な師1性遺伝子の存在を要求する条件下で
の増殖、および(f1段階(e)で得られた該リゾビウ
ム・ジャポニカム(Rhizobium japoni
cum)のコロニーの選択、そこで組み込まれるべき配
列を含む該DNA断片が該リゾビウム・ジャポニカム(
Rhizobium japonicum)の該染色体
と組み換えをしている2段階を包含する。前記DNA断
片がアグロバクテリウム(Agro−bacteriu
m)属の種のゲノムに由来する。前記DNA断片がリゾ
ビウム(Rhizobium)属の種のゲノムに由来す
る。リゾビウム(Rhizobium)属の前記種がリ
ゾビウム・トリフオリ (Rhizobium tri
folii)である。リゾビウム(Rhizobium
)属の前記種がバラスポニア・リゾビウム(Paras
ponia Rhizobium)である。前記自殺ベ
クターがpsUPlollである。
ゾンはそのトランスポゾン内に含まれる′Jγ択可能な
耐性遺伝子を有する。への該DNA断片の挿入、(C)
該組換DNAプラスミドの、該自殺ベクターを8亥すソ
゛ビウム・ジャポニカム(Rhizobiumjapo
nicum)へ移動させ得る。第1の細菌株への形質転
換、(d)該組換DNAプラスミドの、該第1細菌株か
ら該リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiumj
apon icum)の該染色体への、細菌の接合に続
く組み換えによる転移、(e)該リゾビウム・ジャポニ
カム(1?hizobium japonicum)の
、該選択可能な師1性遺伝子の存在を要求する条件下で
の増殖、および(f1段階(e)で得られた該リゾビウ
ム・ジャポニカム(Rhizobium japoni
cum)のコロニーの選択、そこで組み込まれるべき配
列を含む該DNA断片が該リゾビウム・ジャポニカム(
Rhizobium japonicum)の該染色体
と組み換えをしている2段階を包含する。前記DNA断
片がアグロバクテリウム(Agro−bacteriu
m)属の種のゲノムに由来する。前記DNA断片がリゾ
ビウム(Rhizobium)属の種のゲノムに由来す
る。リゾビウム(Rhizobium)属の前記種がリ
ゾビウム・トリフオリ (Rhizobium tri
folii)である。リゾビウム(Rhizobium
)属の前記種がバラスポニア・リゾビウム(Paras
ponia Rhizobium)である。前記自殺ベ
クターがpsUPlollである。
前記選択可能な耐性遺伝子を有する該トランスボゾンが
カナマイシン耐性遺伝子を有するトランスボゾンTn5
である。前記自殺ベクターを移動させ得る細菌の前記株
がエセリシア・コリー(Escheri−chia c
oli) 5Ml0である。
カナマイシン耐性遺伝子を有するトランスボゾンTn5
である。前記自殺ベクターを移動させ得る細菌の前記株
がエセリシア・コリー(Escheri−chia c
oli) 5Ml0である。
以下に本発明を詳細に述べる。
リゾビアまたは゛ブラディリゾビア゛’ Uorda
n。
n。
D、 C,(1982) Int、 J、 5yst、
Bacteriol、 32 :136−139)の
成育の遅いグループの中の一員であるリゾビウム・ジャ
ポニカム(Rhizobium japonicum)
は。
Bacteriol、 32 :136−139)の
成育の遅いグループの中の一員であるリゾビウム・ジャ
ポニカム(Rhizobium japonicum)
は。
重要な大豆共生菌であり、それゆえ農業において非常に
重要である。その」豆遺伝子の構造的構成は、ニトロゲ
ナーゼ複合体ポリペプチドをコードするn1fl(およ
びn1fDK遺伝子が連関していないことが示されてい
る(Kaluza、 K、 et al、 (1983
)J、 Bacteriol、 155 : 915−
918) ”成育の速い”リゾビアとは異なる。fix
複合体はここでは、リゾビウム・ジャポニカム(Rhi
zobium japonicum)/宿主植物の共生
における窒素固定に関係のあるすべての遺伝子を含むも
のと定義される。これらの遺伝子の発現は同等に調節さ
れているかどうか。
重要である。その」豆遺伝子の構造的構成は、ニトロゲ
ナーゼ複合体ポリペプチドをコードするn1fl(およ
びn1fDK遺伝子が連関していないことが示されてい
る(Kaluza、 K、 et al、 (1983
)J、 Bacteriol、 155 : 915−
918) ”成育の速い”リゾビアとは異なる。fix
複合体はここでは、リゾビウム・ジャポニカム(Rhi
zobium japonicum)/宿主植物の共生
における窒素固定に関係のあるすべての遺伝子を含むも
のと定義される。これらの遺伝子の発現は同等に調節さ
れているかどうか。
およびDNA制御領域において相同性が存在するかどう
か、に関して興味深い問題が提起された。
か、に関して興味深い問題が提起された。
以前から3つのニトロゲナーゼ構造遺伝子がクローン化
されていた(Ilennecke、 H,(1981)
Nature(London) 291 : 354
−355)。ジニトロゲナーゼのポリペプチドはエセリ
シア・コリー(Escherichiacoli)中で
発現された( Fuhrmann、 M、 and +
1゜Hennecke (1982) Mo1. Ge
n、 Genet、 187 : 419−425)
; n1fD遺伝子産物(α−サブユニット)は58
.000の分子量を持つことが示され、一方n1fK遺
伝子産物(β−サブユニット)は55,000の分子量
である。n1fDおよびn1fK遺伝子は1つの転写単
位上に構成されており、 n1fDKの方向に転写さ
れる。興味深いことに、他の」■遺伝子は−nifDK
の両側に隣接しては発見されなかった。DNAの由来は
、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiumja
ponicum) n1fDKを含む組換プラスミドp
RJ676およびそのサブクローン(Hennecke
、 H,(1981)上記)、およびn1fHを含む組
換プラスミドpRJ7000およびそのサブクローンで
あった。これら種々のりゾビウム・ジャポニカム(Rh
izobium japo−nicum)組換プラスミ
ドにコードされたポリペプチドは、エセリシア・コリー
(Escherichia coli)のミニセル中で
合成されたポリペプチド産物を用いて分析された。DN
A配列分析を、化学的方法(Mayam+ A、 M、
and IA、 G11bert (1980) M
ethodsEnzymol、65: 449−561
)およびチェインターミネーション法(Sanger+
F、 et al、 (1977) Proc、
Nat。
されていた(Ilennecke、 H,(1981)
Nature(London) 291 : 354
−355)。ジニトロゲナーゼのポリペプチドはエセリ
シア・コリー(Escherichiacoli)中で
発現された( Fuhrmann、 M、 and +
1゜Hennecke (1982) Mo1. Ge
n、 Genet、 187 : 419−425)
; n1fD遺伝子産物(α−サブユニット)は58
.000の分子量を持つことが示され、一方n1fK遺
伝子産物(β−サブユニット)は55,000の分子量
である。n1fDおよびn1fK遺伝子は1つの転写単
位上に構成されており、 n1fDKの方向に転写さ
れる。興味深いことに、他の」■遺伝子は−nifDK
の両側に隣接しては発見されなかった。DNAの由来は
、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiumja
ponicum) n1fDKを含む組換プラスミドp
RJ676およびそのサブクローン(Hennecke
、 H,(1981)上記)、およびn1fHを含む組
換プラスミドpRJ7000およびそのサブクローンで
あった。これら種々のりゾビウム・ジャポニカム(Rh
izobium japo−nicum)組換プラスミ
ドにコードされたポリペプチドは、エセリシア・コリー
(Escherichia coli)のミニセル中で
合成されたポリペプチド産物を用いて分析された。DN
A配列分析を、化学的方法(Mayam+ A、 M、
and IA、 G11bert (1980) M
ethodsEnzymol、65: 449−561
)およびチェインターミネーション法(Sanger+
F、 et al、 (1977) Proc、
Nat。
Acad、 Sci、 U、S、A、 74 : 54
63−5467)の両方を用いて行った。図中に示した
すべての制限エンドヌクレアーゼ部位は重複配列決定法
により確認した。 ゛その遺伝子および隣接す
る配列の両D N A g(の配列を決定した。転写開
始点およびmRNA転写物の範囲は、ヌクレアーゼS1
マツピング(Berk。
63−5467)の両方を用いて行った。図中に示した
すべての制限エンドヌクレアーゼ部位は重複配列決定法
により確認した。 ゛その遺伝子および隣接す
る配列の両D N A g(の配列を決定した。転写開
始点およびmRNA転写物の範囲は、ヌクレアーゼS1
マツピング(Berk。
A、 J、 and P、 八、 5har
p (1977) Ce1l に2 : 7
21−732)により決定した。
p (1977) Ce1l に2 : 7
21−732)により決定した。
リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium ja
poni−cum)のn1fD遺伝子(第1図)のAT
G翻訳開始部位の7塩基対上流に完全なりボゾーム結合
部位を特徴づける5’ −AGGA−3’ の配列(S
hine、 J、 andL、 Dalgarno (
1974) Proc、 Nat、Δcad、 Sci
、 U、S、A。
poni−cum)のn1fD遺伝子(第1図)のAT
G翻訳開始部位の7塩基対上流に完全なりボゾーム結合
部位を特徴づける5’ −AGGA−3’ の配列(S
hine、 J、 andL、 Dalgarno (
1974) Proc、 Nat、Δcad、 Sci
、 U、S、A。
71 : 1342−1346 HStormo、 G
、 D、、 et al、 (1982)Nuclei
c Ac1ds Res、 10 : 2871−29
96)が存在する。
、 D、、 et al、 (1982)Nuclei
c Ac1ds Res、 10 : 2871−29
96)が存在する。
類似の配列である5’ −TGGA−3’ (第2図)
は匪HオペロンのATC翻訳開始部位より8塩基対上流
に現れる。n1fD遺伝子の場合、ATGコドンを含む
下流に515アミノ酸に翻訳されうる1545塩基のオ
ープンリーディングフレームが存在する。
は匪HオペロンのATC翻訳開始部位より8塩基対上流
に現れる。n1fD遺伝子の場合、ATGコドンを含む
下流に515アミノ酸に翻訳されうる1545塩基のオ
ープンリーディングフレームが存在する。
このオープンリーディングフレームは、3つの連続した
終止コドン(TGA、TAG、TGA)により終結し、
最後の終止コドンの3゛側にすく隣接して、 n1f
K遺伝子のATG開始部位の前に8塩基対の間隔をおい
てもう1つのリポソーム結合部、位(5′−へGGへ−
3”)が存在する(第1図)。泄に遺伝子の最初の13
2塩基のみが配列決定されているが、これらは44アミ
ノ酸に翻訳されうる。これらのアミノ酸のうち23個が
アナベナ(Anabaena)のn1fK遺伝子産物の
アミノ末端部位中の対応するアミノ酸の位置に直接に相
同性がある(Mazur+B、 J、and C,
F、 Chui (1982) Proc、
Nat、 八cad。
終止コドン(TGA、TAG、TGA)により終結し、
最後の終止コドンの3゛側にすく隣接して、 n1f
K遺伝子のATG開始部位の前に8塩基対の間隔をおい
てもう1つのリポソーム結合部、位(5′−へGGへ−
3”)が存在する(第1図)。泄に遺伝子の最初の13
2塩基のみが配列決定されているが、これらは44アミ
ノ酸に翻訳されうる。これらのアミノ酸のうち23個が
アナベナ(Anabaena)のn1fK遺伝子産物の
アミノ末端部位中の対応するアミノ酸の位置に直接に相
同性がある(Mazur+B、 J、and C,
F、 Chui (1982) Proc、
Nat、 八cad。
Sci、 U、S、八、 79 : 6782
−6786)。
−6786)。
リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium ja
poni−cum)のn1fD遺伝子のトリプレットコ
ドンの使用頻度から(第3図)、2つのコドンが使われ
ていないことが分かる。他のコドンの多くば、不均斉に
もしくは強度に不均斉に使われている(例えば。
poni−cum)のn1fD遺伝子のトリプレットコ
ドンの使用頻度から(第3図)、2つのコドンが使われ
ていないことが分かる。他のコドンの多くば、不均斉に
もしくは強度に不均斉に使われている(例えば。
フェニルアラニン、アスパラギン、グリシンおよびシス
ティンのコドン)。タレプシエラ・ニューモニエ(Kl
ebsiella pneumoniae)のn1fD
D N Aの配列決定された622塩基対の範囲での
コドン使用は(Scott、 K、 F、 et al
、 (1981) J、 Mo1.八pp]。
ティンのコドン)。タレプシエラ・ニューモニエ(Kl
ebsiella pneumoniae)のn1fD
D N Aの配列決定された622塩基対の範囲での
コドン使用は(Scott、 K、 F、 et al
、 (1981) J、 Mo1.八pp]。
Genet、 1 : 71−81>実質上界なってい
る。リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium
japonicum)の場合、あるアミノ酸に対して2
つ以上のトリプレットが可能であるとき“ゆらぎ”部位
がGおよび/またはCであるものを使用する傾向がある
。これは成育の遅いリゾビラ1、(Rhizobium
)種のC+C含有量に影響するだろう。
る。リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium
japonicum)の場合、あるアミノ酸に対して2
つ以上のトリプレットが可能であるとき“ゆらぎ”部位
がGおよび/またはCであるものを使用する傾向がある
。これは成育の遅いリゾビラ1、(Rhizobium
)種のC+C含有量に影響するだろう。
以前の結果から、 ntfDの5′側に隣接した部位
にはそれ以上」■遺伝子は共通のオペロンの一部として
は存在しないことが示唆されている(Kaluza。
にはそれ以上」■遺伝子は共通のオペロンの一部として
は存在しないことが示唆されている(Kaluza。
K、 et al、 (1983) J、 Bacte
riol、 155 : 915−918)。
riol、 155 : 915−918)。
よってn1fDの5°側に隣接する配列での転写開始部
位の有無が調べられた。遊離に生存するN2固定リゾビ
ウム・ジャポニカム(Rhizobium japon
i−cum)細胞および大豆根粒菌の両方由来のRNA
を32pで標識されたj12qlT断片とハイブリダイ
ズさせ(実施例参照)、そのハイブリッドを31ヌクレ
アーゼで分解した( Berk、八、 J、 and
P、八。
位の有無が調べられた。遊離に生存するN2固定リゾビ
ウム・ジャポニカム(Rhizobium japon
i−cum)細胞および大豆根粒菌の両方由来のRNA
を32pで標識されたj12qlT断片とハイブリダイ
ズさせ(実施例参照)、そのハイブリッドを31ヌクレ
アーゼで分解した( Berk、八、 J、 and
P、八。
5harp (1977) Ce1l 12 : 72
1−732)、転写開始点は。
1−732)、転写開始点は。
同じHpa U断片の“Maxam−Gilbert”
配列決定のバンドのレーンと並列して、 Slから保護
されたDNAの電気泳動を行うことにより決定された:
厘りのATGコドンの46ヌクレオチド(±1ヌクレオ
チド)上流であることが分かった(第4図で矢印で示さ
れる) (Brosius、 J、 et al、
(1982) J。
配列決定のバンドのレーンと並列して、 Slから保護
されたDNAの電気泳動を行うことにより決定された:
厘りのATGコドンの46ヌクレオチド(±1ヌクレオ
チド)上流であることが分かった(第4図で矢印で示さ
れる) (Brosius、 J、 et al、
(1982) J。
Biol、 Chem、 257 : 9205−92
10)。
10)。
転写開始の前の領域は、典型的なエセリシア・コリー(
Escherichia coli) RNAポリメラ
ーゼ結合部位を暗示する配列を1つも含んでいない(R
osenberg、 M、 and D、 Court
(1979) Ann、 Rev。
Escherichia coli) RNAポリメラ
ーゼ結合部位を暗示する配列を1つも含んでいない(R
osenberg、 M、 and D、 Court
(1979) Ann、 Rev。
Genet、 13 : 319−353)。しかし、
n1fDKプロモーター(プロモーターは、ここで
は転写に必要な調節領域のすべてを含む転写開始部位の
上流のヌクレオチド配列と定義される)は、転写開始部
位の26ヌクレオチド前から始まる5”−(:TGG−
8塩基対−TTGCA配列をもつ。・(翻訳開始部位は
、ここではオープンリーディングフレームのアミノ末端
