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CN107158376A - 使用抗IL‑1α抗体治疗癌症 - Google Patents

使用抗IL‑1α抗体治疗癌症 Download PDF

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CN107158376A CN201710383172.5A CN201710383172A CN107158376A CN 107158376 A CN107158376 A CN 107158376A CN 201710383172 A CN201710383172 A CN 201710383172A CN 107158376 A CN107158376 A CN 107158376A
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Abstract

使用抗IL‑1α抗体治疗患者，或抗IL‑1α免疫作为癌症治疗。

Description

使用抗IL-1α抗体治疗癌症
本申请是分案申请的分案申请，原申请的申请日为2007年5月22日、申请号为200780023111.2(PCT/IB2007/001320)、发明名称为“使用抗IL-1α抗体治疗癌症”，所针对的分案申请的申请号为201210043900.5、发明名称为“使用抗IL-1α抗体治疗癌症”。
本申请要求2006年5月22日提交的共同未决临时申请序列号60/802,166的权益，并通过引用将其引入。
背景技术
癌症通常通过侵入邻近组织结构，破坏关键器官的生理学来进行杀伤。已发现转移过程与原发性肿瘤病变(primary tumor lesions)的去分化并发。肿瘤去分化的必然结果是肿瘤异质性(tumor heterogeneity)。去分化、异质性和转移三联征(triad)导致了致命的混合(a deadly mix)。一旦癌症变为转移性的并且是异质性的，完全抗肿瘤治疗的可能性就极小了。长期存在的希望是识别出转移性肿瘤的一些共同要素(common element)，在甚至最异质性肿瘤的生长(赘疣，outgrowth)和去分化过程中保持的关键特征，这个特征对转移过程是固有的，以至于它几乎存在于不论来源或趋向性的所有肿瘤细胞中。随着这种关键要素的识别，治疗晚期播散性疾病的想法可具有现实基础。
附图简述
图1。该图显示了用抗IL-1α抗体治疗后，具有人肿瘤异种移植物的裸鼠的肿瘤反应。用小鼠抗人抗IL-1α单克隆抗体(mahIL-1α)或仓鼠抗小鼠IL-1α单克隆抗体(hamIL-1α)或二者(mahIL-1α+hamIL-1α)治疗小鼠。从异种移植当天(第1天肿瘤)或转移性疾病建立(建立的肿瘤)之后，开始给小鼠5mg/kg剂量的每种抗体，每周两次。当携带相当大的肿瘤负荷并处于明显不适时，小鼠被处死。图1A，前列腺肿瘤，第1天；图1B，乳腺肿瘤，第1天；图1C，建立的前列腺肿瘤；图1D，建立的乳腺肿瘤。
图2。三次皮下注射在明矾中的IL-1α-PPD偶联物后，第56天在C57BL/6小鼠中抗IL-1α自身抗体的形成(◆)。对照小鼠仅用在明矾中的PPD免疫(■)。
图3。抗体依赖性补体介导的EL-4细胞杀伤。EL-4细胞与连续稀释的小鼠抗小鼠IL-1α多克隆抗血清一起温育。死亡细胞与活细胞的比例与血清浓度成比例。人抗小鼠IL-1α单克隆抗体被用作阳性对照。与未用过鼠血清温育或仅与培养基温育作为两个阴性对照。
发明详述
用抗体靶向IL-1α可用作癌症治疗。特别地是，抗IL-1α抗体能够通过中断肿瘤来源的IL-1α在肿瘤转移中所发挥的生理作用来抑制肿瘤转移潜能。此外，因为IL-1α由肿瘤表达，所以靶向IL-1α的抗体可通过抗体介导的细胞毒性(通常称为ADCC，antibodydirected cellular cytotoxicity)导致直接的肿瘤细胞毒性。
