CN107254439B - 增强自然杀伤细胞增殖和活性的方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种自然杀伤（NK）细胞离体培养的方法，更具体地，是通过用烟酰胺或其它烟酰胺部分处理所述细胞并结合细胞因子促进的NK细胞增殖而增强NK细胞的繁殖和/或功能性的方法。还涉及包含培养的NK细胞的组合物及其治疗用途。

Description

增强自然杀伤细胞增殖和活性的方法

本申请是分案申请，其母案的申请日是2010年12月29日，中国申请号是201080064938.X，其国际申请号是PCT/IL2010/001091。

技术领域

本发明，在其某些实施方式中，涉及自然杀伤（NK）细胞的离体（体外，ex-vivo）培养，更具体地，而不排他地，涉及通过用烟酰胺处理所述细胞并结合细胞因子促进的NK细胞增殖而增强NK细胞繁殖和/或功能性的组合物和方法。

背景技术

自然杀伤（以下也简称为“NK”）细胞是参与免疫反应的淋巴样细胞。这些细胞具有多种功能，特别是杀伤肿瘤细胞、发生致癌转化的细胞和活体内其它不正常的细胞，是先天免疫监督机制的重要组成部分。采用用NK细胞的免疫治疗的临床经验，强调了强效并有效地扩增NK细胞群并同时保持甚至增强其体内功能性（杀伤能力、转运、定位、持续和增殖）的更好方法的需要。

NK细胞根据表型和功能代表了不同的淋巴细胞群。NK细胞具有大颗粒淋巴细胞形态并表达特征NK细胞表面受体，同时缺乏TCR重排和T细胞、B细胞、单核细胞和/或巨噬细胞表面标志。细胞杀死通过释放蛋白质的小胞质颗粒（穿孔素和颗粒酶）而导致靶细胞通过细胞凋亡而死亡。NK细胞具有通过启动MHC I类分子、MHC类I类分子和与MHC无关的分子的多个抑制和活化受体而区分潜在的“靶”细胞和健康细胞的机制（Caliguiri Blood 2008112:461-69）。抑制性NK细胞受体包括HLA-E（CD94/NKG2A）；HLA - C（组1或2），KIR2DL；KIR3DL（HLA-B Bw4）和HLA-A3或A4+肽。激活性NK细胞受体包括HLA-E（CD94/NKG2C）；KIR2DS（HLA-C）和KIR3DS（HLA-Bw4）。其它受体包括NK细胞受体蛋白-1（在小鼠中称为NK1.1）和对IgG的Fc部分低亲和力受体（FcγRIII；CD16）。Cosman等人的美国专利申请US20090234699详细描述了具体的NK细胞活化器、UL结合蛋白（ULBP）和其潜在的治疗用途。（其结合于本文中作为参考）。“激活性”和“抑制性”的表面受体控制NK细胞的细胞毒活性。对于治疗考虑因素重要的是，需要NK细胞抑制作用以防止通过“激活”NK细胞破坏正常的宿主组织，但在NK细胞中抑制性信号传递看起来比活化信号更强。

完整骨髓对于NK细胞生成是必要的。人类骨髓来源的NK细胞是CD2+CD16+CD56+表型的大颗粒淋巴细胞（LGL），缺乏CD3，还包含T-细胞受体ζ链[Zeta（ζ）-TCR]。NK细胞可以在各种淋巴样和非淋巴样组织中，包括血液、脾、肝、肺、肠和蜕膜中找到。在肿瘤中已发现相当数量的NK细胞，其中这些细胞可能发挥抗肿瘤活性。

NK细胞展示出抗病毒感染和肿瘤细胞的自发非MHC-限制的细胞毒活性和体内病毒性感染和癌进展的介导抗性。因此，NK细胞代表先天免疫的关键效应器细胞。此外，NK细胞具有多种其它功能，包括分泌细胞因子的能力和调节适应性免疫应答和造血功能。NK细胞在几个实验动物模型中的感染早期期间内提供了必要的γ-干扰素（IFN-γ）。

大多数癌在HLA的背景下缺乏可识别的肿瘤特异性抗原，因此不可能屈服于抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞。由于广泛的癌细胞对NK细胞活性敏感，则能够采取移植自然杀伤（NK）细胞在异源位置对抗癌细胞，而无移植物抗宿主病的风险。

最近研究都强调这种潜在的NK细胞疗法。在移植的动物模型中，供体NK细胞溶解白血病细胞和宿主淋巴造血细胞，而不会影响非造血组织。因为NK细胞受结合至杀伤性免疫球蛋白样受体（KIR）的自我HLA分子抑制，这些发现已经导致了选择采用有助于NK-细胞活化（HLA-和KIR错配）的HLA和KIR型造血干细胞移植受体的临床实践，由此可能预期促进抗白血病作用。然而，“最好”供体的选择受限于具有不只一个潜在的供体的患者，NK细胞溶解淋巴样细胞的能力一般较低而难以预测。自身免疫性疾病中NK细胞分布和功能的一项调查已经表明在许多自身免疫性疾病（如SLE，干燥综合征，多发性硬化，牛皮癣，RA，溃疡性结肠炎等）中NK细胞群的数量和功能降低。因此，用NK细胞的治疗能够主动抑制潜在致病性自身免疫性T细胞，自身免疫性T细胞可以介导骨髓移植后炎性反应，调节抗原非特异性模式中自身免疫记忆T细胞激活而维持临床缓解和防止GVH效应。

对于临床使用，NK细胞通常通过白细胞分离而从患者或捐献者收集。然而，最大的NK细胞剂量是有限的，而高NK细胞剂量只可能为低体重患者获得，致使孩子们成为NK细胞疗法的最佳人选。值得注意的是，NK细胞的总数和活性在病毒性感染和/或癌中显著降低，而使得基于内源性NK细胞激活的免疫疗法无效。此外，难治性的复发是细胞输入中主要的并发症，而许多临床方案需要反复输注淋巴细胞群。

在这方面，Verneris等（Brit J Hematol 2009；147:185-91），综述了脐血NK细胞临床应用的前景，最近表示，新鲜脐血NK细胞群可能需要进一步操作，才能表达其全功能（细胞毒性，迁移率）的潜力。一旦实施采用各种生物反应调节剂，尤其是IL-2后的全身治疗，活化的NK细胞数目和其抗病毒和抗转移活性已发现在各种组织中显著增加。基于这方面的证据，有人尝试了涉及NK细胞联合IL-2（和IL-15）的激活和扩张的治疗策略，以及向输注受者共给予IL-2。然而，迄今为止，这些结果却令人失望，仅仅表明输注（注入）的NK细胞有限的归巢和瞬态植入。此外，IL-2是有毒的，在临床应用中必须极为谨慎使用。

在尝试开发NK细胞离体富集和增殖的临床可行性方案中，磁性细胞选择技术使用顺磁性CD56微球和细胞选择柱，已经用于隔离包含CD3^-/56⁺NK（60.6％±10.8％）和CD3⁺/56⁺NK T细胞（30.4％±8.6％）的CD56⁺群而开始增殖研究。根据不同的供体，甚至在不同场合下进行同一供体的测试，通过加入重组人IL-2或IL-2+重组人IL-15，观察到较明显的细胞扩增变异。选择和繁殖的低E:T比CD56⁺的细胞毒性显著地比起始群更高，与相同条件下培养2周的非分离PBMC相当。在新鲜的未经选择的PBMC培养中，IL-15（结合IL-2）比单独IL-2以1:1的E:T比率引起更高的杀灭作用。值得注意的是，由于CD3⁺细胞在培养之前并未耗尽，CD3⁺CD56⁺NKT细胞的增殖是CD3^-CD56⁺NK细胞的2至3倍。CD56⁺/ CD3^-细胞只有中度增殖发生，所得到的大多数细胞都是CD56⁺/ CD3⁺ NKT细胞。

在不同的方法中，人CD3^-CD56⁺NK细胞培养自通过骨髓基质细胞和/或免疫细胞（c-kit配体，IL-2和IL-15）产生的各种细胞因子存在下培养的BM-衍生的CD34+造血祖细胞（HPC）。向这些培养基中加入干细胞因子，对CD3-CD56+细胞毒性效应器细胞的分化没有影响，而大大增强了其在培养基中的增殖。大多数这些细胞缺乏CD2和CD16，但的确表达了ζ-TCR。类似于外周血中发现的NK细胞，在IL-15存在下生长的骨髓来源的CD2-CD16-CD56+ NK细胞据发现是IFN-γ响应单核细胞衍生的细胞因子的强效生产者。IL-15能够诱导CD34+HPC分化成CD3-CD56+ NK细胞，而KL可以放大其数量。然而，NK细胞的产量受限于CD34+细胞群中潜在NK祖细胞低的数量。

繁殖NK细胞的其它方法已经进行了描述。Frias等人，（Exp Hematol 2008；36:61-68)在基质细胞层上用无血清培养基培养了选自脐血的NK祖细胞（CD7⁺CD34-Lin-CD56^-），采用SCF、IL-7、IL -15、FL和IL-2诱导NK分化，使细胞毒性的经培养的NK细胞数量增加。Harada等（Harada et al.，Exp Hematol. 2004；32:614-21）通过来自肾母细胞瘤细胞系的细胞培养了NK细胞。Waldmann等人（US20070160578）描述了采用IL-15/R-配体激活子络合物在培养基中增强了来自整个血液、骨髓或脾细胞的NK细胞和CD8-T细胞的增殖，以降低不良的细胞因子产生。Campana 等人，（US20090011498）描述了在表达IL-15和4-1BB并具有弱的或没有MHC-Ⅰ或Ⅱ的表达的白血病细胞存在下，进行移植的NK细胞的离体培养和活化。Childs等人（US20090104170）描述了通过在IL-2存在下与照射的EBV-转化的淋巴母细胞共培养而离体增殖和活化NK细胞。Tsai（US20070048290）使用另一种方法，通过采用照射的3T3-衍生的OP-9S细胞离体培养永生的NK祖细胞由造血干细胞生产连续的NK细胞系，进行研究和潜在的治疗应用。（上述所有引用参考文献都结合于本文中作为参考）。

然而，NK细胞培养基的确立方法也支持T细胞增殖，甚至在T细胞耗尽之后，残余T细胞通常会在刺激之后数量上增加，由于潜在的移植物抗宿主病而排斥扩增的细胞群的临床应用。这进一步使得输注之前下一轮的细胞耗尽成为必要，而使制备过程耗时，成本高昂，而且往往造成大量NK细胞损失。

为了减少扩增之后T细胞污染，NK细胞的扩增方案是使用纯化的CD56⁺CD3^-细胞作为扩增培养中要进行接种的初始群。为了获得高度纯化的CD56+CD3-细胞部分，需要两个步骤的净化过程：正选择CD56细胞，接着耗尽CD3细胞，或先耗尽CD3细胞，接着正选择CD56细胞。然而，这个过程是昂贵的，而在两个纯化循环期间涉及大量细胞损失。即使在采用纯化CD56+CD3-细胞开始的培养中，仍然有受T细胞污染的扩增NK产物。

使用细胞因子仅仅用于扩增NK细胞的方案，指示了相对温和的效应和对除了细胞因子之外的另外的刺激物的要求，以获得大幅扩增（Korean J Lab Med 2009；29:89-96，Koehl U et al. Klin Pädiatr 2005；217: 345–350）。辐照的饲养细胞（例如，外周血单核细胞，埃博斯坦-巴尔病毒转化的淋巴母细胞系（ABV-LCL），K562骨髓白血病细胞系，基因修饰以表达白细胞介素-15的膜结合形式和共刺激分子4-1BB的配体）而其它常常作为其它刺激物而用于NK细胞的扩增。虽然大多数NK扩增方案使用纯化的CD56+CD3-细胞作为初始群，但是一些方案却结合辐照的基质或抗-CD3抗体而使用单核细胞作为初始接种群（Blood，15March 2008，Vol. 111，No. 6，pp. 3155-3162）。扩增之后，这些培养基严重受到CD3+和CD3+ CD56+细胞污染，因此，CD56+CD3-细胞需要在输注之前进行纯化。

Miller等人，（Blood，1992 80: 2221-2229），通过涂在抗体涂覆的塑料烧瓶底上，使用NK祖细胞和包含CD56+CD3-细胞的单核细胞富集的部分并结合纯化的CD14+细胞或MNC耗尽CD5和CD8以18天的培养而获得了30倍的NK细胞扩增。Ve'ronique Decot等人（Experimental Hematology 2010；38:351–362）在辐照T和B细胞上通过耗尽T和B细胞的单核细胞而报道了约20倍的NK细胞扩增，并发现耗尽之后污染的群主要是单核细胞。然而，在这种培养模型中，饲养细胞和细胞因子对于获得NK细胞扩增是必要的，因为在单独细胞因子或单独饲养细胞存在下没有观察到扩增。因此，相对于Miller，所考虑的单核细胞都富集于这些接种的群中，在不存在照射T和B基质细胞时没有观察到NK细胞扩增（Decot et al.，Exper Hematology 2010；38:351-362）。

然而，进一步地，尽管离体培养的NK细胞常常证实对无关靶细胞具有相当的活性（例如，细胞毒性），但是对更临床相关的肿瘤和癌细胞的活性，无论体外还是体内往往令人失望，有人已经提出了增强活化的方法。Zitvogel等（美国专利No. 6849452）（结合于本文中作为参考）教导了通过暴露引发的树突细胞（triggered dendritic cells）而离体或体内活化NK细胞。其他人建议通过用缺乏MHC-I分子的细胞培养NK细胞并基因修饰表达IL-15（Campana et al.，美国专利申请No. 2009011498）或用蛋白酶体抑制剂预处理NK细胞（Berg et al. Cytotherapy 2009；11:341-55）增强活化作用（结合于本文中作为参考）。然而，没有任何一种方案已经显著取得了能够在移植之后在合适的宿主靶器官中幸存和扩增的扩增NK细胞群（稳态增殖），而采用离体增殖的NK细胞免疫疗法仍然受限于无法获得临床方案适用的足够数量且高度纯化的功能合适的NK细胞（Bachanova et al.，Canc Immunol.Immunother. 2010；59:739-44；Guven，Karolinska Institute，2005；Schuster et al.，E.J. Immunology 2009；34:2981-90；Bernardini et al. Blood 2008；111:3626-34）。因此，仍然需要简化的且成本有效的方法以离体优先扩增NK细胞，如分离的NK细胞，或来自耗尽或并非来自CD3+细胞的单核细胞的混合细胞群。

有人已经证明，烟酰胺能够调节细胞命运和功能（参见，例如WO 2003/062369，WO2005/007799，WO 2005/007073，WO 2006/030442，WO 2007/063545和WO 2008/056368，其所有都以其全部内容结合于本文中作为参考）。

发明内容

由于对大量治疗上有效的NK细胞临床应用如用于治疗白血病和其它癌的细胞疗法的需求不断增长，增强适用于临床应用的自然杀伤细胞的离体增殖和活化的改进、简化和具有成本有效的方法仍存需要。

因此，NK细胞在离体培养扩增，输注之后增强其功能性，对于其采用的免疫疗法中的临床适用性是至关重要的。

根据本发明一些实施方式的一方面，提供了一种离体培养自然杀伤（NK）细胞的方法，所述方法包括采用至少一种生长因子和有效浓度、有效暴露时间和烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的有效持续时间培养包含NK细胞的细胞群，其中采用至少一种生长因子和有效浓度、有效暴露时间和烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的有效持续时间培养所述NK细胞，导致以下至少之一：

（a）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，CD62L的表达提高；

（b）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，迁移响应提高；

（c）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，归巢和体内停留增加；

（d）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，增殖更多；和

（e）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，细胞毒活性增加。

根据本发明一些实施方式的另一方面，提供了本发明的所述方法培养的NK细胞群。

根据本发明一些实施方式的另一方面，提供的NK细胞群特征在于以下至少之一：

（a）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，CD62L的表达提高；

（b）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，迁移响应提高；

（c）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，归巢和体内停留增加；

（d）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，增殖更多；

（e）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，细胞毒活性增加；

（f）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，CD3+与CD56+/CD3-的细胞比降低。

根据本发明一些实施方式的另一方面，提供的NK细胞群特征在于，移植时归巢、植入和保留得以增强，其中至少15χ10⁶的所述NK细胞群输注到照射的SCID鼠宿主中，导致在宿主淋巴组织中产生至少25%的供体来源的NK细胞，这在输注之后4天时通过免疫检测和流式细胞术进行测定。

根据本发明一些实施方式，所述NK细胞群进一步的特征在于，在输注之时在至少30%的所述细胞群中表达CD62L，这通过免疫检测和流式细胞术进行测定。根据本发明还有的其它实施方式，所述NK细胞群进一步的特征在于，在输注之时CD3+与CD56+/CD3-的细胞比等于或小于1:100。

根据本发明一些实施方式还有的另一方面，提供了一种在需要其的主体中抑制肿瘤生长的方法，包括给予所述主体本发明治疗有效量的所述NK细胞群。

根据本发明一些实施方式的另一方面，提供了一种在需要其的主体中治疗或预防病毒性感染的方法，包括给予所述主体本发明治疗有效量的所述离体培养的NK细胞群。

根据本发明一些实施方式的另一方面，提供了一种在需要其的主体中治疗或预防移植物抗宿主病的方法，包括给予所述主体本发明治疗有效量的所述离体培养的NK细胞群。

根据本发明一些实施方式的另一方面，提供了一种在需要其的主体中治疗或预防自身免疫性疾病或病症的方法，包括给予所述主体本发明治疗有效量的所述离体培养的NK细胞群。

根据本发明一些实施方式的另一方面，提供了一种在需要其的主体中治疗或预防白血病的疾病或病症的方法，包括给予所述主体本发明治疗有效量的所述离体培养的NK细胞群。

根据本发明一些实施方式，NK细胞群与所述主体是自体同源的或异源的。

根据本发明一些实施方式，所述给予通过单次输注或重复输注所述NK细胞群完成。

根据本发明一些实施方式，所述主体采用至少一种生长因子并同时给予所述NK细胞群进行治疗。

根据本发明一些实施方式，所述至少一种生长因子是IL-2或IL-2和IL-15。

根据本发明一些实施方式的另一方面，提供了一种转导具有外源基因（exogene）的离体培养的NK细胞的方法，所述方法包括：

（a）根据本发明的所述方法离体培养NK细胞群；和

（b）转导具有外源基因的所述培养的NK细胞群。

根据本发明一些实施方式，所述至少一种生长因子是IL-2，所述暴露时间为从包含NK细胞的细胞群接种的时间，所述暴露持续时间为约2到约3周，而所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的浓度为5mM。

根据本发明一些实施方式，所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的有效浓度为约0.5mM至约50 mM，或约1.0 mM至约25 mM，或约2.5 mM至约10 mM，或约2.5 mM，约5.0 mM或约7.5 mM。

根据本发明一些实施方式，所述暴露时间为从接种至培养之后约5周的时间，或从接种之后约1h至培养之后约3周的时间，或接种之后约24h至培养之后约3周的时间，或从接种之后约2天至培养之后约2周，或从包含所述NK细胞的细胞群在所述培养基中接种的时间。

根据本发明一些实施方式，所述暴露持续时间为约2h至约5周，或约30h至约4周，或约2天至约3周，或约1周，约2周，约3周，约1天，约2天，约3天，约5天，约10天，约12天，约15天，约17天或约20天。

根据本发明一些实施方式，包含所述NK细胞的细胞群获自选自由脐血、骨髓和外周血组成的组中的来源。

根据本发明一些实施方式，包含所述NK细胞的细胞群是包含NK细胞部分和CD3+细胞部分的异质细胞群。

根据本发明一些实施方式，所述CD3+细胞部分大于所述NK细胞部分。

根据本发明一些实施方式，所述NK细胞部分大于所述CD3+细胞部分。

根据本发明一些实施方式，包含所述NK细胞的细胞群是耗尽CD3+细胞的单核或总核细胞群（total nuclear cell population）。

根据本发明一些实施方式，包含所述NK细胞的细胞群是耗尽CD3+和CD19+细胞的单核或总核细胞群。

根据本发明一些实施方式，包含所述NK细胞的细胞群是未经选择的NK细胞群。

根据本发明一些实施方式，所述NK细胞包含CD56+CD3-细胞。

根据本发明一些实施方式，所述NK细胞包含CD56+CD16+CD3-细胞。

根据本发明一些实施方式，培养包含所述NK细胞的细胞群在无饲养层或饲养细胞下完成。

根据本发明一些实施方式，至少一种生长因子包括选自由SCF、FLT3、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21组成的组中的生长因子。