のメチオニン残基に翻訳されるATGコドンと定義され
。
n1fDKプロモーター(プロモーターは、ここで
は転写に必要な調節領域のすべてを含む転写開始部位の
上流のヌクレオチド配列と定義される)は、転写開始部
位の26ヌクレオチド前から始まる5”−(:TGG−
8塩基対−TTGCA配列をもつ。・(翻訳開始部位は
、ここではオープンリーディングフレームのアミノ末端
のメチオニン残基に翻訳されるATGコドンと定義され
。
転写開始部位は、mRNA配列に転写される最初のデオ
キシヌクレオチドと定義される。)このプロモーター配
列は、予期せぬことにクレブシェラ・ニューモニエ(K
lebsjella pneumoniae) nif
遺伝子のプロモーター配列と類似性を示した(Beyn
on。
キシヌクレオチドと定義される。)このプロモーター配
列は、予期せぬことにクレブシェラ・ニューモニエ(K
lebsjella pneumoniae) nif
遺伝子のプロモーター配列と類似性を示した(Beyn
on。
J、 et al、 (1983) Ce1l 3
4 : 665−671)。 (タレプシエラ・ニュー
モニエ(Klebsiella pneumoniae
)は、窒素還元のためには細菌−植物の共生関係をとら
ない種なので、旦遺伝子の活性を調節する因子は全く異
なるようである。) Beynonらは、 TTGCA
という配列は窒素制御により調節される遺伝子の6プリ
ブノーボツクス”に同等であり(Drum−mond、
M、et al、、 (1983) Nature
(London) 301 :302−307 ; B
eynon、 J、 et al、 (1983) C
e1134 :665−671 ; Ow、 D、 H
,et al、 (1983) Proc、 Nat。
4 : 665−671)。 (タレプシエラ・ニュー
モニエ(Klebsiella pneumoniae
)は、窒素還元のためには細菌−植物の共生関係をとら
ない種なので、旦遺伝子の活性を調節する因子は全く異
なるようである。) Beynonらは、 TTGCA
という配列は窒素制御により調節される遺伝子の6プリ
ブノーボツクス”に同等であり(Drum−mond、
M、et al、、 (1983) Nature
(London) 301 :302−307 ; B
eynon、 J、 et al、 (1983) C
e1134 :665−671 ; Ow、 D、 H
,et al、 (1983) Proc、 Nat。
Acad、 Sci、U、S、A、 80 : 252
4−2528)、 CTGGという配列は1皿活性化
タンパク質の認識標的であろう(Beynon、 J、
et al、 (1983)上記)と提案した。しか
し1本発明の適用は、これらの提案の正しさに依存しな
い。
4−2528)、 CTGGという配列は1皿活性化
タンパク質の認識標的であろう(Beynon、 J、
et al、 (1983)上記)と提案した。しか
し1本発明の適用は、これらの提案の正しさに依存しな
い。
リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium ja
poni−cum) n1fH遺伝子の完全なヌクレオ
チド配列を。
poni−cum) n1fH遺伝子の完全なヌクレオ
チド配列を。
n1fH遺伝子産物(ジニトロゲナーゼレダクターゼ)
の推定されるアミノ酸配列と共に示す(第2図)。推定
上の開始コドン(ATC)から終止コドン(TAA)ま
でに、294アミノ酸に対応する882ヌクレオヂドか
ら成るオープンリーディングフレームが存在する。開始
コドンの8ヌクレオチド上流には、 5’−TGGA−
3’というリポソーム結合部位が存在する。
の推定されるアミノ酸配列と共に示す(第2図)。推定
上の開始コドン(ATC)から終止コドン(TAA)ま
でに、294アミノ酸に対応する882ヌクレオヂドか
ら成るオープンリーディングフレームが存在する。開始
コドンの8ヌクレオチド上流には、 5’−TGGA−
3’というリポソーム結合部位が存在する。
リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium ja
poni−clm) n1fH遺伝子の転写開始点は(
上記に)述べられたように決定された。遊離に生存する
N2固定リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiu
m japoni−cum)細胞および大豆根粒菌の両
方由来のRNAを。
poni−clm) n1fH遺伝子の転写開始点は(
上記に)述べられたように決定された。遊離に生存する
N2固定リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiu
m japoni−cum)細胞および大豆根粒菌の両
方由来のRNAを。
」豆11の5′側領域の一201部位からコード領域の
+41ヌクレオチドまでの”p標識H4nd II[/
Hinf■断片とハイブリダイズさせた(第2図参照
)。
+41ヌクレオチドまでの”p標識H4nd II[/
Hinf■断片とハイブリダイズさせた(第2図参照
)。
そのハイブリッドを81ヌクレアーゼで分解し。
保護されたDNAを同しHindlTI/ Hinf
I断片の” Maxam−Gilbert ”配列決定
ハンドのレーンと並列して電気泳動した。転写開始点は
このようにして、 n1fi+コード領域の最初から
153ヌクレオチド上流に位置するGと決定した(第2
図で矢印で示される)。転写開始点のすぐ上流には5’
−TTGG−8塩基対−TTGCT−3’の配列を有
するプロモーター領域(定義は上記参照)が存在する。
I断片の” Maxam−Gilbert ”配列決定
ハンドのレーンと並列して電気泳動した。転写開始点は
このようにして、 n1fi+コード領域の最初から
153ヌクレオチド上流に位置するGと決定した(第2
図で矢印で示される)。転写開始点のすぐ上流には5’
−TTGG−8塩基対−TTGCT−3’の配列を有
するプロモーター領域(定義は上記参照)が存在する。
(注意:上で述べたn1fllKプロモーターの対応す
る配列は5゛−CTGG−8塩基対−TTGG八−3゛
である。)さらに、 −185から−160の位置の領
域は(第2図)、リゾビウム・ジャポニカム(Rhiz
obium japonicum) n1fDKオペロ
ンのプロモーター領域の同一の位置に見られる19ヌク
レオチドを含む(リゾビウム・ジャポニカム(Rhiz
obium japonicum) n1fDKとn1
fHの比較は第4図参照)。
る配列は5゛−CTGG−8塩基対−TTGG八−3゛
である。)さらに、 −185から−160の位置の領
域は(第2図)、リゾビウム・ジャポニカム(Rhiz
obium japonicum) n1fDKオペロ
ンのプロモーター領域の同一の位置に見られる19ヌク
レオチドを含む(リゾビウム・ジャポニカム(Rhiz
obium japonicum) n1fDKとn1
fHの比較は第4図参照)。
リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium ja
poni−cum) n1fHのコード領域の3゛側の
隣接領域についてまた。終止信号の有無が調べられた。
poni−cum) n1fHのコード領域の3゛側の
隣接領域についてまた。終止信号の有無が調べられた。
非常に明確な逆反復構造が最後のn i f IIコド
ンの13ヌクレオチド下流に見出された(第2図)。こ
の領域から転写されるメンセンジャーRNAは特徴的な
ステム・ループ構造をとりうる: このステムは11の連続した塩基対であり、そのうちの
8つがG−C対である。この構造は、 Tinoc。
ンの13ヌクレオチド下流に見出された(第2図)。こ
の領域から転写されるメンセンジャーRNAは特徴的な
ステム・ループ構造をとりうる: このステムは11の連続した塩基対であり、そのうちの
8つがG−C対である。この構造は、 Tinoc。
ら(Tinoco、 J、l Jr、 et al、
Nature New Biology財凱: 4O−
41)に従い計算した Δ旦0(25℃)=26.2k
calの自由エネルギーを持つ非常に安定なものである
。逆反復構造の3゛側にはCの多い領域が存在する。
Nature New Biology財凱: 4O−
41)に従い計算した Δ旦0(25℃)=26.2k
calの自由エネルギーを持つ非常に安定なものである
。逆反復構造の3゛側にはCの多い領域が存在する。
想定されたG/Cの多いターミネータ領域は。
Tの多い領域ではなくCの多い領域がステム・ループ構
造に続いていることを除いては、バエセリシア・コリー
(Escherichia coli) ”型のもの
である(Rosenberg、 M、 and D、
Court (1979) Ann。
造に続いていることを除いては、バエセリシア・コリー
(Escherichia coli) ”型のもの
である(Rosenberg、 M、 and D、
Court (1979) Ann。
Rev、 Genet、 13 : 319−353)
、想定されたリポソーム結合部位もエセリシア・コリ
ー(Escherichiacol i)遺伝子のもの
(Shine、 J、 and L、 Dalgarn
。
、想定されたリポソーム結合部位もエセリシア・コリ
ー(Escherichiacol i)遺伝子のもの
(Shine、 J、 and L、 Dalgarn
。
(1974) Proc、 Nat、 八cad
、 Sci、 U、S、Δ、 71 : 1
342−1346)と類似しており、このことから−1
工II融合m RN Aをエセリシア・コリー(Esc
herichia coli)のミニセル中で(1つま
たは複数の) n1fll特異的ポリペプチドに翻訳
することが何故可能であったかが説明される(実施例8
および第5図参照)。
、 Sci、 U、S、Δ、 71 : 1
342−1346)と類似しており、このことから−1
工II融合m RN Aをエセリシア・コリー(Esc
herichia coli)のミニセル中で(1つま
たは複数の) n1fll特異的ポリペプチドに翻訳
することが何故可能であったかが説明される(実施例8
および第5図参照)。
これらの翻訳に関する実験から、同じD N A v4
域にコードされる分子量33,000および32,00
0のタンパク質2量体が明らかになった。現在、これが
タンパク質のプロセッシングまたは2つの重複するオー
プンリーディングフレームの存在に影響するかどうかは
知られていない。確かにn i f Hコード領域の上
流12塩基対の所に同じフレームで、2番目の可能なA
TG開始コドンが存在するが、この2番目のコドンの前
には特徴的なShine−Dalgarn。
域にコードされる分子量33,000および32,00
0のタンパク質2量体が明らかになった。現在、これが
タンパク質のプロセッシングまたは2つの重複するオー
プンリーディングフレームの存在に影響するかどうかは
知られていない。確かにn i f Hコード領域の上
流12塩基対の所に同じフレームで、2番目の可能なA
TG開始コドンが存在するが、この2番目のコドンの前
には特徴的なShine−Dalgarn。
配列が存在しない(第2図)。クレブシェラ・ニューモ
ニエ(Klebsiella pneumoniae)
のジニトロゲナーゼレダクターゼの類似した2量体がイ
ンビf (in vivo)において見出され(Rob
erts、 G、 P。
ニエ(Klebsiella pneumoniae)
のジニトロゲナーゼレダクターゼの類似した2量体がイ
ンビf (in vivo)において見出され(Rob
erts、 G、 P。
et al、 (1978) J、Bacteriol
、 136 : 267−279) 。
、 136 : 267−279) 。
リゾビウム・メリロティ(Rhizobium mel
iloti)nifH遺伝子の発現によってもまた。類
似分子量の2つのタンパク質が合成される(Weber
、 G、 andA、 Puhler (19B2)
Plant、 Mo1ec、 Biol、1 : 30
5−320)ことに注目することは興味深い。
iloti)nifH遺伝子の発現によってもまた。類
似分子量の2つのタンパク質が合成される(Weber
、 G、 andA、 Puhler (19B2)
Plant、 Mo1ec、 Biol、1 : 30
5−320)ことに注目することは興味深い。
リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium ja
poni−cum)のn i f I+プロモーター配
列はn1fDKプロモーター領域と数塩基対が異なるだ
けである。両プロモーター配列はクレブシェラ・二j、
−モニエ(Kle−bsiella pneumoni
ae) nifプロモーターと類似の特徴を持ち、転
写開始点の上@9番と25番のヌクレオチドの間に という特徴的な領域を含む(Beynon、 tr、
et al。
poni−cum)のn i f I+プロモーター配
列はn1fDKプロモーター領域と数塩基対が異なるだ
けである。両プロモーター配列はクレブシェラ・二j、
−モニエ(Kle−bsiella pneumoni
ae) nifプロモーターと類似の特徴を持ち、転
写開始点の上@9番と25番のヌクレオチドの間に という特徴的な領域を含む(Beynon、 tr、
et al。
(1983) Ce1l 34 : 665−671)
、しかし、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizob
ium japonicum)の皿Hおよびn1fDK
プロモーターに関して、これらの配列のすぐ前方に(す
なわち上流に)9個の付加的な同一ヌクレオチド(5’
−GTGC−5塩基対−八GACC−3”)が存在する
。これらの配列(すなわち5’−GTGC−5塩基対−
AGACC−3’)は、プロモーターが正常に働くこと
に関与しているだろう。これらの要素のうちのいくつか
は」旦遺伝子調節に関与しているらしく、非共生菌クレ
ブシェラ・ニューモニエ(Klebsiella pn
eumoniae)における」旦遺伝子制御回路の遺物
であろうものが、農業的に重要な共生菌であるリゾビウ
ム・ジャポニカム(Rhizobiumjal)Oni
cum)中で作用しているらしいことが観察されたこと
は驚くべきことである。DNA配列を比較した場合、ク
レブシェラ・ニューモニエ(Kle−bsiella
pneumoniae)のプロモーター要素との類似性
(Sundaresan+ V、 et al、 (1
983) Nature (London) 301
: 728−732 ; Beynon、 J、 et
al、 (1983) Ce1l 34 : 665
−671 ; Oll、 D、 H,et al、 (
1983) Proc、 Nat、 八cad、
Sci、 U、S、A、 80 : 25
24−2528)に加え、リゾビウム・ジャポニカム(
Rhizo−bium japonicum)のn1f
Hおよびn1fDKプロモーターはりゾビウム種バラス
ポニア(Rhizobium sp。
、しかし、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizob
ium japonicum)の皿Hおよびn1fDK
プロモーターに関して、これらの配列のすぐ前方に(す
なわち上流に)9個の付加的な同一ヌクレオチド(5’
−GTGC−5塩基対−八GACC−3”)が存在する
。これらの配列(すなわち5’−GTGC−5塩基対−
AGACC−3’)は、プロモーターが正常に働くこと
に関与しているだろう。これらの要素のうちのいくつか
は」旦遺伝子調節に関与しているらしく、非共生菌クレ
ブシェラ・ニューモニエ(Klebsiella pn
eumoniae)における」旦遺伝子制御回路の遺物
であろうものが、農業的に重要な共生菌であるリゾビウ
ム・ジャポニカム(Rhizobiumjal)Oni
cum)中で作用しているらしいことが観察されたこと
は驚くべきことである。DNA配列を比較した場合、ク
レブシェラ・ニューモニエ(Kle−bsiella
pneumoniae)のプロモーター要素との類似性
(Sundaresan+ V、 et al、 (1
983) Nature (London) 301
: 728−732 ; Beynon、 J、 et
al、 (1983) Ce1l 34 : 665
−671 ; Oll、 D、 H,et al、 (
1983) Proc、 Nat、 八cad、
Sci、 U、S、A、 80 : 25
24−2528)に加え、リゾビウム・ジャポニカム(
Rhizo−bium japonicum)のn1f
Hおよびn1fDKプロモーターはりゾビウム種バラス
ポニア(Rhizobium sp。
Parasponia)の1ifHプロモーター(Sc
ott、 K。
ott、 K。
F、 et al、 (1983) DNA 2 :
141−148)およびリゾビウム・メリロティ(Rh
izobium meliloti)の」UHプロモー
ター(PL) (Sundaresan、 V、 e
t al。
141−148)およびリゾビウム・メリロティ(Rh
izobium meliloti)の」UHプロモー
ター(PL) (Sundaresan、 V、 e
t al。
(1983) Nature (London) 3
01 : 728−732 ; Better。
01 : 728−732 ; Better。
M、 et al、 (1983) Ce1l 35