白细胞介素-1α(IL-1α)可成为癌症治疗的靶是非常意外的。要理解这一点需要简要地回顾所谓白细胞介素-1体系的历史。IL-1体系包括IL-1α、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)和白细胞介素-1受体1(IL-1R1)。发现IL-1α和IL-1β之后的近三十年以来，在区分这两种基因产物不同的生物功能方面进展很小。无法阐明这两个细胞因子独立的生物学功能，这一点被科学文献中通常只提到白细胞介素-1所表明，几十年来白细胞介素-1一直为统称IL-1α和/或IL-1β的术语。无法区分这两种细胞因子这一问题是既独特又罕见的，这是考虑到IL-1α和IL-1β之间相当明显的区别：它们不共有显著的蛋白序列同源性；它们处在不同的转录调节下，造成表达的时空分离；它们是通过单独的和各自的复杂翻译后加工机器而被独立调节；它们受到独特且独立的翻译后修饰；而且它们具有不同的组织分布，并针对不同的刺激上调。此外，IL-1α是通过脂尾(lipid tail)进行膜锚定的，而且具有凝集素样结合活性，而IL-1β是分泌蛋白。
考虑到这些细胞因子之间的区别，就值得理解为什么IL-1α与IL-1β应该统称为白细胞介素1。首先，早期的假设是，这两个基因产物只表现出单一的生物活性，或者也许更精确地说，IL-1α几乎没有显著的生物功能。这种对IL-1α的忽视源于下列事实：没有任何已知的细胞因子的分泌机制，没有能整合入膜的跨膜序列，和没有编码转位到分泌囊泡的信号序列。IL-1α被认为是包含在细胞质中，并且作为细胞内信号分子的角色表明它与真正的细胞因子几乎没有相关性。另一方面，IL-1β的翻译后加工和分泌途径被快速建立。事实上，在所谓的白细胞介素-1体系中仅有的IL-1α的相关性似乎是IL-1α显示出通过IL-1受体-1诱导信号，该信号被发现是响应IL-1α和IL-1β的诱导信号。因为没有分泌机制，所以假定当IL-1α从死细胞的细胞质释放时，它可能只实现生理作用。但几乎在任何情况下，在血清或组织中都没有发现明显水平的IL-1α，这似乎将IL-1α可能的重要性最小化。
因此，用抗IL-1α抗体治疗动物能保护动物免受侵袭性形式的癌症是相当意外的。同样地，免疫动物以诱导抗IL-1α抗体效价可以保护动物免于肿瘤。作用机制目前尚不清楚，可能涉及中和宿主促肿瘤(pro-tumor)IL-1α的产生、中和肿瘤IL-1α的产生或通过抗体介导细胞毒性(ADCC)或补体介导杀伤(ADCK)中和肿瘤直接细胞毒性的一个或多个组合。
可根据本发明治疗的患者包括人和非人哺乳动物，如伙伴动物(companionanimal)、实验室动物、动物模型等(如猫、狗、绵羊、猪、山羊)。
本文使用的“抗体”包括完整多克隆或单克隆免疫球蛋白分子；免疫球蛋白片段，如单体和二聚体Fab、F(ab')2、scFv和Fv；和非天然发生的分子，如双抗体、微抗体(minibody)、Kappa体和Janusins等。本发明治疗方法中可用的抗体包括IL-1α结合位点，并与IL-1α特异性地结合。本文使用的“IL-1α结合位点”包括在抗体可变部分自然发生的IL-1α结合位点。IL-1α结合位点还包括这样的结合位点：其通过1至15个之间(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)保守氨基酸替换而不同于自然产生的IL-1α结合位点，并且该结合位点与IL-1α特异性地结合。典型地，与IL-1α特异性结合的抗体提供了检测信号，其高于当非IL-1α抗原用于免疫化学分析时提供的检测信号的至少10、20或100倍。优选地，在免疫化学分析中，与IL-1α特异性结合的抗体没有检测到其它蛋白，并且可以从溶液中免疫沉淀IL-1α。
多克隆抗体可以通过使用众所周知的方法用IL-1α免疫适合的宿主来获得。但是，单克隆抗体是优选的。单克隆抗体(如全长、scFv、Fv)可以使用通过培养的连续细胞系提供抗体分子产生的任何技术来制备。这些技术包括，但不限于，杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术以及EBV-杂交瘤技术。参见Roberge等，Science 269，202-204，1995；Kohler等，Nature256，495-497，1985；Kozbor等，J.Immunol.Methods 81，31-42，1985；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.80，2026-2030，1983和Shimamoto等,Biologicals，2005Sep；33(3)：169-74。单链抗体可以通过从随机组合文库中进行链改组来产生。Takeda等，Nature 314，452-454，1985。