根据本发明一些实施方式，所述至少一种生长因子是IL-2或IL-2和IL-15。

根据本发明一些实施方式，所述至少一种生长因子仅为IL-2。

根据本发明一些实施方式，所述CD62L的表达通过选自由流式细胞术、免疫检测、定量cDNA扩增和杂交组成的组中的方法进行测定。

根据本发明一些实施方式，所述CD62L的表达通过荧光激活细胞分选法（FACS）进行测定。

根据本发明一些实施方式，所述CD62L的表达采用荧光抗人CD62L单克隆抗体进行测定。

根据本发明一些实施方式，所述迁移响应提高通过迁移或补洞分析法（gapclosure assay）进行检测。

根据本发明一些实施方式，所述迁移响应提高通过迁移分析法（transmigrationassay）进行检测。

根据本发明一些实施方式，所述迁移是响应SDF1的刺激进行分析。

根据本发明一些实施方式，归巢（homing）和体内停留（in-vivo retention）增加通过FACS进行测定，表示为输注之后靶器官中植入的NK细胞的百分数。

根据本发明一些实施方式，所述靶器官选自由脾、骨髓和淋巴结组成的组。

根据本发明一些实施方式，所述归巢和植入在NK细胞输注之后约1天至约2周进行测定。

根据本发明一些实施方式，所述增殖速率通过集落生成分析法、机械分析法、代谢分析法和直接增殖分析法进行测定。

根据本发明一些实施方式，所述增殖速率通过CD56+CD3-细胞百分数的FACS分析进行测定，并表示为随时间的倍数增加。

根据本发明一些实施方式，所述细胞毒活性采用细胞杀伤分析法进行分析。

根据本发明一些实施方式，所述细胞杀伤分析法的靶细胞是癌细胞系、原发性癌细胞、实体肿瘤细胞、白血病细胞或病毒感染细胞。

根据本发明一些实施方式，所述烟酰胺部分是烟酰胺。

根据本发明一些实施方式，所述烟酰胺部分是烟酰胺类似物或衍生物。

根据本发明的其它实施方式，所述烟酰胺类似物或衍生物是取代的苯甲酰胺、取代的烟酰胺、烟乙硫酰胺（乙硫异烟酰胺，nicotinethioamide）、N-取代的烟酰胺、烟硫酰胺（硫代烟酰胺，nicotinthioamide）、3-乙酰吡啶或烟酸钠。

附图说明

本发明的一些实施方式在本文中仅仅通过实施例的方式，参照附图进行描述。现在将详细地具体参照附图，应该强调，所示的细节是通过举例的方式为了示意性讨论本发明实施方式的目的。在这方面，以附图进行的描述，使本发明领域的技术人员很清楚如何可以实施本发明的实施方式。

在附图中：

图1A和1B显示在缺乏（细胞因子）或存在递增浓度（如所示，0.5至5 mM “NAM”）的烟酰胺培养之后，脐血来源的纯化NK细胞部分的剂量依赖性增殖的柱状图。这些培养过程以在免疫磁性微球上纯化的CD56+表型的脐血NK细胞开始，并以细胞因子（包括Flt-3，IL-2和IL-15）维持高达3周。图1A显示了在14天培养下CD56+ NK细胞的增殖（相对于第0天培养开始，增长倍数或“细胞增殖”倍数）。图1B显示了培养3周之后的CD56+NK细胞的增长倍数。注意到，相对于对照（细胞因子），烟酰胺处理的培养基的CD56+细胞组分剂量依赖性急剧增加，在整个培养期间都持续发生。

图2A-2C是显示在以维持在无烟酰胺（细胞因子）或存在烟酰胺下的完全脐血来源的单核细胞部分开始的培养基中根据细胞表面标记（CD56，CD45，CD3）进行分组的不同淋巴细胞亚类的比例柱状图。这些培养采用细胞因子（包括Flt-3，IL-15和IL-2），有或没有浓度逐渐增加(0.5至 5 mM)的烟酰胺（“NAM”）之下维持3周，与表面标记的特异性抗体反应，而随后通过FACS对特异性表型进行分析。图2A = CD56 +/ CD45 +细胞；（NK细胞和NK-T细胞）图2B= CD56 + / CD3-（NK）细胞；图2C= CD3+/CD56-（T）细胞。注意到NK细胞群（CD56+/CD45+和CD56+/CD3-表型）剂量依赖性增加，而烟酰胺处理的培养基中T淋巴细胞群（CD3+/CD56-表型）伴随降低；

图3是显示无（细胞因子）或有2.5mM烟酰胺存在下培养之后纯化骨髓来源的纯化CD56+细胞部分的增殖柱状图。这些培养以由免疫磁性微球上的骨髓纯化的CD56+细胞（NK细胞和NK-T）开始，并以细胞因子（包括Flt-3，IL-2和IL-15）在有（黑暗阴影）或无（细胞因子，淡阴影）2.5mM烟酰胺下维持高达3周。注意到，相比较对照（细胞因子，淡阴影），烟酰胺处理的培养基的CD56+CD3-NK细胞组分急剧增加，在整个培养期间持续发生；

图4A和4B是显示无（细胞因子）或有烟酰胺存在下培养之后骨髓 NK相对于NKT 细胞的增殖柱状图。这些培养以由免疫磁性微球上纯化的骨髓来源的CD56 +细胞开始，并以细胞因子（包括Flt-3，IL-2和IL-15）在有或无2.5mM烟酰胺下维持3周。图4A和4B表示两个独立示例性实验的结果。注意到，相比较对照（细胞因子），CD56+CD3-NK细胞（黑暗阴影）的比例急剧增加，而烟酰胺处理的培养物的CD56+CD3+NKT细胞组分（淡阴影）降低，这与接种细胞中NK相对于NKT细胞的初始比例无关；

图5是显示由无（细胞因子）或有烟酰胺存在下培养之后的纯化骨髓来源的CD56+细胞展示CD56+CD16+ NK细胞表型的细胞增加百分数的柱状图。这些培养以图4A和4B中所述的骨髓来源的免疫磁性纯化CD56+细胞开始，并以细胞因子（包括Flt-3，IL-2和IL-15）在有或无2.5mM烟酰胺下维持高达3周。注意到，相比较对照（细胞因子）中CD56+CD16+细胞份数的降低，烟酰胺处理的培养基中CD56+CD16+ NK细胞的比例在14天（淡阴影）时增加，在21天（黑暗阴影）时仍然持续；

图6A-6C是显示采用烟酰胺的短期培养对骨髓NK和NKT细胞亚类增殖的影响。这些培养以由骨髓来源的免疫磁性纯化的CD56+细胞开始，并以细胞因子（包括Flt-3，IL-2和IL-15）在无（细胞因子）或有浓度逐渐增加的烟酰胺（“NAM”，1 mM，2.5 mM和5 mM）下维持7天，并与表面标记的特异性抗体反应，而通过FACS对特异性表型进行分析。图6A表示作为烟酰胺函数的CD56+CD3-NK细胞群百分数；图6B描述了培养基中作为烟酰胺函数的NKT细胞CD56+CD3+群的降低；而图6C表示相对于对照（细胞因子），作为烟酰胺函数，CD56+CD16+NK细胞亚类的增殖；

图7是显示在浓度逐渐增加（1.0mM至5.0mM）的烟酰胺存在下培养3周的纯化脐血来源的CD56+细胞的抑制性NK细胞CD56+/NKG2A+亚类降低的柱状图。免疫磁性纯化脐血来源的CD56+细胞在浓度逐渐增加（1.0mM至5.0mM）的烟酰胺（“NAM”）存在或不存在（细胞因子）下采用细胞因子（包括Flt-3，IL-2和IL-15）进行培养。在3周后，这些细胞与表面标记的特异性抗体反应，并通过FACS对CD56+/NKG2A+表型进行分析。相比较对照（细胞因子），在烟酰胺处理的培养基中CD56+NKG2A+细胞急剧减少，表明采用烟酰胺暴露NK细胞活化作用增强；

图8A是显示随着烟酰胺浓度增加培养的纯化脐血来源的NK细胞迁移电位增强的柱状图。免疫磁性纯化脐血来源的CD56+细胞采用细胞因子（包括Flt-3，IL-2和IL-15）在2.5mM或5.0mM）烟酰胺存在或不存在（细胞因子）下进行培养。在2周后，这些细胞在转孔试验（Transwell assay）中响应250ng/mL SDF对离体迁移（迁移）进行分析。底室的细胞通过FACS计数。相比较对照（细胞因子），在无（淡阴影）或有SDF（黑暗阴影）（250ng/mL）存在下的迁移增强，表明通过烟酰胺增强了NK细胞移动性，并引导了NK细胞的迁移；

图8B是显示在2.5mM或5mM烟酰胺存在下培养3周的脐血来源的CD56+细胞上迁移（CXCR4）、附着(CD49e)和转运(CD62L)受体表达增加的表格。这些培养以免疫磁性微球纯化脐血来源的CD56+细胞开始，并采用细胞因子（包括FLT-3，IL-2和IL-15）或细胞因子加烟酰胺（2.5mM和5mM）维持。3周后，培养的细胞与所述指定的表面标记的特异性抗体反应，然后通过FACS监测。注意到，相比较对照（仅仅细胞因子）在烟酰胺存在下培养的细胞中CXCR4和CD62L的表达急剧增强，CD49e的表达提高；

图9是显示采用浓度逐渐增加的烟酰胺培养的脐血来源的CD56+细胞杀伤潜力增强的柱状图。免疫磁性微球纯化脐血来源的CD56+细胞采用细胞因子（包括Flt-3，IL-2和IL-15）在有（黑暗阴影）或无（淡阴影）2.5mM烟酰胺存在下进行培养。经过2周之后，FACScalibur分析表明，所有的细胞都具有CD56 +/ CD3-表型。采用每次试验5x10³ K562靶细胞对脐血NK细胞分析离体杀伤潜力进行分析，每个靶细胞5:1，10:1和20:1 的NK细胞（E:T）。对K562细胞的死亡通过FACS作为PI阳性CFSE标记的细胞百分数进行监测。相比较对照（细胞因子）和新鲜未培养的脐血来源的CD56+细胞（无阴影），增强的靶细胞杀伤作用强有力地表明，通过烟酰胺增强了NK细胞杀伤潜力的活化作用；

图10是举例说明采用烟酰胺培养3周的人体外周血NK细胞扩增的柱状图。通过新鲜单元单核细胞部分的T细胞（CD3+或CD3+CD19+）耗尽而制备的外周血NK细胞[MidiMACS分离(MACS分离柱，Cat. No.130-042-901)或RosetteSep Human CD3+Cell DepletionCocktail (Stem Cell Technologies，RosestteSep，Cat. No.15661)]，通过FACS分析进行表征，并在所示浓度的烟酰胺（NAM 2.5 淡阴影和NAM 5mM 黑暗阴影）存在下于VueLifeBags中培养。对照=仅仅细胞因子（NAM 0，无阴影）。培养介质包含MEMα，人体血清（10 %v/v）和细胞因子(20ng/mL IL-15和50ng/mL IL-2或仅仅50ng/mL IL-2)。在1和2周之后培养体积加倍，而在7天、14天和21天之后对细胞进行FACS分析的计数和染色。注意，在烟酰胺存在下扩增大大增加（相比较第0天倍数增加），而同时仅仅细胞因子（NAM 0）对照却表现出随时间失去自更新能力的趋势；

图11是显示3周培养的烟酰胺和接种密度对人体外周血NK细胞的影响的柱状图。外周血NK细胞通过如图10中描述的单核细胞T细胞（CD3+或CD3+CD19+）耗尽而制备，并在每个培养袋中按2，5或10x10⁵个细胞/mL而以10mL进行接种。细胞随后在所示浓度（NAM 2.5，淡阴影和NAM 5mM，黑暗阴影）烟酰胺，或仅仅细胞因子（细胞因子，无阴影）存在下扩增。在所有的接种密度下，显而易见通过烟酰胺增强了NK细胞的增殖；

图12是显示在人外周血NK细胞21天培养中CD56+CD3- NK细胞百分比的柱状图。外周血NK细胞通过图10中描述的单核细胞T-细胞（CD3+或CD3+CD19+）耗尽进行制备，并在每个培养袋中按照2，5或10x10⁵个细胞/mL而以10mL进行接种。细胞随后在所示浓度（NAM 2.5和NAM 5mM）烟酰胺，或仅仅细胞因子（细胞因子）存在下进行培养。注意到，即使在培养基中21天之后所有组中NK细胞百分数都较高，但是在暴露于烟酰胺的培养基中NK百分数比对照培养中高得多；

图13A-13C是显示暴露于烟酰胺的人体外周血NK细胞培养中迁移受体CD62L表达增加的柱状图。外周血NK细胞是通过在图10中描述的单核细胞T-细胞（CD3+或CD3+CD19+）耗尽进行制备，并在所示浓度（NAM 2.5，淡阴影和NAM 5mM，黑暗阴影）烟酰胺，或仅仅细胞因子（细胞因子，无阴影）存在下扩增。经过7（13A），14（13B）和21（13C）天之后，培养细胞与指定的表面标记的特异性抗体反应，然后通过FACS监测。注意，相比较对照（仅仅细胞因子），在烟酰胺存在下培养的细胞中，CD62L表达急剧增强，随着暴露持续时间而增加；

图14A-14B是显示暴露于烟酰胺的人体外周血NK细胞培养中单核细胞的和粒性白细胞增殖的抑制作用的柱状图。外周血NK细胞图10中描述的单核细胞T-细胞（CD3+或CD3+CD19+）耗尽进行制备，并在所示浓度（NAM 2.5，淡阴影和NAM 5mM，黑暗阴影）烟酰胺，或仅仅细胞因子（细胞因子，无阴影）存在下扩增。经过2周，培养的细胞对于单核细胞标记CD14（图14A）或粒性白细胞标记CD15（图14B）与特特异性抗体反应，然后通过FACS监测。注意到，相比较对照（仅仅细胞因子），在烟酰胺存在下培养的细胞中CD14+或CD15+细胞降低显著增强；

图15A-15D是图示说明采用暴露烟酰胺的人体外周血NK细胞的烟酰胺培养的NK细胞杀伤潜力增强的柱状图。外周血NK细胞是用图10中描述的单核细胞CD3+或CD3+CD19+耗尽进行制备的，并在所示浓度（NAM 2.5，淡阴影和NAM 5mM，黑暗阴影）烟酰胺，或仅仅细胞因子（细胞因子，无阴影）存在下扩增。经过2周之后，FACScalibur分析表明，所有的细胞都具有CD56+/CD3-表型。采用K562或BL2(15A)，原发性双表型白血病（图15B和15C）和Colo205克隆癌（图15D）靶细胞按照每个靶细胞1:1，2.5:1，5:1或10:1 NK细胞的E:T比对外周血NK细胞分析离体杀伤潜力，如所示。细胞系的靶细胞死亡通过FACS作为双重PI阳性和CFSE阳性的细胞百分数进行监测。原发性白血病的靶细胞死亡通过FACS作为CFSE标记靶细胞的降低百分数进行监测。相比较对照（细胞因子，NAM 0，无阴影）和新鲜未培养的NK细胞（对照，阴影线），增强的靶细胞杀伤作用强有力地表明，通过烟酰胺增强了NK细胞杀伤潜力的活化作用；

图16是显示烟酰胺存在下扩增的NK细胞体内功能性（归巢和植入）增加的柱状图。外周血NK细胞是用图10中描述的单核细胞CD3+或CD3+CD19+耗尽进行制备，并在所示浓度（2.5mM NAM，淡阴影；5mM NAM，黑暗阴影）烟酰胺，或仅仅细胞因子（细胞因子，无阴影）存在下扩增。在培养基中经过2至3周之后，每个实验组的15x10⁶个NK细胞输注到照射的（350Rad）NOD/SCID小鼠中。输注之后4天处死小鼠，并对脾、骨髓和外周血的样品分析人体NK细胞（CD45+ CD56 +）细胞的移植。注意到，相比较未采用烟酰胺培养的NK细胞，采用烟酰胺培养的NK细胞的体内归巢/停留/植入显著更高；

图17是显示在无（细胞因子）或有浓度逐渐增加（NAM，1至7.5 mM）的烟酰胺存在下培养时脐血来源的CD56+-纯化NK细胞部分剂量依赖性增殖的柱状图。这些培养以免疫磁性微球上CD56+表型纯化的脐血NK细胞开始，并以细胞因子（包括Flt-3，IL-2和IL-15）维持高达3周。图17显示了培养基中在7天（无阴影）、14天（淡阴影）和21天（黑暗阴影）时CD56+NK细胞的增殖（相对于第0天，培养之初，成倍增加）。注意到，相比较对照（细胞因子），在烟酰胺处理培养基的扩增中剂量依赖性显著增加，在整个培养期间持续；

图18A和18B显示了以部分CD3-耗尽的外周血开始而在无(细胞因子，0 NAM，无阴影)或有烟酰胺存在下维持的培养基中T(CD3+)和NKT(CD3+CD56+)细胞增殖的抑制作用。这些培养以细胞因子（包括Flt-3，IL-2和IL-15）在有或无浓度逐渐增加（2.5，黑暗阴影；5mM，淡阴影和7.5 mM，非常淡的阴影）的烟酰胺下维持3周，表面标记（56FITC和3APC）与特异性抗体反应，并通过FACS（图18）分析特异性表型。注意到，在暴露烟酰胺的NK培养基中CD3+T细胞和CD3+CD56+NKT细胞显著降低；

图19A和19B显示了采用烟酰胺对CD62L转运受体表达的增强。图19A是显示相比较仅仅细胞因子的对照（0“NAM”，无阴影），在2.5（淡阴影）和5（黑暗阴影）mM烟酰胺中暴露3周培养而具有IL-2的培养基中活化之前（非常淡阴影）和之后由外周血纯化的CD56+细胞上CD62L转运受体表达水平的柱状图。图19B是在（2.5 至7.5 mM）烟酰胺，或对照（NAM 0）中培养3周的纯化外周血CD56+细胞上CD62L表达的FACS分析。注意，相比较对照（仅仅细胞因子），在有烟酰胺存在下培养的细胞中CD62L的表达显著增强；

图20是显示烟酰胺对由CD3耗尽而接着进行CD56+细胞选择的外周血源单核细胞部分纯化的CD56+细胞增殖（倍增）的效果的柱状图。纯化的CD56+细胞在培养基（IL-2，IL-15和Flt-3，在有或无烟酰胺2.5和5.0mM下）中而用源自相同血液单元（Cyt+Irr，NAM 2.5+Irr和NAM 5+Irr）的外周血单核细胞的照射基质进行接种。照射的外周血细胞和CD56+选择的细胞比为10:1。注意到，相比较对照（仅仅细胞因子），用烟酰胺处理的培养基中增殖显著增强；

图21是显示所述烟酰胺对CXCR4在如图20中所述用细胞因子和照射的基质细胞处理的培养基中CD56+细胞上表达的效果的柱状图；

图22是显示采用烟酰胺培养对CD62L在如图20中所述用细胞因子和照射的基质细胞处理的培养基中CD56+细胞上表达的效果的柱状图；

图23是显示E:T为每个靶细胞1:1，2.5:1和5:1 的CD56+细胞下用烟酰胺培养对K562靶细胞的CD56+细胞离体杀伤潜力的效果的柱状图。靶细胞死亡通过FACS作为PI-阳性CFSE标记的K562细胞的百分数进行监测。增强的靶细胞杀伤作用，对于在所示浓度的烟酰胺（NAM 2.5+Irr，淡阴影；和NAM 5+Irr，黑暗阴影）培养的细胞，相比较对照（仅仅细胞因子，NAM 0+Irr，无阴影），强有力地表明，通过烟酰胺增强了NK细胞杀伤潜力的活化作用，而与照射细胞的效果无关。