: 479−485)といくらかの相同性を有する。
: 479−485)といくらかの相同性を有する。
しかし、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiu
m japonicum)が感染可能な種は、リゾビウ
ム種バラスボニア(Rhizobium sp。
m japonicum)が感染可能な種は、リゾビウ
ム種バラスボニア(Rhizobium sp。
Parasponia)もしくはりゾビウム・メリロテ
イ (Rhizobium meliloti)が感染
可能な種とは全く異なることから、非相同性領域が非常
に重要でありうろことに注意しなければならない。よっ
て、細菌−植物共生関係における宿主種として大豆を使
用することが望まれる場合、後者の2つの種を亘遺伝子
プロモーター制御下でのどんな遺伝子発現にも用いるこ
とはできない。
イ (Rhizobium meliloti)が感染
可能な種とは全く異なることから、非相同性領域が非常
に重要でありうろことに注意しなければならない。よっ
て、細菌−植物共生関係における宿主種として大豆を使
用することが望まれる場合、後者の2つの種を亘遺伝子
プロモーター制御下でのどんな遺伝子発現にも用いるこ
とはできない。
n1fHオペロンおよびn1fDKオペロンのプロモー
ター領域は単離、特徴づけ、およびクローン化がされて
いるので、 n1fllおよびn1fDKニトロゲナ
ーゼ遺伝子、すなわち通常はmRNAまたはRNAに転
写されるDNA配列を欠落させ、外来起源生物から単離
された(1つまたは複数の)構造遺伝子(ここでは“外
来遺伝子”)と置き換えることができる。このようにし
てn1fHおよび泄DKプロモーターの制御下に置かれ
た外来遺伝子を次にプラスミドベクターに挿入し、接合
によりリゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiur
n japonicum)に入れることができる。ここ
ではベクターとは。
ター領域は単離、特徴づけ、およびクローン化がされて
いるので、 n1fllおよびn1fDKニトロゲナ
ーゼ遺伝子、すなわち通常はmRNAまたはRNAに転
写されるDNA配列を欠落させ、外来起源生物から単離
された(1つまたは複数の)構造遺伝子(ここでは“外
来遺伝子”)と置き換えることができる。このようにし
てn1fHおよび泄DKプロモーターの制御下に置かれ
た外来遺伝子を次にプラスミドベクターに挿入し、接合
によりリゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiur
n japonicum)に入れることができる。ここ
ではベクターとは。
1つ以上の外来DNA断片を持ち複製する。単一の複製
起点を保持するプラスミドと定義される。
起点を保持するプラスミドと定義される。
外来遺伝子は、こうして1厘遺伝子プロモータB
−が活性化される条件下で、この新しいりゾビウム・ジ
ャポニカム(Rhizobium japonicum
)中において発現される。あるいは、外来構造遺伝子お
よび皿遺伝子プロモーターを含む新しい混成遺伝子を、
その混成遺伝子により与えられた特性の安定性を最大に
するために、宿主のりゾビウム・ジャポニカム(Rhi
zobium japonicum)の染色体に組み込
むことができる。
ャポニカム(Rhizobium japonicum
)中において発現される。あるいは、外来構造遺伝子お
よび皿遺伝子プロモーターを含む新しい混成遺伝子を、
その混成遺伝子により与えられた特性の安定性を最大に
するために、宿主のりゾビウム・ジャポニカム(Rhi
zobium japonicum)の染色体に組み込
むことができる。
ここに開示される新しいプラスミドは、混成遺伝子の量
を増加させること5 これらの遺伝子を選択されたりゾ
ビウム・ジャポニカム(Rh i zob iumja
pon icum)宿主株へ移入させること、新しいり
ゾビウム・ジャポニカム(Rhizol]ium ja
ponicum)宿主株を生ずること、および中間のも
のとして前記の1つまたはそれ以上の使用法を有するプ
ラスミドを構築すること、などにおいて有用である。本
発明のりゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium
japonicum)株は、ある条件下で混成遺伝子を
発現させ、有用な産物を供すること、植物に有利な特性
を与えること、または外来遺伝子産物の生成速度、質ま
たは効率を高めることに関して有用である。特に、新し
い株の特性は、宿主植物との共生的協力において本発明
の新しいりゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiu
m japonicum)株により形成された根粒中に
おいて明らかにされる。粒中での発現のために選択され
た外来遺伝子に依存して1粒は外来遺伝子にコードされ
たタンパク質の生成源として役立つ。根粒中で発現可能
なタンパク質の例として、バシラス・チューリンギエン
シス(Ba−cillus thuringiensi
s)の対昆虫毒素タンパク質(Wong、 Il、 C
,et al、 (1983) J、 Biol、 C
hem、 258 :1960 ff、) 、 リゾ
ビウム(Rh i zob i um)株のすべてでは
なくいくつかのものに見出されるヒドロゲナーゼ(Ca
ntrell、 M、 et al、 (1983)
Proc、 Nat。
を増加させること5 これらの遺伝子を選択されたりゾ
ビウム・ジャポニカム(Rh i zob iumja
pon icum)宿主株へ移入させること、新しいり
ゾビウム・ジャポニカム(Rhizol]ium ja
ponicum)宿主株を生ずること、および中間のも
のとして前記の1つまたはそれ以上の使用法を有するプ
ラスミドを構築すること、などにおいて有用である。本
発明のりゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium
japonicum)株は、ある条件下で混成遺伝子を
発現させ、有用な産物を供すること、植物に有利な特性
を与えること、または外来遺伝子産物の生成速度、質ま
たは効率を高めることに関して有用である。特に、新し
い株の特性は、宿主植物との共生的協力において本発明
の新しいりゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiu
m japonicum)株により形成された根粒中に
おいて明らかにされる。粒中での発現のために選択され
た外来遺伝子に依存して1粒は外来遺伝子にコードされ
たタンパク質の生成源として役立つ。根粒中で発現可能
なタンパク質の例として、バシラス・チューリンギエン
シス(Ba−cillus thuringiensi
s)の対昆虫毒素タンパク質(Wong、 Il、 C
,et al、 (1983) J、 Biol、 C
hem、 258 :1960 ff、) 、 リゾ
ビウム(Rh i zob i um)株のすべてでは
なくいくつかのものに見出されるヒドロゲナーゼ(Ca
ntrell、 M、 et al、 (1983)
Proc、 Nat。
八cad、 Sci、 [1,S、A、 80 : 1
81 ff、) 、メタロチオネイン(Karin、
M、 and R,1,Rtchards (1982
)Nucleic Ac1ds Res、10 : 3
165 ff、)およびプロラクチン(Cooke、
N、 et al、 (1981) J、 Biol、
Chem。
81 ff、) 、メタロチオネイン(Karin、
M、 and R,1,Rtchards (1982
)Nucleic Ac1ds Res、10 : 3
165 ff、)およびプロラクチン(Cooke、
N、 et al、 (1981) J、 Biol、
Chem。
256 : 4007−4016)が含まれる。前記の
リス1〜は制限するためのものではなく、単に植物の根
および幹の粒中でのタンパク質合成に関する広範囲の可
能性の見本として示したものである。一般的に。
リス1〜は制限するためのものではなく、単に植物の根
および幹の粒中でのタンパク質合成に関する広範囲の可
能性の見本として示したものである。一般的に。
本発明により、宿主植物に利益を与えるような。
粒からの抽出物または粒からの分泌物として、もしくは
共生の相互作用の効率を高めるような9粒そのものの中
での機能的タンパク質として有用な。
共生の相互作用の効率を高めるような9粒そのものの中
での機能的タンパク質として有用な。
いかなるタンパク質をも生成することが可能となる。こ
こで開示したタンパク質に加えて、根粒および特異的タ
ンパク質の既知もしくは後に発見される特性を利用する
ことにより、他のタンパク質も当業者にとって明らかに
なるであろう。根粒中におけるn 1 f gJ1節領
域の制御下での遺伝子発現によりもたらされる主な利点
は、それらの発現は泄遺伝子自体の発現と類似した様式
により調節される。という発明者の認識からきている。
こで開示したタンパク質に加えて、根粒および特異的タ
ンパク質の既知もしくは後に発見される特性を利用する
ことにより、他のタンパク質も当業者にとって明らかに
なるであろう。根粒中におけるn 1 f gJ1節領
域の制御下での遺伝子発現によりもたらされる主な利点
は、それらの発現は泄遺伝子自体の発現と類似した様式
により調節される。という発明者の認識からきている。
外来遺伝子は遊離で生存する細菌中では、もしあったと
しても最小限にしか発現されないが、根粒中では最大限
に発現される。さらに宿主−細菌共生の特異的性質によ
り、遺伝子発現は、修飾された細菌株に認識される選択
された植物種中でのみ起こる。
しても最小限にしか発現されないが、根粒中では最大限
に発現される。さらに宿主−細菌共生の特異的性質によ
り、遺伝子発現は、修飾された細菌株に認識される選択
された植物種中でのみ起こる。
これらの特性はその結果として、第1に、外来遺伝子の
発現が発現産物の最大の局在性効果を与えること、第2
に、遺伝子発現を選択された大豆植物株または変種の粒
組織に限定することができるので、環境上の副作用が限
定されること、を保証する。
発現が発現産物の最大の局在性効果を与えること、第2
に、遺伝子発現を選択された大豆植物株または変種の粒
組織に限定することができるので、環境上の副作用が限
定されること、を保証する。
連木Jシ列λ里
本発明の原理は、泄Hあるいはn1fDKプロモーター
の制御下に挿入された外来遺伝子を保持するプラスミド
の構築である。構造遺伝子は、プロモーターによって制
御される構造遺伝子として発現させるため、プロモータ
ーに関して正しい位置と方向で挿入されなければならな
い。位置については2つの見方がある。第1は、構造遺
伝子がプロモーターのどちら側に挿入されるかに関係が
ある。プロモーターの大半がDNAに沿って一方向のみ
で、転写と翻訳の開始を制御することは知られている。
の制御下に挿入された外来遺伝子を保持するプラスミド
の構築である。構造遺伝子は、プロモーターによって制
御される構造遺伝子として発現させるため、プロモータ
ーに関して正しい位置と方向で挿入されなければならな
い。位置については2つの見方がある。第1は、構造遺
伝子がプロモーターのどちら側に挿入されるかに関係が
ある。プロモーターの大半がDNAに沿って一方向のみ
で、転写と翻訳の開始を制御することは知られている。
プロモーターの制御下に置かれるDNAvi域は、“下
流”あるいはプロモーターの3゛側に存在すると言われ
る。したがって、プロモーターによって制御されるため
には、外来遺伝子の挿入の正しい位置はプロモーターよ
り“下流”でなければならない。位置に関する第2の観
点は、プロモーターの機能的要素の間の、たとえば外来
遺伝子の転写開始部位と翻訳開始部位の間の、塩基対と
しての距離に関するものである。実質上の多様性は、こ
の距離に関してプロモーター間で存在するようである。
流”あるいはプロモーターの3゛側に存在すると言われ
る。したがって、プロモーターによって制御されるため
には、外来遺伝子の挿入の正しい位置はプロモーターよ
り“下流”でなければならない。位置に関する第2の観
点は、プロモーターの機能的要素の間の、たとえば外来
遺伝子の転写開始部位と翻訳開始部位の間の、塩基対と
しての距離に関するものである。実質上の多様性は、こ
の距離に関してプロモーター間で存在するようである。
したがって、このことについての構造上の必要条件は2
機能的という用語で最もよく表現される。最適間隔は、
この距離の長さを変化させる実験によって達成され得る
。第一近似として、妥当な実施可能性はプロモーターと
挿入された外来遺伝子間の距離がプロモーターとそのプ
ロモーターが正常に制御する遺伝子との距離に似ている
場合、得ることができる。方向性は構造遺伝子の方向に
関連している。通常、タンパク質のアミノ末端を最終的
にコードする構造遺伝子の部分は構造遺伝子の5′末端
と称され、一方クンバク質のカルボキシル末端近くのア
ミノ酸をコードする末端は構造遺伝子の3゛末端と称さ
れる。構造遺伝子の正しい方向性はプロモーターに近い
方に5″末端がある。融合タンパク質の発現をもたらす
構築物の場合さらに必要な条件は、存在するニトロゲナ
ーゼ複合構造遺伝子配列への構造遺伝子の挿入は、2つ
の遺伝子のコード配列が同じリーディングフレームにあ
るようにする必要があるということであり、これは当該
分野ではよく理解されている構造的必要条件である。
機能的という用語で最もよく表現される。最適間隔は、
この距離の長さを変化させる実験によって達成され得る
。第一近似として、妥当な実施可能性はプロモーターと
挿入された外来遺伝子間の距離がプロモーターとそのプ
ロモーターが正常に制御する遺伝子との距離に似ている
場合、得ることができる。方向性は構造遺伝子の方向に
関連している。通常、タンパク質のアミノ末端を最終的
にコードする構造遺伝子の部分は構造遺伝子の5′末端
と称され、一方クンバク質のカルボキシル末端近くのア
ミノ酸をコードする末端は構造遺伝子の3゛末端と称さ
れる。構造遺伝子の正しい方向性はプロモーターに近い
方に5″末端がある。融合タンパク質の発現をもたらす
構築物の場合さらに必要な条件は、存在するニトロゲナ
ーゼ複合構造遺伝子配列への構造遺伝子の挿入は、2つ
の遺伝子のコード配列が同じリーディングフレームにあ
るようにする必要があるということであり、これは当該
分野ではよく理解されている構造的必要条件である。
ニトロゲナーゼ複合調節配列の3゛側にある外来遺伝子
を発現させるためには、 n1fl+あるいは泄り調
節配列に相当する2末鎖DNA配列を構築することが、
まず有利である。これを達成するため。
を発現させるためには、 n1fl+あるいは泄り調
節配列に相当する2末鎖DNA配列を構築することが、
まず有利である。これを達成するため。
mRNAのリポソーム結合部位に相補的でそこから2〜
3ヌクレオチド延びている合成りNAプライマーをまず
作成する。そしてクローン化されたn1fHあるいはn
1fD断片をベクターから切出し。
3ヌクレオチド延びている合成りNAプライマーをまず
作成する。そしてクローン化されたn1fHあるいはn
1fD断片をベクターから切出し。
精製し、切出したn1fl(あるいは」豆り断片を適当
な1本鎖DNAファージ(例えば、 fd)ベクターへ
連結する。得られた組換DNAプラスミドは。
な1本鎖DNAファージ(例えば、 fd)ベクターへ
連結する。得られた組換DNAプラスミドは。
次にエセリシア・コリー(Escherichia c
oli)株へ形質転換し、単一コロニーを増殖させる。
oli)株へ形質転換し、単一コロニーを増殖させる。
mRNA鎖に相当する1本鎖鋳型を放出するコロニーを
分離する。合成りNAをこれらの1本鎖鋳型上のプライ
マーとして用いて、DNAポリメラーゼ■ (クレノー
断片)でプライマーを伸長させて2本鎖DNAを産生ず
る。この2本鎖DNAは、リボゾーム結合部位から1本
鎖DNAベクター内のある位置まで伸長するであろう。
分離する。合成りNAをこれらの1本鎖鋳型上のプライ
マーとして用いて、DNAポリメラーゼ■ (クレノー
断片)でプライマーを伸長させて2本鎖DNAを産生ず
る。この2本鎖DNAは、リボゾーム結合部位から1本
鎖DNAベクター内のある位置まで伸長するであろう。
1本鎖領域を31ヌクレアーゼ処理によって除去する。
他の方法として、2本鎖ベクター、例えばpBR322
、を変性させ、そして同じ合成りNAプライマーを用い
て複製させてもよい。もし2本鎖ベクターを用いる場合
、当業者にはよく知られている適切な予防策を、まわり
のラベルされない断片の存在を避けるため講じねばなら
ない1例えば、制限酵素地図の使用によって混入断片の
存在を証明することが可能である。
、を変性させ、そして同じ合成りNAプライマーを用い
て複製させてもよい。もし2本鎖ベクターを用いる場合
、当業者にはよく知られている適切な予防策を、まわり
のラベルされない断片の存在を避けるため講じねばなら
ない1例えば、制限酵素地図の使用によって混入断片の
存在を証明することが可能である。
次に2合成EcoRIリンカーをDNA断片へ連結し次
にEcoRIと、 n1fHまたはn1fDの5゛末
端の制御部位を認識する制限エンドヌクレアーゼ(一般
化するためエンドヌクレアーゼAと称する)とで分解す
る。得られたDNA断片を次にEcoRT−エンドヌク
レアーゼAで切断されたプラスミドへクローン化し、適
切なエセリシア・コリー(Escherj−chia
coli)宿主へ形質転換し、増幅させる。プラスミド