单链抗体还可以使用DNA扩增方法——如PCR——利用杂交瘤cDNA为模板来构建。单链抗体可以是单特异性或双特异性的，并且可以是二价或四价的。四价双特异性单链抗体的构建在本领域内是众所周知的。编码单链抗体的核苷酸序列可以使用人手动或自动核苷酸合成构建，使用标准重组DNA方法克隆到表达构建体内，并引入到细胞以表达编码序列。可选地，单链抗体可以直接使用，例如丝状噬菌体技术(filamentous phagetechnology)来产生。Burton等，Proc.Natl.Acad.Sci.88，11120-23，1991；Verhaar等，Int.J.Cancer 61，497-501，1995。
本发明可用的IL-1α抗体可从任何表达抗体的细胞纯化，所述细胞包括已用编码抗体的核酸分子转染的宿主细胞。宿主细胞在适于抗体表达的条件下培养。适合的宿主细胞和培养条件可从本领域已知的各种各样中选择。
纯化的抗体与其它化合物分离，这些化合物正常情况下在细胞内与抗体结合，如某些蛋白质、碳水化合物或脂质。纯化方法包括，但不限于：尺寸排阻层析、硫酸铵分级分离、离子交换层析、亲和层析和制备型凝胶电泳。纯化抗体的制品至少是80％纯度，优选地，制品是90％、95％或99％纯度。制品的纯度可用本领域任何已知的方法进行评估，如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。本发明纯化抗体的制品可包含与IL-1α特异性结合的一种类型以上的抗体。
但是，制备的全长多克隆或单克隆抗体可以用标准技术切割以获得功能性抗体片段，如Fab或F(ab')2。见Cheung等，Protein Expr.Purif.32，135-40，2003。可以制备结合蛋白，其来自免疫球蛋白并且是多价和多特异性的，如在WO 94/13804和Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 90，6444-48，1993中所述的“双抗体”；在Martin等，EMBO J.13，5303-09，1994中所述的“微抗体”；在Ill等，Protein Eng.10，949-57，1997中所述的“Kappa体”和在Traunecker等，EMBO J.10，3655-3659，1991和Traunecker等，Int.J.CancerSuppl.7，51-52，1992中所述的“Janusins”(双特异性单链分子)。
本发明可用的任何IL-1α抗体也可利用化学方法合成其氨基酸序列来产生，如通过采用固相技术的直接肽合成(Merrifield，J Am.Chem.Soc.85，2149-54，1963；Roberge等，Science 269，202-04，1995)。蛋白质合成可以使用手动技术或自动装置来实施。自动合成可通过使用例如Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)来获得。任选地，抗体片段可单独合成并使用化学方法进行组合来产生全长分子。新合成的分子可用制备型高效液相色谱法充分地纯化(如Creighton，PROTEINS：STRUCTURES ANDMOLECULAR PRINCIPLES，WH Freeman and Co.，New York，N.Y.，1983)。合成多肽的组成可用氨基酸分析或测序来确定(例如使用Edman降解)。
本领域普通技术人员可以使用已知可注射的，生理可接受的无菌溶液来制备包含本发明抗体的适合的药物组合物。水等渗溶液，如盐水或相应的血浆蛋白质溶液是容易获得的，并且可用于制备用于肠胃外注射或灌注的现成可用的溶液。药物组合物可作为冻干粉(lyophylisate)或干燥制品存储，在使用前其可用已知可注射的溶液重建。药物组合物可以补充已知的载体物质和/或添加剂(如血清白蛋白、葡萄糖、亚硫酸氢钠，EDTA等)。本发明药物组合物典型地包括药学可接受的赋形剂，如惰性稀释剂。
本发明药物组合物可通过本领域普通技术人员已知的不同途径施用。对于全身性应用(systemic application)，静脉内、血管内、肌肉内、动脉内、腹腔内、口腔、结节内(intranodal)或鞘内途径均可使用。更局部的应用可以皮下地、皮内地、心内地、叶内地(intralobally)、髓内地(intramedullarly)、肺内地(intrapulmonarily)或直接地在或接近待被治疗的组织来实现。根据治疗所期望的持续时间和效果，组合物可能被施用一次或数次，例如以每日为基础，持续数天、数周或数月，并且以不同剂量施用。
剂量将取决于患者的年龄、状况、性别和疾病程度，可以从每千克患者体重0.25mg到50mg变化。可以治疗的癌症包括，但不限于，血癌(如白血病、淋巴瘤)和实体组织(例如膀胱、骨、脑、乳腺、宫颈、结肠、食道、肾、肝、肺、胰腺、前列腺、胃)的癌症。
