[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

JP7515396B2 - プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む動物用飼料添加物及びその使用 - Google Patents

プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む動物用飼料添加物及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP7515396B2
JP7515396B2 JP2020512477A JP2020512477A JP7515396B2 JP 7515396 B2 JP7515396 B2 JP 7515396B2 JP 2020512477 A JP2020512477 A JP 2020512477A JP 2020512477 A JP2020512477 A JP 2020512477A JP 7515396 B2 JP7515396 B2 JP 7515396B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
polypeptide
animal feed
protease
sequence identity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2020512477A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2020531037A (ja
Inventor
トビーゼブレンク ホー レアゲ
ホフ ティーネ
ラーベク ウスタゴー ピーダ
Original Assignee
ノボザイムス アクティーゼルスカブ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ノボザイムス アクティーゼルスカブ filed Critical ノボザイムス アクティーゼルスカブ
Publication of JP2020531037A publication Critical patent/JP2020531037A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7515396B2 publication Critical patent/JP7515396B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
    • A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/174—Vitamins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K40/00—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs
    • A23K40/10—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs by agglomeration; by granulation, e.g. making powders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
    • A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21062—Subtilisin (3.4.21.62)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/30—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/30—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for swines

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

配列リストの参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれるコンピューター可読形式の配列リストを含有する。
本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む動物用飼料又は動物用飼料添加物及びその使用に関する。本発明は、プロテアーゼを生成する方法並びにプロテアーゼを用いて動物の性能及び動物用飼料の栄養価を向上させる方法にも関する。
動物用飼料中でのプロテアーゼの（インビボ）使用及び／又はそのようなプロテアーゼの、植物性タンパク質を（インビトロ）処理するための使用時、タンパク質は、動物及びヒトに必須の栄養因子であることに留意する必要がある。ほとんどの家畜及び多くのヒトは、必須タンパク質を植物性タンパク質源から得ている。重要な植物性タンパク質源は、例えば、油糧種子作物、豆類及び穀物である。
ダイズミール等のタンパク質源が単胃動物、例えばブタ及び家禽の飼料に含まれる場合、ダイズミールの大部分は、効率的に消化されない（子ブタ、成長期ブタ並びに家禽、例えばブロイラー、産卵鶏及び雄鶏における見掛けの回腸窒素消化率は、およそ８０％のみである）。タンパク質の消化率を向上させることにより、動物は、タンパク質をより吸収することによって性能、例えば体重増加の増大を向上させることができる。
動物の消化管は、それぞれが異なるｐＨ環境を示す一連のセグメントからなる。単胃動物、例えばブタ及び家禽並びに魚の多くの種類において、胃は、強く酸性であり、ｐＨが潜在的に２～３もの低さである一方、腸管は、ｐＨがより中性であり、およそ６～７．５である。胃及び腸管を別として、家禽は、素嚢も胃に先行して有する。素嚢中のｐＨは、ほとんどの場合、摂取される飼料によって決定されるため、典型的にｐＨ４～６の範囲にある。プロテアーゼによるタンパク質消化が消化管の全体に沿って起こり得るが、プロテアーゼが活性であり、且つ消化管内の条件を生き残る場合に限られる。そのため、高度に酸安定性であり、胃環境内で生き残ることができると同時に、標的動物内の消化管の広範囲の生理学的ｐＨにおいて効率的に活性であるプロテアーゼがとりわけ所望される。
プロテアーゼがタンパク質の吸収を向上させることができるかを判定する一方法として、プロテアーゼが動物用食餌に加えられた場合に回腸窒素消化率が向上するかを調査することによるものがある。インビボ治験のランにより、プロテアーゼの胃安定性及びプロテアーゼの、タンパク質分解の有効性の両方を確認することができる。本発明の目的は、例えば、見掛けの回腸窒素消化率により、成長性能の向上の増大を示すプロテアーゼを提供することである。