の選択は当業者によって理解されているような、操作の
便宜性と適切な制限部位の位置に基づいて行う。
にEcoRIと、 n1fHまたはn1fDの5゛末
端の制御部位を認識する制限エンドヌクレアーゼ(一般
化するためエンドヌクレアーゼAと称する)とで分解す
る。得られたDNA断片を次にEcoRT−エンドヌク
レアーゼAで切断されたプラスミドへクローン化し、適
切なエセリシア・コリー(Escherj−chia
coli)宿主へ形質転換し、増幅させる。プラスミド
の選択は当業者によって理解されているような、操作の
便宜性と適切な制限部位の位置に基づいて行う。
増幅、単離および再精製に続いて、この同じプラスミド
を次にエンドヌクレアーゼAで切断し。
を次にエンドヌクレアーゼAで切断し。
S1ヌクレアーゼあるいはBAL−31で短時間処理し
て平滑末端の断片にする。このプラスミドを」匹RIで
切断し、その断片を広宿主域プラスミドpRK290へ
クローン化してpRK290 nif 調節断片構築
物をつくる。代わりに、別の広宿主域プラスミド、 p
sUP204を組換厘調節プラスミドを構築するために
使用することができる。
て平滑末端の断片にする。このプラスミドを」匹RIで
切断し、その断片を広宿主域プラスミドpRK290へ
クローン化してpRK290 nif 調節断片構築
物をつくる。代わりに、別の広宿主域プラスミド、 p
sUP204を組換厘調節プラスミドを構築するために
使用することができる。
他の方法として+ EcoRI−エンドヌクレアーゼ
ム−特異的末端で得られるDNA断片をpsuP104
あるいはpsUP204のような、エセリシア・コリー
(Escherichia coli)あるいはもっと
別のダラム陰性菌のどちらかで複製能を持つ移動可能な
広宿主域ベクターへ、まずクローン化する(Puhle
r。
ム−特異的末端で得られるDNA断片をpsuP104
あるいはpsUP204のような、エセリシア・コリー
(Escherichia coli)あるいはもっと
別のダラム陰性菌のどちらかで複製能を持つ移動可能な
広宿主域ベクターへ、まずクローン化する(Puhle
r。
八、+ Simon、 R,and U、 P
r1efer“C1ass II Mobi−1i
zable Gram−Negative Pla
smid”、 U、S、 Pat、 八ppl。
r1efer“C1ass II Mobi−1i
zable Gram−Negative Pla
smid”、 U、S、 Pat、 八ppl。
5erial No、510,334 Filed J
une 30.1983)。増幅後1組換プラスミドを
望まれる受容株へ直接転移させる。
une 30.1983)。増幅後1組換プラスミドを
望まれる受容株へ直接転移させる。
外来遺伝子をクローン化し1発現させるため。
これらの外来遺伝子を保持する適当なりNA断片を単離
し1合成EcoRIリンカーをその断片(」並RI−外
来遺伝子−EcoRI)へ連結する。これらのEcoR
I−外来遺伝子−」並R1−DNA断片を2次に」並R
Iで切断したベクターDNA、例えば、 pSUP10
4あるいはpsUP204へ連結し、それぞれを」U−
調節発現プラスミドであるpss104あるいはpss
204にして、エセリシア・コリー(Escheric
hia colt)へ形質転換する。選択と増幅の後9
次いでnif −調節発現プラスミドを接合によって適
当なりゾビウム(Rhizobium)あるいはアグロ
バクテリウム(八grobacterium)へ、ヘル
パープラスミドの助けを借りて転移させる。
し1合成EcoRIリンカーをその断片(」並RI−外
来遺伝子−EcoRI)へ連結する。これらのEcoR
I−外来遺伝子−」並R1−DNA断片を2次に」並R
Iで切断したベクターDNA、例えば、 pSUP10
4あるいはpsUP204へ連結し、それぞれを」U−
調節発現プラスミドであるpss104あるいはpss
204にして、エセリシア・コリー(Escheric
hia colt)へ形質転換する。選択と増幅の後9
次いでnif −調節発現プラスミドを接合によって適
当なりゾビウム(Rhizobium)あるいはアグロ
バクテリウム(八grobacterium)へ、ヘル
パープラスミドの助けを借りて転移させる。
接合完了体リゾビウム(Rhjzobium)株を次に
大豆植物あるいは他の適当な豆科植物へ感染させ次に外
来mRNAおよび/またはタンパク質の産生を調べる。
大豆植物あるいは他の適当な豆科植物へ感染させ次に外
来mRNAおよび/またはタンパク質の産生を調べる。
(以下余白)
エセリシア・コリー(Escherichia col
t)J3夕の婁ノ、 プラスミドは、細菌株から容易に失われ、従ってプラス
ミド上に保持されるそれらの遺伝子が発現しなくなる。
t)J3夕の婁ノ、 プラスミドは、細菌株から容易に失われ、従ってプラス
ミド上に保持されるそれらの遺伝子が発現しなくなる。
プラスミド上に保持されるある遺伝子、あるいは、それ
についてはいかなる外来DNA小片の発現をも安定化さ
せるひとつの方法として、宿主細菌の染色体へのそのよ
うな遺伝子。
についてはいかなる外来DNA小片の発現をも安定化さ
せるひとつの方法として、宿主細菌の染色体へのそのよ
うな遺伝子。
あるいは以後“導入DNA”と呼ぶ外来DNA小片の導
入がある。そのような系は“自殺ベクター”および好ま
しくはトランスポゾンを使用する。自殺ベクターは、ひ
とつの細菌宿主(この場合、エセリシア・コリー(Es
cherichia coli))で安定に複製するが
、違う細菌種(例えばりゾビウム・トリフオリ (Rh
izobium trifolii) )では複製でき
ないプラスミド分子である。
入がある。そのような系は“自殺ベクター”および好ま
しくはトランスポゾンを使用する。自殺ベクターは、ひ
とつの細菌宿主(この場合、エセリシア・コリー(Es
cherichia coli))で安定に複製するが
、違う細菌種(例えばりゾビウム・トリフオリ (Rh
izobium trifolii) )では複製でき
ないプラスミド分子である。
トランスボゾンは、DNA上でひとつの位置から他へ移
動(転位)できる遺伝要素である。転位過程は、トラン
スホモン上にコードされた遺伝子産物によって介在され
、トランスポゾンの両末端に存在する反復配列(正方向
あるいは逆方向に繰返される)の完全性に依存する。ト
ランスポゾンは、一般に1つ(あるいはそれ以上)の抗
生物質耐性をコードする遺伝子を保持している。トラン
スポゾンと自殺ベクターは、線状にし、単一組換DNA
分子へ再連結される。
動(転位)できる遺伝要素である。転位過程は、トラン
スホモン上にコードされた遺伝子産物によって介在され
、トランスポゾンの両末端に存在する反復配列(正方向
あるいは逆方向に繰返される)の完全性に依存する。ト
ランスポゾンは、一般に1つ(あるいはそれ以上)の抗
生物質耐性をコードする遺伝子を保持している。トラン
スポゾンと自殺ベクターは、線状にし、単一組換DNA
分子へ再連結される。
導入DNA小片をエセリシア・コリー(Escheri
−chia coli)以外のダラム陰性細菌株の染色
体へ転移する一般法の概略をここに示す。導入されるD
NA断片は多数の方法で作成できる。(a)部位特異的
制限エンドヌクレアーゼでの制限切断;(b)平滑末端
を持つDNA断片を生ずる制限エンドヌクレアーゼでの
部分的あるいは完全分解; (C)Mn”イオンの存
在下での酵素DNAase IでのDNAの分解、そこ
で一般に平滑末端の任意の断片を生じる;(d)剪断に
よるDNAの巨大断片化。
−chia coli)以外のダラム陰性細菌株の染色
体へ転移する一般法の概略をここに示す。導入されるD
NA断片は多数の方法で作成できる。(a)部位特異的
制限エンドヌクレアーゼでの制限切断;(b)平滑末端
を持つDNA断片を生ずる制限エンドヌクレアーゼでの
部分的あるいは完全分解; (C)Mn”イオンの存
在下での酵素DNAase IでのDNAの分解、そこ
で一般に平滑末端の任意の断片を生じる;(d)剪断に
よるDNAの巨大断片化。
望ましい方法としては、抗生物質耐性遺伝子を持つトラ
ンスボゾンを保持する自殺ベクターを線状化し、導入D
NAの適切な断片を“共同取込み組換分子”へ連結する
。DNA断片を、正常な転移も薬剤耐性マーカーの発現
も壊さないような挿入法でトランスボゾン内の制限エン
ドヌクレアーゼ部位へ挿入する。この連結されたDNA
を5次にその中でそれが増幅でき、他のグラム陰性菌へ
の転移のため移動可能なエセリシア・コリー(Esch
erichia coli)株へ形質転換する。
ンスボゾンを保持する自殺ベクターを線状化し、導入D
NAの適切な断片を“共同取込み組換分子”へ連結する
。DNA断片を、正常な転移も薬剤耐性マーカーの発現
も壊さないような挿入法でトランスボゾン内の制限エン
ドヌクレアーゼ部位へ挿入する。この連結されたDNA
を5次にその中でそれが増幅でき、他のグラム陰性菌へ
の転移のため移動可能なエセリシア・コリー(Esch
erichia coli)株へ形質転換する。
このエセリシア・コリー(Escherichia c
oli)株のクローン化され、導入されたDNA断片は
5次に他のグラム陰性菌3例えばりゾビウム・ジャポニ
カム(Rhizobium japonicum)、の
染色体へ移されることが可能である。これは、細菌接合
の過程によって最も簡便に達成される。抗生物質耐性遺
伝子を含む自殺ベクターを保持するエセリシア・コリー
(Escherichia coli)株を、栄養寒天
培地の表面上で当該抗生物質感受性のグラム陰性菌の菌
体と混合する。プレートを、ダラム陰性株の最適温度で
、ある時間(4〜16時間)インキュベートし、この間
にそれぞれの細菌種の菌体は物理的に接触(接合)シ、
自殺ベクターは供与者である工セリシア・コリー(Es
cherichia coli)から受容者であるダラ
ム陰性株へ転移される。細胞混合液をプレートから洗い
取り、抗生物質耐性に選択的な寒天プレート上に広げる
。それは、一度接合と転移が完成すれば、エセリシア・
コリー(IEscherichiacoli)親株の増
殖に対して選択する選択方法を含 。
oli)株のクローン化され、導入されたDNA断片は
5次に他のグラム陰性菌3例えばりゾビウム・ジャポニ
カム(Rhizobium japonicum)、の
染色体へ移されることが可能である。これは、細菌接合
の過程によって最も簡便に達成される。抗生物質耐性遺
伝子を含む自殺ベクターを保持するエセリシア・コリー
(Escherichia coli)株を、栄養寒天
培地の表面上で当該抗生物質感受性のグラム陰性菌の菌
体と混合する。プレートを、ダラム陰性株の最適温度で
、ある時間(4〜16時間)インキュベートし、この間
にそれぞれの細菌種の菌体は物理的に接触(接合)シ、
自殺ベクターは供与者である工セリシア・コリー(Es
cherichia coli)から受容者であるダラ
ム陰性株へ転移される。細胞混合液をプレートから洗い
取り、抗生物質耐性に選択的な寒天プレート上に広げる
。それは、一度接合と転移が完成すれば、エセリシア・
コリー(IEscherichiacoli)親株の増
殖に対して選択する選択方法を含 。
むことが望ましい。
DNAの導入断片を含む自殺ベクターは、受容ダラム陰
性株では自律的に増幅できないので、遺伝物質の細菌染
色体への転移は次の3種の方法の一つで起こり得る。(
a)受容グラム陰性菌染色体(BC)の断片が前もって
自殺ベクター(SV)へ挿入され、自殺ベクターと受容
グラム陰性菌染色体間に相同性の領域を形成したなら2
次に単一相互的組換えにより、受容グラム陰性菌染色体
への全組換分子の取込み、あるいは共同取込みが生じる
であろう (第6図)。枠内は導入遺伝子断片の挿入の
位置を示し pHは抗生物質耐性遺伝子の位置を示す。
性株では自律的に増幅できないので、遺伝物質の細菌染
色体への転移は次の3種の方法の一つで起こり得る。(
a)受容グラム陰性菌染色体(BC)の断片が前もって
自殺ベクター(SV)へ挿入され、自殺ベクターと受容
グラム陰性菌染色体間に相同性の領域を形成したなら2
次に単一相互的組換えにより、受容グラム陰性菌染色体
への全組換分子の取込み、あるいは共同取込みが生じる
であろう (第6図)。枠内は導入遺伝子断片の挿入の
位置を示し pHは抗生物質耐性遺伝子の位置を示す。
(bl受容ダラム陰性菌染色体の断片が前もって自殺ベ
クター(SV)へ挿入され、自殺ベクターと受容グラム
陰性菌染色体間に相同性の領域を形成し。
クター(SV)へ挿入され、自殺ベクターと受容グラム
陰性菌染色体間に相同性の領域を形成し。
次に導入DNA断片と薬剤耐性遺伝子が、この相同性の
領域へ挿入されたならば、二重相互的組換えにより導入
DNA断片と薬剤耐性遺伝子のみが受容グラム陰性菌の
染色体へ取り込まれるであろう(第7図)。そのような
組換えは部位特異的で。
領域へ挿入されたならば、二重相互的組換えにより導入
DNA断片と薬剤耐性遺伝子のみが受容グラム陰性菌の
染色体へ取り込まれるであろう(第7図)。そのような
組換えは部位特異的で。
その染色体上の位置は自殺ベクター上に保持される染色
体DNAの断片によって決められる。その構成要素を第
7図に示す。(C1望ましい方法としては、導入DNA
断片と抗生物質耐性遺伝子を含むトランスポゾンが受容
ダラム陰性菌株の細菌染色体へ転置される(第8図)。
体DNAの断片によって決められる。その構成要素を第
7図に示す。(C1望ましい方法としては、導入DNA
断片と抗生物質耐性遺伝子を含むトランスポゾンが受容
ダラム陰性菌株の細菌染色体へ転置される(第8図)。
その構成要素を第8図に示す。更に、Tnは、細菌染色
体への導入DNAの転置に使用されるトランスボゾンを
示す。
体への導入DNAの転置に使用されるトランスボゾンを
示す。
抗生物質耐性の選択は、導入DNAの維持を確証する。
簡便さと明快さのために、使用される定義を集め以下に
示す。
示す。
(a)ニトロゲナーゼ複合体:リゾビウム・ジャボニカ
ム(Rhizobium japonicum)宿主植
物共生における窒素固定に関係するすべての遺伝子。
ム(Rhizobium japonicum)宿主植
物共生における窒素固定に関係するすべての遺伝子。
山)プロモーター:転写に必要なすべての調節領域を含
む、転写開始部位の上流のヌクレオチド配列。
む、転写開始部位の上流のヌクレオチド配列。
(C)翻訳開始部位:オープンリーディングフレームの
アミノ末端のメチオニン残基へ翻訳されるATGコドン
。
アミノ末端のメチオニン残基へ翻訳されるATGコドン
。
(d)転写開始部位:mRNA配列のRNA配列へ転写
される初めのデオキシヌクレオチド。
される初めのデオキシヌクレオチド。
(e)外来遺伝子:外来起源の生物から単離された1つ
または複数の構造遺伝子。
または複数の構造遺伝子。
(f)ベクター:外来DNAのひとつあるいはそれ以上
の断片を保持し複製する単一複製起点を持つプラスミド
。
の断片を保持し複製する単一複製起点を持つプラスミド
。
(a外来DNA :外来起源の生物から単離されたDN
Aの断片。
Aの断片。
(hl iff 密なる条件:50°Cで3時間のイン
キュベーション。
キュベーション。
jLL方叙り追弔−1:DNAの己・′、とDNAのP
歳酊舛汰定nif DKに関しては、DNAの起源はり
ゾビウム、ジャポニカム(Rhizobium jap
onicum) n’rf DKを含む組換プラスミド
pRJ676およびそれからのサブクローンであった(
Hennecke、 H,(1981)Nature
(London) 291 : 354−355
; Fuhrmann、 M。
歳酊舛汰定nif DKに関しては、DNAの起源はり
ゾビウム、ジャポニカム(Rhizobium jap
onicum) n’rf DKを含む組換プラスミド
pRJ676およびそれからのサブクローンであった(
Hennecke、 H,(1981)Nature
(London) 291 : 354−355
; Fuhrmann、 M。
and H、1lennecke(1982) Mo1
. Gen、 Genet、 187 :419−4
25)。加工」に関しては、リゾビウム・ジャポニカム
(Rhizobium japonicum)の全DN
Aを用いた以前のサザンブロソトハイブリダイゼーショ
ン実験により、約12〜14キロベースベア(kb)の
Pst I断片が、放射能で標識されたクレブシェラ・
ニューモニエ(Klebsiella pneumon
iae)とりゾビウム・メリロティ(Rhizobiu
m meliloti)由来のnif I(DNAと特
異的にハイブリダイズすることが明らかにされた。この
断片をクローン化するため、大きさにより分画したりゾ
ビウム・ジャポニカム(Rhizo−bium jap
onicum) DNA(1(1〜16kb〕間のPs
t I断片)をクローニングベクターpHE3のハ[I
で分解したDNAに連結し、そしてこの組換DNAをエ
セリシア・コリー(Escherichiacoll)
I?R28へ形質転換した(llennecke、 H
,et al。
. Gen、 Genet、 187 :419−4
25)。加工」に関しては、リゾビウム・ジャポニカム
(Rhizobium japonicum)の全DN
Aを用いた以前のサザンブロソトハイブリダイゼーショ
ン実験により、約12〜14キロベースベア(kb)の
Pst I断片が、放射能で標識されたクレブシェラ・
ニューモニエ(Klebsiella pneumon
iae)とりゾビウム・メリロティ(Rhizobiu
m meliloti)由来のnif I(DNAと特
異的にハイブリダイズすることが明らかにされた。この