在一个实施方式中，用IL-1α免疫患者以诱导IL-1α抗体。本领域已知的任何免疫方法可用于获得期望的抗体反应(见下文)。一般来说，重组IL-1α可用于含有佐剂的配方用以获得免疫；编码IL-1α的核酸序列可用于制造可用于免疫的重组病毒或生物；或重组IL-1α可与病毒样颗粒化学连接，其作为免疫刺激复合物发挥作用。
在本公开内容中引用的所有专利、专利申请和参考文献通过引用明确引入本文。上述公开内容一般性地描述本发明。更加完整的理解可通过参考以下具体实施例获得，实施例只提供用于说明目的，而不企图限制本发明的范围。
实施例1
动物和肿瘤细胞
使用无胸腺nu/nu小鼠(8-10周龄，NCI,Frederick，MD)产生数据。小鼠皮下侧面注射悬浮于200μl DMEM的5×l06的肿瘤细胞。因为我们预计IL-1α可能提供肿瘤细胞生存力的一般机制，所以我们测试了用抗IL-1α对几种肿瘤细胞系的抑制，用衍生于乳腺(MDA-MB-436或MDA-MB-231，Nozaki等Biochem Biophy Res Comm 275，60-62(2000))或前列腺(PC-3,Chung等，The Prostate 38:199-207(1999)；Singer CF等Clin Cancer Res.2003Oct15；9(13):4877-83)谱系的肿瘤细胞注射动物，以前已表明这些肿瘤细胞表达IL-1α。
用小鼠抗人IL-1α抗体注射小鼠来对抗肿瘤IL-1α的产生。小鼠接受5mg/kg IgG1单克隆抗体(克隆364-3B3-14，BioLegend)或5mg/kg IgG2a单克隆抗体(克隆1F3B3，ProMab)，从肿瘤植入当天或原发肿瘤病变至少约3mm3的迹象之后开始，每周两次腹腔内施用。其它两组小鼠接受IgG1单克隆抗体或IgG2a单克隆抗体以及5mg/kg的抗小鼠抗IL-1α单克隆抗体(仓鼠抗小鼠IL-1α购自BD PharMingen(San Diego,Calif))，用以中和内源IL-1α的产生。
动物维持生命56天，除非由于过度肿瘤负荷而出于人道主义原因较早处死。每周记录动物体重，测量可观察到的肿瘤体积。当动物具有明显的肿瘤相关病状(体重减轻，嗜睡)时，动物被处死。使用CO2室处死小鼠。在彻底检查腹部和腹膜腔及包括肝脏、淋巴结、脾和肺在内的主要器官之后，转移物被收获和分开存放。计算聚集的肿瘤块。存活和肿瘤负荷的结果表示为平均+/-SE。
实施例2
免疫组织化学
从一些动物取得与周围组织一起切除的转移性肿瘤标本，进行组织学分析。在处死时产生福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤制备物。使用抗鼠和抗人IL-1α抗体实施组织学分析，还实施抗VEGF、抗ICAM-1、抗E-选择蛋白和抗VCAM染色。
实施例3
PCR
从每个肿瘤细胞系和取自带有已确定皮下移植肿瘤的小鼠的肿瘤活组织中提取RNA。使用RT-PCR对细胞进行IL-1α转录分析。设计引物用以特异性识别人IL-1α，以至不会在肿瘤活组织检查样本中混淆IL-1α转录物来源于肿瘤细胞或内源产生。此外，设计IL-1α小鼠特异性引物用以识别内源IL-1α，内源IL-1α可能已由侵入的白细胞或肿瘤微环境周围组织产生。因此，两种来源的任意一种IL-1α可能对创造良好的肿瘤微环境是重要的。
使用Trizol(Gibco/BRL Life Technologies，Rockville，MD，USA)按制造商的指导从肿瘤样本中分离总RNA。污染的DNA用无RNase的DNAse去除。1μg DNAse处理的总RNA(或用水作为阴性对照)与lμg寡dT引物在95℃共温育3min，然后在68℃共温育10min。根据Lee等人的方法(Journal of Orthopaedic Research，21(2003)62-72)，将8μl 5×缓冲液、4μlDTT(0.1M)、2μl dNTP(10mM)、lμl RNase抑制剂和lμl superscript逆转录酶加入到每个反应。
实施例4
aIL-1α抗体降低转移发生率
每周两次腹腔内注射PBS、5mg/kg的mahIL-1αb、或5mg/kg的hamIL-1αb与5mg/kg的hamIL-1αb，对携带确定的转移性肿瘤的Nu/nu小鼠进行治疗。使用两组肿瘤携带小鼠，其被皮下注射5×106MDA-MB-436或PC-3肿瘤细胞。从皮下注射肿瘤细胞当日或肿瘤生长至3mm3后开始，每周两次施用抗体。见表1。