本発明は、プロテアーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを含む動物用飼料添加物であって、ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｂ）配列番号２と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｃ）配列番号３と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｄ）配列番号４と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｅ）配列番号５と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｆ）配列番号６と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｇ）配列番号７と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｈ）配列番号８と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｉ）配列番号９と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｊ）配列番号１の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｋ）配列番号２の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｌ）配列番号３の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｍ）配列番号５の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｎ）配列番号６の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｏ）配列番号７の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｐ）配列番号８の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｑ）配列番号９の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｒ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のポリペプチド並びにＮ末端及び／又はＣ末端のＨｉｓ－タグ及び／又はＨＱ－タグを含むポリペプチドと；
（ｓ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のポリペプチド並びに最大１０個のアミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸のＮ末端及び／又はＣ末端伸長を含むポリペプチドと；
（ｔ）プロテアーゼ活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも９０％を有する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択されるＳ８プロテアーゼである、動物用飼料添加物に関する。
本発明は、動物用飼料添加物を含む動物用飼料及び液体製剤；動物用飼料添加物を用いて、動物の１つ以上の性能パラメータを向上させる方法；動物用飼料を調製する方法；タンパク質を処理する方法；タンパク質の消化率及び／又は可溶性を増大させる方法、並びに動物用飼料の栄養価を向上させる方法、並びにそれらの使用にさらに関する。本発明は、組換えバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属宿主細胞内で本発明のポリペプチドを生成する方法にさらに関する。
本発明は、本発明の動物用飼料添加物又は液体製剤の、動物用飼料に用いる組成物の調製における、動物用飼料の栄養価を向上させるための；消化可能な且つ／若しくは可溶性のタンパク質を動物用飼料中で増大させるための；動物用食餌中でのタンパク質の加水分解の程度を増大させるための；動物において１つ以上の性能パラメータを向上させるための；及び／又はタンパク質を処理するための使用にさらに関する。
配列リストの概要
配列番号１は、バチルス・ホルネキアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｎｅｃｋｉａｅ）由来の成熟Ｓ８プロテアーゼのアミノ酸配列である。
配列番号２は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種ＴＹ１４５由来の成熟Ｓ８プロテアーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種ＴＹ１４５由来の変異Ｓ８プロテアーゼのアミノ酸配列である。
配列番号４は、保存モチーフＴＧＸＫ［Ｖ／Ｔ］［Ｉ／Ｖ］Ｘ［Ｎ／Ｓ］ＭＳＬＧである。
配列番号５は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種１３３８０由来の成熟Ｓ８プロテアーゼのアミノ酸配列であり（国際公開第２０１７０６４２５３号パンフレットにも開示されている）、配列番号１とおよそ７８％の同一性を有する。
配列番号６は、バチルス・イドリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｄｒｉｅｎｓｉｓ）由来の成熟Ｓ８プロテアーゼのアミノ酸配列であり（国際公開第２０１５０９１９８９号パンフレットにも開示されている）、配列番号１と８０％の同一性を有する。
配列番号７は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種１３３８０由来の成熟Ｓ８プロテアーゼのアミノ酸配列であり（国際公開第２０１５０９１９８９号パンフレットにも開示されている）、配列番号１と８９％の同一性を有する。
配列番号８は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種６２４５１由来の成熟Ｓ８プロテアーゼのアミノ酸配列であり（国際公開第２０１５０９１９８９号パンフレットにも開示されている）、配列番号１と９０％の同一性を有する。
配列番号９は、バチルス・オセアニセディミニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｃｅａｎｉｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）由来の成熟Ｓ８プロテアーゼのアミノ酸配列であり、配列番号１と８７％の同一性を有する。
配列番号１０は、バチルス・オセアニセディミニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｃｅａｎｉｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）由来のＳ８プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列である。
定義
ダイズ－トウモロコシミールに及ぼすポリペプチドの活性：用語「ダイズ－トウモロコシミールに及ぼすポリペプチドの活性」は、酵素のプロテアーゼ活性を、本明細書に記載されるように、ｏ－フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）アッセイを用いて、３０：７０の比率で混合したダイズミール－トウモロコシミールで求めたことを意味する。アッセイｐＨ値の例は、ｐＨ３．０、４．０、５．０、６．０及び７．０である。アッセイ温度の例は、３０、３５、４０、４５及び５０℃である。アッセイ時間の例は、２、３及び４時間である。酵素濃度の例は、酵素タンパク質５０、１００、１５０、２００、２５０及び３００ｍｇ／ｋｇ基質乾物である。