具体实施方式

本发明涉及繁殖自然杀伤（NK）细胞群而同时维持或增强细胞离体和/或体内功能的方法。在一个实施方式中，采用烟酰胺和/或其它烟酰胺部分和NK细胞生长因子离体培养NK细胞，有助于产生适用于作为治疗性离体培养的细胞制剂的NK细胞群，这包括功能性NK细胞的繁殖群，在这种群中CD3+细胞的增殖受到抑制而同时NK细胞增殖优先增强。具体而言，在这个方面，本发明能够用于提供功能性NK细胞的强健群，能够适用于治疗癌症和其它疾病的细胞移植的应用，以及适用于基因操作的NK细胞生成的应用，在这种应用中可以用于细胞基因疗法。其它非限制性应用可以包括治疗移植物抗宿主病（例如，在骨髓重构中)，异源和自体同源的采用的免疫疗法，治疗自身免疫性疾病，在NK细胞中采用敏化剂和基因修饰的组合疗法。本发明进一步涉及适用于输注的NK细胞制剂，并涉及制备这种制剂的制品生产。

本发明的原理和操作参照实施例和附加描述可以更好地理解。

在详细解释说明本发明至少一个实施方式之前，应该理解到，本发明在其应用中并无必要仅限于在以下描述中提出或通过实施例举例说明的细节。本发明能够以各种方式实践或实施其它实施方式。

自然杀伤（以下简称为“NK”）细胞是参与免疫反应的淋巴样细胞。这些细胞具有各种功能，尤其是杀死活体内肿瘤细胞、发生致癌转化和其它异常细胞的功能，而是先天免疫监视机制的重要组分。NK细胞展示出抗病毒性感染和肿瘤细胞的自发非-MHC-受限的细胞毒活性，并介导体内对病毒性感染和癌进展的抵抗力。因此，有效提高NK细胞数目的方法能够用于治疗肿瘤并消除认为是肿瘤产生潜在之源的病毒感染细胞。

因此，制定诊断级别的方案（例如，无基质层，最低细胞因子）而有效扩增活体NK细胞数目和有效增强其功能和提高向淋巴结归巢及其输注后体内稳态增殖的可能性，能够提高采用的用NK细胞的免疫疗法治疗实体肿瘤、造血系统恶性肿瘤、病毒和自身免疫性疾病等的成功率。

本发明基于培养期间NK细胞离体暴露于以上一定浓度的烟酰胺，这将在本文中进一步详细描述，而有效增强功能性强效NK细胞的增殖和/或功能性并导致培养基的T细胞部分显著降低的发现。因此，在其一个实施方式中，本发明提供了临床上能够有效诱导离体和体外功能上成熟的NK细胞的增殖和/或功能的合适培养条件，而同时不会导致非-NK细胞（例如，CD3+）的增殖。

因此，根据本发明一个实施方式的一个方面，提供了一种离体培养自然杀伤（NK）细胞的方法，所述方法包括采用至少一种生长因子和有效浓度、有效暴露时间和烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的有效持续时间培养包含NK细胞的细胞群，其中采用至少一种生长因子和有效浓度、有效暴露时间和烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的有效持续时间培养所述NK细胞导致以下至少之一：

（a）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，CD62L的表达提高；

（b）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，迁移响应提高；

（c）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，归巢和体内停留增加；

（d）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，增殖更多；和

（e）采用小于0.1 mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，与其它相同培养条件下培养的NK细胞比较，细胞毒活性增加。

正如本文中所用术语自然杀伤（NK）细胞是指涉及先天免疫应答的大颗粒淋巴细胞。功能上，NK细胞展示出经由含多种蛋白质，包括穿孔蛋白和颗粒酶蛋白酶的胞质颗粒的胞吐作用对抗各种靶的溶胞活性。杀伤作用在不需要预先对抗原敏化的暴露依赖性的非吞噬过程中触发。人体NK细胞的特征在于存在细胞-表面标记CD16和CD56，而不存在T细胞受体（CD3）。人体骨髓来源的NK细胞的进一步特征在于CD2+CD16+CD56+CD3-表型，进一步包含T-细胞受体Zeta链[Zeta（ζ）-TCR]，而经常以NKp46，NKp30或NKp44为特征。非-NK细胞如NKT细胞或CD8NKT同时具有T细胞和NK细胞的特性和细胞-表面标记。在一个实施方式中，本发明的所述方法适用于由细胞群离体繁殖成熟NK细胞。正如本文中所用术语“成熟的NK细胞”被定义为一个坚定的NK细胞，具有特性表面标记和NK细胞的功能，而缺乏进一步分化的潜力。正如本文中所用，成熟的NK细胞包括但不限于CD56^亮细胞，可以进行增殖，并产生丰富的细胞因子，CD56^暗细胞，表现出强大的细胞毒性，CD56^亮CD94^高和CD56^暗CD94^高细胞。在另一个实施方式中，NK祖细胞，或混合的NK祖细胞和成熟的NK细胞群进行繁殖。例如，经由FACS分析或免疫组织化学染色技术，可确定CD56+，CD3 +，CD16，CD94和其它标记的细胞表面表达。

正如本文中所用术语“祖”是指能够分裂和/或分化成一个或多个成熟的效应器细胞的不成熟细胞。淋巴祖细胞包括，例如，能够产生成熟B细胞，T细胞和NK细胞谱系细胞的多能造血干细胞。在B细胞谱系（即，在产生成熟B细胞的发育途径中）中，祖细胞还包括特征在于免疫球蛋白基因重组和表达的原- B细胞和前-B细胞。在T细胞和NK细胞谱系中，祖细胞也包括骨髓来源的双电位T/NK细胞祖细胞[例如，CD34+CD45RA（hi）CD7抗原（+）和CD34（+）CD45RA（hi）Lin（-）CD10（+）细胞]，以及胸腺内祖细胞，包括双阴性（关于CD4和CD8）和双阳性胸腺细胞（T细胞谱系）和坚定NK细胞祖细胞。造血祖细胞包括CD34 +细胞和早期祖细胞，如CD133+，CD34+CD38-和CD34+Lin-细胞。

正如本文中所用的术语“离体（ex-vivo）”是指细胞从活有机体移出而在生物体外（例如，试管中）繁殖的过程。正如本文中所用术语“体外（试管内，in-vitro）”是指仅在体外繁殖的细胞如各种细胞系进行培养的过程。

NK细胞离体扩增，能够根据本发明这个方面通过为离体NK细胞提供细胞增殖的条件并用烟酰胺部分离体培养NK细胞进行实施，从而离体繁殖NK细胞的细胞群。

正如本文中所用的“培养”，包括提供NK细胞维持所需的化学和物理条件（例如，温度，气体）和生长因子。在一个实施方式中，培养NK细胞，包括为NK细胞提供增殖的条件。能够有助于NK细胞增殖的化学条件的实例，包括但不限于缓冲剂，营养物质，血清，维生素和抗生素，以及细胞因子和其它通常提供于生长（即，培养）培养基中的生长因子。在一个实施方式中，NK细胞培养介质包括的MEMα包含10％FCS的MEMα或包含5％人体血清/LiforCell®FBS替代品（Lifeblood Products）的细胞Gro SCGM（细胞Genix）。适合本发明使用的其它介质，包括但不限于Glascow培养基（Gibco Carlsbad CA），RPMI培养基（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯MO）或DMEM（Sigma-Aldrich，St Louis MO）。应该注意到，许多培养介质含有例如作为维生素补充剂的烟酰胺，MEMα（8.19μM的烟酰胺），RPMI（8.19μM的烟酰胺），DMEM（32.78μM的烟酰胺）和Glascow培养基（16.39μM的烟酰胺），然而，本发明方法涉及补充包括培养基配方，或源自整体调节培养基组分浓度的任何烟酰胺和/或烟酰胺部分的外加烟酰胺。

根据本发明一些实施方式，用生长因子培养NK细胞包括为细胞提供营养物和至少一种生长因子。在某些实施方式中，所述至少一种生长因子包括细胞因子和/或趋化因子，如但不仅限于，干细胞因子（SCF），FLT3配体，白细胞介素-2（IL-2），白细胞介素-7（IL-7），白细胞介素-15（IL-15），白细胞介素-12（IL-12）和白细胞介素-21（IL-21）。使用其它细胞因子和生长因子都是可以设想的，例如，加入IL-1，TNF-α等。细胞因子和其它生长因子通常按照0.5至100ng/mL，或1.0至80ng/mL，更通常5至750ng/ml，而更加常见的是5.0至50ng/ml（高达10X的这种浓度也是可以设想的）的浓度范围提供，而例如能够从美国新泽西州落基山Perpo Tech，Inc.商购获得。在一个实施方式中，至少一种生长因子IL-2。在另一个实施方式中，生长因子是IL-15。在另一个实施方式中，NK细胞采用IL-2和IL-15培养。

另外，在这个方面应该理解到，新型细胞因子不断发现，其中一些可以在本发明NK细胞增殖的方法中找到用武之地。对于许多应用，将细胞引入（或重新引入）人体主体中，经常优选使用无血清制剂，如培养淋巴细胞的AIM V.^RTM无血清培养基或MARROWMAX.^RTM骨髓培养基。这种培养基制剂和补充剂可从商业来源如Invitrogen（GIBCO）（Carlsbad，Calif）获得。这些培养能够用氨基酸、抗生素和/或采用细胞因子进行补充而提高最佳生命力、增殖、功能性和/或存活率。

根据一个实施方式，这些细胞采用生长因子和烟酰胺和/或烟酰胺部分进行培养。正如本文中所用术语“烟酰胺部分” 是指烟酰胺以及由烟酰胺衍生的产物，衍生物，类似物及其代谢物，如例如，NAD，NADH和NADPH，这些能够有效而优选增强NK细胞增殖和/或活化作用的物质。烟酰胺衍生物、类似物和代谢物能够进行筛选，并通过加入到按以下描述而维持的NK培养基中，加入到功能分析试验如杀伤和迁移率分析试验（参见实施例部分）中或在设计用于本领域众所周知的高产量分析试验的自动筛选方案中评价其对培养基中的离体NK增殖的影响。

正如本文中所用，短语“烟酰胺类似物”是指在以上提及的或类似试验分析中已知作用类似烟酰胺的任何分子。烟酰胺类似物的代表性实例能够包括，但不限于，苯甲酰胺，烟乙硫酰胺（乙硫异烟酰胺，nicotinethioamide）（烟酰胺的硫醇类似物），烟酸和α-氨基-3-吲哚丙酸。

短语“烟酰胺衍生物”进一步是指烟酰胺自身或烟酰胺类似物的任何结构衍生物。这种衍生物的实例包括，但不限于，取代的苯甲酰胺，取代的烟酰胺和烟乙硫酰胺（乙硫异烟酰胺，nicotinethioamide）和N-取代的烟酰胺和烟硫酰胺（硫代烟酰胺，nicotinthioamide），3-乙酰吡啶和烟酸钠。在本发明一个具体实施方式中，烟酰胺部分是烟酰胺。

正如本文中所用短语“烟酰胺和/或其烟酰胺部分的有效浓度”定义为当烟酰胺和/或烟酰胺部分提供于培养基中所述NK细胞群达到对烟酰胺和/或其它烟酰胺部分有效暴露持续时间和在对培养基中烟酰胺和/或其它烟酰胺部分暴露有效时间而导致相比较相同条件下采用小于0.1 mM烟酰胺和/或烟酰胺部分培养的NK细胞出现NK细胞的CD62L表达提高、迁移响应提高、归巢和体内停留增加、增殖更多和细胞毒活性增加的一种或多种情况时的浓度。适合在本发明的某些实施方式中使用的烟酰胺或烟酰胺部分浓度通常的范围为约0.5 mM至约50 mM，约1.0 mM至约25 mM，约1.0 mM至约25 mM，约2.5 mM至约10 mM，约5.0mM至约10 mM。基于这些烟酰胺浓度对增殖和NK细胞功能的效应，以下实施例I-VII证明了约0.5至约10 mM，通常2.5或5.0 mM的典型烟酰胺部分（烟酰胺）有效浓度。根据本发明的一些实施方式，烟酰胺和/或烟酰胺部分的浓度范围为约0.5，约0.75，约1.0，约1.25，约1.5，约1.75，约2.0，约2.25，约2.5，约2.75，约3.0，约3.25，约3.5，约3.75，约4.0，约4.25，约4.5，约4.75，约5.0，约5.25，约5.5，约5.75，约6.0，约6.25，约6.5，约6.75，约7.0，约7.25，约7.5，约7.75，约8.0，约8.25，约8.5，约8.75，约9.0，约9.25，约9.5，约9.75，约10.0，约11.0，约12.0，约13.0，约14.0，约15.0，约16.0，约17.0，约18.0和约20.0 mM，并包括所有有效中间浓度。

烟酰胺和/或烟酰胺部分的有效浓度能够根据NK增殖和/或活性的任何试验分析，例如，以下实施例1至VI中详细描述的细胞培养或功能试验进行确定。根据一个实施方式，烟酰胺和/或烟酰胺部分的有效浓度是相比较具有小于0.1mM烟酰胺和/或烟酰胺部分的“对照”培养基并由相同的脐血、骨髓或外周血制剂进行测试，在相同的分析试验和在类似的培养条件（烟酰胺和/或烟酰胺部分的暴露持续时间，对烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的暴露时间）下其应用于培养基中“增强”或导致NK细胞在培养基增殖和/或功能净增加的浓度。

正如本文中所用短语NK细胞对烟酰胺和/或其它烟酰胺部分暴露的“有效持续时间 ”定义为当烟酰胺和/或其它烟酰胺按照有效浓度和有效暴露时间提供于培养基中的NK细胞群时导致相比较相同条件下不采用或采用小于0.1 mM烟酰胺和/或烟酰胺部分培养的NK细胞出现NK细胞的CD62L表达提高、迁移响应提高、归巢和体内停留增加、增殖更多和细胞毒活性增加的一种或多种情况的该期间内暴露烟酰胺的持续时间。适合于本发明某些实施方式中使用的NK细胞群对烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的持续暴露时间，通常的范围为约2 h至约5周，约30 h至约4周，约2天至约3周，约1周，约2周，约3周。基于暴露烟酰胺和/或其它烟酰胺部分对增殖和NK细胞功能的效应，以下实施例I-VI证明了约1周至约3周的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分典型有效暴露持续时间。根据本发明的一些实施方式，烟酰胺和/或其它烟酰胺部分暴露持续时间为约1.0，约，约2.0，约2.5，约3.0，约3.5，约4.0，约4.5，约5.0，约6.0，约7.0，约8.0，约9.0，约10.0，约11.0，约12.0，约13.0，约14.0，约15.0，约16.0，约17.0，约18.0，约19.0，约20.0，约21.0天，约25天，约30天，约35天并包括所有有效中间持续时间。烟酰胺和/或其它烟酰胺部分有效暴露持续时间能够根据NK增殖和/或活性的任何试验分析，例如，以下实施例1至VI中详细描述的细胞培养或功能试验进行确定。

应该理解到，NK细胞群对烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的暴露能够以建立细胞培养，或在细胞培养期间的任何时间开始，甚至恰好在NK细胞使用（例如，输注（注入））之前进行一段短的持续时间。正如本文中所用短语NK细胞群对烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的“有效暴露时间”定义为NK细胞群培养期间将烟酰胺和/或其它烟酰胺部分按照烟酰胺和/或其它烟酰胺部分有效浓度和有效持续时间提供于NK细胞群导致相比较相同条件下不采用或采用小于0.1mM烟酰胺和/或烟酰胺部分培养的NK细胞出现NK细胞的CD62L表达提高、迁移响应提高、归巢和体内停留增加、增殖更多和细胞毒活性增加的一种或多种情况时的时间。适用于本发明一些实施方式的NK细胞群对烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的暴露时间通常为从NK细胞接种至培养之后约5周，从接种之后约1h至培养之后约3周，从约24 h至培养之后约3周和从培养基中NK细胞群接种的时间。根据本发明的一些实施方式，NK细胞对烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的暴露时间接种之时，该细胞接种之后约2h，该细胞接种之后约12h，该细胞接种之后约24h，该细胞接种之后约2天，该细胞接种之后约4天，该细胞接种之后约7天，该细胞接种之后约8.0，约9.0，约10.0，约11.0，约12.0，约13.0，约14.0，约15.0，约16.0，约17.0，约18.0，约19.0，约20.0，约21.0天，约25天，约30天，约35天，而包括所有的有效中间时间。烟酰胺和/或其它烟酰胺部分有效暴露时间能够根据NK增殖和/或活性的任何试验分析，例如，以下实施例1至VI中详细描述的细胞培养或功能试验进行确定。

正如在以下实施例部分中的描述，采用至少一种生长因子和以有效暴露时间和培养有效持续时间提供的有效浓度的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分培养NK细胞群，导致相比较相同条件下以小于0.1 mM烟酰胺和/或烟酰胺部分培养的NK细胞出现所培养细胞增殖提高和/或NK细胞功能增强中至少之一。

正如本文中所用术语“繁殖”或“增殖”是指生长，例如，细胞生长，和细胞数量的倍增。正如本文中所用的繁殖和增殖，涉及培养期间出现的NK细胞数量的增加。展示NK细胞表型的细胞体内或体外繁殖是一种在其受到例如用IL-2、EB病毒转化的淋巴线等刺激之后的已知现象。

细胞增殖的试验分析在本领域内是众所周知的，包括但不限于集落生成分析法，其中细胞以低密度接种和生长，并对集落计数；机械分析法[流式细胞术（例如，FACS^TM），碘化丙啶]，这种方法机械测定细胞数目；代谢分析法（如引入四唑鎓盐，例如，XTT，MTT等），这种方法测定活体细胞数量；直接增殖分析法（如BudR，胸腺嘧啶核苷引入等），这种方法测定生长群的DNA合成。在一个实施方式中，采用根据本发明的有效浓度的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分培养的NK细胞群的细胞增殖，在培养基中接种NK细胞之后的预定时间（例如，约10h，12 h，约1，2，3，4，5，6，7天，约1，2，3，4，5周，2月或更长）通过FACS分析，使用抗-CD56和抗-CD3标记识别和定量群的CD56+CD3- NK细胞部分而进行测定。NK细胞的增殖能够表示相比较培养之前原始NK细胞部分的NK细胞倍增，（例如，扩增或成倍扩增）。在某些实施方式中，根据本发明暴露有效浓度的烟酰胺的NK细胞群，在约5，约7，约12，约14，约18，约21，约25，约30或更多天培养之后，所具有的NK细胞群倍增至少2X，至少10X，至少20X，至少40X，至少50X，至少75X，至少100X，至少150X，至少250X和至少500X或更高。在另一实施方式中，暴露有效浓度的烟酰胺的NK细胞群的成倍扩增，通过FACS^TM测定，为至少约1.2X，约1.3X，约1.5X，约1.75X，约2X，约2.25X，约2.5X，约2.75X，约3.0，约3.5X，约4X，约4.5X，约5X，约6X，约7X，约8X，约9X，约10X，大于在相同条件下采用小于0.1mM烟酰胺和/或其它烟酰胺部分培养的NK细胞的扩增。

正如本文中所用术语“功能”或“NK细胞功能”是指归属于NK细胞的任何生物功能。NK细胞功能非限制性的清单包括，例如，细胞毒性，诱导细胞凋亡，细胞移动性，定向迁移，细胞因子和其它细胞信号响应，细胞因子/趋化因子的产生和分泌，活化和抑制性细胞表面分子的体外表达，在移植的宿主中细胞归巢和植入（体内停留），以及体内疾病或疾病过程的改变。在某些实施方式中，通过暴露烟酰胺和/或其它烟酰胺部分增强的NK细胞功能包括CD62L表面标记的表达提高、迁移响应提高和NK细胞细胞毒活性更大，以及输注的NK细胞的归巢和体内停留增加中的至少一种。

