CN107602677B

CN107602677B - 一种用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽及其试剂盒

Info

Publication number: CN107602677B
Application number: CN201710942502.XA
Authority: CN
Inventors: 余治健; 胡凯涛; 白冰; 姚伟明; 徐广健
Original assignee: SHENZHEN NANSHAN DISTRICT PEOPLE'S HOSPITAL
Current assignee: SHENZHEN NANSHAN DISTRICT PEOPLE'S HOSPITAL
Priority date: 2017-10-11
Filing date: 2017-10-11
Publication date: 2020-05-26
Anticipated expiration: 2037-10-11
Also published as: CN107602677A

Abstract

本发明提供了一种用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽及其试剂盒，所述用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽的核心氨基酸序列为：AMRYGETSTPTGKTYAS。本发明的技术方案的B细胞抗原表位肽用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测，效价高，重复性和特异性好，能用于检测粪肠球菌毒力蛋白gelE，具有很大的临床价值。

Description

一种用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种抗原表位肽，尤其涉及一种用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽及其试剂盒。

背景技术

通常认为肠球菌是条件致病菌，常定植在人和动物的口腔，正常肠道粘膜，女性生殖道等部位。肠球菌目前是院内感染的常见病原菌，常会导致泌尿道、呼吸道、腹腔内、盆腔内等部位的感染。肠球菌感染主要见于免疫力低下或过量使用抗生素的患者，也可以导致血流感染、心内膜炎等从而危及生命，死亡率可达21.0％～27.5％。我国院内感染病原体中肠球菌属在革兰阳性菌中居第3位，仅位于葡萄球菌、链球菌之后。北京大学深圳医院检验科对2005年10月至2008年8月间从该院临床标本中分离出184株肠球菌进行鉴定,结果184株肠球菌中粪肠球菌133株(72.3％)，屎肠球菌32株(17.4％)，其他种类肠球菌19株(10.3％)，显示肠球菌感染率明显上升。由于肠球菌具有天然耐药和获得性耐药的特性，特别是对于头孢类药物的天然耐药，使所致医院感染成为临床治疗棘手的问题之一，越来越受到人们的重视。而耐万古霉素的肠球菌(vancomycin-resistant Enterococci，VRE)，已是医院感染爆发流行的主要病原体之一。

粪肠球菌目前是肠球菌感染最常见的致病菌，可以占到肠球菌感染的80-90％。而在2014年报道的肠球菌血流感染研究中，粪肠球菌也要明显多于屎肠球菌。因此，粪肠球菌血流感染已在院内感染中，占据着越来越重要的地位。而在临床感染患者中，由于血培养的阳性率较低，导致不能早期明确诊断血流感染的病原体，从而延误临床治疗或造成误诊误治。

近年来在临床分离的粪肠球菌株中，不断有研究报道检测到粪肠球菌相关的毒力因子。Cosentino S等在临床分离的91株粪肠球菌中，检测到了毒力因子cylA、gelE、esp和efaA，其中cylA或gelE阳性率高于其它因子。2014年Medeiros AW等在57株临床分离粪肠球菌株中，检测到了cylA、gelE和esp阳性，而且临床分离株中的cylA和esp阳性率高于食品来源菌株。而最近2016年Strateva T等报道在510株临床分离肠球菌株中，检测到了相关毒力因子：esp-44.3％,efaA-85.9％,gelE-64.3％,和cylA-47.1％。而且这些毒力因子在粪肠球菌株中的阳性率高于屎肠球菌。因此，找到可以早期诊断粪肠球菌血流感染的分子标记物，并且可监测和评估疗效，预测治疗的临床预后情况，从而显得越来越迫切和意义重大。

发明内容

针对以上技术问题，本发明公开了一种用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽及其试剂盒，结合酶联免疫分析法，可用于血流中具gelE毒力蛋白的粪肠球菌的检测。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽，其核心氨基酸序列为：AMRYGETSTPTGKTYAS(如SEQ ID No.1所示)、GIRNLQTPSKHGQPETMAQY(如SEQ ID No.2所示)、VDEQHPDAYDNAFWD(如SEQ ID No.3所示)或SGASNPEIGADTQSVDRKT(如SEQ ID No.4所示)。