表1实验设计与动物数量说明
PBS mahIL-1α+hamIL-1α mahIL-1α hamIL-1α
D1MDA-MB436 6 6 6 6
D1PC-3 6 6 6 6
EstMDA-MB436 6 6 6 6
EstPC-3 6 6 6 6
在处死时对器官上可见的肿瘤集落进行计数。表面肝转移的数量通过检查组织显现肿瘤病灶来测定。膈壁、肠壁及腹腔壁和淋巴结上的转移病灶数量以类似的方式测定。
在乳腺肿瘤模型可见淋巴结中，通过使用mahIL-1α治疗或mahIL-1αb+hamIL-1αb结合治疗，肺和肝转移得到降低。对照处理小鼠百分之百发展成腹水，相反，抗IL-1α处理的小鼠仅有10％形成腹水。在前列腺肿瘤模型中进行类似的观察，其中接受mahIL-1α或mahIL-1αb+hamIL-1αb的小鼠具有降低的转移负荷。在乳腺和前列腺肿瘤模型中，施用hamIL-1αb的小鼠在处死时显示转移没有明显减少。见表2。
表2使用aIL-1α抗体治疗对异种移植肿瘤的控制
D1MDA-MB436 PBS mahIL-1α+hamIL-1α mahIL-1α hamIL-1α
腹水 6(100) 0(0) 1(17) 4(66)
淋巴结 6(100) 1(17) 2(33) 6(100)
腹膜 6(100) 0(0) 1(17) 6(100)
肝脏 6(100) 1(17) 3(50) 6(100)
EstMDA-MB436 PBS mahIL-1α+hamIL-1α mahIL-1α hamIL-1α
腹水 6(100) 0(0) 0(0) 4(66)
淋巴结 6(100) 4(66) 5(83) 6(100)
腹膜 6(100) 3(50) 5(83) 6(100)
肝脏 6(100) 3(50) 5(83) 6(100)
D1PC-3 PBS mahIL-1α+hamIL-1α mahIL-1α hamIL-1α
腹水 6(100) 0(0) 0(0) 3(50)
淋巴结 6(100) 0(0) 3(33) 5(83)
腹膜 6(100) 1(17) 2(33) 6(100)
肝脏 6(100) 0(0) 1(17) 6(100)
EstPC-3 PBS mahIL-1α+hamIL-1α mahIL-1α hamIL-1α
腹水 6(100) 0 0 5(83)
淋巴结 6(100) 3(50) 3(50) 6(100)
腹膜 6(100) 4(66) 2(33) 6(100)
肝脏 6(100) 3(50) 2(33) 6(100)
所有用PBS处理的小鼠在第50天处死，而60天后，aIL-1α处理的小鼠没有死于乳腺或前列腺异种移植肿瘤。靶向肿瘤表达的IL-1α或内源(主要是白细胞)产生的IL-1α的aIL-1α治疗在携带乳腺或前列腺异种移植癌症的小鼠中，降低了转移负荷。靶向肿瘤表达IL-1α的aIL-1α治疗具有统计学上更有效的抗肿瘤作用，而组合的抗肿瘤和抗内源aIL-1α抗体治疗在携带乳腺或前列腺癌的nu/nu小鼠中几乎完全阻止转移性肿瘤生长。见图1。
接受mahIL-1α或hamIL-1α或这两种抗体组合的动物具有降低的临床病程严重性。所有对照动物最终显现出濒死状，需要在研究结束之前处死。与之相反，接受mahIL-1α+hamIL-1α的动物在外表上没有异样，它们是整洁的、活跃的、没有显示痛苦迹象，显示出正常生长和体重增加，并且在整个实验期间所有动物均存活。但是，经过对死后器官仔细的检查，接受抗体组合的小鼠确实显示出可观察到的转移病灶。这在治疗开始前已具有确定的转移性肿瘤的动物中尤其明显。这显示出仅在确定转移病灶形成之后接受治疗的小鼠在随后无法清除所有已确定的病变。但是，在这些被治疗的小鼠中的转移病灶明显被抑制。
可以在用乳腺或前列腺肿瘤接种小鼠和在具有可检测到的转移性疾病时处死动物之后，对这种作用进行分析，其是其中动物接受治疗的疾病的相同过程。在这些小鼠中，转移病灶的多度和大小明显大于在接受mahIL-1α+hamIL-1α组合的动物尸检中所观察到的。这显示出抗体治疗引起已确定的转移疾病的退化。
mahIL-1α+hamIL-1α处理的小鼠，其从肿瘤接种第1天就开始接受抗体注射，几乎完全阻止形成转移。在每个乳腺或前列腺肿瘤组中，只有个别动物(17％)形成转移病灶。