粘附和迁移分子如CD62L、CXCR-4、CD49e等，对于移植中细胞的归巢/植入和停留是很重要的，对其试验分析在本领域内是众所周知的。CD62L在细胞中的表达能够，例如，通过流式细胞术、免疫检测、定量cDNA扩增和杂交等进行试验分析。在一个实施方式中，CD62L的表达通过将细胞暴露荧光标记的特异性抗人体CD62L单克隆抗体[例如，CD62L PE，Cat.No. 304806，BioLegend（San Diego，CA，USA）]，并通过荧光激活细胞分选法（FACS）进行这些细胞的分类而在不同NK细胞群中进行检测。在某些实施方式中，暴露有效浓度的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的NK细胞群通过FACS^TM检测而检测到具有至少 25 %，至少 30 %，至少 40 %或更多表达CD62L的细胞。在另一实施方式中，通过检测 FACS^TM，当相比较相同条件下采用小于0.1mM烟酰胺和/或其它烟酰胺部分培养的NK细胞，根据本发明暴露烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的NK细胞群具有至少约1.2X，约1.3X，约1.5X，约1.75X，约2X，约2.25X ，约2.5X，约2.75X，约3.0X，约3.5X，约4X，约4.5X，约5X，约6X，约7X，约8X，约9X，约10X或更多倍的CD62L表达。

对于细胞迁移的试验分析在本领域内是众所周知的。例如，通过迁移试验分析法或补洞试验分析法就能够分析细胞的迁移。在迁移试验分析法中，如双室技术，细胞通过障碍（例如，过滤器）与刺激物分离，而细胞的迁移通过在特定的时间间隔下从起点计数损失的细胞，累计穿过障碍的细胞，或同时进行这二者而进行检测。在补洞试验分析中，细胞置于可见隙（刻痕琼脂板，绕着一个圆圈，等）的周边并用刺激物培养。细胞响应刺激物而施加细胞移动性的细胞之间的空间封闭，采用细胞计量术、免疫检测、显微镜/形态测定等进行可视观察。在一个实施方式中，NK细胞不同群的迁移电位响应SDF（250 ng/mL）而通过“Transwell”^TM 迁移试验分析法进行检测。在某些实施方式中，根据本发明暴露有效浓度的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的NK细胞群，通过本文中描述的Transwell试验分析，具有至少40 %，至少50 %，至少60 %，至少70 % 和至少80 %或更多的迁移测定值。在另一实施方式中，暴露有效浓度的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的NK细胞群，通过Transwell试验分析进行检测，相比较相同条件下采用小于0.1mM烟酰胺和/或其它烟酰胺部分培养的NK细胞时，具有至少 约1.2X，约1.3X，约1.5X，约1.75X，约2X，约2.25X ，约2.5X，约2.75X，约3.0，约3.5X，约4X，约4.5X，约5X，约6X，约7X，约8X，约9X，约10X或更多倍的迁移。

对输注或移植细胞进行归巢和体内停留的试验分析在本领域内是众所周知的。正如本文中所用术语“归巢”是指输注或移植细胞在宿主靶器官中到达和存活的能力。例如，NK细胞靶器官能够是淋巴样组织，肝细胞靶器官能够是肝脏软组织，肺泡细胞靶器官能够是肺软组织等。正如本文中所用术语“体内停留”（也已知为“植入”）是指输注或移植细胞进行增殖而在靶器官中存活的能力。实验分析移植NK细胞归巢和体内停留的动物模型包括但不限于，免疫缺陷的小哺乳动物（如SCID和IL2Rγ^null鼠等）。SCID-Hu鼠模型采用移植人体胎儿胸腺和肝组织或胎儿BM组织的C.B-17 scid/scid（SCID）鼠，并提供合适的模型进行移植人体NK细胞停留和治疗潜力的评价。移植细胞的归巢和体内停留也能够在人体宿主主体内进行评价。在一个实施方式中，归巢和体内停留的试验分析在受照射的 NOD/SCID鼠（参见本文中实施例VI）中进行，这些鼠移植了，例如，约15×10⁴，约15×10⁵，约15×10⁶，约15×10⁷或更多根据本发明采用有效浓度的烟酰胺培养的人体NK细胞，并在输注之后预定时间（例如，输注之后约5 h，10 h，12 h，1，2，3，4，5，6，7天，1，2，3，4，5周，2，3，4月或更长时间）进行处死。这些鼠一旦处死，就通过FACS对脾、骨髓、外周血和其它器官的样品评价使用人体特异性Abs的人体NK细胞（CD56+CD45+）的存在。体内停留的百分数表示展示供体表型（例如，人体细胞的CD45）的器官的细胞百分数。在某些实施方式中，输注根据本发明暴露有效浓度烟酰胺的NK细胞群的宿主鼠的靶器官（例如，淋巴样组织，如骨髓，脾，胸腺，淋巴结，GALT）具有至少5 %，至少10 %，至少20 %，至少25 %，至少30 %，至少40 %，至少50 %，至少60%，至少70 %和至少80 %或更高的归巢和体内停留。在一个具体实施方式中，15×10⁶ 个根据本发明采用有效浓度的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分培养的NK细胞输注于照射的SCID鼠，而在输注之后4天，宿脾内就检测到至少 25 %的具有供体特异性细胞谱系（例如，CD45+）的NK细胞。在另一实施方式中，通过检测 FACS^TM，相比较相同条件下采用小于0.1mM烟酰胺和/或其它烟酰胺部分培养的NK细胞时，暴露有效浓度的烟酰胺的NK细胞群具有至少约1.2X，约1.3X，约1.5X，约1.75X，约2X，约2.25X ，约2.5X，约2.75X，约3.0，约3.5X，约4X，约4.5X，约5X，约6X，约7X，约8X，约9X，约10X或更多倍的归巢和体内停留。

正如本文中所用术语“稳态增殖”是指靶器官或组织中随时间推移，优选月或年，能够维持所输注NK细胞的稳定数目的增殖。

目前涉及NK细胞移植患者的许多临床试验正在进行，对于这些病症，包括而不排他地，例如，白血病（NCT 00799799 和NCT 00303667），恶性血液病（NCT 00697671，NCT00354172和00640796），后-ASCT（NCT 00586703），成神经细胞瘤（NCT 00698009），恶性黑[色]素瘤（NCT 00846833），采用化疗的组合疗法（NCT 00625729），实体肿瘤（NCT00640796）和鼻咽癌（NCT 00717184）以及对于各种恶性肿瘤（NCT01105650）。对于NK细胞疗法，目前临床试验和详细方案的完整而详细的现有清单在美国国立健康临床试验研究所网站能够找到。

细胞毒性（细胞“杀伤作用”）的试验分析在本领域内是众所周知的。适用于重导向杀伤试验分析的合适靶细胞实例有癌细胞系，原发性癌细胞实体肿瘤细胞，白血病细胞或病毒感染细胞。具体而言，能够使用K562，BL-2，colo250 和原发性白血病细胞，但是能够使用任何许多其它细胞类型，而这在本领域内是众所周知的（参见，例如，Sivori et al.（1997）J. Exp. Med. 186: 1129-1136；Vitale et al.（1998）J. Exp. Med. 187: 2065-2072；Pessino et al.（1998）J. Exp. Med. 188: 953-960；Neri et al.（2001）Clin.Diag. Lab. Immun. 8:1131-1135）。细胞杀伤作用通过细胞存活率试验分析法（例如，色素排除法，铬释放试验法，CFSE），代谢分析法（例如，四唑鎓盐）和直接观察法进行评价。在一个实施方式中，NK细胞不同群的细胞毒性潜力在暴露E:T比为1:1、2.5:1、5:1或10:1的NK细胞的细胞中通过CFSE停留和PI摄取进行检测，而根据本发明暴露有效浓度的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的NK细胞群杀死至少20 %，至少25 %，至少30 %，至少40 %，至少50 %，至少60 %，至少70 % 和至少80 %或更多的所述靶细胞，这通过本文中所述的色素排除分析法进行测定。在另一实施方式中，通过检测色素排除分析法进行测定，相比较相同条件下采用小于0.1mM烟酰胺和/或其它烟酰胺部分培养的NK细胞时，暴露有效浓度的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的NK细胞群具有至少约1.2X，约1.3X，约1.5X，约1.75X，约2X，约2.25X ，约2.5X，约2.75X，约3.0，约3.5X，约4X，约4.5X，约5X，约6X，约7X，约8X，约9X，约10X或更多倍的杀伤潜力。

所述NK细胞的培养能够使用或不使用饲养细胞或饲养细胞层而完成。无饲养层的离体培养对于所培养的细胞，包括NK细胞的临床应用是高度有利的。这将在以下实施例部分进行详细描述，在源自经选择和未经选择的脐血和骨髓细胞的无饲养层和饲养细胞的长短期 NK细胞培养基中观察到NK细胞离体增殖和细胞功能的有效增强。因此，根据一个实施方式，所述NK细胞群的培养在无饲养层或饲养细胞下完成。

根据本发明一些实施方式，而这将在以下实施例部分进行详细描述， NK细胞群采用IL-2和5 mM烟酰胺进行培养，对烟酰胺的暴露时间为从包含NK 细胞的细胞群接种的时间，而所述暴露持续时间为约2周至约3周，可选地为2周，而可选地为3周。

在本发明的某些实施方式中，根据本发明暴露有效浓度的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的NK细胞群，相比较相同条件下采用小于0.1mM烟酰胺和/或其它烟酰胺部分培养的NK细胞时，能够具有NK细胞CD62L表面标记的表达提高，迁移响应提高和细胞毒活性更大，以及输注的NK 细胞归巢和体内停留增加中至少任意两种，可选地任意三种，可选地任意四种和可选地所有五种。在一个具体实施方式中，根据本发明暴露有效浓度的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的NK细胞群具有更大的增殖，提高的CD62L表达和改善的输注NK细胞归巢和体内停留。

正如本文中的详细描述，在饲养细胞存在下也观察到通过暴露烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的NK细胞增殖和细胞功能的增强。因此，在另一实施方式中，NK细胞在饲养细胞或饲养层存在下进行培养。在通常情况下，饲养层包括照射的基质细胞，永生化细胞系的细胞等。在饲养层上或采用饲养细胞培养NK细胞的方法详细描述于，例如，Frias et al.（ExpHematol 2008；36: 61-68），Harada et al.（Exp Hematol 2004；32:614-21），Campana etal. （US20090011498）Childs et al.（US20090104170）和Tsai（US20070048290）（结合于本文中作为参考）中。

本发明的NK细胞可以源自任何包含这种细胞的来源。NK细胞可以发现于许多组织，并能够获自，例如，淋巴结、脾、肝、肺、肠、蜕膜，并也能够获自iPS 细胞或胚胎干细胞（ESC）。通常情况下，脐血，外周血，流通外周血和骨髓，含有异质淋巴细胞的细胞群，用于提供大量的NK细胞供研究和临床应用。因此，根据本发明一个实施方式的一个方面，所述方法包括培养源自脐血、外周血或骨髓中之一的NK细胞群。正如本文中的详细描述，据发现，不同源的NK细胞制剂之间在不同比例的淋巴细胞的细胞类型中发现了显著差异。例如，（通过免疫磁性分离法）从脐血中分离的CD56+细胞通常比骨髓或外周血的CD56+部分包含更大比例的CD56+CD3- NK细胞和更少的共表达CD56 NK标记和CD3 T细胞标记（CD56+CD3+）的NKT细胞（参见本文中的实施例I-VI）。因此，在某些实施方式中，NK细胞由包含NK 细胞、CD3-细胞和CD3+细胞的异质细胞群培养。在一个实施方式中，CD3+部分大于CD3- NK细胞部分，这在骨髓，脐血或外周血中是很典型的。在还有的另一实施方式中，NK细胞群针对NK细胞进行了选择或富集。在某些实施方式中，NK细胞能够由新鲜的细胞群繁殖，而同时其它实施方式由储存的细胞群（如 低温冷藏和解冻的细胞）或先前培养的细胞群繁殖NK细胞。

NK细胞与脐血或外周血或骨髓的单核细胞部分有关。在一个实施方式中，包含所述NK细胞的细胞群是耗尽CD3+细胞，或CD3+和CD19+细胞的单核或总核细胞群。在另一实施方式中，包含所述NK细胞的细胞群是未经选择的NK细胞群。在还有的另一实施方式中，所述细胞经过了进一步的选择而所述NK细胞包含CD56+CD16+CD3-细胞和/或CD56+CD16-CD3-。根据表型选择NK细胞的方法（例如，免疫检测法和FACS分析法）在本文中，例如，在以下方法部分中进行了详细描述。

最常见的是，整个血液或骨髓样品进一步加工处理而获得在将淋巴细胞放置于培养基（或缓冲液）中之前的细胞群。例如，血液或骨髓样品能够进行加工处理而富集或纯化或分离具体定义的细胞群。术语“纯化”和“分离”并不需要绝对纯度；相反，这些预想作为相对术语。因此，例如，纯化的淋巴细胞群是指其中指定的细胞比在其源组织中的那些细胞更富集的群。基本纯净的淋巴细胞制剂能够经过富集而使之所需的细胞占制剂中存在的总细胞的至少50%。在某些实施方式中，基本纯净的细胞群占制剂中总细胞的至少60 %，至少70%，至少80 %，至少85 %，至少90 %或至少95 %或更多。

富集和分离淋巴细胞的方法在本领域内是众所周知的，而合适的方法能够基于所需的群进行选择。例如，在一种方法中，源材料通过去除红血球而富集淋巴细胞。在其最简单的形式中，红血细胞的去除可能涉及未凝血的整个血液或骨髓的离心。红血细胞基于密度而与淋巴细胞和其它细胞分离。淋巴细胞富集部分随后能够选择性地回收。淋巴细胞及其祖细胞也能够通过离心而采用分离介质如获自许多商业渠道的标准淋巴细胞分离介质（LSM）进行富集。另外，淋巴细胞/祖细胞能够采用各种基于亲合力的方法和步骤进行富集。许多抗体介导亲合力的制备方法在本领域是众所周知的，如抗体共轭磁力微珠。淋巴细胞的富集也能够采用阴性选择多余细胞的商购获得的制剂，如FICOLL-HYPAQUE™和其它配制用于富集整个淋巴细胞、T细胞或NK细胞的密度梯度介质而进行实施。

由血液、骨髓或组织样品选择NK细胞的方法在本领域内是众所周知的（参见，例如，Litwin等的美国专利NO. 5,770,387）（以其全文结合于本文中作为参考）。最常用的是基于分离和纯化CD56+细胞，通常接着是单核细胞分离和耗尽非-NK细胞如CD3+，CD34+，CD133+等的方案。两种或多种方案的组合能够用于提供无非-NK污染物的更大纯度的NK细胞群。NK细胞制剂的纯度对于临床应用意义重大，因为非-NK细胞，如T-细胞和NKT-细胞有助于抗原特异性反应如GVHD，而损害NK细胞移植的潜在受益。分离NK细胞的商购可获得的试剂盒包括一步法（例如，CD56微珠和CD56+，CD56+CD16+分离试剂盒，Miltenyi Biotec，Auburn CA）和多步法，包括CD3+的耗尽或部分耗尽或采用非-NK细胞抗体识别而去除T-细胞（例如，OKT-3）、B 细胞、干细胞、树突细胞、单核细胞、粒性白细胞和红系细胞的耗尽。因此，在某些实施方式中，NK细胞选择CD56+CD3-、CD56+CD16+CD3-、CD56+CD16-CD3-或其它纯化的NK细胞群。然而，应该注意到，临床应用通常偏好操作更少的候选细胞群。

在一个实施方式中，NK细胞通过短或长期培养基进行离体繁殖。正如实施例I中的详细描述，根据本发明的方法，NK细胞采用生长因子和烟酰胺和/或其它烟酰胺部分培养少至7天，或多至3周，导致相比较采用细胞因子而烟酰胺和/或其它烟酰胺部分小于0.1 mM培养的细胞，所培养的NK细胞优先增殖和/或功能性增强。因此，在本发明的某些实施方式中，NK细胞群培养至少3，至少5，至少7，可选10，可选12，可选14，可选16，可选18，可选20和可选21天，或1，2或3周，4周，5周，6周，或更长时间。正如实施例1至VI中的详细描述，典型的非限制性培养持续时间为7天（1周）和21天（3周）。

NK细胞群能够使用各种方法和设备进行培养。培养设备的选择通常基于培养的规模和目的。细胞培养按比例放大，优选涉及使用专用设备。大规模临床级别的NK细胞生产的设备详细描述于，例如，Spanholtz et al.（PLoS ONE 2010；5:e9221）和Sutlu et al.（Cytotherapy 2010，Early Online 1-12）中。

Peled等（WO 03/062369，以其全文结合于本文中作为参考）最近已经公开了烟酰胺处理对CD34+细胞植入潜力的显著影响。在培养基中的细胞增殖和足以发生最低或无细胞分裂的短持续期培养中都已经观察到这种烟酰胺的效应。因此，尽管离体培养基中的NK细胞增殖增强是本发明的重要目标，但是还设想了NK细胞几分钟、几小时、1天等的短期离体暴露烟酰胺和/或其它烟酰胺部分。这种NK细胞短期暴露烟酰胺和/或其它烟酰胺部分不足以发生增殖的时间，能够潜在地增强，例如，NK细胞功能性（细胞毒性，迁移电位，细胞表面分子表达，植入潜力等）。烟酰胺的短期处理能够提供于新鲜细胞、低温冷藏和解冻细胞、培养基中细胞、纯化细胞、混合细胞群等。在一个实施方式中，这种短期烟酰胺和/或其它烟酰胺部分处理在NK细胞使用（移植，输注等）之前立即提供。

本发明人已经令人惊讶地观察到，在培养基中有效浓度的烟酰胺存在下，培养包含NK（CD56+）细胞和非-NK细胞（例如，T（CD3+）细胞，NKT （CD56+CD3+）细胞等）的混合细胞群，不仅增强了NK细胞的增殖、生长和功能性，而且抑制了相同培养基中非-NK细胞（例如，T-细胞和NKT细胞）的增殖和生长（参见本文中的实施例V）。因此，在本发明的一个实施方式中，采用有效浓度的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分培养NK和CD3+细胞的异质群，导致相比较在其它相同的培养条件下采用小于0.1 mM烟酰胺和/或其它烟酰胺部分培养的NK细胞群，产生了具有CD3+与CD56+CD3-的细胞比降低的NK细胞群。在还有的另一实施方式中，根据本发明的方法，采用有效浓度的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分培养NK和CD3+细胞的异质群，导致相比较在其它相同的培养条件下采用小于0.1 mM烟酰胺和/或其它烟酰胺部分培养的NK细胞群，产生了CD14+和CD15+细胞数目降低的NK细胞群。

以上所述的离体培养NK细胞群的方法尤其能够产生NK细胞的培养群。

因此，进一步根据本发明的一方面，与其它相同培养条件下培养的NK细胞群比较，采用小于0.1mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，提供的NK细胞群特征在于以下的至少之一：CD62L的表达提高，迁移响应提高，归巢和体内停留增加，增殖更多，细胞毒活性提高和CD3+与CD56+/CD3-的细胞比降低。在某些实施方式中，，与其它相同培养条件下培养的NK细胞群比较，采用小于0.1mM的所述烟酰胺和/或其它烟酰胺部分，所述NK细胞群特征在于以下方面至少任意两方面，至少任意三方面，至少任意四方面，至少 任意物方面或所有六方面：CD62L的表达提高，迁移响应提高，归巢和体内停留增加，增殖更多，细胞毒活性提高，而CD3+与CD56+/CD3-的细胞比降低。

在实施例VI中，本发明人已经证明，根据本发明方法制备的NK群提高了体内功能潜力，这通过靶器官（例如，脾，骨髓和外周血）中的定位和体内停留进行证实。因此，在本发明一些实施方式的一个具体方面，提供的NK细胞群特征在于移植时归巢、植入和体内停留增强，其中向照射的宿主（例如，SCID鼠）输注至少15×10⁶个NK细胞群的细胞导致宿主淋巴样组织中产生至少5 %，至少10 %，至少15 %，至少20 %，至少25 %，至少30 %，至少35 %，至少40 %，至少45 %，至少50 %，至少55 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %和至少90 %或更多的供体来源的NK细胞，这通过免疫检测和流式细胞术在输注后第4天进行测定。在一个实施方式中，输注至少15×10⁶个NK群的细胞导致宿主淋巴样组织中产生至少25%供体来源的NK细胞，这通过免疫检测和流式细胞术在输注后第4天进行测定。