优选的，所述用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽的核心氨基酸序列为：AMRYGETSTPTGKTYAS(如SEQ ID No.1所示)。

在体外免疫学实验研究中，应用ELISA方法检测的动物学实验、特异性实验和重复性实验中发现，含有上述核心氨基酸序列的合成肽效价高，且具有良好的特异性和重复性。

进一步的，所述用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽序列的至少一端连接有不超过5个氨基酸的保护肽。

进一步的，所述用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽序列的N端连接有两个氨基酸HS。

进一步的，所述用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽序列的C端连接有GG。

本发明还公开了一种用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的抗原，其是通过采用如上所述的用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽与载体蛋白偶联制备而成的。

进一步的，所述载体蛋白为KLH。

本发明还公开了一种用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的试剂盒，其含有如上所述的用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽的包被物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的技术方案的B细胞抗原表位肽用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测，效价高，重复性和特异性好，能用于检测粪肠球菌毒力蛋白gelE，具有很大的临床价值。

附图说明

图1是本发明免疫前后间接ELISA法检测的合成肽P1与小鼠血清反应的OD值变化图。

图2是本发明免疫前后间接ELISA法检测的合成肽P2与小鼠血清反应的OD值变化图。

图3是本发明免疫前后间接ELISA法检测的合成肽P3与小鼠血清反应的OD值变化图。

图4是本发明免疫前后间接ELISA法检测的合成肽P4与小鼠血清反应的OD值变化图。

图5是本发明间接ELISA法检测合成肽P1与大肠、金葡、肺克、肺链、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的交叉反应测试结果图。

具体实施方式

下面对本发明的较优的具体实施方式作进一步的详细说明。

实施例1

采用固相合成法按照以下步骤制备合成肽P1，所述合成肽P1的氨基酸序列为：

合成肽P1：AMRYGETSTPTGKTYAS(如SEQ ID No.1所示)

步骤S1：Fmoc-氨基酸与树脂相连

取2-氯三苯基氯树脂CTC树脂1.0g(取代度为1.08mmol/g)加入到固相合成反应管中，用N，N'-二环己基碳二亚胺DCM 30ml浸泡30min使CTC树脂充分溶胀，活化待用。随后加入1.5mmol的Fmoc-氨基酸-OH、二氯甲烷15ml、N，N-二异丙基乙基胺DIPEA 0.42ml，震荡反应3h。反应结束后，将液体滤去，依次用甲醇、二氯甲烷洗涤树脂各3次，抽干待用。

步骤S2：氨基酸的逐步连接

在步骤S1反应得到的树脂中加入20％哌啶-DMF溶液15ml，震荡反应30min。将称量好的Fmoc-氨基酸(2eq)与1-羟基苯并三氮唑HOBt(3eq)混溶于5ml N，N-二甲基甲酰胺DMF溶液中，再加入N，N'-二环己基碳二亚胺DCC(3eq)、二氯甲烷15ml，震荡反应30min。并用20％哌啶-DMF溶液15ml脱去Fmoc，然后将下一个Fmoc-氨基酸活化，将活化液过滤至固相反应管中，震荡反应2h，反应完毕后用DMF、二氯甲烷各洗涤3次。根据如SEQ ID No.1所示的序列如此重复脱保护→缩合→脱保护，直到所有氨基酸连接完毕，得到反应后树脂。

步骤S3：采用稀酸体系将多肽从树脂上进行游离

在上述步骤S2反应后树脂中加入乙酸∶三氟乙醇∶二氯甲烷＝1∶1∶8(体积比)的溶剂共30ml，振荡反应1h，过滤，树脂再用二氯甲烷洗涤3次，浓缩滤液(期间加入甲苯除去残留乙酸)得带保护的多肽粗品。并且在粗品中加入三氟乙酸TFA∶DCM＝1∶3(体积比)的溶剂共20ml，搅拌反应30min，浓缩得目标多肽粗品，再用制备型高效液相进行纯化得纯品合成肽P1。

