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CN113151169A - 一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法 - Google Patents

一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法 Download PDF

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CN113151169A
CN113151169A CN202110527157.XA CN202110527157A CN113151169A CN 113151169 A CN113151169 A CN 113151169A CN 202110527157 A CN202110527157 A CN 202110527157A CN 113151169 A CN113151169 A CN 113151169A
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magnetic bead
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Shanghai Saili Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法，具体包括以下内容；使用磁珠分选缓冲液重悬外周血单个核细胞；加入CD14antibodycocktail并混匀孵育；涡旋后加入Rapidspheres并混匀孵育；插入磁铁内孵育；得到上清细胞；重悬上清细胞；加入CD3antibodycocktail混匀孵育；涡旋后加入Rapidspheres并混匀孵育；插入磁铁内孵育，得到上清细胞；加入CD56antibodycocktail并混匀孵育；涡旋后加入Rapidspheres并混匀孵育；插入磁铁内孵育；倒出上清，获得自然杀伤细胞。

Description

一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法
技术领域
本发明属NK细胞磁珠分选技术领域，具体涉及一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法。
背景技术
免疫磁珠分选是一种非常有效的细胞分离手段。通常分为标记目的细胞的阳性分选策略，以及标记非目的细胞的阴性分选策略。阴性细胞分选虽然特异性较好，但是得率不高，且样本利用率底下。阳性细胞分选策略由于使用单标志物分选，细胞特异性并不好，如果使用CD56作为标志物进行阳性分选细胞的话，会含有较大比例的单核细胞及NKT细胞，并不能拿到理想的自然杀伤细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法，具体包括以下步骤：
步骤1、使用磁珠分选缓冲液重悬外周血单个核细胞至14ml圆底试管中使其终浓度为1*108cells/mL；
步骤2、每毫升细胞加入100ul CD 14antibody cocktail并混匀孵育10min；
步骤3、涡旋磁珠30s，每毫升细胞加入100ul Rapidspheres并混匀孵育3min；
步骤4、将体积补到10ml并将样本插入磁铁内孵育3min；
步骤5、缓缓拿起磁铁倒出上清，从而实现上清细胞和磁珠的分离，得到上清细胞；
步骤6、使用磁珠分选缓冲液重悬步骤5所得上清细胞至14ml圆底试管中使其终浓度为1*108cells/mL；
步骤7、每毫升细胞加入100ul CD3 antibody cocktail并混匀孵育3min；
步骤8、涡旋磁珠30s，每毫升细胞加入60ul Rapidspheres并混匀孵育3min；
步骤9、.将体积补到10ml并将样本插入磁铁内孵育3min；
步骤10、缓缓拿起磁铁倒出上清，从而得到上清细胞；
步骤11、使用磁珠分选缓冲液重悬步骤10所得上清细胞至14ml圆底试管中使其终浓度为1*108cells/mL；
步骤12、每毫升细胞加入100ul CD56 antibody cocktail并混匀孵育3min；
步骤13、涡旋磁珠30s，每毫升细胞加入100ul Rapidspheres并混匀孵育3min；
步骤14、将体积补到10ml并将样本插入磁铁内孵育3min；
步骤15、缓缓拿起磁铁倒出上清，并用10ml缓冲液重悬磁珠；
步骤16、将步骤14和步骤15重复两次即可获得自然杀伤细胞。
优选的，所述步骤3、步骤8和步骤13中的涡旋速度为3000rpm。
优选的，所述步骤5中倒出上清后，并用10ml缓冲液重悬磁珠，再结合两次磁铁内孵育3min、分离上清和磁珠，即可获得单核细胞。
优选的，所述步骤10中倒出上清后，并用10ml缓冲液重悬磁珠，再结合两次磁铁内孵育3min、分离上清和磁珠，即可获得T淋巴细胞。
优选的，所述步骤1-步骤16须在II级生物安全柜内操作，并严格遵守无菌操作。
本发明的技术效果和优点：本发明可以通过合理的分离步骤，以较高的得率获得高特异性的自然杀伤细胞，此外，还能够收获一定的T淋巴细胞和单核细胞作为副产物，提高了外周血单个核细胞的利用率。
附图说明
图1为检测样本的前向侧向散射光散点图；
图2为细胞样本中CD3/CD56双荧光散点图(第二象限比例为NK细胞)。
具体实施方式
实施例1
一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法，具体包括以下步骤：
步骤1、使用磁珠分选缓冲液重悬外周血单个核细胞至14ml圆底试管中使其终浓度为1*108cells/mL；
步骤2、每毫升细胞加入100ul CD 14antibody cocktail并混匀孵育10min；
步骤3、涡旋磁珠30s，每毫升细胞加入100ul Rapidspheres并混匀孵育3min；
步骤4、将体积补到10ml并将样本插入磁铁内孵育3min；
步骤5、缓缓拿起磁铁倒出上清，从而实现上清细胞和磁珠的分离，得到上清细胞；
步骤6、使用磁珠分选缓冲液重悬步骤5所得上清细胞至14ml圆底试管中使其终浓度为1*108cells/mL；