其它相关的标准可以适用于表征NK细胞群。因此，在还有的另一实施方式中，本发明的NK群进一步的特征在于向宿主输注之时至少30%的细胞群表达CD62L，这通过流式细胞术和免疫检测测定。在还有的另一实施方式中，NK细胞群能够根据CD3+细胞污染的纯度程度进行进一步表征，例如，在输注之时NK细胞群具有的CD3+与CD56+/CD3-的细胞比等于或小于1:100。

在本发明的上下文中，应该理解到，治疗性细胞群能够连同包含烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的培养基一起，与培养基分离，和与药用载体混合而提供。因此，本发明的细胞群能够采用药用载体或稀释剂，如灭菌盐水和水性缓冲溶液给予。这种载体和稀释剂的使用在本领域内是众所周知的。

在本发明这方面的一个具体实施方式中，NK细胞群包含在有效用量的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分存在下离体培养的NK细胞群；和药用载体。在还有的另一实施方式中，所述离体培养的细胞群，当相比较采用生长因子在小于0.1 mM的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分中培养的NK细胞群时，包含已经活化并提高了对靶细胞毒性能力的NK细胞。

烟酰胺和/或其它烟酰胺部分维持NK细胞增殖和功能的能力能够进一步用于各种技术应用中：

根据本发明的其它方面，提供了一种保存NK细胞的方法。在一个实施方式中，所述方法在有效用量的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分存在下通过在以下步骤至少之一中处理NK细胞而进行实施：收获，分离和/或储存。

根据本发明还有的其它方面，提供了NK细胞的收集/培养袋。本发明的细胞收集/培养袋采用有效用量的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分进行补充。

根据本发明，也提供了NK细胞的分离和/或冲洗缓冲液。这种分离和/或冲洗缓冲液采用有效用量的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分进行补充。

正如以下的进一步详细描述，NK细胞可以进行遗传修饰。

在离体基因疗法中，细胞从患者移出，而同时进行体外培养处理。一般而言，功能替代基因经由合适的基因递送载体/方法（转染、转导、均质重组等）和表达系统按需引入该细胞中，随后改性的细胞经过培养而返回宿主/患者中。这些遗传重新移植的细胞已经表明能够原位表达所转染的遗传物质。

因此，进一步根据本发明的一个方面，提供了一种转导具有外源基因的离体培养的NK细胞的方法。这种方法，根据本发明的这个方面，通过以下步骤实施：（a）根据本发明NK细胞培养方法通过培养NK细胞群而离体培养NK细胞群，和（b）转导具有外源基因的所述培养的NK细胞群的细胞。应该理解到，步骤（a）和步骤（b）的次序可以颠倒。转导所培养的NK细胞的方法在本领域是已知的，例如，离体修饰的NK细胞的用途已经由Campana等（US20090011498）公开。

因此，本发明所培养的细胞能够进行改性而表达基因产物。正如本文中所用短语“基因产物”是指蛋白，肽和功能RNA分子。一般而言，通过核苷酸分子编码的基因产物是要供给于主体的所需基因参悟。这种基因产物的实例包括蛋白，肽，糖蛋白和脂蛋白，通常通过接受主体的细胞生产。另外，所编码的基因产物是通过所述细胞（例如，引入的遗传物质编码诱导要供给于主体的基因产物的转录的转录因子）诱导所需基因参悟表达的产物。例如，这种NK细胞能够改性而表达细胞表面分子，或能够增强或调节NK细胞功能的胞内基因产物，如细胞因子，粘附分子，活化和/或抑制性受体，等。

真核细胞转染的合适载体、构建和方案的描述，能够查阅Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel，F.M. et al.（eds.）Greene Publishing Associates（1989），Section 9.2 和Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd Edition，Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989）(结合于本文中作为参考），例如，Sections 16.41-16.55，9或其它标准实验室手册。

正如以上详细的讨论，NK细胞的离体繁殖能够有利地应用于NK细胞移植或植入。因此，根据本发明的另一方面，提供了一种向受者移植或植入NK细胞的方法。根据本发明这方面的方法通过以下步骤实施：（a）根据本发明的方法采用生长因子和有效浓度的烟酰胺和/或其它烟酰胺部分离体培养NK细胞群和（b）向主体给予治疗有效量的所述培养的NK细胞。

供体和受者能够是同一个体或不同个体，例如，异源个体。因此，所述NK细胞群能够是与所述主体自体同源的或异源的。当实施异源移植时，能够进行降低植入排异和/或移植物抗宿主病的方案，正如本领域中众所周知的。这种方案目前增在人体疗法中实施。最先进的方案公开于Slavin S.等的出版物中，例如，J Clin Immunol（2002）22: 64，和JHematother Stem Cell Res（2002）11: 265），Gur H. et al.（Blood（2002）99: 4174），和Martelli MF等的出版物（Semin Hematol（2002）39: 48）中，结合于本文作为参考。

根据一个实施方式，NK细胞群的移植用于主体中治疗或预防疾病。

根据本发明一个实施方式还有的另一方面，提供了一种在需要其的主体中抑制肿瘤生长的方法。根据本发明这方面的方法通过给予所述主体本发明治疗有效量的NK细胞群而进行实施。

“治疗”或“处治”包括，但不限于给予本发明富集的、活化的或培养的NK细胞组合物或群而预防或延迟疾病的症状、综合症或生化标记的发作，缓解症状或阻止或抑制该疾病、病症或失调（例如，癌，转移癌或转移实体癌）的进一步发展。治疗能够是预防性的，即，辅助性的（预防或延缓疾病的发作，或预防其临床或亚临床症状的显现）或治疗性抑制或减轻疾病显现之后的症状。

在一个实施方式中，NK细胞群按照有效剂量给予而减低或消除癌，如实体肿瘤或恶性肿瘤，或预防其发生或复发。“有效降低或消除实体肿瘤或预防其发生或复发的用量”或“有效降低或消除过度增生疾病或预防其发生或复发的用量”是指在治疗肿瘤疾病症态或过度增生疾病之后改善通过患者测试数据、存活数据、肿瘤标记水平的升高或抑制、基于遗传分布或对环境因子暴露的易感性而测定的患者疗效或存活率的治疗组合物用量。“抑制肿瘤生长”是指降低肿瘤细胞的尺寸或生存力或数量。“癌”、“恶性肿瘤”、“实体肿瘤”或“过度增生性疾病”都作为同名术语使用而是指任何多种通过细胞失控异常增殖、所影响细胞局部或通过血液循环和淋巴系统扩散到身体其它部位（即，转移）的能力以及任何多种特性结构和/或分子特点表征的疾病。“癌性的”或“恶性的细胞”或“实体肿瘤细胞”应该理解为具有特异性结构性质而缺乏分化和能够侵袭和转移的的细胞。“癌”是指在哺乳动物内发现的所有类型的癌或赘生物或恶性肿瘤，包括癌和肉瘤。例子有乳腺癌，肺癌，非小细胞肺癌，胃癌，脑癌，头和颈癌，结肠，泌尿生殖系统癌，膀胱癌，尿道癌，肾癌，睾丸癌，子宫癌，卵巢癌，宫颈癌，前列腺癌，黑色素瘤，间皮瘤，肉瘤，（参见，DeVita et al.，（eds.），2001，Cancer Principles and Practice of Oncology，6th. Ed.，Lippincott Williams &Wilkins，Philadelphia，Pa.；该参考文献仪器全文处于各种目的结合于本文中作为参考）。

“癌相关的”是指核酸及其表达，或其缺失，或蛋白及其水平或活性，或其缺失，对主体细胞中恶性肿瘤发作的关系。例如，癌可能与正常健康细胞中并未表达，或低水平表达的具体基因的表达有关。相反，癌相关的基因可能是在恶性肿瘤细胞（或在发生转化的细胞）中并未表达，或在恶性肿瘤细胞中以比其在正常健康细胞中表达更低的水平表达的基因。

“过度增生疾病”是指其中细胞增殖比正常组织生长更迅速的任何疾病或病症。因此，过度增生细胞是比正常细胞增殖更迅速的细胞。

“晚期癌”是指不再定域于原生肿瘤位置的癌，或处于根据美国癌联合委员会（American Joint Committee on Cancer）（AJCC）的III或IV阶段的癌。

“良好耐受性”是指不存在健康状态下由于治疗发生而将会影响治疗决策的不良变化。

“转移癌”是指一旦输注免疫缺陷鼠的乳腺脂肪垫和/或循环系统而能够在免疫缺陷鼠的肺、肝、骨骼或脑中建立次生肿瘤损伤的肿瘤细胞，例如，人体实体肿瘤或生殖泌尿的恶性肿瘤。

“实体肿瘤”包括，但不限于，肉瘤，黑色素瘤，恶性瘤，或其它实体肿瘤癌。“肉瘤”是指由像胚胎结缔组织的物质构成而一般包含紧密填充而嵌入纤维或均质物质中的细胞的肿瘤。肉瘤包括，但不仅限于，软骨肉瘤，纤维肉瘤，淋巴肉瘤，黑素肉瘤，粘液肉瘤，骨肉瘤，阿伯内西肉瘤， 脂肉瘤，脂肪肉瘤，肺泡软组织肉瘤，造釉细胞肉瘤，葡萄状肉瘤，绿色肉瘤，绒毛膜癌，胚胎肉瘤，维尔姆斯肿瘤肉瘤，子宫内膜肉瘤，间质肉瘤，尤文氏肉瘤，筋膜肉瘤，纤维母细胞肉瘤，巨细胞肉瘤，粒细胞肉瘤，何杰金氏肉瘤，特发性多色素出血性肉瘤，B细胞免疫母细胞肉瘤，淋巴瘤，T-细胞免疫母细胞肉瘤，杰森肉瘤，卡波西氏肉瘤，库普弗细胞肉瘤，血管肉瘤，白血病性肉瘤，恶性间叶肉瘤，骨旁肉瘤，网状细胞肉瘤，劳氏肉瘤，浆液囊肉瘤，滑膜肉瘤，和毛细血管扩张性肉瘤。

“黑色素瘤”是指源自皮肤和其它器官的黑色素细胞系统的肿瘤。黑色素瘤包括，例如，肢端-雀斑黑色素瘤，无色素性黑色素瘤，良性幼年黑色素瘤，克劳德曼黑色素瘤，S91黑色素瘤，哈丁-帕西黑色素瘤，幼年黑色素瘤，雀斑恶性黑色素瘤，恶性黑色素瘤，结节性黑色素瘤，甲下黑色素瘤和浅表扩散黑色素瘤。

“癌”是指由易于渗透周围组织并产生转移的上脾细胞构成的恶性新肿瘤。典型的癌包括，例如，腺泡癌，粒状癌，腺胞囊癌，腺样囊性癌，癌腺癌，肾上腺皮质的癌，肺泡癌，胞状细胞癌，基部细胞癌，基底细胞癌，基底细胞样癌，基底鳞状细胞癌，支气管肺泡癌，细支气管癌，原发性支气管癌，脑样癌，胆管细胞癌，绒膜癌，胶体状癌，粉刺癌，原体癌，筛状癌，胸甲状癌，上皮瘤，圆柱形癌，圆柱形细胞癌，导管癌，硬癌，胚胎性癌，髓样癌，表皮癌，癌上皮增殖腺，外生性癌，溃疡癌，纤维癌，胶状癌，凝胶性癌，巨细胞癌，巨细胞癌，腺性癌，粒层细胞癌，毛发基质癌，血样癌，肝细胞癌，啫酸细胞癌，透檬癌，副肾样癌，幼稚型胚胎性癌，原位癌，表皮内癌，内上皮癌，克龙派切尔癌，库尔契茨基-细胞癌，大-细胞癌，水晶体癌，豆状癌，脂瘤样癌，髓样上皮癌，髓样软癌，髓样癌，黑色素癌，软性癌，粘液癌，生粘液癌，克鲁肯伯格氏癌，黏液表皮样癌，胶样癌，似粘液癌，粘液瘤样癌，鼻咽癌，燕麦细胞癌，骨化性癌，化骨性癌，乳头状癌，门脉周癌，原位癌癌，鳞状细胞癌，果肉状癌，肾脏肾细胞癌，贮备细胞癌，肉瘤化肌癌，内翻性乳头状癌，慢性癌，阴囊癌，印戒细胞癌，单纯癌，小-细胞癌，马铃薯状癌，球状细胞癌，梭状细胞癌，海绵体软癌，鳞状癌，鳞状细胞癌，串状癌，血管扩张性癌，血管扩张癌，移行细胞癌，结节性皮癌，结节性癌，疣状癌和近绒毛状癌 。

“白血病”是指造血器官的渐进性恶性疾病而一般特征在于血液和骨髓中异常增殖和发育白细胞及其前体。白血病一般基于（1）疾病急性或慢性的持续期和特性；（2）涉及的细胞类型：骨髓样（粒细胞），淋巴样（淋巴细胞），或单核细胞样；和（3）血液-白血病或非白血白血病（亚白血病） 进行临床分类。白血病包括，例如，急性非淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，急性粒细胞性白血病，慢性粒细胞性白血病，急性早幼粒细胞白血病，成年T-细胞白血病，非白血白血病，非急性骨髓性白血病，嗜碱性白血病，急变细胞白血病，牛白血病，慢性粒细胞白血病，皮肤白血病，胚胎白血病，嗜曙红细胞白血病，格罗斯白血病，毛发性细胞白血病，成血细胞性白血病，成血细胞白血病，组织细胞性白血病，干细胞白血病，急性单核细胞白血病，白细胞减少性白血病，淋巴白血病，淋巴细胞性白血病，淋巴腺白血病，淋巴球性白血病，淋巴样白血病，淋巴瘤细胞白血病，肥大细胞白血病，巨核细胞白血病，小原粒細胞性白血病，单核细胞白血病，髓细胞白血病，粒细胞性白血病，骨髓性粒细胞性白血病，髓性单核细胞白血病，内格利型白血病，浆细胞白血病，浆细胞性白血病，早幼粒细胞白血病，多形核细胞白血病，希林氏性白血病，干细胞白血病，亚白血病型白血病和未分化细胞白血病。其它癌症包括，例如，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，神经母细胞瘤，乳房癌，卵巢癌，肺癌，横纹肌肉瘤，原发性血小板增多症，原发性巨球蛋白血症，小细胞肺癌肿瘤，原发性脑肿瘤，胃癌，结肠癌，恶性胰腺胰岛素瘤，恶性类癌，膀胱癌，皮肤癌前病变，睾丸癌，淋巴瘤，甲状腺癌，神经母细胞瘤，食道癌，生殖泌尿道癌，恶性高钙血症，宫颈癌，子宫内膜癌，肾上腺皮质癌和前列腺癌。

在本发明这方面的另一具体实施方式中，所述方法伴随在造血细胞、造血祖细胞或造血干细胞移植至所述主体中时一起、之后或之前进行实施。在还有的另外的实施方式中，主体伴随用敏化剂或增效剂（例如，蛋白酶体抑制剂，IL-2，IL-15，等）进行治疗而进一步增强所输注NK的体内功能（详见，例如，Childs等的美国专利申请20090104170）。

在自体免疫疾病患者中已经观察到NK细胞的数量和功能降低，表明在各种自身免疫性疾病和病症中具有NK细胞疗法的可能性（参见，Schleinitz，et al.，Immunology2010；131:451-58和French and Yokohama，Arthrit Res Ther 2004；6:8-14）。因此，在本发明还有的另一实施方式中，提供了一种在需要其的主体中治疗自身免疫性疾病或病症的方法。根据本发明这方面的方法通过给予所述主体本发明治疗有效量的NK细胞群而进行实施。

通过本发明的方法能够治疗的自身免疫性疾病包括但不限于，心血管疾病，类风湿疾病，腺体疾病，胃肠道疾病，皮肤疾病，肝脏疾病，神经系统疾病，肌肉疾病，肾脏疾病，与生殖相关的疾病，结缔组织疾病和全身性疾病。

自身免疫性心血管疾病的例子包括，但不限于，动脉粥样硬化，心肌梗死，血栓形成，韦格纳肉芽肿病，高安氏大动脉炎，川崎综合症，抗因子VIII自身免疫性疾病，坏死性小血管炎，显微镜下多血管炎，Churg-Strauss综合征（变应性肉芽肿血管炎），寡免疫局灶性坏死和新月体性肾小球肾炎，抗磷脂综合征，抗体引起的心脏衰竭，血小板减少性紫癜，自身免疫性溶血性贫血，克氏锥虫病中的心脏自身免疫性疾病和抗辅助性T淋巴细胞自身免疫性疾病。

自身免疫性类风湿病的实例包括但不限于，类风湿关节炎和强直性脊柱炎。

自身免疫性腺体疾病的例子包括但不限于，胰腺疾病，I型糖尿病，甲状腺疾病，格雷夫斯病，甲状腺炎，自发免疫性甲状腺炎，桥本氏甲状腺炎，特发性粘液性水肿，卵巢自身免疫性疾病，自身免疫性抗精子不孕不育，自身免疫性前列腺炎和I型自身免疫性多腺体综合征。这些疾病包括，但不仅限于，胰腺的自身免疫性疾病，I型糖尿病，自身免疫性甲状腺疾病，格雷夫斯病，自发自身免疫性甲状腺炎，桥本氏甲状腺炎，特发性粘液性水肿，卵巢自身免疫性疾病，抗精子免疫性不孕不育，自身免疫性前列腺炎和Ⅰ型自身免疫性多腺体综合征。

自身免疫性胃肠疾病的实例包括但不限于，慢性炎性肠道疾病，腹腔疾病，结肠炎，回肠炎和克罗恩病。

自身免疫性皮肤疾病的例子包括，但不仅限于，自身免疫性大疱性皮肤病，如，但不仅限于，寻常型天疱疮，大疱性类天疱疮和落叶型天疱疮。

自身免疫性肝病的例子包括，但不仅限于，肝炎，自身免疫性慢性活性肝炎，原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎。

自身免疫性神经系统疾病的例子包括，但不限于，多发性硬化症，阿尔茨海默氏症，重症肌无力，神经病变，运动神经病变；格林-巴利综合征和自身免疫性神经病变，重症肌无力，兰伯特-伊顿肌无力综合征；副肿瘤性神经系统疾病，小脑萎缩症，副肿瘤性小脑萎缩和僵人综合征；非副肿瘤性僵人综合征，渐进性小脑萎缩，脑炎，Rasmussen脑炎，肌萎缩性侧索硬化症，西登哈姆舞蹈病，吉尔斯德拉妥瑞症和自身免疫性多内分泌腺疾病；免疫异常神经病；获得性神经性肌强直，先天性多发性关节挛缩症，神经炎，视神经炎和神经退行性疾病。

自身免疫性肌肉疾病的例子包括，但不仅限于，肌炎，自身免疫性肌炎和原发性干燥综合征和平滑肌自身免疫性疾病。

自身免疫性肾脏疾病的例子包括，但不仅限于，肾炎和自身免疫性间质性肾炎。

与生殖相关的自身免疫性疾病的例子包括，但不仅限于，反复性失胎。

自身免疫性结缔组织病的例子包括，但不仅限于，耳疾，自身免疫性耳疾病和内耳的自身免疫性疾病。

自身免疫性全身性疾病的例子包括，但不仅限于，全身性红斑狼疮和全身性硬化症。

在本发明还有的另一实施方式中，提供了一种在需要其的主体中抑制病毒性感染的方法。根据本发明这方面的方法通过以下步骤实施：（a）用NK细胞生长因子和有效浓度的烟酰胺离体培养NK细胞群，其中相比较采用生长因子而不采用所述浓度的烟酰胺培养的细胞群，有效浓度的烟酰胺增强了NK 细胞的增殖；和（b）给予所述主体治疗有效量的所述培养的NK细胞。适合采用本发明NK细胞或NK细胞组合物治疗的病毒性感染包括但不限于，HIV，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV），巨细胞病毒（CMV），牛痘病毒，流感和副流感病毒，肝炎（包括A型肝炎，B型肝炎，C型肝炎，非-A非-B型等），单纯疱疹病毒，疱疹带状疱疹病毒，泰勒病毒和HSV-1。适合采用本发明NK细胞或NK细胞制剂治疗的其它传染病包括但不限于，寄生虫感染，如疟原虫，利什曼虫和弓形虫感染，和细菌感染如结核分枝杆菌和李斯特氏杆菌（对于NK细胞治疗病毒、细菌和原虫疾病的综述，参见Zucchini et al.，Exp RevAnti-Infect Ther 2008；6:867-85，其结合于本文中作为参考）。