实施例2

采用固相合成法按照以下步骤制备合成肽P2，所述合成肽P2的氨基酸序列为：

合成肽P2：GIRNLQTPSKHGQPETMAQY(如SEQ ID No.2所示)

步骤S1：Fmoc-氨基酸与树脂相连

步骤S2：氨基酸的逐步连接

在步骤S1反应得到的树脂中加入20％哌啶-DMF溶液15ml，震荡反应30min。将称量好的Fmoc-氨基酸(2eq)与1-羟基苯并三氮唑HOBt(3eq)混溶于5ml N，N-二甲基甲酰胺DMF溶液中，再加入N，N'-二环己基碳二亚胺DCC(3eq)、二氯甲烷15ml，震荡反应30min。并用20％哌啶-DMF溶液15ml脱去Fmoc，然后将下一个Fmoc-氨基酸活化，将活化液过滤至固相反应管中，震荡反应2h，反应完毕后用DMF、二氯甲烷各洗涤3次。根据如SEQ ID No.2所示的序列如此重复脱保护→缩合→脱保护，直到所有氨基酸连接完毕，得到反应后树脂。

步骤S3：采用稀酸体系将多肽从树脂上进行游离

在上述步骤S2反应后树脂中加入乙酸∶三氟乙醇∶二氯甲烷＝1∶1∶8(体积比)的溶剂共30ml，振荡反应1h，过滤，树脂再用二氯甲烷洗涤3次，浓缩滤液(期间加入甲苯除去残留乙酸)得带保护的多肽粗品。并且在粗品中加入三氟乙酸TFA∶DCM＝1∶3(体积比)的溶剂共20ml，搅拌反应30min，浓缩得目标多肽粗品，再用制备型高效液相进行纯化得纯品合成肽P2。

实施例3

采用固相合成法按照以下步骤制备合成肽P3，所述合成肽P3的氨基酸序列为：

合成肽P3：VDEQHPDAYDNAFWD(如SEQ ID No.3所示)

步骤S1：Fmoc-氨基酸与树脂相连

步骤S2：氨基酸的逐步连接

在步骤S1反应得到的树脂中加入20％哌啶-DMF溶液15ml，震荡反应30min。将称量好的Fmoc-氨基酸(2eq)与1-羟基苯并三氮唑HOBt(3eq)混溶于5ml N，N-二甲基甲酰胺DMF溶液中，再加入N，N'-二环己基碳二亚胺DCC(3eq)、二氯甲烷15ml，震荡反应30min。并用20％哌啶-DMF溶液15ml脱去Fmoc，然后将下一个Fmoc-氨基酸活化，将活化液过滤至固相反应管中，震荡反应2h，反应完毕后用DMF、二氯甲烷各洗涤3次。根据如SEQ ID No:3所示的序列如此重复脱保护→缩合→脱保护，直到所有氨基酸连接完毕，得到反应后树脂。

步骤S3：采用稀酸体系将多肽从树脂上进行游离

在上述步骤S2反应后树脂中加入乙酸∶三氟乙醇∶二氯甲烷＝1∶1∶8(体积比)的溶剂共30ml，振荡反应1h，过滤，树脂再用二氯甲烷洗涤3次，浓缩滤液(期间加入甲苯除去残留乙酸)得带保护的多肽粗品。并且在粗品中加入三氟乙酸TFA∶DCM＝1∶3(体积比)的溶剂共20ml，搅拌反应30min，浓缩得目标多肽粗品，再用制备型高效液相进行纯化得纯品合成肽P3。

实施例4

采用固相合成法按照以下步骤制备合成肽P4，所述合成肽P4的氨基酸序列为：

合成肽P3：SGASNPEIGADTQSVDRKT(如SEQ ID No.4所示)