断片をクローン化するため、大きさにより分画したりゾ
ビウム・ジャポニカム(Rhizo−bium jap
onicum) DNA(1(1〜16kb〕間のPs
t I断片)をクローニングベクターpHE3のハ[I
で分解したDNAに連結し、そしてこの組換DNAをエ
セリシア・コリー(Escherichiacoll)
I?R28へ形質転換した(llennecke、 H
,et al。
(1982) Gene 19 : 231−234)
。このクローニング系は組換プラスミドの直接的選択が
可能なので、730形質転換体を選び取り、厳密な条件
下で種間コロニーハイブリダイゼーションによってリゾ
ビウム・ジャポニカム(Rhizobium japo
nicum) nif H遺伝子の存在をスクリーニン
グをした。厳密な条件は、ここでは50℃で3時間での
インキュベーションと定義される。ひとつのコロニー(
pRJ7000)は。
。このクローニング系は組換プラスミドの直接的選択が
可能なので、730形質転換体を選び取り、厳密な条件
下で種間コロニーハイブリダイゼーションによってリゾ
ビウム・ジャポニカム(Rhizobium japo
nicum) nif H遺伝子の存在をスクリーニン
グをした。厳密な条件は、ここでは50℃で3時間での
インキュベーションと定義される。ひとつのコロニー(
pRJ7000)は。
12.1キロベースの挿入体を保持する所望の組換プラ
スミドを含んでいた。この12.1キロベースの挿入体
は、 pRmR2の、(2P)で標識されたn1fHを
含むリゾビウム・メリロティ(Rhizobium m
eliloti)11indIII断片+ (Ruvk
un+ G、 B、 and F、M、Au5ubel
(1980) Proc、 Nat、 八cad
、 Sci、 U、S、八、 77 : 1
91−195) 、およびpsA31の、 (” P
)で標識された加工」ヲ含むクレブシェラ・ニューモニ
エ(Klebsiellapneumoniae) E
co RI/Kpn 1断片(Sott、 K、 F、
。
スミドを含んでいた。この12.1キロベースの挿入体
は、 pRmR2の、(2P)で標識されたn1fHを
含むリゾビウム・メリロティ(Rhizobium m
eliloti)11indIII断片+ (Ruvk
un+ G、 B、 and F、M、Au5ubel
(1980) Proc、 Nat、 八cad
、 Sci、 U、S、八、 77 : 1
91−195) 、およびpsA31の、 (” P
)で標識された加工」ヲ含むクレブシェラ・ニューモニ
エ(Klebsiellapneumoniae) E
co RI/Kpn 1断片(Sott、 K、 F、
。
et al、 (1981) J、 Mo1. App
l、 Genet、 1 : 7l−81)の両方にハ
イブリダイズした。pRJ7000の12.1キロベー
スリゾビウム・ジャポニカム(Rh 1zob i u
mjaponicum)断片の制限酵素分解地図につい
ては第5図を参照)。…f 11の相同性領域は1点線
によって示されている。 ヌクレオチド配列データは。
l、 Genet、 1 : 7l−81)の両方にハ
イブリダイズした。pRJ7000の12.1キロベー
スリゾビウム・ジャポニカム(Rh 1zob i u
mjaponicum)断片の制限酵素分解地図につい
ては第5図を参照)。…f 11の相同性領域は1点線
によって示されている。 ヌクレオチド配列データは。
チェインターミネーション法と同様に化学法を用いて得
られた。化学的塩基配列決定は、A+G修飾手順をGr
ayら(Gray、 C,P、 et al、(197
8) Proc。
られた。化学的塩基配列決定は、A+G修飾手順をGr
ayら(Gray、 C,P、 et al、(197
8) Proc。
Nat、 Acad、 Sci、 U、S、A、 75
: 5O−53)に従った以外はMaxamとG1
1bertの方法によって行なった(Maxam、
八、 and W、 G11bert (19
80) Methods Enzymol。
: 5O−53)に従った以外はMaxamとG1
1bertの方法によって行なった(Maxam、
八、 and W、 G11bert (19
80) Methods Enzymol。
−競−: 499−561)。チェインターミネーショ
ン法(Sanger、 P、 et al、 (197
7) Proc、 Nat、Δcad、 Sci。
ン法(Sanger、 P、 et al、 (197
7) Proc、 Nat、Δcad、 Sci。
U、S、A、74 : 5463−5467)に関して
は、DNA断片をバクテリオファージM13mp7.−
mp8.−mp9.−mpl。
は、DNA断片をバクテリオファージM13mp7.−
mp8.−mp9.−mpl。
およびmp11ヘサブクローン化した(Messing
、 J。
、 J。
(1983) Methods Enzymol、 1
01 : 2O−78)。エセリシア・コリー(Es
cherichia colt) JM103の形質転
換後1組換ファージをドントブロソトーハイブリダイゼ
ーション技術を用いて選別した。−末鎖DNAを記載(
Messfng+ J、 (1983) Method
s Enzymol。
01 : 2O−78)。エセリシア・コリー(Es
cherichia colt) JM103の形質転
換後1組換ファージをドントブロソトーハイブリダイゼ
ーション技術を用いて選別した。−末鎖DNAを記載(
Messfng+ J、 (1983) Method
s Enzymol。
101 : 2O−78)に従い単離し+ Bethe
sda Re5earchLaboratories
(26塩基)あるいはNew EnglandBiol
abs (15塩基)から購入したプライマーにアニ
ールさせた。すべての制限部位を重複した塩基配列決定
によって確認し、完全な旦fD (第1図と第9図)
仁nif H領域は、DNA0両鎖について塩基配列
決定した。nif K領域を1部分的に塩基配列決定し
た(第1図と第9図)。今のところ。
sda Re5earchLaboratories
(26塩基)あるいはNew EnglandBiol
abs (15塩基)から購入したプライマーにアニ
ールさせた。すべての制限部位を重複した塩基配列決定
によって確認し、完全な旦fD (第1図と第9図)
仁nif H領域は、DNA0両鎖について塩基配列
決定した。nif K領域を1部分的に塩基配列決定し
た(第1図と第9図)。今のところ。
独特で説明できないような特徴は、 nif Dコード
領域の5゛側のDNA断片がM13ベクターにクローン
化できず、化学法によって塩基配列決定しなければなら
なかったという事実である。この特徴のため、 nif
Hあるいはnif D調節配列に相当する2末鎖D
N A配列を構築するために、ファージM13を使用す
ることは不可能であった。しかし、他の1本鎖ファージ
ベクター(例えば、 fd)をこれらの構築に使用する
ことができた。コンピュータープログラムを、塩基配列
決定データの分析と保存に使用した(Larsor++
R,and J、 Messing (1982)N
ucleic Ac1ds Res、10 : 39−
49)。
領域の5゛側のDNA断片がM13ベクターにクローン
化できず、化学法によって塩基配列決定しなければなら
なかったという事実である。この特徴のため、 nif
Hあるいはnif D調節配列に相当する2末鎖D
N A配列を構築するために、ファージM13を使用す
ることは不可能であった。しかし、他の1本鎖ファージ
ベクター(例えば、 fd)をこれらの構築に使用する
ことができた。コンピュータープログラムを、塩基配列
決定データの分析と保存に使用した(Larsor++
R,and J、 Messing (1982)N
ucleic Ac1ds Res、10 : 39−
49)。
リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium ja
po−nicum )旦fHとnif D遺伝子の転写
開始点を。
po−nicum )旦fHとnif D遺伝子の転写
開始点を。
(Weaver、 R,F、 and C,Weiss
mann (1979) Nucleic八cids
へes、−ヱ: 1175−1192)の修飾を加えた
(Berk。
mann (1979) Nucleic八cids
へes、−ヱ: 1175−1192)の修飾を加えた
(Berk。
A、 J、 and P、 八、 5har
p (1977) Ce1l 1ご2ニア2l
−732)のヌクレアーゼS1マツピングによって決定
した。nif Dの場合では、RNAの起源は、リゾビ
ウム・ジャポニカム(Rhizobium japon
tcum )株110 spc 4の遊離に生存してい
る窒素固定培養(Regensburger、 B、
and H,Hennecke (1983) Arc
h+Microbiol、 135 : 103−10
9)あるいは(Sundaresan。
p (1977) Ce1l 1ご2ニア2l
−732)のヌクレアーゼS1マツピングによって決定
した。nif Dの場合では、RNAの起源は、リゾビ
ウム・ジャポニカム(Rhizobium japon
tcum )株110 spc 4の遊離に生存してい
る窒素固定培養(Regensburger、 B、
and H,Hennecke (1983) Arc
h+Microbiol、 135 : 103−10
9)あるいは(Sundaresan。
V、 et al、 (1983) Nature
(London) 301 : 728−732)に
従って単離した大豆(グリシンマックスL、 Merr
、 var、 C1ark L−1)根粒由来の110
spc 4バクテロイドであった。RNAは、既幸艮
(Kaluza。
(London) 301 : 728−732)に
従って単離した大豆(グリシンマックスL、 Merr
、 var、 C1ark L−1)根粒由来の110
spc 4バクテロイドであった。RNAは、既幸艮
(Kaluza。
K、 and H,Hennecke (1981)
Arch、 Microbiol。
Arch、 Microbiol。
13073B−43)に従い抽出した。遊離生存の好気
性のリゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium
japo−nicum)培養由来のRNAをネガティブ
コントロールとした。nif Dに関しては、5”−f
f2p−標識DNA断片をヌクレオチド位置−63から
+82までの145塩基対1(pa TJ断片として使
用した(第1図)。nif Hに関しては、コード領域
の−201から+41の5”−32p=標識血d II
I/Hinfr断片を使用した(第2図)。2本鎖を分
離してmRNAとハイブリダイズ(43”C,12時間
)させた後、ハイブリダイズしなかった核酸をヌクレア
ーゼSL (BoehringerMannheim)
で分解し、そして保護されたDNAを。
性のリゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium
japo−nicum)培養由来のRNAをネガティブ
コントロールとした。nif Dに関しては、5”−f
f2p−標識DNA断片をヌクレオチド位置−63から
+82までの145塩基対1(pa TJ断片として使
用した(第1図)。nif Hに関しては、コード領域
の−201から+41の5”−32p=標識血d II
I/Hinfr断片を使用した(第2図)。2本鎖を分
離してmRNAとハイブリダイズ(43”C,12時間
)させた後、ハイブリダイズしなかった核酸をヌクレア
ーゼSL (BoehringerMannheim)
で分解し、そして保護されたDNAを。
同じ展■断片(n1fD )あるいは」釦d m/ll
i n f T断片(nif H)のMaxam−G
ilbert ”シーフェンシングハンド”のレーンに
並列して電気泳動した。
i n f T断片(nif H)のMaxam−G
ilbert ”シーフェンシングハンド”のレーンに
並列して電気泳動した。
リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium ja
p6−nicum)nif H遺伝子のりポゾーム結合
部位(5°−GCTGCTCTCCATCAACCG−
3’ )に相補的な合成りNAABO 3イマーを作成する。Eco RI制限部位上流(すな
わち、ATG翻訳開始コドンの5゛側)から…虹■部位
下流(すなわち、ATG翻訳開始コドンの3”側)の領
域にわたるDNA断片を1次いで1本鎖DNAファージ
へサブクローン化し、エセリシア・コリー(Esche
richia coli) JM103 (第10図)
へ形質転換し、そしてそこで増殖させる。クローン化さ
れた断片を増幅させ、1本鎖鋳型(約1μg)を、細菌
宿主を遠心分離した後の上澄から回収する。4種のデオ
キシヌクレオチド3リン酸(そのうちひとつは放射活性
がある)とDNAポリメラーゼI (クレノー断片)の
存在下で、10倍量の合成りNAプライマーを、このn
if H6i型上のプライマーとして用いて、2本鎖D
NA (dsDNA)を産生ずる(第10図)。混合液
を25℃から37℃で15〜45分間インキュベートし
その間に相補鎖が充分に伸びる。残った1本鎖DNAは
1次いでS1ヌクレアーゼで分解して取り去る(第10
図)。次に。
p6−nicum)nif H遺伝子のりポゾーム結合
部位(5°−GCTGCTCTCCATCAACCG−
3’ )に相補的な合成りNAABO 3イマーを作成する。Eco RI制限部位上流(すな
わち、ATG翻訳開始コドンの5゛側)から…虹■部位
下流(すなわち、ATG翻訳開始コドンの3”側)の領
域にわたるDNA断片を1次いで1本鎖DNAファージ
へサブクローン化し、エセリシア・コリー(Esche
richia coli) JM103 (第10図)
へ形質転換し、そしてそこで増殖させる。クローン化さ
れた断片を増幅させ、1本鎖鋳型(約1μg)を、細菌
宿主を遠心分離した後の上澄から回収する。4種のデオ
キシヌクレオチド3リン酸(そのうちひとつは放射活性
がある)とDNAポリメラーゼI (クレノー断片)の
存在下で、10倍量の合成りNAプライマーを、このn
if H6i型上のプライマーとして用いて、2本鎖D
NA (dsDNA)を産生ずる(第10図)。混合液
を25℃から37℃で15〜45分間インキュベートし
その間に相補鎖が充分に伸びる。残った1本鎖DNAは
1次いでS1ヌクレアーゼで分解して取り去る(第10
図)。次に。
取乞R1リンカ−(GGAATTCC)を2本鎖DNA
断片へ連結し、 Eco R1で分解する(第11図)
。この断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、プロモ
ーター配列を含む断片を溶出し、前もって制限酵素Ec
o RIによって切断されている広宿主域プラスミドp
sUP204へクローン化する(第11図)。得られた
組換プラスミドをpRj−nif II−P/5S20
4と名付ける。適切なエセリシア・コリー(Esche
richia coli)宿主株1例えば制限切断ネガ
ティブ、すなわちr−。
断片へ連結し、 Eco R1で分解する(第11図)
。この断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、プロモ
ーター配列を含む断片を溶出し、前もって制限酵素Ec
o RIによって切断されている広宿主域プラスミドp
sUP204へクローン化する(第11図)。得られた
組換プラスミドをpRj−nif II−P/5S20
4と名付ける。適切なエセリシア・コリー(Esche
richia coli)宿主株1例えば制限切断ネガ
ティブ、すなわちr−。
の17−1に形質転換し増幅させた後、 Eco R1
で部分分解することにより、線状化プラスミドのn1f
llプロモ一ター断片の下流へ、いかなる外来構造遺伝
子あるいは外来DNA断片をもつけることができる。例
えば、ヒトプロラクチン遺伝子(cooke。
で部分分解することにより、線状化プラスミドのn1f
llプロモ一ター断片の下流へ、いかなる外来構造遺伝
子あるいは外来DNA断片をもつけることができる。例
えば、ヒトプロラクチン遺伝子(cooke。
N、et al、 (1981) J、 Biol、
Chem、 256 : 4007−4016) 、
あるいはヒトメタ゛ロチオネイン遺伝子(Marin、
M、 and R,1,Richards (
1982) NucleicAcids Res、
10 :3165−3173および実施例5を参照)
を挿入でき、その結果“混成”組換体となる。
Chem、 256 : 4007−4016) 、
あるいはヒトメタ゛ロチオネイン遺伝子(Marin、
M、 and R,1,Richards (
1982) NucleicAcids Res、
10 :3165−3173および実施例5を参照)
を挿入でき、その結果“混成”組換体となる。
混成組換体は、ここではベクター、プロモーター配列お
よび、その発現が該プロモーター配列の制御下にあるあ
らゆる外来DNAを含む組換DNAプラスミドとして定
義される。
よび、その発現が該プロモーター配列の制御下にあるあ
らゆる外来DNAを含む組換DNAプラスミドとして定
義される。
リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium ja
po−nicum)nif D遺伝子のりホゾラム結合