造血细胞移植已经变成各种遗传性或恶性疾病的治疗选择方案。然而，造血细胞组合物经常富含T-淋巴细胞，这种细胞有助于移植物抗宿主病。因为患有恶性血液病的患者经常缺乏NK细胞数目和功能，则连同造血细胞移植一起外给予NK细胞目前正在研究增强长期移植和预防移植物抗宿主病。因此，在本发明还有的另一实施方式中，提供了一种在需要其的主体中治疗或预防移植物抗宿主病的方法。因此，在本发明还有的另一实施方式中，提供了一种在需要其的主体中治疗自身免疫性疾病或病症的方法。根据本发明这方面的方法通过给予所述主体本发明治疗有效量的NK细胞群而进行实施。

用NK细胞治疗，以及用NK细胞和HSC细胞群组合治疗的临床方案，在本领域中是众所周知的。例如，近来的报道已经证明，NK细胞输注是安全的，而并不会导致受者中出现GVHD。一个这种方案涉及骨髓细胞清除，活化的IL-2、NK富集的（非-NK耗尽的）HLA-错配脐血的输注，接着双倍脐血输注进行HSC复育[参见，Miller et al.，Blood 2006；108:3111（摘要）]。作者报道，连同脐血HSC一起移植NK细胞导致长期移植HSC改善。

治疗方案

根据本发明一些实施方式的一些方面，提供了包含NK细胞群并连同药用载体配制而用于治疗疾病，例如，转移癌、实体肿瘤、自身免疫性疾病、过增生疾病或病毒性感染的药物组合物。一些组合物包括本发明多种（例如，两种或多种）NK细胞群的组合。

在预防性应用中，向易感，或要不然就是具有疾病或病症（即，过增生疾病或实体肿瘤）风险的患者按照足以消除或降低过增生疾病或实体肿瘤复发风险，降低严重度或延缓疾病发作，包括疾病的生化、组织和/或行为症状，其综合症和疾病发展期间表现出的中间病理表型的用量给予药物组合物或医药。 在治疗应用中，向易感或已经患有这种疾病的患者按照足以治愈，或至少部分抑制这种疾病的症状（生化的、组织的和行为的），包括其综合症和疾病发展期间的中间病理表型的用量给予药物组合物或医药。足以完成治疗或预防治疗的剂量定义为治疗或预防有效剂量。在预防性和治疗性的这两种方案中，药剂通过按照几个剂量给予直至实现足够抗增生响应。通常情况下，抗增生响应要进行监测并在抗增生响应开始消退时提供重复剂量。

有效剂量

NK细胞群组合物用于治疗本文中描述的疾病，如转移癌，实体肿瘤或过增生疾病的有效剂量，要根据许多不同的因素而变化，包括给予方式，靶位点，患者生理状态，患者是人还是动物，其它给予的医药，以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但是也能够治疗非人的动物，包括基因修饰哺乳动物。治疗剂量需要斟酌而优化安全和效能。

对于给予治疗性NK细胞群，剂量范围为每患者约1×10⁶至约1×10⁹ 个NK细胞。对于给予NK细胞群，每kg受者体重剂量范围为约1×10⁵至约1×10⁹个 NK细胞，或每kg受者体重剂量范围为约5×10⁵至约1×10⁸个 NK细胞。典型的治疗方案要求每两周给予1次或每月1次或每3至6个月1次。在一些方法中，两种或多种NK细胞群同时给予，在这种情况下，所给予的每种NK细胞群的剂量都处于所示的剂量范围。NK细胞群能够进行多次给予。单剂量之间的间隔可能是以周为单位，以月为单位或以年为单位。间隔也能够是不定期的，这要按照患者体内NK细胞群的血液水平测定所示。另外，NK细胞群能够作为缓释制剂给予，在这种情况下需要更小的给予频率。剂量和频率根据患者体内NK细胞群的半衰期而变化。给予的剂量和频率能够根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性的应用中，相对较低的剂量以相对不太频繁的间隔在长时间内进行给予。一些患者继续在其生命的剩余时间内接受治疗。在治疗性应用中，有时需要相对较高的剂量以相对较短时间间隔给予直至病情发展降低或终止，而优选直至患者表现出部分或完全缓解疾病症状。此后，缓则能够按照预防性方案给予。

给药途径

治疗性NK细胞群的组合物用于治疗疾病，例如，转移癌，实体肿瘤或过增生疾病，能够按照静脉注射，囊内，鞘内，肠外，局部外用，皮下，口腔，鼻腔，动脉，颅内，腹腔，或肌肉注射的方式进行给予。作为预防性/辅助性或用于治疗疾病，治疗性NK细胞群靶向过增生疾病或实体肿瘤，例如，生殖泌尿的恶性肿瘤和/或治疗性治疗。最典型的给予免疫原性药物的途径是皮下给予，但是其它途径可能是等效的。另一最常见的途径是肌肉注射。这种类型的注射是最典型地实施于胳膊或大腿肌肉。在某些方法中，药物直接注射到沉积物累积的具体组织，例如头颅内注射。对于NK细胞群的给予，优选关于静脉滴注的肌肉注射。在某些方法中，具体治疗性的NK细胞群直接注射到膀胱内。

制剂

NK细胞群的组合物用于治疗疾病，例如，转移癌，实体肿瘤或过增生疾病。

NK细胞群的组合物用于治疗疾病，例如，转移癌，实体肿瘤或过增生疾病，经常作为包含活性治疗药物，即，和许多各种其它药用组分的药物组合物给予。参见，例如，Alfonso R Gennaro（ed），Remington: The Science and Practice of Pharmacy，(Formerly Remington's Pharmaceutical Sciences）20th ed.，Lippincott，Williams &Wilkins，2003，以其全文结合于本文中作为参考。优选的形式取决于预想的给予模式和治疗应用。这种组合物，更具所需的配方，也能够包括药用无毒载体或稀释剂，这定义为常用于配制动物或人给予的药物组合物的载体。稀释剂经过选择而使之不会影响这些组合的生物活性。这种稀释剂的实例是包含10%的热失活人体AB血清或10% 自体同源血清的X-vivo20介质（Cambrex Bio Science，Walkersville，Md.）。这种稀释剂的其它实例有蒸馏水，磷酸盐缓冲的生理盐水，林格氏溶液，葡萄糖溶液和汉克溶液。另外，药物组合物或制剂也能够包括其它载体，佐剂或无毒非治疗性的非免疫原性的稳定剂等。

药物组合物也能够包括大而代谢缓慢的大分子如蛋白、多糖如壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物（如，乳胶功能化的琼脂糖™，琼脂糖，纤维素等）、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚结物（如油滴或脂质体）。另外，这些载体能够起到免疫刺激剂（即，佐剂）作用。

对于非肠道给予，本发明的组合物能够作为该物质在生理可接受稀释剂中的可注射剂量的溶液或悬浮液与可能是灭菌液体如水油、盐水、甘油或乙醇的药用载体一起给予。另外，佐剂物质，如润湿或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲剂物质等能够提供于组合物中。其它药物组合物组分是石油、动物植物或合成源，例如，花生油、豆油和矿物油的那些组分。一般而言，二元醇如丙二醇或聚乙二醇，都是优选的液体载体，尤其适用于可注射溶液。治疗性NK细胞群能够以按照容许缓释活性成分的方式配制的积存或输注制剂形式给予。典型的组合物包含5mg/mL的治疗性NK细胞群，在由50 mM L-组氨酸、150 mM NaCl构成的水性缓冲液中配制，用HCl调节 pH 6.0。

通常情况下，组合物制备成可注射液，要么是液体溶液，要么是悬浮液；在注射之前适合液体载体中重构溶液或悬浮液的固体形式也能够制备。这种制剂也能够在脂质体或大颗粒如聚交酯、聚乙交酯或共聚物中乳化或囊封而增强佐剂效应，正如以上的讨论。Langer，Science，249: 1527，1990；Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews，28: 97-119，1997，以其全文结合于本文中作为参考。本发明的药物能够按照容许缓释或脉冲式释放活性成分的方式配制的积存注射或输入制剂的形式给予。和用于其它方式给予的其它制剂包括口服、鼻腔和肺部制剂、栓剂、透皮施用。

对于栓剂，粘合剂和载体包括，烈日，聚脂肪二醇或三甘油酯；这种栓剂能够由包含范围为0.5 %至10 %，优选1 %至2 %的活性成分的混合物形成。口服制剂包括赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精酸钠、纤维素和碳酸镁。这种组合物采用溶液、悬浮液、片剂、药丸、胶囊、缓释制剂或粉末的形式并含有10 %至95 %，优选25 %至70 %的活性成分。

药物组合物一般包含以适用于向患者给予形式的治疗性NK细胞群的组合物。这种药物组合物一般配制成无菌而基本等渗的，并遵守美国食品和药物管理局的所有《良好生产规范》（GMP）的规定。

毒性

优选本文中描述的治疗有效量的NK细胞群组合物将会提供治疗性受益，而不会导致显著的毒性。

本文中所述的治疗性NK细胞群的毒性，能够在细胞培养或实验动物中通过标准制药方法，例如通过测定LD.sub.50（50%群的致死剂量）或LD.sub.100（100%群的致死剂量）而进行确定。毒性和疗效之间的计量比率是治疗指数。产品名高这些细胞培养实验分析和动物研究中获得的数据能够用于配制适用于人体的无毒剂量范围。本文中所述的治疗性NK细胞群的剂量优选处于包括有效剂量而几乎无或没有毒性的循环浓度范围。这种剂量能够根据采用的剂量形式和所使用的给药途径而在此范围内变化。精确配方、给药途径和剂量能够由各个医师根据患者病症进行选择。（参见，例如，Fingl，et al.，The PharmacologicalBasis Of Therapeutics，Ch. 1，1975），以其全文结合于本文中作为参考。

试剂盒

属于本发明范围内的还有包含本发明组合物（例如，治疗性NK细胞群）和使用说明书的试剂盒。这种试剂盒能够进一步包含至少一种附加试剂，或一种或多种本发明的附加人体抗体（例如，具有结合至不同于第一人体抗体的抗原中的抗原决定基的互补活性的人体抗体）。这些试剂盒通常包括指示试剂盒内容物预想用途的标签。术语标签包括任何书面的，或提供于试剂盒上或以试剂盒提供的记录材料，或其它连同试剂盒一起的材料。

正如本文中所用的术语“大约”是指 ± 10 %。

术语“包含”，“含有”，“包括”，“囊括”，“具有”及其词形变化体是指“包括但不限于”。这个术语涵盖了“由…构成”和“基本由…构成”。

短语“基本由..构成”是指组合物或方法，但只要附加其它成分和/或步骤并不实质性改变所要求授权的组合物或方法的基本而新颖的特性，可以包括其它成分和/或步骤。

正如本文中所用单数形式“一个”，“一种”和“这个（种）”包括复数参指物，而除非上下文清楚地另外指出。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

纵观整个本说明书，本发明的各个实施方式可以按照一定范围的格式提呈。应该理解到，按照范围格式的描述仅仅是为了方便和简短，而不应该诠释为不灵活的限制本发明范围。因此，范围的描述应该考虑成专门公开所有的可能子范围以及此范围内的各个数字值。例如，如1至6的范围描述， 应该当作专门公开了如1至3，1至4，1至5，2至 4，2至6，3至6 等的子范围，以及此范文诶的各个数字，例如，1，2，3，4，5和 6。无论该范围的幅度范围如何，这都适用。

每当本文中指示数字范围时，是指其包括任何所指示范围内的引述的数值（分数或整数）。术语第一个指示数和第二指示数之间的“范围/范围” 和从第一个指示数“至”第二个指示数之间的“范围/范围”，在本文中可以互换使用并意味着包括第一和第二指示数和其间的所有分数和整数数值。

正如本文中所用的术语“方法”是指完成咯啶任务的方式，模式，技术和方法与步骤，包括但不限于，化学、制药、生物、生化和医药领域的从业者已知的，或通过其由已知的方式、模式技术和方法与步骤随时开发出来的那些方式、模式、技术和方法与步骤。

正如本文中所用术语“治疗”包括消除，基本抑制、延缓或逆转病症的发展，基本改善病症的临床或美学症状或疾病预防病症的临床或美学症状出现。

应该理解到，本发明的某些特征，尽管为了清晰起见描述于独立的实施方式的上下文中，而也可以在单个实施方式中组合提供。相反，本发明的许多特性，尽管为了清晰起见描述于单个实施方式的上下文中，而也可以独立提供或以任何合适的子组合物或正如适合本发明任何其它描述的实施方式中提供。各个实施方式的上下文中描述的某些特性不应该当作这些实施方式的基本特性，除非该实施方式如果没有这些元素就是无效的。

本文以上已经概述和以下权利要求部分中要求授权的本发明各个实施方式和方面，在以下实施例中找到实验支持证据。

实施例

现在参照以下实施例，这将连同以上描述一起，以非限制性方式举例说明本发明的一些实施方式。

一般而言，本文中所用术语学和本发明中利用的实验室方法与步骤包括，分子，生化、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中进行了深入解释。参见，例如，"MolecularCloning: A laboratory Manual" Sambrook et al.，(1989）；"Current Protocols inMolecular Biology" Volumes I-III Ausubel，R. M.，ed.（1994）；Ausubel et al.，"Current Protocols in Molecular Biology"，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland（1989）；Perbal，"A Practical Guide to Molecular Cloning"，John Wiley &Sons，New York（1988）；Watson et al.，"Recombinant DNA"，Scientific AmericanBooks，New York；Birren et al.（eds）"Genome Analysis: A Laboratory ManualSeries"，Vols. 1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York（1998）；美国Nos.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057专利中提出的方法学；"CellBiology: A Laboratory Handbook"，Volumes I-III，Cellis，J. E.，ed.（1994）；纽约Freshney Wiley-Liss的"Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique"（1994），第三版；"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E.，ed.（1994）；Stites et al.（eds），"Basic and Clinical Immunology"（8th Edition），Appleton & Lange，Norwalk，CT（1994）；Mishell and Shiigi（eds），"Selected Methodsin Cellular Immunology"，W. H. Freeman and Co.，New York（1980）；可供使用的免疫试验分析广泛地描述于专利和科技文献中，参见，例如，美国专利Nos. 3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis" Gait，M. J.，ed.（1984）；“Nucleic Acid Hybridization"Hames，B. D.，and Higgins S. J.，eds.（1985）；"Transcription and Translation"Hames，B. D.，and Higgins S. J.，eds.（1984）；"Animal Cell Culture " Freshney，R.I.，ed.（1986）；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press，(1986）；"A PracticalGuide to Molecular Cloning" Perbal，B.，(1984）和"Methods in Enzymology" Vol. 1，2，317，Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications"，Academic Press，San Diego，CA（1990）；Marshak et al.，"Strategies for ProteinPurification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press（1996）；所有这些文献都如同其全文结合于本文中作为参考。其它一般参考文献都提供于这整个文档中。其文中的方法与步骤据信在本领域是众所周知的，为方便读者而提供。其文中所含的所有信息都结合于本文中作为参考。

材料和实验步骤

脐血样品

在正常足月分娩（知情同意）之后从脐带脐血中获得细胞。产后24h内样品收集并冷冻。简而言之，脐血通过重力从分娩胎盘收集，富含白细胞的部分通过密度梯度离心而分离，细胞混合DMSO（10%）并随后在-80℃下冷冻。使用之前，细胞在含有2.5%的人体血清白蛋白（HSA）(Bayer Corp. Elkhart，IN，USA）的Dextran缓冲液（Sigma，St. Louis，MO，USA）中解冻。而除去防冻剂。

BM和外周血样品

骨髓（BM）和外周血（PB）细胞在Ficoll-Hypaque梯度（1.077 g/mL；Sigma）上分层，并以800×g离心30min。收集界面层上的单核细胞并在含0.5% HAS的磷酸盐缓冲的盐水（PBS）（Biological Industries，Israel）中冲洗3次。

CD56+细胞的富集

脐血（CB），骨髓（BM）或外周血（PB）细胞在Ficoll-Hypaque梯度（1.077 g/mL；Sigma）上分层，并以800×g离心30min分离单核细胞。收集界面上的细胞并在含0.5% HAS的磷酸盐缓冲的盐水（PBS）（Biological Industries，Israel）中冲洗3次。为了纯化CD56+细胞，根据厂商建议，使用 “MiniMACS或CliniMACS CD56 祖细胞分离试剂盒”（MiltenyiBiotec Bergisch，Gladbach，德国），将单核细胞部分经过两个循环的免疫磁性微珠分离。简而言之，CD56+细胞与CD56+特异性磁性免疫微珠反应，并采用磁性分离器分离，通过冲洗而从未结合的细胞中纯化出来。由此获得的CD56+群的纯度通过流式细胞仪评价，为约92%。

可选地，这些细胞并不在Ficoll-Hypaque梯度上分离，而在含0.5% HAS的磷酸盐缓冲的盐水（PBS）（Biological Industries）中冲洗3次（“总单核细胞部分”）。在最后一次冲洗中，细胞用50µg/mL rHu-DNAse培养10min。为了纯化CD56+细胞，根据厂商建议，使用“MiniMACS CD56 祖细胞分离试剂盒”（Miltenyi Biotec Bergisch，Gladbach，德国），将该细胞经过两个循环的免疫磁性微珠分离。由此获得的CD56+群的纯度通过流式细胞仪评价，为约92%。

可选地，骨髓细胞使用 “MiniMACS或CliniMACS CD133细胞分离试剂盒”（Miltenyi Biotec Bergisch，Gladbach，德国）通过免疫磁性微珠分离耗尽CD133+或CD34+细胞，并随后根据厂商建议，使用 “MiniMACS或CliniMACS CD56 祖细胞分离试剂盒”（Miltenyi Biotec Bergisch，Gladbach，德国），将该这些细胞经过两个循环的免疫磁性微珠分离而对NK细胞进一步富集CD133-或CD34阴性部分。

CD56+CD3-细胞的富集

脐血（CB），骨髓（BM）或外周血（PB）细胞在Ficoll-Hypaque梯度（1.077 g/mL；Sigma）上分层，并以800×g离心30min分离单核细胞。收集界面上的细胞并在含0.5% HAS的磷酸盐缓冲的盐水（PBS）（Biological Industries，Israel）中冲洗3次。为了纯化CD56+CD3-细胞，根据厂商建议，使用 “MiniMACS或CliniMACS CD56 祖细胞分离试剂盒”（Miltenyi Biotec Bergisch，Gladbach，德国），将单核细胞部分经过免疫磁性微珠分离。简而言之，CD56+细胞与CD56+特异性磁性免疫微珠反应，并采用磁性分离器分离，通过冲洗而从未结合的细胞中纯化出来。根据厂商建议，使用 “MiniMACS或CliniMACS CD3 祖细胞分离试剂盒”（Miltenyi Biotec Bergisch，Gladbach，德国），将纯化CD56+细胞部分经过另外一次免疫磁性微珠分离。简而言之，CD56+细胞与CD3+特异性磁性免疫微珠反应，并采用磁性分离器分离，而在未结合的细胞部分中回收CD56+CD3-细胞。由此获得的CD56+CD3-群的纯度通过流式细胞仪评价，为约85%至97 %。