异种移植的人肿瘤用于肿瘤转移的裸小鼠模型。利用表达人IL-1α的人肿瘤，使我们能够尝试治疗小鼠，此种治疗通过靶向以下任一来进行：在肿瘤上表达的人IL-1α、在白细胞上表达的鼠IL-1α(为了简便起见，我们称为内源IL-1产生)；或通过施用两种不同的抗体，同时靶向内源和肿瘤源的IL-1α来进行。这使我们开始在某种程度上将肿瘤源IL-1α在转移中的作用与内源产生的IL-1α(由白细胞浸入或肿瘤微环境组织表达)在转移中的作用相区分。
结果表明，内源和肿瘤源的IL-1α在肿瘤转移中均发挥作用，原因在于针对任一来源IL-1α的抗体均提高小鼠的存活率。但是，针对内源性IL-1α的抗体与靶向肿瘤源的IL-1α的抗体相比，在提供长期存活益处上相当低效，并且不能保护小鼠免于转移。显然，IL-1α从肿瘤本身的表达在这些模型中足以促进转移。
针对肿瘤表达的IL-1α的抗体具有有效的抗肿瘤作用。在接受抗肿瘤IL-1α抗体的动物中意义深远的抗肿瘤作用似乎涉及肿瘤转移中IL-1α的生理阻断(physiologicalblockade)，但也可能涉及抗体的直接杀肿瘤作用。我们预期，使用IgGl抗体靶向肿瘤表达IL-1α可表现在裸小鼠模型中对IL-1α表达肿瘤相当的杀肿瘤作用，其中所使用的IgGl抗体是有效诱导补体结合和抗体介导的细胞毒性(antibody directed cellularcytotoxicity，ADCC)的抗体亚类。但是，如果针对肿瘤源IL-1α抗体的抗肿瘤作用是通过ADCC或其它细胞毒性机制专有地发挥作用，那么将不会有所预期的两种抗体协同作用。也不会预期针对内源IL-1α的抗体会影响存活率；而是与用针对内源IL-1α抗体处理的动物中所见的存活受益相一致，虽然是适度的。从用hamIL-1α抗体靶向抗内源IL-1α中所见的存活受益可以是hamIL-1α与人IL-1α交叉反应，从而直接靶向肿瘤的结果。我们检查了对抗鼠IL-1α抗体的交叉反应性，以评估存活受益是否是该抗体与肿瘤表达IL-1α的交叉反应的直接结果；肿瘤表达的IL-1α诱导肿瘤的ADCC，诱导对肿瘤IL-1α产生的生理性IL-1α阻断，或两者兼而有之。没有与抗体明显的交叉反应性。此外，hamIL-1α抗体不能有效地结合鼠Fc受体，并且不可能诱导有效的ADCC反应。
从裸小鼠异种移植模型中内源和肿瘤表达的IL-1α的不同靶向的结果，我们得出的结论是IL-1α的生理阻断可以减少肿瘤的致死率。抗IL-1α抗体组合的存活受益的协同作用——既针对内源性IL-1α又针对肿瘤源的IL-1α——提供了令人信服的证明：肿瘤和内源性来源的IL-1α在这种模型的肿瘤转移中都是重要的。这些结果也有助于了解其它报告，这些报告表明IL-1α在肿瘤和宿主之间的动态相互作用(dynamic interplay)中发挥生理作用；而且IL-1α的表达可增强肿瘤的转移潜能。
使用单克隆抗体靶向由肿瘤细胞产生的IL-1α是延长存活和降低转移负荷的有效方法。IL-1α表达肿瘤的抗体靶向将在人疾病调整(disease setting)中具有潜在的治疗价值，并可代表了多种形式癌症在疾病早期或晚期有效的治疗目标。
据其它报道，所分析的多达20％的人具有存在于血清的IL-1α中和自身抗体。此外，据报道，这些人在长期观察中是健康的。同样地，IL-1α敲除小鼠没有明显表型(Horai等J.Exp.Med.1998 187:1463-1475)。最后，其它的报道(Svenson等)可用IL-1α对动物进行简单和有效的免疫以诱导出对细胞因子有效的中和抗体反应。这些发现表明主动免疫治疗，如用IL-1α免疫以诱导中和自身抗体，也可能是治疗表达IL-1α的人癌症的有效方法。
实施例5
材料和方法
用ELISA测量抗IL-lα抗体效价
人或鼠IL-lα分别在96孔ELISA板上温育过夜，每孔用0.5μg/ml 100μl体积的量。板随后用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)+0.05％吐温20(Tween 20)洗涤4次，然后用封闭液进行饱和，所述封闭液含有在PBS+0.05％吐温20中的1％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)。在室温下，每孔使用200μl这种封闭缓冲液1-2小时。然后用PBS+0.05％Tween 20(PBST)再洗涤板4次。100ml连续稀释的血清样品(在PBST+1％BSA中1:2稀释)随后加入，并在室温下温育一小时或4℃温育过夜。然后再次用PBST洗涤板4次。