部位(5°−CTGGTGTCCTTTAAAAG−3
’ )に相補的な合成りNAプライマーを作成する。−
375から+732までの領末鎖DNAファージ、例え
ばfd、ヘサブクローン化し、エセリシア・コリー(E
scherichia coli)JM103 (第
12図)へ形質転換し、0.1M塩中、30“Cでイン
キュベートする。あるいはまた、加工」特異的Bgl
II/C1a I断片をpBR322へクローン化す
ることができる。適当な宿主で増幅後9Mi換DNAを
精製し、2本鎖DNA合成プライマーとして。
po−nicum)nif D遺伝子のりホゾラム結合
部位(5°−CTGGTGTCCTTTAAAAG−3
’ )に相補的な合成りNAプライマーを作成する。−
375から+732までの領末鎖DNAファージ、例え
ばfd、ヘサブクローン化し、エセリシア・コリー(E
scherichia coli)JM103 (第
12図)へ形質転換し、0.1M塩中、30“Cでイン
キュベートする。あるいはまた、加工」特異的Bgl
II/C1a I断片をpBR322へクローン化す
ることができる。適当な宿主で増幅後9Mi換DNAを
精製し、2本鎖DNA合成プライマーとして。
また電気泳動後の適当な断片の認識のために、同一の配
列(上記参照)をもつ放射性DNAプライマーを用いる
。単離された放射性断片の純度を検定するために、当業
者に既知の方法(例えば、制限酵素地図)を用いる。ク
ローン化した断片を増幅させ、リゾビウム・ジャポニカ
ム(Rhizobiumjaponic++m) ni
f DのmRNA鎖に対応する1本鎖の鋳型をパッケー
ジさせ、培地中に放出させる。
列(上記参照)をもつ放射性DNAプライマーを用いる
。単離された放射性断片の純度を検定するために、当業
者に既知の方法(例えば、制限酵素地図)を用いる。ク
ローン化した断片を増幅させ、リゾビウム・ジャポニカ
ム(Rhizobiumjaponic++m) ni
f DのmRNA鎖に対応する1本鎖の鋳型をパッケー
ジさせ、培地中に放出させる。
1本鎖の鋳型(約1μg)を細菌の宿主を遠心分離した
後の上澄から回収する。4種のデオキシヌクレオチド3
リン酸(そのうちの1つは放射性)およびDNAポリメ
ラーゼ■ (クレノー断片)の存在下で、10倍量の合
成りNAプライマーを、εのnif D iin型のプ
ライマーとして用いて、dsDNAを生成する(第12
図)。混合液を25°Cから37℃で15分間から45
分間インキュベートし、この間に。
後の上澄から回収する。4種のデオキシヌクレオチド3
リン酸(そのうちの1つは放射性)およびDNAポリメ
ラーゼ■ (クレノー断片)の存在下で、10倍量の合
成りNAプライマーを、εのnif D iin型のプ
ライマーとして用いて、dsDNAを生成する(第12
図)。混合液を25°Cから37℃で15分間から45
分間インキュベートし、この間に。
相補鎖が充分に伸長する。残ったの1本鎖DNAはS1
ヌクレアーゼで分解して除去する (第12図)。
ヌクレアーゼで分解して除去する (第12図)。
次にル堅−R1リンカ−(GGAATTCC)を2重鎖
DNA断片に連結し、その後Eco RIおよびXho
ITで分解する(第13図)。断片をアガロースゲル
電気泳動により分離し、 L、I Kbpの断片を溶出
させ、すでに制限酵素Bam111による制限分解、制
限部位の平滑末端への変換1および最後にEco R1
による分解。
DNA断片に連結し、その後Eco RIおよびXho
ITで分解する(第13図)。断片をアガロースゲル
電気泳動により分離し、 L、I Kbpの断片を溶出
させ、すでに制限酵素Bam111による制限分解、制
限部位の平滑末端への変換1および最後にEco R1
による分解。
を受けている広宿主域プラスミドpsUP204中にク
ローン化する く第13図)。得られた組換プラスミド
を、 pRj−nif D−P/5S204 と名付け
る。適当なエセリシア・コリー(Escherichi
a coli)宿主株5例えば、17−1へ形質転換し
、そこで増幅させた後。
ローン化する く第13図)。得られた組換プラスミド
を、 pRj−nif D−P/5S204 と名付け
る。適当なエセリシア・コリー(Escherichi
a coli)宿主株5例えば、17−1へ形質転換し
、そこで増幅させた後。
Eco RIで切断することにより、線状プラスミドへ
いかなる外来構造遺伝子または外来DNAをもつけるこ
とができる。例えば、ヒトプ、ロラクチン遺伝子(Co
oke、 N、 et a+、(1981) J、 B
iol、 Chem。
いかなる外来構造遺伝子または外来DNAをもつけるこ
とができる。例えば、ヒトプ、ロラクチン遺伝子(Co
oke、 N、 et a+、(1981) J、 B
iol、 Chem。
256 : 4007−4016)またはヒトメタロチ
オネイン遺伝子(Marin、 M、 and R,1
,Richards (19B2)Nucleic A
c1ds Res 、 10 : 3165−3173
および実施例5参照)を挿入することができ、その結果
共同組込み組換体が生じる。
オネイン遺伝子(Marin、 M、 and R,1
,Richards (19B2)Nucleic A
c1ds Res 、 10 : 3165−3173
および実施例5参照)を挿入することができ、その結果
共同組込み組換体が生じる。
本実施例で行う手順は、dsDNA断片にEco RI
う手順と同様である(第11図)。手順はよく似ている
ので、 nif !(−Pについての実験手順のみを示
す。nif D−Pについては、 Hin dII[の
ところを■虹■にすれば良い(第11図と第13図を比
較せよ)。
う手順と同様である(第11図)。手順はよく似ている
ので、 nif !(−Pについての実験手順のみを示
す。nif D−Pについては、 Hin dII[の
ところを■虹■にすれば良い(第11図と第13図を比
較せよ)。
得られたDNA断片(nif )l−I’については約
551塩基対)を次にに虹RI (nif H−P)で
切断したpBR322ヘクローン化する (第14図)
。適当なエセリシア・コリー(Escherichia
colt)宿主株へ形質転換、増幅後5組換プラスミ
ドをEco R1(nif It−P)で部分分解しく
第14図)、そしてはみ出し部分を除去する為に短時間
S1ヌクレアーゼで処理する。
551塩基対)を次にに虹RI (nif H−P)で
切断したpBR322ヘクローン化する (第14図)
。適当なエセリシア・コリー(Escherichia
colt)宿主株へ形質転換、増幅後5組換プラスミ
ドをEco R1(nif It−P)で部分分解しく
第14図)、そしてはみ出し部分を除去する為に短時間
S1ヌクレアーゼで処理する。
組換体を次いでEco RI (第14図)で切断し、
2末鎖nif調節断片をニRI切断したpRK290
D N Aへクローン化する(詳細は第15図参照)。
2末鎖nif調節断片をニRI切断したpRK290
D N Aへクローン化する(詳細は第15図参照)。
得られた組換体はI]RK290− n1f−プロモー
ター断片構築物である( pRK290−社f !(−
PまたはpRK290旦f ll−P)。
ター断片構築物である( pRK290−社f !(−
PまたはpRK290旦f ll−P)。
pRK290は広宿主域プラスミドである。
次の段階は対象となる外来遺伝子を含むDNA断片の単
離と、これら断片への合成Eco RIリンカ−の連結
である。これらの修飾された断片を次にに乞RI切断し
たベクターDNA (すなわちpRK290−nifプ
ロモーター断片構築物)に連結し、“混成”組換体(p
RK290−nifプロモーター断片−外来遺伝子)(
第15図)とし、エセリシア・コリー(Escheri
−chia coli)宿主株1例えば17−1または
RRlへ形質転換する。混成組換体を次に、必要であれ
ばヘルパープラスミドを用い、細菌接合によりリゾビウ
ム°ジャポニカム(Rhizobium japoni
cum)へ移す。
離と、これら断片への合成Eco RIリンカ−の連結
である。これらの修飾された断片を次にに乞RI切断し
たベクターDNA (すなわちpRK290−nifプ
ロモーター断片構築物)に連結し、“混成”組換体(p
RK290−nifプロモーター断片−外来遺伝子)(
第15図)とし、エセリシア・コリー(Escheri
−chia coli)宿主株1例えば17−1または
RRlへ形質転換する。混成組換体を次に、必要であれ
ばヘルパープラスミドを用い、細菌接合によりリゾビウ
ム°ジャポニカム(Rhizobium japoni
cum)へ移す。
この混成組換体を有するリゾビウム・ジャポニカム(R
hizobium japonicum)菌を用いて次
に植物を感染させ、その後外来mRNAおよび/または
タンパク質を当業者によく知られた標準方法により分析
する。
hizobium japonicum)菌を用いて次
に植物を感染させ、その後外来mRNAおよび/または
タンパク質を当業者によく知られた標準方法により分析
する。
ハシラス・チューリンギエンシス(Bacillus
thu−ringiensis)の毒性結晶タンパク質
をコードする遺伝子が挿入された組換プラスミドは既報
(Wong。
thu−ringiensis)の毒性結晶タンパク質
をコードする遺伝子が挿入された組換プラスミドは既報
(Wong。
H,C,、5chnepf、 tL E、 and H
,R,Whiteley (1983)J、 Biol
、 Chem、 258 : 1960−1967)の
手法により得られる。プラスミドベクターpBR322
,およびハシラス・チューリンギエンシス(Bacil
lus thurin−giensis)の巨大プラス
ミドの線状型に相同なりNAと同様に、 30.32お
よび37メガダルトンプラスミドに相同なりNA、から
成る組換プラスミドpH31(ATCCNo、3199
5)をEco RIで部分切断し、 !fA状分子を得
る。この部分分解産物を次いで酵素Ava Tで制限切
断する。分解条件は試供者の指示に従う。
,R,Whiteley (1983)J、 Biol
、 Chem、 258 : 1960−1967)の
手法により得られる。プラスミドベクターpBR322
,およびハシラス・チューリンギエンシス(Bacil
lus thurin−giensis)の巨大プラス
ミドの線状型に相同なりNAと同様に、 30.32お
よび37メガダルトンプラスミドに相同なりNA、から
成る組換プラスミドpH31(ATCCNo、3199
5)をEco RIで部分切断し、 !fA状分子を得
る。この部分分解産物を次いで酵素Ava Tで制限切
断する。分解条件は試供者の指示に従う。
毒性結晶タンパク遺伝子に対するプローブを単離し、既
報(Wong、 H,C,et al、 (1983)
上記)に従い放射能ラベルする。制限断片をアガロース
ゲル電気泳動で分離すると約15キロベース(k b
)の−断片がラベルしたプローブとハイブリダイズする
。
報(Wong、 H,C,et al、 (1983)
上記)に従い放射能ラベルする。制限断片をアガロース
ゲル電気泳動で分離すると約15キロベース(k b
)の−断片がラベルしたプローブとハイブリダイズする
。
この断片はEco RI断片のDとFを含む(Wong
、 H。
、 H。
C,et at、 (1983)上記)。この15kb
断片を次に標準操作(Messing、 J、ancl
J、 Vieira (1982) Gene19
: 269−276)によりM13mp8またはM1
3mp9へクローン化し、そしてエセリシア・コリー(
Escheri−chia coli) JM103へ
形質転換する。放出されたファージ粒子から1本鎖DN
Aを精製し1合成プライマー(5’−TGTTATCC
A−T匹GTTACCTCC−3’)を用いてインビト
ロで複製させる(部位特異的変異の一般法はZolle
r、 M、 J、 and M、 Sm1th (19
82) Nucle−ic Ac1ds Re5ear
ch刊: 6487−6500にある)。得られた2本
鎖組換プラスミドをエセリシア・コリー(Escher
ichia colt) JM103へ戻し形質転換し
。
断片を次に標準操作(Messing、 J、ancl
J、 Vieira (1982) Gene19
: 269−276)によりM13mp8またはM1
3mp9へクローン化し、そしてエセリシア・コリー(
Escheri−chia coli) JM103へ
形質転換する。放出されたファージ粒子から1本鎖DN
Aを精製し1合成プライマー(5’−TGTTATCC
A−T匹GTTACCTCC−3’)を用いてインビト
ロで複製させる(部位特異的変異の一般法はZolle
r、 M、 J、 and M、 Sm1th (19
82) Nucle−ic Ac1ds Re5ear
ch刊: 6487−6500にある)。得られた2本
鎖組換プラスミドをエセリシア・コリー(Escher
ichia colt) JM103へ戻し形質転換し
。
増幅させる。増幅した2本鎖プラスミドDNAをエセリ
シア・コリー(Escherichia colt)
JM103菌体から精製し、制限エンドヌクレアーゼ
Nco IおよびAva Iで切断する。Neo rは
合成プライマーの部位(毒性結晶タンパク遺伝子の開始
部位)で切断し+ Ava 1はこの毒性結晶タンパク
遺伝子の3”−末端の下流部位で切断する。はみ出し部
分は平滑末端になるように埋める(Maniatis、
T、+Jeffrey+ A、 and D、 G、
Kleid (1975) Proc、 Nat。
シア・コリー(Escherichia colt)
JM103菌体から精製し、制限エンドヌクレアーゼ
Nco IおよびAva Iで切断する。Neo rは
合成プライマーの部位(毒性結晶タンパク遺伝子の開始
部位)で切断し+ Ava 1はこの毒性結晶タンパク
遺伝子の3”−末端の下流部位で切断する。はみ出し部
分は平滑末端になるように埋める(Maniatis、
T、+Jeffrey+ A、 and D、 G、
Kleid (1975) Proc、 Nat。
Acad、 Sci、 U、S、八、 72
:1184−1188)。
:1184−1188)。
最後にpsUP204 (第11図)由来のpRj−
nif H−P/5S204組換プラスミドをEco
RIで切断し、はみ出し部を平滑末端に埋める。Hin
dllrリンカ−を次いで、ハシラス・チューリンギエ
ンシス(Bacillusthuringiensis
)の毒性結晶タンパク遺伝子断片。
nif H−P/5S204組換プラスミドをEco
RIで切断し、はみ出し部を平滑末端に埋める。Hin
dllrリンカ−を次いで、ハシラス・チューリンギエ
ンシス(Bacillusthuringiensis
)の毒性結晶タンパク遺伝子断片。
およびpRj一旦f )I−P/5S204組換体両方
につける。
につける。
両成分をHindlI[で分解後、この毒性結晶タンパ
ク遺伝子とpRj−社r II−P/5S204 Mi
換プラスミドを共に連結し、 pRj一旦f H−P/
5S204−ハシラス・チューリンギエンシス(Bac
illus thuringiensis)毒性結晶タ
ンパク遺伝子混成体を得る。混合物を適当なエセリシア
・コリー(Escherichia coli)宿主。
ク遺伝子とpRj−社r II−P/5S204 Mi
換プラスミドを共に連結し、 pRj一旦f H−P/
5S204−ハシラス・チューリンギエンシス(Bac
illus thuringiensis)毒性結晶タ
ンパク遺伝子混成体を得る。混合物を適当なエセリシア
・コリー(Escherichia coli)宿主。
例えばに802.5Ml0またはRRIへ形質転換する
。
。
プラスミドを各コロニーから単離し1方向性を制限地図
により決定する。正しい方向性を有するプラスミドを含
むコロニーをリゾビウム・ジャポニカム(Rhizob
ium japonicum)に接合させ、プラスミド
を既述(実施例3および実施例4)のように転送する。
により決定する。正しい方向性を有するプラスミドを含
むコロニーをリゾビウム・ジャポニカム(Rhizob
ium japonicum)に接合させ、プラスミド
を既述(実施例3および実施例4)のように転送する。
mRNAおよび/または毒性結晶タンパク質の生成を既
述(Wong、 et al、上記)のように調べる。
述(Wong、 et al、上記)のように調べる。
列4戸り入
この実施例は以下の一般的な原理に基づいている。2つ
の基本的な成分が必要である。それらは。
の基本的な成分が必要である。それらは。
(1)自殺ベクター、および(2)トランスボッ′ンで
ある。
ある。
自殺ベクターは1つのバクテリアの宿主(この場合、エ
セリシア・コリー(Escherichia colt
))では安定に複製するが、異なるバクテリア種(例え
ば、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium
japo−nicum) )では複製出来ないプラスミ
ド分子である。
セリシア・コリー(Escherichia colt
))では安定に複製するが、異なるバクテリア種(例え
ば、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium
japo−nicum) )では複製出来ないプラスミ
ド分子である。
トランスポゾンは、DNA中を1つの位置から他へと動
く (転位する)ことができる遺伝的要素である。転位
過程はトランスホモン上にコードされている遺伝子産物
により媒介され、トランスポゾンの各端に位置する(同