可选地，这些细胞并不在Ficoll-Hypaque梯度上分离，而在含0.5% HAS的磷酸盐缓冲的盐水（PBS）（Biological Industries）中冲洗3次（“总单核细胞部分”）。在最后一次冲洗中，细胞用50µg/mL rHu-DNAse培养10min。为了纯化CD56+细胞，根据厂商建议，使用“MiniMACS CD56 祖细胞分离试剂盒”（Miltenyi Biotec Bergisch，Gladbach，德国），将该细胞经过两个循环的免疫磁性微珠分离。由此获得的CD56+群的纯度通过流式细胞仪评价，为约92%。为了纯化CD56+CD3-细胞，根据厂商建议，使用 “MiniMACS或CliniMACS CD56祖细胞分离试剂盒”（Miltenyi Biotec Bergisch，Gladbach，德国），将该细胞经过免疫磁性微珠分离。简而言之，CD56+细胞与CD56+特异性磁性免疫微珠反应，并采用磁性分离器分离，通过冲洗而从未结合的细胞中纯化。根据厂商建议，使用 “MiniMACS或CliniMACS CD3祖细胞分离试剂盒”（Miltenyi Biotec Bergisch，Gladbach，德国），将纯化的CD56+ 细胞部分经过另外的免疫磁性微珠分离。简而言之，CD56+细胞与CD3+特异性磁性免疫微珠反应，并采用磁性分离器分离，在未结合的细胞部分中回收CD56+CD3-细胞。由此获得的CD56+CD3-群的纯度通过流式细胞仪评价，为约85%至97 %。

可选地，骨髓细胞使用 “MidiMACS或CliniMACS CD133细胞分离试剂盒”（Miltenyi Biotec Bergisch，Gladbach，德国）通过免疫磁性微珠分离耗尽CD133+或CD34+细胞，并随后根据厂商建议，使用 “MiniMACS或CliniMACS CD56 祖细胞分离试剂盒”（Miltenyi Biotec Bergisch，Gladbach，德国），将该这些细胞经过两个循环的免疫磁性微珠分离而对NK细胞进一步富集CD133-或CD34阴性部分。为了纯化CD56+CD3-细胞，根据厂商建议，使用 “MiniMACS或CliniMACS CD56祖细胞分离试剂盒”（Miltenyi BiotecBergisch，Gladbach，德国），将CD133-或CD34阴性部分经过免疫磁性微珠分离。简而言之，CD56+细胞与CD56+特异性磁性免疫微珠反应，并采用磁性分离器分离，通过冲洗而从未结合的细胞中纯化。根据厂商建议，使用 “MiniMACS或CliniMACS CD3祖细胞分离试剂盒”（Miltenyi Biotec Bergisch，Gladbach，德国），将纯化的CD56+ 细胞部分经过另外的免疫磁性微珠分离。简而言之，CD56+细胞与CD3+特异性磁性免疫微珠反应，并采用磁性分离器分离，在未结合的细胞部分中回收CD56+CD3-细胞。由此获得的CD56+CD3-群的纯度通过流式细胞仪评价，为约85%至97 %。

培养之前CD3+或CD3+CD19+细胞的耗尽

对于耗尽过程，脐带脐血（CB），骨髓（BM）或外周血（PB）细胞的总核细胞在Ficoll-Hypaque梯度（1.077 g/mL；Sigma）上分层，并以800×g离心30min而分离单核细胞。收集界面层上的细胞并在含0.5% HAS的磷酸盐缓冲的盐水（PBS）（Biological Industries，Israel）中冲洗3次。可选地，这些细胞并不在Ficoll-Hypaque梯度上分离，而在含0.5% HAS的磷酸盐缓冲的盐水（PBS）（Biological Industries）中冲洗3次（“总单核细胞部分”）。使用 CD3细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec Bergisch，Gladbach，德国）耗尽CD3细胞，并培养全部CD3阴性细胞部分。可选地，CD19细胞也采用CD19细胞分离试剂盒（Miltenyi BiotecBergisch，Gladbach，德国）耗尽CD19细胞，并培养CD3/CD19阴性细胞部分（CD3/CD19耗尽）。可选地，RosetteSep人体CD3+细胞耗尽混合液（Stem Cell Technologies，RosestteSep，Cat. No.15661）用于CD3耗尽并培养整个CD3阴性细胞部分。在阴性耗尽之后，这些细胞通过FACS分析进行计数和表征。

离体培养：

1. 总单核细胞部分在培养基袋（American Fluoroseal Co. Gaithersburg，MD，USA），T-烧瓶或24孔孔板中按照（0.5至2.0）×10⁶个细胞/mL的浓度于包括10%而由5% 至10% 含有以下人体重组细胞因子的人体血清/LiforCell® FBS 替代物（LifebloodProducts）构成的FCS或细胞Gro SCGM（Cell Genix）的MEMα中采用或不采用OKT-3（10至50ng/ml），采用或不采用烟酰胺（0.5至10 mM）进行培养：细胞介素-2（IL-2）（5-50ng/ml），白细胞介素-15（IL-15），白细胞介素7（IL7），白细胞介素 21（IL21），FLT-3或SCF或FLT3和SCF（Perpo Tech，Inc.，Rocky Hill，NJ，USA），并在37℃下于空气中5% CO₂润湿气氛中培养。当培养基中使用OKT-3时，在5至7天之后将培养基离心并将这些细胞采用排除了OKT-3的相同培养基中悬浮。所有培养基都采用相同体积的含生长因子而有或无烟酰胺的新鲜培养基每周或每周两次加满。为了计数，细胞用锥虫蓝染色。在各个的时间点，取样分析NK 细胞，CD56+CD3-，CD56+CD3+，CD34+CD56+，CD56+CD16+和/或CD56+NKG2A细胞的相对分数。细胞形态在以May-Grunwald/Giemsa溶液染色的涂片剂制备的 Cytospin（细胞离心涂片器）（Shandon，Pittsburgh，PA，USA）上测定。

2. 源自总核或单核细胞或CD34+或CD133+细胞耗尽的部分的纯化CD56+或CD56+CD3-细胞在培养基袋，T-烧瓶或24孔孔板中按照（1至100）×10⁴个细胞/mL的浓度于MEMα/10% FCS或细胞Gro SCGM（Cell Genix）/5%含有以下人体重组细胞因子的人体血清/LiforCell® FBS 替代物（Lifeblood Products）中采用或不采用烟酰胺进行培养：白细胞介素-2（IL-2）（5-50ng/ml），白细胞介素-15（IL-15），FLT-3或SCF或FLT3 和SCF或IL-2和IL-15或仅仅IL-2（Perpo Tech，Inc.，Rocky Hill，NJ，USA），并在37℃下于空气中5% CO₂润湿气氛中培养。所有培养基都采用相同体积的含生长因子而有或无烟酰胺的新鲜培养基每周或每周两次加满。实际上，这些培养基能够每周1次或每周几次采用IL-2和/或IL-2和IL-15进行补充。为了估计培养基中细胞的数目，细胞样品用锥虫蓝染色进行计数。在各个的时间点，取样进行FACS分析而确定NK 细胞，CD56+CD3-，CD56+CD3+，CD34+CD56+，CD56+CD16+和/或CD56+ NKG2A细胞的相对分数。

3. 源自PB、BM和CB的CD3+ 耗尽的，或CD3+/CD19+耗尽的单核细胞部分在培养基袋，T-烧瓶或24孔孔板中按照（1至1000）×10⁴个细胞/mL的浓度于MEMa/ 10% FCS或细胞Gro SCGM（Cell Genix）/ 5%含有以下人体重组细胞因子的人体血清/LiforCell® FBS 替代物（Lifeblood Products）中采用或不采用FLT-3或SCF或FLT3和SCF（5至50ng/mL）（PerpoTech，Inc.，Rocky Hill，NJ，USA），所有组合，采用或不采用烟酰胺，进行培养：白细胞介素-2（IL-2）或/和白细胞介素-15（IL-15），并在37℃下于空气中5% CO₂润湿气氛中培养。所有培养基都采用相同体积的含生长因子而有或无烟酰胺的新鲜培养基每周或每周两次加满。这些培养基能够每周1次或每周几次采用IL-2和/或IL-2和IL-15进行补充。为了估计培养基中细胞的数目，细胞样品在用锥虫蓝染色之后进行计数。在各个的时间点，取样进行FACS分析而确定NK 细胞，CD56+CD3-，CD56+CD3+，CD34+CD56+，CD56+CD16+和/或CD56+NKG2A细胞的相对分数。

4. 源自PB、BM和CB 细胞的总单核细胞部分、源自总核或单核细胞或源自CD34+或CD133+耗尽部分的纯化CD56+或CD56+CD3-细胞，和CD3+耗尽，或 CD3+/CD19+ 耗尽的单核细胞部分，也能够在生物反应器如GE Wave Bioreactor袋或Gas Permeable Cultureware烧瓶（Wilson Wolf）中按照（1至10000）×10⁴ 细胞/mL中含有MEMα，人体血清（10 %v/v），20ng/mL IL-2和可选的50ng/mL IL-2 和可选的IL-15的培养基介质中采用烟酰胺进行培养。这些培养基采用相同体积的含生长因子而有或无烟酰胺的新鲜培养基每周或每周两次加满。后来这些培养基能够每周1次或每周几次采用IL-2和/或IL-2和IL-15进行补充。并且，在1，2和3周之后对细胞计数和染色进行FACS试验分析。

具有照射的基质的NK细胞培养

源自PB、BM和CB 细胞的总单核细胞部分、源自总核或单核细胞或源自CD34+或CD133+耗尽部分的纯化CD56+或CD56+CD3-细胞，或CD3+耗尽，或CD3+/CD19+ 耗尽的单核细胞部分的NK细胞，能够采用照射的基质进行培养。为了制备照射的基质（饲养细胞），采用3000rad照射这些单核细胞。在CD56或CD56+CD3-选择或CD3耗尽之后，对这些细胞计数并通过本文以上所述的FACS分析进行表征。这些细胞按照本文以上所述，采用或不采用烟酰胺，采用和不采用照射的基质，按照20×10⁵个细胞/mL的照射细胞的浓度进行培养。

FACS分析

对于FACS分析，细胞采用以下荧光抗体：CD15 FITC、Cat. No. 332778、CD14FITC、Cat. No. 345784、CD3 APC、Cat. No. 345767、所有这些荧光抗体都来自BectonDickinson（San Jose，CA，USA），来自BioLegend（San Diego，CA，USA）的CD62L PE、Cat. No.304806，来自eBioscience（San Diego，CA，USA）的CD56 FITC、Cat. No.11-0569-42和来自Dako（Glostrup，Denmark）的CD45 PE、Cat. No. R7807进行染色。

NK细胞也通过CXCR4，KIR3，DL1/2，DL2/2，DL1，NKG2A，NKG2C，NKG2D，TRAIL，Fc-γ受体IIIb，NKp44，NKp30，NKp46，Fas-L，L-选择蛋白，藻红蛋白，IL-2受体γ链（CD16），VLA-5α链和CD8进行表征。

在第0天接种的NK细胞数的计算

为了计算第0天NK细胞的数目，第0天接种的细胞总数乘以第0天通过FACS测定的CD56+/CD3-细胞的百分数。

培养物中的NK细胞数和接种后第7、14和21天倍增的计算

为了测定第7、14和21天细胞的总数，细胞计数/mL乘以培养基的体积。为了确定培养基中NK细胞数，培养基中的细胞总数乘以在第7、14和21天测定的CD56+/CD3-细胞百分数。为了测定成倍扩增，第7、14和21天的NK细胞总数除以第0天培养基中接种的NK细胞总数。

表面抗原分析

这些细胞用含1% BSA的PBS溶液冲洗，并用荧光素异硫氰酸（FITC）-或藻红蛋白（PE）-成对的抗体或别藻蓝蛋白（APC）染色。随后这些细胞在上述缓冲液中冲洗并采用FACScalibur^®流式细胞仪（Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）进行分析。采用488 nm或661nm氩激光束作为激发光源，将这些细胞以高达1000个细胞/s的速度通过。采用对数放大测定10⁴个细胞的发射，并采用CellQuest软件（Becton Dickinson）进行分析。用FITC、PE和APC-配对的同种型对照抗体染色的细胞用于测定背景荧光。

NK细胞功能的测定

“杀伤作用”分析：NK细胞（效应器细胞=E）与K562或BL2（靶细胞=T），或双表型白血病细胞按照不同E与T之比（E:T）混合。BL2或K562，或双表型白血病靶细胞在PBS中用1 ng/mL CFSE（Invitrogen）于37℃下标记15min。15min内向细胞中加入小牛血清，随后冲洗细胞并再悬浮于RPMI介质中。将100µL的双表型白血病细胞、BL2或K562 细胞按照5X10³个细胞/孔的浓度置于96孔圆底孔板中。将100µL的未染色NK细胞按照E:T比为1:1，2.5:1，5:1，10:1或20:1（如所示，分别为5X10³，1.25X10⁴，2.5X10⁴，5X10⁴和1X10⁵ 细胞/孔）加入到双表型白血病细胞、BL2或K562 细胞中。在2至28h之后，细胞系中的靶细胞如K562和BL-2 的杀伤作用通过FACS作为碘化丙啶（PI）-阳性（死亡）CFSE-标记细胞百分数进行测定。原发性白血病细胞的杀伤作用通过采用FACS计数其用NK细胞培养之后培养基中剩余的CFSE染色细胞的数目而进行测定。较低的CFSE+细胞数表明较高的杀伤水平。

趋化性（“迁移”）试验分析：人体NK细胞的迁移响应（趋化性）通过Transwell迁移试验分析（Costar，Cambridge，MA；直径6.5-mm，孔径5-µm）进行分析。简而言之，将含有2X10⁵个NK细胞的100µL趋化性缓冲液（RPMI 1640，1 % FCS）加入上室，而将含有或无250ng/mL基质源的因子CXCL12（“SDF-1”）（R&D Systems）的0.5mL趋化性缓冲液加入底室。4h内迁移至“Transwell”底室的细胞采用FACScalibur（Becton DickinsonImmunocytometry Systems）60s内进行计数。

“体内”归巢和植入：

如上所述，采用或不采用2.5 mM或5.0 mM 烟酰胺进行NK细胞扩增。在培养基中2至3周之后，将相同数目（15X10⁶）的细胞输注于照射（350 Rad）的NOD/SCID 鼠中。输注之后4天杀死该鼠。采用免疫磁性微球法，而将其与外源细胞区分开，对脾、骨髓和外周血分析人体NK（CD45+CD56+）细胞的归巢和植入。植入表示具有使用来自组织中确定的鼠外源细胞总数的抗人体特异性抗体的移植谱系（CD45+CD56+）的NK细胞%。

NK细胞表面上CD62L表达的分析

采用免疫磁性微球纯化并用细胞因子（包括IL-2和IL-15）和采用或不采用烟酰胺（2.5，5和7.5 mM）活化的外周血源CD56+细胞开始培养。在培养基中活化之前和采用烟酰胺培养3周之后，NK细胞采用特异性抗体对于指定表面标记（例如，CD62L）进行染色，并随后通过FACS进行监测。

结果

实施例I：烟酰胺增强NK细胞的离体增殖

为了评价所加烟酰胺对NK细胞离体生长的影响，将脐血或骨髓细胞用生长因子（细胞因子）和递增浓度的烟酰胺，在不使用饲养细胞或饲养层的情况下进行培养，而在不同时间点测定NK和非-NK（例如，CD3+）细胞的分数。

源自脐血的CD56+ 细胞据发现富集于CD56+CD3- NK细胞群，并含有相当少的CD56+CD3+ NKT 细胞。当在IL-2和IL-15存在下采用烟酰胺培养纯化脐血NK细胞(CD56+）时，早在培养的14天就明显出现NK细胞增殖大幅度增强，并在所有浓度下都进行测试。图1A表明，采用2.5mM烟酰胺的NK细胞在14天的增殖比仅仅采用生长因子（“细胞因子”）（包括IL-2和IL-15）培养的细胞增殖大4倍，而甚至超过采用5 mM烟酰胺的情况。当测试更宽的烟酰胺浓度范围时（图1B），据发现，采用0.5至5mm所有浓度的烟酰胺培养3周，增强的ＮＫ细胞增殖，高达仅仅采用生长因子（“细胞因子”）（包括IL-2和IL-15）培养相同细胞的增殖2.5倍之多。

烟酰胺能够增强来自混合未经选择的脐血单核细胞群的增殖。未经选择的脐血单核细胞培养基采用10ng/mL Flt-3，20ng/mL白细胞介素-15（IL-15），5 ng/mL白细胞介素-2（IL-2），并采用或不采用0.5，1，2.5和5mM 烟酰胺进行补充。为了进一步评价烟酰胺对NK细胞离体增殖的特异性影响，采用和不采用浓度逐渐增加的烟酰胺，在培养基中3周之后分析繁殖的细胞。图2A和2B显示了CD56+/CD45+细胞和来自单核部分的CD56+/CD3- NK细胞的培养中显而易见的剂量依赖性的烟酰胺诱导的增殖增强。图2C清楚指示出烟酰胺处理的培养基中CD3+CD56- T细胞生长的抑制作用，也是以剂量依赖性的模式，而同时在不使用烟酰胺的对照培养基中生长的CD3+细胞占据了NK细胞的优势。因此，NK和CD3+（例如，T和NKT）细胞的混合细胞群采用烟酰胺培养，导致NK细胞部分的进一步富集，而同时仅仅采用细胞因子，而不使用烟酰胺的培养，却几乎不支持NK细胞增殖，反而增强了CD3+细胞的增殖。

骨髓和外周血细胞据发现含有包含CD56+CD3+NKT和CD56+CD3- NK细胞群的CD56+细胞的异质群。骨髓来源的NK细胞的增殖类似地由采用烟酰胺的培养而增强。培养的骨髓纯化CD56+细胞的表征表明，约20%至60%的细胞展示出NKT 细胞(CD56+CD3+）的表型而40%至80%的细胞展示出NK细胞(CD56+CD3-）的表型（不同BM样品之间是不同的）。因此，BM源的CD56+细胞包含NK和NKT细胞的混合细胞群。尽管仅仅采用生长因子（“细胞因子”）（包括FLT3，IL-2和IL-15）培养的骨髓来源的CD56+细胞中NK细胞增殖在培养基中14天之后几乎没有提高，但是在采用生长因子和2.5mM烟酰胺培养的CD56+细胞中NK细胞的增殖在14天（倍增 =8）和21天（倍增 =12）之间却提高了50%（图3）。在21天时进一步分析培养细胞的CD56+CD3- 和CD56+CD3+亚类表明，在烟酰胺处理的培养基中CD56+CD3- NK细胞对CD56+CD3+ NKT细胞具有压倒性的优势（大于80%），而仅仅采用生长因子（“细胞因子”）（包括FLT3，IL-2和IL-15）培养的骨髓来源的CD56+细胞占优势的是NKT细胞(CD56+CD3+）而不是NK（CD56+CD3-）（图4A和4B）。因此，异质NK + NKT细胞群采用烟酰胺培养，导致NK细胞部分进一步繁殖和富集，NKT细胞增殖最低，而同时仅仅采用细胞因子而不采用烟酰胺的培养并不支持NK细胞的优先增殖。

CD56+CD16+细胞毒性的NK细胞群已经证明能够具有抗体依赖性的细胞介导细胞毒性（ADCC）。采用生长因子而采用和不采用2.5 mM 烟酰胺培养的骨髓 CD56+细胞在14天和21天培养之后的CD56+CD16+细胞分析表明，展示CD56+CD16+表型的NK细胞部分显著增加，超过了仅仅采用生长因子（“细胞因子”）（包括FLT3，IL-2和IL-15）培养的骨髓来源的CD56+细胞（参见图5）

当骨髓来源的CD56+细胞采用生长因子（“细胞因子”）（包括FLT3，IL-2和IL-15）和烟酰胺离体培养7天时，在1mM，2.5 mM 和5 mM 烟酰胺浓度之下，显而易见CD56+CD3- NK细胞子组的增殖增强（图6A），而CD56+CD3+ NKT细胞的增殖降低（图6B）。采用2.5mM和5mM烟酰胺在第7天时CD56+CD16+ NK细胞的增殖增强程度最大（图6C）。

烟酰胺和所培养的外周血NK细胞的自我更新能力：

当外周血单核细胞耗尽CD3+或CD3+/CD19+群时，就获得NK细胞中富集的群，包含2%至10 % NK细胞，绝大多数接种的细胞都属于骨髓细胞谱系。在采用烟酰胺的培养中2至3周之后，培养基中超过90%的细胞是NK（CD56+CD3-）细胞。