然后加入辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidise，HRP)偶联的抗Fc-抗体作为二抗(在具有1％BSA的PBST中1:2000稀释，每孔加100μl，1小时，室温)。人：0.2μl山羊抗人IgG-HRP在400μl PBST+1％BSA中。小鼠：0.5μl HRP山羊抗小鼠IgG(H+L)。然后，板再次用PBST洗涤4次。用ABTS缓冲液(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，Sigma目录号A-1888，150mg；0.1M柠檬酸，Fisher anhydrous，目录号A-940，500毫升；用NaOH颗粒将pH值调节到4.35，每瓶11ml等分样品并保存在-20℃，40％SDS(80g SDS溶于200ml dd H2O)中，并添加200ml DMF(N,N-二甲基甲酰胺))进行显色反应(coloring reaction)。向每个孔加100μl ABTS缓冲液。当良好对比度可见时，通过加入100μl 2％草酸溶液停止反应。然后，用ELISA读数器在405nm波长下测量光密度。
在肿瘤攻击中监测动物
动物健康通过监测如下指标来记录：外表、食物和水的摄入量、自然行为以及挑衅行为(provoked behaviour)，使用以下评分系统：分数0：没有偏离正常；分数1：轻度偏离正常；分数2：中等偏离正常；分数3：重大偏离正常。如果分数3多于一次，则每次另加1分，最高分数为15分。分数0-3：正常。分数4-7：仔细监测。分数8-15：动物患病。动物被处以安乐死。当体重减轻15％以上或体温下降超过3.0℃时，动物也被处以安乐死。
肿瘤细胞系
EL-4细胞从American Type Culture Collection(ATCC，Manassas VA，USA)获得。EL-4源于在C57BL/6小鼠中用9,10-二甲基-1,2-苯并蒽诱导的淋巴瘤。细胞培养于Dulbecco的改良Eagle培养基，该培养基用4mM L-谷氨酰胺调整到含有1.5g/L碳酸氢钠和4.5g/L葡萄糖，90％；胎牛血清，10％。
PC-3细胞从American Type Culture Collection(ATCC，Manassas VA，USA)获得。PC-3细胞系最初来自62岁男性白种人IV级前列腺癌的骨转移。该细胞系用Ham的F12K培养基生长，该培养基用2mM L-谷氨酰胺调整到含有1.5g/L碳酸氢钠，90％；胎牛血清，10％。
用与PPD偶联的IL-1α和IL-1b免疫小鼠
IL-1α和IL-1β从eBioscience(San Diego，CA)获得。PPD从Statens SerumInstitute(Copenhagen，Denmark)获得。偶联方法改编自Svenson等(Svenson M.2000)。IL-1α或IL-1b在4℃与PPD以0.41(w/w)的比例并且在0.1％戊二醛存在下温育48小时(IL-l/PPD＝0.41)。作为对照，PPD被平行处理，但不含IL-1α或IL-1β。偶联物随后被吸附到Al(OH)3(Rehydragel；Reheis Chemical，Dublin，Ireland)，以使终体积中具有1.5％的Al(OH)3。与明矾在室温下温育90分钟。颗粒随后用0.9％NaCl洗涤，并将其重悬在0.9％NaCl中，达到11μg IL-1α/100μl悬液，假设70％IL-1α被吸附到Al(OH)3(使用125I-IL-1α在实验性研究中发现)。IL-1β偶联物以同样方式制备。对照悬液同样地稀释以匹配IL-lα-PPD偶联物中PPD的量。该偶联物储存在4℃备用。
实施例6
C57BL/6小鼠中抗IL-1α抗体反应的产生
然而，由于免疫系统对自身蛋白质如细胞因子的耐受，所以这种主动免疫必须打破自身耐受性。对大多数自身蛋白来说，免疫耐受是由于缺乏特异性T细胞——这是胸腺中负选择的结果——引起的。相反，潜在的自身反应B细胞通常存在。当仅注射像IL-lα这样的自身蛋白时，由于缺乏T细胞的帮助，这些B细胞不会应答。将一种外源蛋白，如PPD，与自身抗原IL-1α偶联，就提供了T细胞对B细胞刺激的帮助，因为T细胞识别PPD，导致受刺激的B细胞针对IL-1α和PPD产生抗体。因此，我们用明矾中的IL-1α-PPD偶联物接种小鼠，以确保T细胞对IL-1β-特异性B细胞产生有效的帮助。抗体效价用ELISA测定。5只小鼠的组接受用15μg偶联至10μg PPD的重组IL-1α进行的皮下免疫，该偶联采用与戊二醛温育的步骤进行。IL-1α-PPD偶联物随后吸附到明矾。小鼠接受三次这样的皮下免疫，时间间隔为2周。