步骤7、每毫升细胞加入100ul CD3 antibody cocktail并混匀孵育3min；
步骤8、涡旋磁珠30s，每毫升细胞加入60ul Rapidspheres并混匀孵育3min；
步骤9、.将体积补到10ml并将样本插入磁铁内孵育3min；
步骤10、缓缓拿起磁铁倒出上清，从而得到上清细胞；
步骤11、使用磁珠分选缓冲液重悬步骤10所得上清细胞至14ml圆底试管中使其终浓度为1*108cells/mL；
步骤12、每毫升细胞加入100ul CD56 antibody cocktail并混匀孵育3min；
步骤13、涡旋磁珠30s，每毫升细胞加入100ul Rapidspheres并混匀孵育3min；
步骤14、将体积补到10ml并将样本插入磁铁内孵育3min；
步骤15、缓缓拿起磁铁倒出上清，并用10ml缓冲液重悬磁珠；
步骤16、将步骤14和步骤15重复两次即可获得自然杀伤细胞。
实施例2
一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法，具体包括以下步骤，并对分离结果进行检测，其检测结果如图1和图2所示：
步骤1、使用磁珠分选缓冲液重悬外周血单个核细胞至14ml圆底试管中使其终浓度为1*108cells/mL；
步骤2、每毫升细胞加入100ul CD 14antibody cocktail并混匀孵育10min；
步骤3、涡旋磁珠30s，每毫升细胞加入100ul Rapidspheres并混匀孵育3min；
步骤4、将体积补到10ml并将样本插入磁铁内孵育3min；
步骤5、缓缓拿起磁铁倒出上清，从而实现上清细胞和磁珠的分离，得到上清细胞；
步骤6、使用磁珠分选缓冲液重悬步骤5所得上清细胞至14ml圆底试管中使其终浓度为1*108cells/mL；
步骤7、每毫升细胞加入100ul CD3 antibody cocktail并混匀孵育3min；
步骤8、涡旋磁珠30s，每毫升细胞加入60ul Rapidspheres并混匀孵育3min；
步骤9、.将体积补到10ml并将样本插入磁铁内孵育3min；
步骤10、缓缓拿起磁铁倒出上清，从而得到上清细胞；
步骤11、使用磁珠分选缓冲液重悬步骤10所得上清细胞至14ml圆底试管中使其终浓度为1*108cells/mL；
步骤12、每毫升细胞加入100ul CD56 antibody cocktail并混匀孵育3min；
步骤13、涡旋磁珠30s，每毫升细胞加入100ul Rapidspheres并混匀孵育3min；
步骤14、将体积补到10ml并将样本插入磁铁内孵育3min；
步骤15、缓缓拿起磁铁倒出上清，并用10ml缓冲液重悬磁珠；
步骤16、将步骤14和步骤15重复两次即可获得自然杀伤细胞。
优选的，所述步骤3、步骤8和步骤13中的涡旋速度为3000rpm。
优选的，所述步骤5中倒出上清后，并用10ml缓冲液重悬磁珠，再结合两次磁铁内孵育3min、分离上清和磁珠，即可获得单核细胞。
优选的，所述步骤10中倒出上清后，并用10ml缓冲液重悬磁珠，再结合两次磁铁内孵育3min、分离上清和磁珠，即可获得T淋巴细胞。
优选的，所述步骤1-步骤16须在II级生物安全柜内操作，并严格遵守无菌操作。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法，其特征在于：具体包括以下步骤，
步骤1、使用磁珠分选缓冲液重悬外周血单个核细胞至14ml圆底试管中使其终浓度为1*108cells/mL；
步骤2、每毫升细胞加入100ul CD 14antibody cocktail并混匀孵育10min；
步骤3、涡旋磁珠30s，每毫升细胞加入100ul Rapidspheres并混匀孵育3min；
步骤4、将体积补到10ml并将样本插入磁铁内孵育3min；
步骤5、缓缓拿起磁铁倒出上清，从而实现上清细胞和磁珠的分离，得到上清细胞；
步骤6、使用磁珠分选缓冲液重悬步骤5所得上清细胞至14ml圆底试管中使其终浓度为1*108cells/mL；
步骤7、每毫升细胞加入100ul CD3 antibody cocktail并混匀孵育3min；
步骤8、涡旋磁珠30s，每毫升细胞加入60ul Rapidspheres并混匀孵育3min；
步骤9、.将体积补到10ml并将样本插入磁铁内孵育3min；
步骤10、缓缓拿起磁铁倒出上清，从而得到上清细胞；
步骤11、使用磁珠分选缓冲液重悬步骤10所得上清细胞至14ml圆底试管中使其终浓度为1*108cells/mL；
步骤12、每毫升细胞加入100ul CD56 antibody cocktail并混匀孵育3min；
步骤13、涡旋磁珠30s，每毫升细胞加入100ul Rapidspheres并混匀孵育3min；
步骤14、将体积补到10ml并将样本插入磁铁内孵育3min；
步骤15、缓缓拿起磁铁倒出上清，并用10ml缓冲液重悬磁珠；
步骤16、将步骤14和步骤15重复两次即可获得自然杀伤细胞。
2.根据权利要求1所述的一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法，其特征在于：所述步骤3、步骤8和步骤13中的涡旋速度为3000rpm。
3.根据权利要求1所述的一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法，其特征在于：所述步骤5中倒出上清后，并用10ml缓冲液重悬磁珠，再结合两次磁铁内孵育3min、分离上清和磁珠，即可获得单核细胞。
4.根据权利要求1所述的一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法，其特征在于：所述步骤10中倒出上清后，并用10ml缓冲液重悬磁珠，再结合两次磁铁内孵育3min、分离上清和磁珠，即可获得T淋巴细胞。
5.根据权利要求1所述的一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法，其特征在于：所述步骤1-步骤16须在II级生物安全柜内操作，并严格遵守无菌操作。
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