图10举例说明了在细胞因子（IL-2或IL-2+IL-15）存在下，在按比例放大（在培养袋中10mL体积）的培养基中3周的培养期间外周血NK（T-细胞耗尽的）细胞的扩增。这个扩增在培养基中第一个7天期间是所有组中最缓慢的。在14天和21天之后，在都采用2.5mM和5mM烟酰胺处理的培养基中NK扩增相对于不采用烟酰胺（NAM 0）生长的对照培养基显著更高。有意思的是，采用烟酰胺生长的NK细胞从14天至21天继续发生扩增，而不采用NAM处理的NK细胞却停止扩增。

当这些培养采用一定范围的接种密度（2-，5-和10X10⁵ 个接种细胞）开始时，在21天后在2.5 mM和5 mM两种情况下都观察到CD56+CD3- NK细胞增殖进一步增强（图11）。在接种后第21天时NK细胞群的FACS分析表明，采用2.5mM和5.0mM两个浓度的烟酰胺培养对于NK（CD56+/CD3-）群具有明显的优势。注意到，即使所有组中NK细胞的百分数都提高，但是相比较不采用烟酰胺的对照培养基，采用烟酰胺处理的培养基中非-NK细胞的分数较小（图12）。

烟酰胺浓度和脐血来源的纯化CD56+NK细胞的扩增

当仅仅采用细胞因子（包括Flt-3，IL-2和IL-15）（细胞因子）或在递增浓度（NAM 1至7.5 mM）的烟酰胺存在下培养已经对于CD56+表型在免疫磁性微珠上纯化的脐血来源的NK细胞部分高达3周时，据观察，相比较仅仅细胞因子的对照，所有浓度的测试烟酰胺都有效增强了脐血来源的NK细胞的NK增殖（参见图17）。注意，相比较对照（细胞因子），暴露烟酰胺的培养基的扩增是剂量依赖性的提高，持续于整个培养期间。因此，NK细胞增殖的烟酰胺增强作用对于短期和长期离体NK培养都是有效的，并不需要饲养层或饲养细胞，在整个烟酰胺浓度范围内是明显的，并能够使用来自各种起始细胞群（例如，外周血，脐血）的NK和非-NK（CD3+，T细胞，NKT细胞等）细胞的NK富集的混合物，或高度异质性的单细胞群作为源，所有这些对于提供巨大数量的治疗用途的NK细胞是很重要的。

实施例II-离体暴露烟酰胺增强NK细胞功能

NK细胞特征在于既能响应抑制刺激，又能响应活化刺激，而具有有效而特异性的细胞毒性的功能NK细胞的生产对于任何离体NK细胞培养的考虑因素都是至关重要的。烟酰胺对NK细胞功能的影响通过其对细胞标记的影响，并采用趋化性“Tranwell”迁移和靶细胞“杀伤”试验分析而进行评价。为了检测抑制性和活化NK细胞部分的盛行情况的变化，采用生长因子[10ng/mL Flt-3，20ng/mL 白细胞介素-15（IL-15）和5ng/mL 白细胞介素-2（IL-2）]，采用或不采用1、2.5 和5mM 烟酰胺，在孔板孔中培养纯化脐血来源的CD56+细胞。3周的培养之后，相比较仅仅采用生长因子（包括FLT3，IL-2和IL-15）培养的脐血来源的NK细胞（图7），在NK细胞中抑制性CD56+NKG2A细胞部分的盛行在所有烟酰胺浓度下出现显著而剂量依赖性的降低，表明采用烟酰胺增强了NK细胞的活化作用。

功能上胜任的NK细胞能够通过其趋化性和细胞毒性潜力进行表征。为了评价烟酰胺对NK细胞功能的影响，实施了体外迁移（趋化性）和杀伤作用（细胞毒性）试验分析。

相比较仅仅采用生长因子培养的CD56+细胞的迁移作用，采用生长因子和2.5或5.0mM烟酰胺培养的免疫磁性纯化脐血来源的CD56+细胞响应250ng/mL SDF刺激的迁移作用被大大增强（图8A）。另外，烟酰胺培养的CD56+ 细胞在无SDF刺激存在下表现出移动性增强。

烟酰胺对功能上相关的细胞表面受体的影响进行了研究。当使用特异性抗体和FACS分析对迁移（CXCR4）、粘附（CD49e）和转运（CD62L）受体的表达时，相比较对照（仅仅采用细胞因子）在烟酰胺存在下培养的细胞中CXCR4和CD62L的表达强烈增强，CD49e表达提高（图8B），强有力地表明烟酰胺处理的细胞迁移和归巢骨髓、淋巴样器官和其它器官的能力提高，并能够预测烟酰胺培养的NK细胞优异的体内归巢和活性。

当分析转运（CD62L）受体在烟酰胺存在下培养的T-细胞耗尽（CD3或CD3/CD19耗尽的）外周血NK细胞群表面上的表达时，相比较对照细胞（细胞因子）观察到该受体的表达提高。在2.5 and 5.0 mM 烟酰胺下，在7（图13A）、14（图13B）和21（图13C）天的培养之后观察到CD62L-阳性细胞的百分数增加，而同时在仅仅细胞因子的对照中表达CD62L的NK细胞百分数从培养7天的20%缩小至培养21天的小于10%。

图20显示了CD62L转运受体在具有IL-2的培养基中活化之前于外周血源免疫微球纯化CD56+细胞上的表达水平，在采用IL-2活化之后CD62L表达水平显著降低而在具有IL-2和浓度逐渐增加的烟酰胺（2.5至7.5mM）的培养基中活化之后CD62L表达水平显著增加。这些培养都是采用免疫磁性微球纯化的外周血源CD56+细胞开始而仅仅在细胞因子（包括IL-2和IL-15）（参见图20，柱“0”）或细胞因子+烟酰胺（2.5，5和7.5 mM）存在下维持。培养之前和3周培养之后，NK细胞用特异性CD62L抗体染色，而随后通过FACS监测。注意，相比较对照（仅仅细胞因子，“0”），在烟酰胺存在下培养的细胞中CD62L的表达显著增强。插入的是FACS数据，显示了相对于CD56分布作图的CD62L分布。

采用CFSE-标记的K562靶细胞进行试验分析，并对采用生长因子和采用或不采用烟酰胺培养的脐血来源的CD56+细胞评价NK细胞的杀伤潜力。在E:T之比为1:5，1:10和1:20NK细胞/靶细胞的情况下，采用生长因子和烟酰胺培养的脐血来源的NK细胞的杀伤（细胞毒性）潜力远大于相同数目而仅仅生长因子培养的细胞（图9）。新鲜的未培养细胞几乎没有展示出杀伤潜力。

对采用生长因子和采用或不采用2.5 mM或5.0 mM烟酰胺培养3周的外周血源CD56+细胞，采用CFSE-标记的K562和BL2靶细胞试验分析和评价外周血NK细胞的杀伤潜力。在E:T之比为1:1至10:1 NK细胞/靶细胞的情况下，采用生长因子和烟酰胺培养的增殖外周血源NK细胞的杀伤（细胞毒性）潜力远大于相同数目而仅仅生长因子培养的细胞（图15A。

外周血的增殖NK细胞的细胞毒性潜力也采用人体原发性双表型白血病细胞(其中> 90 % 的细胞是CD3+ T-细胞）作为靶细胞进行证明。图15B和15C显示了用NK细胞的2个独立供体（供体A和供体B）在24h之后的结果，表明通过采用烟酰胺培养NK细胞杀伤潜力的活化作用提高。在培养的供体A的NK对照细胞中没有任何杀伤潜力，进一步表明烟酰胺对NK细胞具有强烈的活化效应。

采用烟酰胺增殖的外周血源NK细胞对实体肿瘤细胞这种重要的治疗性靶的细胞毒性潜力，采用colo205结肠直肠腺癌细胞系的细胞作为靶细胞进行证实。图15D显示了所有测试的E:T比（1:1至10:1）下采用5mM烟酰胺培养的NK细胞提高的杀伤潜力。

总之，这些结果表明，CD56+细胞暴露烟酰胺不仅能够提高NK细胞的增殖，而尤其是CD56+CD62L细胞群的增殖，而且在烟酰胺存在下繁殖的细胞相比较仅仅采用生长因子培养的类似细胞具有更大的移动性、定向迁移和细胞毒性潜力。另外，本文中所示的结果表明烟酰胺能够有效增强NK细胞的增殖和功能，无论是来自纯化的还是总单核细胞部分和来自各种源，如外周血、骨髓或脐血。

实施例III-烟酰胺对采用饲养细胞培养的NK细胞增殖的效果

NK细胞也能够采用饲养细胞进行培养。烟酰胺对采用外周血单核细胞(PBMC）饲养细胞共培养的NK细胞增殖和功能性进行了评价。

一般而言，采用饲养细胞的培养如下实施：含NK的细胞群（例如，脐血，外周血，骨髓）在照射的异源的或自体同源的 PBMC 饲养细胞存在下按照10:1至100:1的饲养:培养的细胞比，并结合细胞因子（包括包括FLT3，IL-2和/或IL-15）和递增浓度的烟酰胺（0.5至10mM）进行培养。这些培养维持2至5周并基于NK细胞和非-NK细胞和亚类（例如，CD56+，CD3+，CD56+CD3-，CD56+CD16+）的分布和NK细胞的功能（例如，趋化性，细胞毒性）评价烟酰胺在饲养细胞培养基中的影响作用。在饲养细胞培养基中采用烟酰胺培养的NK细胞增殖和功能的增强，进一步表明烟酰胺对培养基中NK细胞繁殖的功效。

为了评价烟酰胺对采用饲养细胞培养的NK细胞的影响，外周血NK细胞部分在采用照射的基质细胞，采用和不采用烟酰胺的共培养下进行扩增，并分析检测倍增、表面标记CD56、CXCR4和功能性能。

外周血源的单核细胞部分进行CD3耗尽并随后通过免疫微珠纯化而对CD56+细胞进行选择。来自相同血液单位的单核细胞部分一直保留并以3000rad照射，而提供照射的单核细胞。CD56+NK细胞采用照射的外周血源的单核细胞部分按照10：1的照射外周血单核细胞/CD56选择的细胞比接种。这些培养基采用IL-2，IL-15和Flt-3，采用或采用烟酰胺（2.5和5 mM）进行补充。

采用照射饲养细胞培养21天之后，观察到烟酰胺补充的培养基具有显著优势。在第21天时在2.5mM和5mM烟酰胺存在下培养的NK细胞倍增，相比较第0天，至少为对照（细胞火速+照射的单核细胞）的4倍（参见图20）。NK细胞采用照射的单核细胞在烟酰胺存在下共培养，也产生了表面标记CXCR4（参见图 21）和 CD62L（参见图 22）表达的显著增加。因此，采用烟酰胺在照射的单核细胞和细胞因子存在下扩增的NK细胞已经证实迁移（CXCR4）和转运（CD62L）潜力都得以增强。

当扩增的NK细胞对其离体杀灭K562靶细胞的作用进行分析时，在5:1，2.5:1和1:1NK细胞/靶细胞时观察到细胞毒性能力增加（参见图23）。靶细胞死亡通过FACS作为PI阳性CFSE标记的细胞的百分数而进行监测。增加的靶细胞杀灭潜力，相比较对照（仅仅细胞因子）强有力地表明通过烟酰胺和照射的单核细胞培养，增强了NK细胞杀伤潜力的活化作用。因此，当NK细胞在烟酰胺存在下采用或不采用另外的饲养细胞进行培养时，都观察到增殖和功能的同样增强。

总之，这些结果表明在采用烟酰胺处理的NK细胞培养基中观察到的效应是很独特的而大于采用饲养细胞培养NK细胞的效应。采用烟酰胺，使用或不适用饲养细胞情况下培养NK细胞，不仅导致其离体增殖提高，而且增强了扩增的NK细胞的功能潜力（例如，CD62L和CXCR4的表达），这对于用NK细胞进行治疗的移植和采用的免疫疗法的临床效能都是很重要的。

实施例IV-烟酰胺对采用CD3-或CD3CD19-耗尽的MNC开始的NK细胞培养中非NK细 胞增殖的效果

适用于临床环境培养的NK细胞扩增方法，对于NK细胞群是必须稍微具有特异性，由于细胞培养条件最不具污染性的非NK细胞也会增殖。烟酰胺对非NK细胞的影响通过监测暴露2.5，5和7.5 mM烟酰胺的NK细胞培养基中的单核细胞和粒性白细胞群进行评价。

图14A和14B举例说明了相比较NAM非未处理的培养基中的百分数，烟酰胺降低用烟酰胺处理14天的NK细胞培养基中污染性单核细胞（CD14+，图14A）和粒性白细胞（CD15+，图14B）的百分数的效果。令人惊讶的是，采用烟酰胺培养NK细胞，在第14天培养时抑制了50%的CD14和CD16增殖。

当开始之后3周时分析根据采用CD56+纯化外周血NK细胞开始而在在无（细胞因子，"NAM 0"）或有烟酰胺（NAM 2.5，NAM 5.0）存在下维持的培养基中存在的细胞表面标记（CD56，CD3）进行分类的不同淋巴细胞亚类的比例时，采用浓度逐渐增加的烟酰胺观察到了非NK细胞如CD3+T细胞和CD3+CD56+ NKT 细胞的分数降低（参见图18和图18B，小图表）。采用烟酰胺培养的NK细胞比未暴露烟酰胺的NK细胞更加有效地抑制了CD3+细胞。这些培养基采用细胞因子（包括Flt-3，IL-15 和 IL-2），采用或不采用浓度（2.5至 7.5 mM）逐渐增加的烟酰胺维持3周，对于表面标记于特异性抗体反应，而随后通过FACS对特异性表型进行分析。

这种经常与移植物抗宿主病、NKT 和T-细胞有关的CD14和CD15细胞污染的降低，可能是对于培养基中NK细胞扩增的任何临床有用方案的重要方面，因为这能够降低对粗放的T-细胞、单核细胞和粒性白细胞耗尽预移植的需要，并进一步降低移植物抗宿主病和宿主中相关的综合症。

实施例V-烟酰胺对以纯化造血干细胞/祖细胞开始的培养中NK细胞增殖和功能的 效果

烟酰胺对造血源细胞中NK细胞增殖和功能的增强作用，能够通过将烟酰胺处理的造血细胞群暴露培养基中的烟酰胺和合适的细胞因子而进行评价。

这些培养采用纯化的造血干细胞和/或祖细胞（例如，CD34+或CD133+细胞）开始，并用细胞因子包括TPO，FLT3，SCF和/或IL7和/或IL15的组合，采用或不采用浓度逐渐增加的烟酰胺（0.5至10mM）补充1周或两周。在这段时间之后，培养基用细胞因子包括FLT3，IL7，IL15，IL21和/或IL-2的组合，采用或不采用浓度逐渐增加的烟酰胺（0.5至10mM）补充另一段时间（例如，2至3周）。为了评价烟酰胺对所培养的造血源NK细胞的增殖和功能的影响，在所培养的细胞群中监测NK和非NK细胞和亚类（例如，CD56+，CD3+，CD56+CD3-，CD56+CD16+）的分布和NK细胞的功能（例如，趋化性，细胞毒性）。

实施例VI-烟酰胺培养的NK细胞的植入和治疗潜力

在将NK细胞移植到活体宿主中之后，对烟酰胺存在下扩增的NK细胞测试体内对靶细胞的定位和对器官的植入。

照射的（350 Rad）NOD/SCID鼠接受15X10⁶个来自人体外周血NK（T-细胞耗尽的）培养基并采用（NAM 2.5mM和NAM 5mM）或不采用（NAM 0）烟酰胺维持高达3周的细胞。一旦在输注之后第4天杀死这些小鼠时，通过FACS使用人体特异性Abs对脾、骨髓和外周血样品评价人体NK细胞(CD56+CD45+）的存在。图16显示了采用烟酰胺扩增的NK细胞对合适的靶组织定位和植入的提高，表示所示器官总NK细胞的百分数，而证实烟酰胺浓度越高，效应越强。因此，采用烟酰胺培养NK细胞，不仅增加了NK细胞的数目，而且也提高了其体内功能的潜力，这一点通过对靶器官（例如，脾，骨髓和外周血）的定位和植入得以证实。

在进一步的研究中，培养的，以及新鲜的未培养的人体NK或CD56+细胞的输注能够在预想实现亚最佳移植的剂量范围内进行实施，并随后在小鼠或其后代的部分中进行非植入。在输注之后4h和高达4周时能够，例如根据人体CD45或CD45CD56抗原，评价人体NK细胞归巢和停留。

采用亚最佳剂量，能够给予烟酰胺-培养的NK细胞，并能够记录对受者PB、BM和淋巴器官中归巢和停留的影响，而与不采用烟酰胺（仅仅细胞因子）培养的NK细胞或新鲜NK细胞的归巢和停留相比较。

采用烟酰胺培养的NK细胞体内抗肿瘤潜力能够采用许多动物肿瘤模型如骨髓性白血病（K562）伯基特氏淋巴瘤（BL-2）、人体胰腺癌（BxPC-3 和Panc-1）人体乳腺癌和结肠直肠癌异体移植进行评价——异体移植的实体肿瘤生长在输注本发明的NK细胞群之后不同的时间点进行监测。异体移植的肿瘤的转移癌潜力也在NK细胞输注之后进行评价。NK细胞对白血病和骨髓增生异常综合症模型的影响，能够直接采用输注1X10³，1X10⁴，1X10⁵，1X10⁶，1X10⁷，1X10⁸或更大剂量的培养NK细胞/kg鼠体重进行评价，或在连同造血祖细胞、骨髓、干细胞等一起输注时评价切除后骨髓增殖的效能改善。

尽管本发明已经结合其具体实施方式进行了描述，很明显，许多改变、修改和变化对于本领域的那些技术人员是很明显的。因此，本发明预想涵盖所有这些改变、修改和变化，这些都落入本发明附加权利要求的精神和宽范围内。

本说明书内提及的所有出版物、专利和专利申请都以其全文结合于本说明书中作为参考，就如同每个各个出版物、专利或专利申请特异且单独指出而结合于本文中作为参考的程度一样。另外，本申请书中引述或确定的任何参考文献不应该解释为是承认这些文献是可得到的本发明的现有技术。至于使用的节标题，不应理解为必要的限制。

参考文献

Claims (11)

1.一种离体培养自然杀伤（NK）细胞的方法，所述方法包括采用至少一种选自由IL-2和IL-15组成的组中的生长因子和2.5至10 mM的烟酰胺培养包含NK细胞的细胞群14天至21天，其中培养所述NK细胞产生CD3⁺CD56⁺对CD56⁺CD3^-细胞的比降低和与相同培养条件下采用相同生长因子和小于0.1mM的所述烟酰胺培养的NK细胞比较，CD62L的表达提高。

2.根据权利要求1所述的方法，其中培养所述NK细胞产生以下中的至少之一：

（a）与相同培养条件下采用相同生长因子和小于0.1mM的所述烟酰胺培养的NK细胞比较，迁移响应提高；

（b）与相同培养条件下采用相同生长因子和小于0.1mM的所述烟酰胺培养的NK细胞比较，归巢和体内停留增加；

（c）与相同培养条件下采用相同生长因子和小于0.1mM的所述烟酰胺培养的NK细胞比较，增殖更多；和

（d）与相同培养条件下采用相同生长因子和小于0.1mM的所述烟酰胺培养的NK细胞比较，细胞毒活性增加。

3.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包含采用另外的生长因子IL-21培养所述NK细胞。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述烟酰胺的浓度为4.0 mM至8 mM。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述至少一种生长因子是IL-15，所述培养从接种开始为2至3周，且所述烟酰胺的浓度为7 mM。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述培养从接种开始为2周。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中包含所述NK细胞的所述细胞群获自选自由脐血、骨髓和外周血组成的组中的来源。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中包含所述NK细胞的所述细胞群是包含NK细胞部分和CD3+细胞部分的异质细胞群。

9.根据权利要求7所述的方法，其中包含所述NK细胞的所述细胞群是耗尽CD3+细胞的单核或总核细胞群。

10.根据权利要求7所述的方法，其中包含所述NK细胞的所述细胞群是耗尽CD3+和CD19+细胞的单核或总核细胞群。

11.一种转导具有外源基因的离体培养的NK细胞的方法，所述方法包括：

（a）根据权利要求1至10中任一项所述的方法离体培养NK细胞群；和

（b）转导具有外源基因的所述培养的NK细胞群。

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