免疫的小鼠产生高效价的抗IL-1α抗体，而用明矾中的PPD免疫的对照小鼠未能诱导出可检测到的抗体效价(图2)。抗IL-1α抗体的诱导需要至少2次注射。在仅仅注射一次明矾中的重组IL-1α-PPD偶联物之后，在血清中检测不到抗体反应。但在用明矾中的重组IL-lα-PPD偶联物第三次注射后，所有接种的小鼠都产生抗IL-1α抗体。
实施例7
对IL-1α的主动免疫保护小鼠对抗用EL-4的肿瘤攻击
在第0天、第14天和第28天，通过在颈部区域皮下给药，使用在明矾中与10μg PPD偶联的15μg鼠IL-1α三次注射，对C57BL/6小鼠进行主动免疫。注射体积为100μl，氢氧化铝的量为约1mg。对照小鼠进行类似处理，但是使用含有相同量的PPD和氢氧化铝，但不包含IL-1α的制品。在第0、28、42和56天，从尾静脉血液取样，以便用ELISA确定抗IL-1α抗体反应的形成。首次免疫56天后，所有小鼠接受1000个EL-4淋巴瘤细胞的接种物。随后，在接下来的四周每天观察小鼠。在首次出现疾病症状时，小鼠处以安乐死，进行肿瘤生长和转移的肉眼和组织学定量。
在肿瘤攻击后的30天内，因肿瘤发展对照小鼠显示出疾病症状，这被内脏器官中散布的肉眼可见的转移所证实。与之相反，对IL-1α主动免疫的小鼠没有显示出疾病的临床症状。
实施例8
对IL-1α的被动免疫防止小鼠淋巴瘤EL-4
使用明矾中的IL-1α-PPD偶联物三次皮下注射，对C57BL/6小鼠进行对IL-1α的主动免疫。56天后，收集它们的血清，并用ELISA确定抗IL-1α自身抗体效价的产生。200μl这种血清被动转移至6周龄的C57BL/6小鼠。每周重复这些被动血清转移。对照C57BL/6小鼠以周为间隔接受200μl来自未用过C57BL/6小鼠的血清。与首次血清转移一起，所有小鼠接受1000个EL-4淋巴瘤细胞的接种物。随后，在接下来的四周每天观察小鼠。在首次出现疾病症状时，小鼠处以安乐死，进行肿瘤生长和转移的肉眼和组织学定量。
30天内，对照小鼠死于肿瘤，这被内脏器官中散布的肉眼可见的转移证实。与之相反，接受多克隆抗IL-1α抗血清被动血清转移的小鼠没有显示出疾病的临床症状。
实施例9
对IL-1α的被动免疫保护SCID小鼠对抗PC-3异种移植肿瘤
使用明矾中IL-1α-PPD偶联物三次皮下注射，对C57BL/6小鼠进行对IL-1α的主动免疫。56天后，收集它们的血清，并用ELISA确定抗IL-1α自身抗体效价的产生。200μl这种血清被动转移至6周龄的雌性SCID小鼠。每周重复这些被动血清转移。对照SCID小鼠以周为间隔接受来自未用过C57BL/6小鼠的200μl血清。与首次血清转移一起，所有小鼠接受107PC-3细胞的皮下接种物至侧腹。每周鉴定带有可触摸到肿瘤的小鼠。
30天内，对照小鼠在接种部位已形成为可触摸到的肿瘤，然而，接受多克隆抗IL-1α抗血清被动血清转移的小鼠没有形成可触摸到的肿瘤。
实施例10
ADCK-抗体依赖性补体介导杀伤
使用明矾中的IL-1α-PPD偶联物三次皮下注射，对C57BL/6小鼠进行对IL-1α的主动免疫。56天后，收集它们的血清，并用ELISA确定抗IL-1α自身抗体效价的产生。热灭活血清。50μl EL-4细胞悬液被铺入96孔板。向这些孔的每一个中加入15μl的热灭活血清的1:2连续稀释液。然后在37℃温育板20分钟。随后将25ml鼠血清加入每个孔。在37℃下另外温育5h后，对孔进行拍照，随后使用台盼蓝将死细胞与活细胞区分，在计数室对细胞进行计数。
EL-4肿瘤细胞的多克隆小鼠抗小鼠IL-1α抗血清介导的补体依赖性杀伤为浓度依赖方式。见图3。

Claims (5)

1.抗IL-1α抗体在制备用于增加患有转移癌的哺乳动物患者的存活率的药物中的应用，其中所述抗IL-1α抗体靶向通过所述哺乳动物对象的白细胞表达的内源IL-1α。
2.权利要求1所述的应用，其中所述转移癌是乳腺癌。
3.权利要求1所述的应用，其中所述转移癌是前列腺癌。
4.权利要求1所述的应用，其中所述转移癌是实体组织的癌症。
5.权利要求4所述的应用，其中所述实体组织的癌症是膀胱癌、骨癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、食道癌、肾癌、肝癌、胰腺癌或胃癌。
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