步骤S1：Fmoc-氨基酸与树脂相连

步骤S2：氨基酸的逐步连接

在步骤S1反应得到的树脂中加入20％哌啶-DMF溶液15ml，震荡反应30min。将称量好的Fmoc-氨基酸(2eq)与1-羟基苯并三氮唑HOBt(3eq)混溶于5ml N，N-二甲基甲酰胺DMF溶液中，再加入N，N'-二环己基碳二亚胺DCC(3eq)、二氯甲烷15ml，震荡反应30min。并用20％哌啶-DMF溶液15ml脱去Fmoc，然后将下一个Fmoc-氨基酸活化，将活化液过滤至固相反应管中，震荡反应2h，反应完毕后用DMF、二氯甲烷各洗涤3次。根据如SEQ ID No:4所示的序列如此重复脱保护→缩合→脱保护，直到所有氨基酸连接完毕，得到反应后树脂。

步骤S3：采用稀酸体系将多肽从树脂上进行游离

在上述步骤S2反应后树脂中加入乙酸∶三氟乙醇∶二氯甲烷＝1∶1∶8(体积比)的溶剂共30ml，振荡反应1h，过滤，树脂再用二氯甲烷洗涤3次，浓缩滤液(期间加入甲苯除去残留乙酸)得带保护的多肽粗品。并且在粗品中加入三氟乙酸TFA∶DCM＝1∶3(体积比)的溶剂共20ml，搅拌反应30min，浓缩得目标多肽粗品，再用制备型高效液相进行纯化得纯品合成肽P4。

实施例5

间接ELISA法检测抗体效价实验。

采用间接ELISA方法检测，合成肽P1、P2、P3、P4分别与其相应组小鼠在免疫前、第2次免疫以及末次免疫后，随机抽取的8只小鼠的在一系列稀释度下测量OD450nm值，绘制免疫前、2次免疫及末次免疫后的曲线变化图，如图1、图2、图3和图4所示。

通过图1、图2、图3和图4可见，经过免疫后，小鼠血清抗体的效价明显提高。经过比较，其中合成肽P1的效价明显大于另外三个合成肽，下面的实验选取P1作为表位肽包被，进行后续的特异性和重复性评估。

实施例6

合成肽P1_ELISA特异性实验。

将合成肽P1分别与己感染大肠、金葡、肺克、肺链、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、粪肠球菌的小鼠血清进行ELISA反应并检测其OD值，结果见表1和图5所示。

表1.交叉反应测试数据

从表1和图5可见，大肠、金葡、肺克、肺链、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌检测OD值都很低，皆无显著交叉反应，**,P<0.001，因此，粪肠球菌gelE蛋白表位肽P1的特异性良好。

实施例7

合成肽P1_ELISA重复性评估实验。

将合成肽P1经变异系数计算评估重复性。结果见表2，可见，变异系数在6.2％～9.1％，重复性良好。

表2合成肽P1_ELISA重复性评估实验结果

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 深圳市南山区人民医院

<120> 一种用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽及其试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Met Arg Tyr Gly Glu Thr Ser Thr Pro Thr Gly Lys Thr Tyr Ala

1 5 10 15

Ser

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Ile Arg Asn Leu Gln Thr Pro Ser Lys His Gly Gln Pro Glu Thr

1 5 10 15

Met Ala Gln Tyr

20

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Val Asp Glu Gln His Pro Asp Ala Tyr Asp Asn Ala Phe Trp Asp

1 5 10 15

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Gly Ala Ser Asn Pro Glu Ile Gly Ala Asp Thr Gln Ser Val Asp

1 5 10 15

Arg Lys Thr

Claims

1.一种用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽，其特征在于，其氨基酸序列为：AMRYGETSTPTGKTYAS。

2. 一种用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的抗原，其特征在于：其是通过使权利要求1 所述的用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽与载体蛋白偶联制备而成的。

3.根据权利要求2所述的用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的抗原，其特征在于：所述载体蛋白为KLH。

4.一种用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的试剂盒，其特征在于：其含有如权利要求1所述的用于粪肠球菌gelatinase蛋白检测的B细胞抗原表位肽的包被物。