方向あるいは逆方向に繰返している)反復配列の完全性
に依存している。
く (転位する)ことができる遺伝的要素である。転位
過程はトランスホモン上にコードされている遺伝子産物
により媒介され、トランスポゾンの各端に位置する(同
方向あるいは逆方向に繰返している)反復配列の完全性
に依存している。
トランスポゾンは一般的に、1つくあるいは複数の)抗
生物質に対する耐性をコードしている1つの遺伝子(あ
るいは複数の遺伝子)を持つ。
生物質に対する耐性をコードしている1つの遺伝子(あ
るいは複数の遺伝子)を持つ。
以下に概略を示す手順では、 Ta2と表されるトラン
スボッ゛ンと自殺ベクターpsUP1011 (Si
mon。
スボッ゛ンと自殺ベクターpsUP1011 (Si
mon。
R,、Pr1efer、 U、and A、Pt+h
ler (1981)Proc、ofBielefe
ld Symposium+ Springer−V
erlag、WestGermany) (第16図参
照)を用いる。
ler (1981)Proc、ofBielefe
ld Symposium+ Springer−V
erlag、WestGermany) (第16図参
照)を用いる。
トランスポゾンTn5は長さが5.7キロ塩基(kb)
のDNA要素で、 2.7 kbの中心領域に隣接する
1、5kbの逆反復配列から成る。逆反復配列の1つの
中に転位に必要な機能がコードされている。トランスポ
ゾンの中心領域は抗生物質、カナマイシンに耐性(Km
’ )な遺伝子を持っている。中心領域の中央に、制限
エンドヌクレアーゼ展旧に認識されるDNA配列がある
。自殺ベクターpSUP 1011には、 Bam H
lにより認識され、切断される。 Tn5要素内に在る
ものと同じ1部位が唯一存在する。
のDNA要素で、 2.7 kbの中心領域に隣接する
1、5kbの逆反復配列から成る。逆反復配列の1つの
中に転位に必要な機能がコードされている。トランスポ
ゾンの中心領域は抗生物質、カナマイシンに耐性(Km
’ )な遺伝子を持っている。中心領域の中央に、制限
エンドヌクレアーゼ展旧に認識されるDNA配列がある
。自殺ベクターpSUP 1011には、 Bam H
lにより認識され、切断される。 Tn5要素内に在る
ものと同じ1部位が唯一存在する。
実験(Simon+ R,l Prjefer、 U、
and A、 Puhler (1981) Pro
c、 of Bielefeld Symposium
+ Springer−Verlag+ West G
ermany)では、 Ta2のBam旧部位にDNA
断片を挿入することは、正常な転位や。
and A、 Puhler (1981) Pro
c、 of Bielefeld Symposium
+ Springer−Verlag+ West G
ermany)では、 Ta2のBam旧部位にDNA
断片を挿入することは、正常な転位や。
結果として生じた“ハイブリッド トランスボゾンのカ
ナマイシン耐性遺伝子の発現を阻止することはないと示
している。
ナマイシン耐性遺伝子の発現を阻止することはないと示
している。
導入すべきDNA断片はいくつかの方法で得られる。
(1)同じで、相補的で、−重鎖の末端を持つ断片を生
じるハm HI、 Sa且」Δ、熊oI等で完全に、あ
るいは部分的に制限切断する。
じるハm HI、 Sa且」Δ、熊oI等で完全に、あ
るいは部分的に制限切断する。
(2)平滑末端を持つDNA断片を生じる制限エンドヌ
クレアーゼで完全に、あるいは部分的に分解する。
クレアーゼで完全に、あるいは部分的に分解する。
(3)(一般的に)平滑末端であるランダムな断片を生
じるM 、l+ +イオン存在下で、酵素I) N A
aselでDNAを分解する。
じるM 、l+ +イオン存在下で、酵素I) N A
aselでDNAを分解する。
自殺ベクター(psUPloll )D N Aを、ク
ローン化すべき断片の型(上記)により以下に従い処理
する。
ローン化すべき断片の型(上記)により以下に従い処理
する。
(1)エンドヌクレアーゼBam旧で完全分解し、アル
カリホスファターゼ処理する。
カリホスファターゼ処理する。
+21B a m旧で完全分解し、以下のどれかを行う
:fa)一本鎖末端を除くためS1ヌクレアーゼで処理
する。あるいは 中)デオキシヌクレオチド3リン酸の存在下で逆転写酵
素またはDNAポリメラーゼのクレノー断片を用いて一
本鎖末端を“埋め込む”。
:fa)一本鎖末端を除くためS1ヌクレアーゼで処理
する。あるいは 中)デオキシヌクレオチド3リン酸の存在下で逆転写酵
素またはDNAポリメラーゼのクレノー断片を用いて一
本鎖末端を“埋め込む”。
上記の各処理の次に、アルカリホスファターゼ処理する
。
。
クローニング:上記で調製したベクターと断片DNAを
混合し、酵素T4DNAリガーゼで処理する。連結した
DNAは、エセリシア・コリー(Escherichi
a colt)株5M10へ形質転換(導入)する。
混合し、酵素T4DNAリガーゼで処理する。連結した
DNAは、エセリシア・コリー(Escherichi
a colt)株5M10へ形質転換(導入)する。
(この鎖はpsUP1011誘導体(組換プラスミド)
を他のグラム陰性菌へと移動できる(Mob”) )
(Simon+ r+、l Pr1efer+ U、
and A、 Puhler (1981)Proc、
of Bielefeld Symposium、 S
pringer−Verlag+West Germa
nい。得られた形質転換体を、GrunsteinとI
(ognessのコロニーハイブリダイゼーション手順
(Grunsteir++ M、 and D、 S、
Hogness (1975) Proc。
を他のグラム陰性菌へと移動できる(Mob”) )
(Simon+ r+、l Pr1efer+ U、
and A、 Puhler (1981)Proc、
of Bielefeld Symposium、 S
pringer−Verlag+West Germa
nい。得られた形質転換体を、GrunsteinとI
(ognessのコロニーハイブリダイゼーション手順
(Grunsteir++ M、 and D、 S、
Hogness (1975) Proc。
Nat、、 Acad、 Set、 U、S、A、 7
2 : 3961)により選別して、所望のクローン化
DNA断片を含むものを検出する。
2 : 3961)により選別して、所望のクローン化
DNA断片を含むものを検出する。
クローン化DNA断片をあらゆるダラム陰性菌(例えば
、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiumj
apon icum) )に導入することは、細菌接合
と呼ばれる過程を経て達成される。所望のpsUP10
11組換体を持つエセリシア・コリー(Escheri
chia colt)SMIO誘導体を栄養寒天プレー
トの表面上で、 (カナマイシン感受性)リゾビウム・
ジャポニカム(Rhizobium japonicu
m)の菌体と混ぜる。プレートをある時間(4〜16時
間)29〜30℃(リゾビウム・ジャポニカム(Rhi
zobium japonicum)の最適温度)でイ
ンキュベートすると、この間に各タイプの菌体が物理的
接触(接合) L、 psUP1011誘導体がエセ
リシア・コリー(Escheriehia coli)
からりゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium
japonicum)へと転送される。菌の混合液をプ
レートより洗い出し、カナマイシン耐性のりゾビウム・
ジャポニカム(Rhizobium japonicu
m)を選択する寒天プレート上に広げる。得られたコロ
ニーは、 Tn5内のクローン化DNA断片がゲノムの
同じ位置に挿入されているリゾビウム・ジャポニカム(
Rhizobiumjaponicum)の誘導体であ
ろう。カナマイシン耐性の選択は、挿入されたDNAの
維持を確証する。
、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiumj
apon icum) )に導入することは、細菌接合
と呼ばれる過程を経て達成される。所望のpsUP10
11組換体を持つエセリシア・コリー(Escheri
chia colt)SMIO誘導体を栄養寒天プレー
トの表面上で、 (カナマイシン感受性)リゾビウム・
ジャポニカム(Rhizobium japonicu
m)の菌体と混ぜる。プレートをある時間(4〜16時
間)29〜30℃(リゾビウム・ジャポニカム(Rhi
zobium japonicum)の最適温度)でイ
ンキュベートすると、この間に各タイプの菌体が物理的
接触(接合) L、 psUP1011誘導体がエセ
リシア・コリー(Escheriehia coli)
からりゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium
japonicum)へと転送される。菌の混合液をプ
レートより洗い出し、カナマイシン耐性のりゾビウム・
ジャポニカム(Rhizobium japonicu
m)を選択する寒天プレート上に広げる。得られたコロ
ニーは、 Tn5内のクローン化DNA断片がゲノムの
同じ位置に挿入されているリゾビウム・ジャポニカム(
Rhizobiumjaponicum)の誘導体であ
ろう。カナマイシン耐性の選択は、挿入されたDNAの
維持を確証する。
この段階では、 TnS内のDNA断片がリゾビウム・
ジャポニカム(Rhizobium japonicu
m )の染色体に転送されたか、あるいはそのいくつか
のプラスミドの1つに転送されたかばわからない。この
問題は、水平型アガロースゲル電気泳動後、エチジウム
プロミド染色によりプラスミドやバクテリア染色体を視
覚化することにより解決される(Djordjevic
、 M、 A、、 Zurkoiyski、 W、 a
nd B、 G。
ジャポニカム(Rhizobium japonicu
m )の染色体に転送されたか、あるいはそのいくつか
のプラスミドの1つに転送されたかばわからない。この
問題は、水平型アガロースゲル電気泳動後、エチジウム
プロミド染色によりプラスミドやバクテリア染色体を視
覚化することにより解決される(Djordjevic
、 M、 A、、 Zurkoiyski、 W、 a
nd B、 G。
Rolfe (1982) J、 Bacteriol
、151 : 560−568)。
、151 : 560−568)。
子の発塊
リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium ja
po−nicum)nif HfJ域にコードされてい
るポリペプチドをエセリシア・コリー(Escheri
chia coli)のミニセル中で分析した。この目
的のために、 nif Hを含むEco R1断片をp
A’cUc184のクロラムフェニコール耐性遺伝子へ
2つの考えられる方向でクローン化し、 pRJ700
3とpRJ7004を得た(第5図)。
po−nicum)nif HfJ域にコードされてい
るポリペプチドをエセリシア・コリー(Escheri
chia coli)のミニセル中で分析した。この目
的のために、 nif Hを含むEco R1断片をp
A’cUc184のクロラムフェニコール耐性遺伝子へ
2つの考えられる方向でクローン化し、 pRJ700
3とpRJ7004を得た(第5図)。
発現はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ遺伝子の強力なプロモーターにより媒介された。pR
J7003は1分子量33.000および32.000
の2つのタンパク質の合成をコードしている。逆方向(
pRJ7004)では、 20,000の分子量のタン
パク質が作られ、その方向に長い、オープンリーディン
グフレームが存在することを示した。pRJ 7003
のTn5挿入誘導体を構築し、コードしているタンパク
質の発現にどの変異が極性効果を及ぼすかを見るために
試験した。33/32にのダブレットは、変異プラスミ
ドpRJ7003 ::Tn5−31で合成されるが。
ゼ遺伝子の強力なプロモーターにより媒介された。pR
J7003は1分子量33.000および32.000
の2つのタンパク質の合成をコードしている。逆方向(
pRJ7004)では、 20,000の分子量のタン
パク質が作られ、その方向に長い、オープンリーディン
グフレームが存在することを示した。pRJ 7003
のTn5挿入誘導体を構築し、コードしているタンパク
質の発現にどの変異が極性効果を及ぼすかを見るために
試験した。33/32にのダブレットは、変異プラスミ
ドpRJ7003 ::Tn5−31で合成されるが。
pRJ7003 ::Tn5−22あるいはpRJ70
03 ::Tn5−45 (第5図)では合成されず、
このことから、 33732gのタンパク質はTn5挿
入番号45と31の間のD N A tij域にコード
されており、挿入番号45および22での極性効果が転
写の方向を決めていることが示唆された(第5図)。
03 ::Tn5−45 (第5図)では合成されず、
このことから、 33732gのタンパク質はTn5挿
入番号45と31の間のD N A tij域にコード
されており、挿入番号45および22での極性効果が転
写の方向を決めていることが示唆された(第5図)。
第1図は、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizo−b
ium japonicum)のnif D遺伝子の全
塩基配列とnif K遺伝子の部分配列、およびそれか
ら想定されるnif Kのリボゾウム結合部位である。 第2図は、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizo−b
ium japonicum)のnif H遺伝子の全
塩基配列とそれから想定される遺伝子産物のアミノ酸配
列を示す。ATG開始コドンの8bp上流に完全なりポ
ジラム結合部位(下線で示す)がある。転写開始点(G
)を矢印で示す。 第3図は、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizo−b
ium japonicum)のnif D遺伝子のコ
ドン使用頻度を示す。 第4図は、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizo−b
ium japonicum)および他の種のnif
D 、 nif I+遺伝子などの転写開始点(下線)
の上流の類似構造の比較を示す。 第5図は、各種ベクターに挿入されたnif遺伝子の物
理的マツプである。 第6図は宿主ゲノム陰性菌の染色体(DC)を組込んだ
自殺ベクター(SV)へ外来遺伝子を挿入した混成組換
体を示す。DI+は薬剤耐性遺伝子。 第7図は、自殺ベクター中の組込まれた宿主細菌の染色
体内への外来挿入を示す。 第8図は自殺ベクターに組込まれたトランスボゾン(T
n)内への挿入例を示す。 第9図はりゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiu
mjapon icum)の恒f rlK遺伝子領域の
制限地図とシーフェンスの方針を示す。 第10図は、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizo−
bium japonicum)のn1fl+遺伝子の
りポジラム結合部位への合成りNAプライマー結合断片
の作成手順を示し。 第11図は、これの広宿主域ベクターpSUP204へ
のクローニング手順を示す。 第12図は、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizo〜
bium japonicum)のnif D遺伝子の
りホゾラム結合部位への合成りNAプライマー結合断片
の作成手順を示し。 第13図は、これの広宿主域ベクターpsUP204へ
のクローニング手順を示す。 第14図は第11図で得られたpRj一旦f H−P/
5S204拳 のEco R1断片をpBR322に組込んだプラスミ
ドからのn1fll制御断片の調製を示し、第15図は
これを広宿主域ヘクターpRK290ヘクローニングし
、そこへ外来遺伝子を導入する手順を示す。 第16図は、 psUPlollの構造を示す。 以上
ium japonicum)のnif D遺伝子の全
塩基配列とnif K遺伝子の部分配列、およびそれか
ら想定されるnif Kのリボゾウム結合部位である。 第2図は、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizo−b
ium japonicum)のnif H遺伝子の全
塩基配列とそれから想定される遺伝子産物のアミノ酸配
列を示す。ATG開始コドンの8bp上流に完全なりポ
ジラム結合部位(下線で示す)がある。転写開始点(G
)を矢印で示す。 第3図は、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizo−b
ium japonicum)のnif D遺伝子のコ
ドン使用頻度を示す。 第4図は、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizo−b
ium japonicum)および他の種のnif
D 、 nif I+遺伝子などの転写開始点(下線)
の上流の類似構造の比較を示す。 第5図は、各種ベクターに挿入されたnif遺伝子の物
理的マツプである。 第6図は宿主ゲノム陰性菌の染色体(DC)を組込んだ
自殺ベクター(SV)へ外来遺伝子を挿入した混成組換
体を示す。DI+は薬剤耐性遺伝子。 第7図は、自殺ベクター中の組込まれた宿主細菌の染色
体内への外来挿入を示す。 第8図は自殺ベクターに組込まれたトランスボゾン(T
n)内への挿入例を示す。 第9図はりゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiu
mjapon icum)の恒f rlK遺伝子領域の
制限地図とシーフェンスの方針を示す。 第10図は、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizo−
bium japonicum)のn1fl+遺伝子の
りポジラム結合部位への合成りNAプライマー結合断片
の作成手順を示し。 第11図は、これの広宿主域ベクターpSUP204へ
のクローニング手順を示す。 第12図は、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizo〜
bium japonicum)のnif D遺伝子の
りホゾラム結合部位への合成りNAプライマー結合断片
の作成手順を示し。 第13図は、これの広宿主域ベクターpsUP204へ
のクローニング手順を示す。 第14図は第11図で得られたpRj一旦f H−P/
5S204拳 のEco R1断片をpBR322に組込んだプラスミ
ドからのn1fll制御断片の調製を示し、第15図は
これを広宿主域ヘクターpRK290ヘクローニングし
、そこへ外来遺伝子を導入する手順を示す。 第16図は、 psUPlollの構造を示す。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、(a)ベクター、 (b)リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium
japonicum)細菌のニトロゲナーゼ複合遺伝子
のプロモーター、および (c)該プロモーターの制御下にある構造遺伝子、 を有する組換DNAプラスミドを含み、そこで複製する
細菌株。 2、前記ベクターがpRK290である特許請求の範囲
第1項に記載の細菌株。 3、前記構造遺伝子が外来遺伝子である特許請求の範囲
第1項に記載の細菌株。 4、前記プロモーターが¥nif¥Hプロモーターであ
る特許請求の範囲第1項に記載の細菌株。 5、前記¥nif¥Hプロモーターがヌクレオチド配列
【ヌクレオチド配列があります】 は厳密な条件下で、これとハイブリダイズし得る機能的
に等価な配列を含む特許請求の範囲第4項に記載の細菌
株。 6、前記プロモーターが¥nif¥Dプロモーターであ
る特許請求の範囲第1項に記載の細菌株。 7、前記¥nif¥Dプロモーターがヌクレオチド配列
【ヌクレオチド配列があります】 または厳密な条件下でこれとハイブリ ダイズし得る機能的に等価な配列を含む特許請求の範囲
第6項に記載の細菌株。 8、前記構造遺伝子が外来遺伝子である特許請求の範囲
第1項に記載の細菌株。 9、前記構造遺伝子がヒトのプロラクチン遺伝子である
特許請求の範囲第1項に記載の細菌株。 10、前記構造遺伝子がヒトのメタロチオネイン遺伝子
である特許請求の範囲第1項に記載の細菌株。 11、前記構造遺伝子がバシラス・チューリンギェンシ
ス(Bacillus thuringiensis)
の細菌毒素遺伝子である特許請求の範囲第1項に記載の
細菌株。 12、(a)ベクター、および (b)リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium
japonicum)細菌のニトロゲナーゼ複合遺伝子
のプロモーター、 を有する組換DNAプラスミド。 13、前記ベクターがpRK290またはpSUP20
4である特許請求の範囲第12項に記載の組換DNAプ
ラスミド。 14、前記プロモーターが¥nif¥Hプロモーターで
ある特許請求の範囲第12項に記載の組換DNAプラス
ミド。 15、前記¥nif¥Hプロモーターがヌクレオチド配
列【ヌクレオチド配列があります】ま たは厳密な条件下でこれとハイブリダイズし得る機能的
に等価な配列を含む特許請求の範囲第14項に記載の組
換DNAプラスミド。 16、前記プロモーターが¥nif¥Dプロモーターで
ある特許請求の範囲第12項に記載の組換DNAプラス
ミド。 17、前記¥nif¥Dプロモーターがヌクレオチド配
列【ヌクレオチド配列があります】 または厳密な条件下でこれとハイブ リダイズし得る機能的に等価な配列を含む特許請求の範
囲第16項に記載の組換DNAプラスミド。 18、さらに前記プロモーターの制御下で発現し得るよ
うな方向と位置に挿入された構造遺伝子を含む特許請求
の範囲第12項に記載の組換DNAプラスミド。 19、前記構造遺伝子がリゾビウム(Rhizobiu
m)種から得られた特許請求の範囲第12項に記載の組
換DNAプラスミド。 20、前記構造遺伝子がリゾビウム・トリフォリ(Rh
izobium trifolii)またはリゾビウム
・メリロティ(Rhizobium meliloti
)から得られた特許請求の範囲第12項に記載の組換D
NAプラスミド。 21、前記構造遺伝子がパラスポニア・リゾビウム(P
arasponia Rhizobium)から得られ
た特許請求の範囲第12項に記載の組換DNAプラスミ
ド。 22、前記構造遺伝子が外来遺伝子である特許請求の範
囲第12項に記載の組換DNAプラスミド。 23、前記構造遺伝子がヒトのプロラクチン遺伝子また
はヒトのメタロチオネイン遺伝子である特許請求の範囲
第12項に記載の組換DNAプラスミド。 24、前記構造遺伝子が毒素遺伝子である特許請求の範
囲第12項に記載の組換DNAプラスミド。 25、前記毒素遺伝子がバシラス・チューリンギェンシ
ス(Bacillus thuringiensis)
の細菌毒素遺伝子である特許請求の範囲第24項に記載
の組換DNAプラスミド。 26、リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium
japonicum)細菌のニトロゲナーゼ複合遺伝子
のプロモーターの制御下で構造遺伝子を発現させる方法
であって、 (a)ニトロゲナーゼ複合遺伝子の該プロモーターの単
離、 (b)ニトロゲナーゼ複合遺伝子の該プロモーターの、
組換DNAプラスミドを生ずる広宿主域プラスミドへの
クローニング、 (c)外来構造遺伝子を有するDNA断片の単離、およ
び該DNA断片の該組換DNAプラスミドへの、共同取
込み組換プラスミドを生ずるニトロゲナーゼ複合読み取
り鎖の該プロモーターの3′側の位置での挿入、そして
そこで該DNA断片が該ニトロゲナーゼ複合遺伝子の該
プロモーターに関し、その制御下で発現するような方向
にある、 (d)該共同取込み組換プラスミドの、植物細胞と共生
関係を有するリゾビウム・ジャポニカム(Rhizob
ium japonicum)株への形質転換、および
(e)該外来構造遺伝子によりコードされるmRNAま
たはタンパク質の発現が生ずる該リゾビウム・ジャポニ
カム(Rhizobium japonicum)株に
よる大豆植物の感染、 の段階を含む方法。 27、前記プロモーターが¥nif¥Hプロモーターで
ある特許請求の範囲第26項に記載の方法。 28、前記¥nif¥Hプロモーターがヌクレオチド配
列【ヌクレオチド配列があります】ま たは厳密な条件下でそれとハイブリダイズし得る機能的
に等価な配列を含む特許請求の範囲第27項に記載の方
法。 29、前記プロモーターが¥nif¥Dプロモーターで
ある特許請求の範囲第26項に記載の方法。 30、前記¥nif¥Dプロモーターがヌクレオチド配
列【ヌクレオチド配列があります】 または厳密な条件下でそれとハイブ リダイズし得る機能的に等価な配列を含む特許請求の範
囲第29項に記載の方法。 31、前記広宿主域プラスミドがpRK290またはp
SUP204である特許請求の範囲第26項に記載の方
法。 32、DNA配列をエセリシア・コリー(Esche−
richia coli)以外のリゾビウム・ジャポニ
カム(Rhizobium japonicum)の染
色体へ組み込ませる方法であって、 (a)組み込まれるべき配列を含むDNA断片の単離、 (b)組換DNAプラスミドを生ずるための、自殺ベク
ター上にあるトランスポゾン、該トランスポゾンはその
トランスポゾン内に含まれる選択可能な耐性遺伝子を有
する、への該DNA断片の挿入、 (c)該組換DNAプラスミドの、該自殺ベクターを該
リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium ja
−ponicum)へ移動させ得る、第1の細菌株への
形質転換、 (d)該組換DNAプラスミドの、該第1細菌株から該
リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobium ja
−ponicum)の該染色体への、細菌の接合に続く
組み換えによる転移、 (e)該リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobiu
mjaponicum)の、該選択可能な耐性遺伝子の
存在を要求する条件下での増殖、および (f)段階(e)で得られた該リゾビウム・ジャポニカ
ム(Rhizobium japonicum)のコロ
ニーの選択、そこで組み込まれるべき配列を含む該DN
A断片が該リゾビウム・ジャポニカム(Rhizobi
um japo−nicum)の該染色体と組み換えを
している、段階を包含する方法。 33、前記DNA断片がアグロバクテリウム(Agro
bacterium)属の種のゲノムに由来する特許請
求の範囲第32項に記載の方法。 34、前記DNA断片がリゾビウム(Rhizobiu
m)属の種のゲノムに由来する特許請求の範囲第32項
に記載の方法。 35、リゾビウム(Rhizobium)属の前記種が
リゾビウム・トリフォリ(Rhizobium tri
folii)である特許請求の範囲第34項に記載の方
法。 36、リゾビウム(Rhizobium)属の前記種が
パラスポニア・リゾビウム(Parasponia R
hizobium)である特許請求の範囲第34項に記
載の方法。 37、前記自殺ベクターがpSUP1011である特許
請求の範囲第32項に記載の方法。 38、前記選択可能な耐性遺伝子を有する前記トランス
ポゾンがカナマイシン耐性遺伝子を有するトランスポゾ
ンTn5である特許請求の範囲第32項に記載の方法。 39、前記自殺ベクターを移動させ得る細菌の前記株が
エセリシア・コリー(Escherichia col
i)SM10である特許請求の範囲第32項に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61843984A | 1984-06-08 | 1984-06-08 | |
US618439 | 1984-06-08 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6152279A true JPS6152279A (ja) | 1986-03-14 |
Family
ID=24477681
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60124999A Pending JPS6152279A (ja) | 1984-06-08 | 1985-06-07 | リゾビウム・ジヤポニカムのnifプロモ−タ− |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0164245A3 (ja) |
JP (1) | JPS6152279A (ja) |
AU (1) | AU587978B2 (ja) |
IL (1) | IL75440A0 (ja) |
NZ (1) | NZ212266A (ja) |
ZA (1) | ZA853861B (ja) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU574048B2 (en) * | 1982-10-08 | 1988-06-30 | State Of Oregon Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University, The | Hydrogen uptake gene cosmid and process of constructing same |
AU580064B2 (en) * | 1984-06-04 | 1988-12-22 | Lubrizol Genetics Inc. | Nitrogen fixation regulator genes |
DE3585275D1 (de) * | 1984-12-10 | 1992-03-05 | Monsanto Co | Einsetzung des bacillus thuringiensis kristallproteingens in pflanzen kolonisierende mikroorganismen und deren verwendung. |
CA1341283C (en) * | 1985-03-28 | 2001-08-14 | Frank H. Gaertner | Biological pesticides and methods for their delivery and use |
ZA864898B (en) * | 1985-07-18 | 1987-03-25 | Lubrizol Genetics Inc | Insecticidal phizobiaceae cells |
US4803165A (en) * | 1985-08-07 | 1989-02-07 | Lubrizol Genetics, Inc. | Nif promoter of fast-growing rhizobium japonicum |
GB8619008D0 (en) * | 1986-08-04 | 1986-09-17 | Ashby A M | Plant treatment method |
US5308616A (en) * | 1990-08-06 | 1994-05-03 | The Johns Hopkins University | Mutant strain of Bradyrhizobium japonicum |
MXPA02003920A (es) * | 2002-04-19 | 2003-10-22 | Univ Mexico Nacional Autonoma | Biofertilizante para plantas basado en bacterias de rhizobium con capacidad mejorada de fijacion de nitrogeno. |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ208557A (en) * | 1983-06-22 | 1988-11-29 | Lubrizol Genetics Inc | Recombinant nif (nitrogen fixation) promoters - foreign structural gene combinations, plasmids, transformants and method of expressing the structural gene in plants |
US4626504A (en) * | 1983-07-01 | 1986-12-02 | Lubrizol Genetics, Inc. | DNA transfer vector for gram-negative bacteria |
AU580064B2 (en) * | 1984-06-04 | 1988-12-22 | Lubrizol Genetics Inc. | Nitrogen fixation regulator genes |
-
1985
- 1985-05-21 ZA ZA853861A patent/ZA853861B/xx unknown
- 1985-05-29 EP EP85303750A patent/EP0164245A3/en not_active Withdrawn
- 1985-05-31 NZ NZ212266A patent/NZ212266A/xx unknown
- 1985-06-07 JP JP60124999A patent/JPS6152279A/ja active Pending
- 1985-06-07 AU AU43426/85A patent/AU587978B2/en not_active Ceased
- 1985-06-07 IL IL75440A patent/IL75440A0/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NZ212266A (en) | 1989-02-24 |
ZA853861B (en) | 1986-01-29 |
EP0164245A2 (en) | 1985-12-11 |
IL75440A0 (en) | 1985-10-31 |
EP0164245A3 (en) | 1987-12-09 |
AU4342685A (en) | 1986-11-13 |
AU587978B2 (en) | 1989-09-07 |
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