好ましい実施形態において、ダイズミール－トウモロコシミールを３０：７０の比率で混合（２ｇ）して、１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＰＳ、１２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（１０ｍＬ）を含有するバッファ（ダイズ－トウモロコシミール基質をアッセイバッファと混合した後、スラリーの最終ｐＨがｐＨ３．０、４．０、５．０、６．０又は７．０となるようなｐＨ値にＨＣｌ又はＮａＯＨを用いて調製又は調整した）に加えてから、基質スラリーのアリコート（２ｍＬ）を４０℃において３０分間混合して、１００μｌ １００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（９．５６５ｇ／Ｌ ＮａＯＡｃ、１．７５ｇ／Ｌ酢酸、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０１％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）中に溶解したプロテアーゼ（２００ｍｇ酵素タンパク質／ｋｇ基質）を加えて、サンプルを４０℃において３時間インキュベート（磁気撹拌）して、サンプルを遠心分離（１０分、４０００ｒｐｍ、０℃）して、ｏ－フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）アッセイ（本明細書では「ダイズ－トウモロコシミールアッセイ」と呼ぶ）を用いて分析のための上清を収集することにより、ダイズ－トウモロコシミールに及ぼすポリペプチドの活性を求めた。別の好ましい実施形態において、ダイズ－トウモロコシミールに及ぼすポリペプチドの活性を本明細書で実施例４に記載されるように求める。
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドとしてｐＨ４においてダイズ－トウモロコシミールに及ぼす活性の少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％を有する。
対立遺伝子変異体：用語「対立遺伝子変異体」は、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然に生じて、集団内に多型をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレント（コードされるポリペプチド中で不変）であり得るか、又はアミノ酸配列が変更されたポリペプチドをコードし得る。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるポリペプチドである。
動物：用語「動物用飼料」は、ヒト以外の全ての動物に言及する。動物の例として、非反芻動物及び反芻動物がある。反芻動物として、例えば動物、例えばヒツジ、ヤギ、ウシ、例えば肉牛、乳牛及び仔牛、シカ、ヤンク、ラクダ、ラマ並びにカンガルーが挙げられる。非反芻動物として、単胃動物、例えばブタ又はイノシシ（以下に限定されないが、子ブタ、成長期ブタ及び雌ブタが挙げられる）；家禽、例えばシチメンチョウ、カモ及びニワトリ（以下に限定されないが、ブロイラー雛、産卵鶏が挙げられる）；ウマ（以下に限定されないが、熱血種、冷血種及び温血種が挙げられる）、仔牛；魚（以下に限定されないが、アンバージャック、ピラルクー、バルブ、バス、ブルーフィッシュ、ボカチコ、ブリーム、ブルヘッド、カチャマ、コイ、ナマズ、カトラ、サバヒー（ｃｈａｎｏｓ）、チャー、シクリッド、スギ、タラ、クラッピー、ドラド、ドラム、ウナギ、ハゼ、キンギョ、グーラミ、ハタ、グァポーテ、オヒョウ、ジャワ、ラベオ、イケカツオ、ドジョウ、サバ、ミルクフィッシュ、クロサギ、マッドフィッシュ、ボラ、パコ、パールスポット、ペヘレイ、パーチ、カワカマス、コバンアジ、ローチ、サケ、ヒゲナガヒレナマズ（ｓａｍｐａ）、ソーガー、シーバス、タイ、シャイナー、スリーパ、スネークヘッド、フエダイ、アカメ、シタビラメ、アイゴ、チョウザメ、マンボウ、アユ、テンチ、テラー、テラピア、マス、マグロ、ターボット、シロマス、ウォールアイ及びホワイトフィッシュが挙げられる）；並びに甲殻類（以下に限定されないが、小エビ及びクルマエビが挙げられる）が挙げられる。
動物用飼料：用語「動物用飼料」は、動物による摂取に適した又は動物による摂取が意図されるあらゆる化合物、調製物又は混合物に言及する。単胃動物のための動物用飼料は、典型的に、濃縮物並びにビタミン、ミネラル、酵素、直接供与微生物、アミノ酸及び／又は他の飼料成分を（例えば、プレミックス中に）含むが、反芻動物のための動物用飼料は、通常、飼草（粗飼料及びサイレージが挙げられる）を含み、且つ濃縮物並びにビタミン、ミネラル、酵素、直接供与微生物、アミノ酸及び／又は他の飼料成分を（例えば、プレミックス中に）さらに含み得る。
体重増加：用語「体重増加」は、所与の期間中における動物の生体重の増加、例えば１日目から２１日目までの体重の増加を意味する。
ｃＤＮＡ：用語「ｃＤＮＡ」は、真核細胞又は原核細胞から得られるスプライスされた成熟ｍＲＮＡ分子から逆転写によって調製され得るＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡに存在し得るイントロン配列を欠く。初期の一次ＲＮＡ転写物は、スプライスされた成熟ＲＮＡとして生じる前の、スプライシングを含む一連のステップを通してプロセシングされるｍＲＮＡに対する前駆体である。
コード配列：用語「コード配列」は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接指定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般に、ＡＴＧ、ＧＴＧ又はＴＴＧなどの開始コドンで始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡなどの終止コドンで終わるオープンリーディングフレームによって決定される。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はこれらの組合せであり得る。
組成物：用語「組成物」は、キャリア及び本発明の少なくとも１つの酵素を含む組成物を指す。本明細書に記載される組成物は、動物用飼料と混合され得、「マッシュ飼料」と呼ばれる場合がある。
濃縮物：用語「濃縮物」は、魚粉、糖蜜、オリゴ糖、モロコシ、種子及び穀物（全体又は例えばトウモロコシ、カラスムギ、ライムギ、オオムギ、コムギから破砕、粉砕などによって作製される）、脂肪種子油かす（例えば、綿実、ベニバナ、ヒマワリ、ダイズ、ナタネ／キャノーラ、ピーナッツ又は塊茎から）、パームカーネルケーキ、酵母由来材料及び蒸留穀物（未乾燥の蒸留穀物（ＷＤＳ）及び可溶成分を含む乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）など）などの高タンパク質並びに高エネルギー濃縮物を有する飼料を意味する。
制御配列：用語「対照配列」は、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して天然（すなわち同じ遺伝子由来）若しくは外来（すなわち異なる遺伝子由来）又は互いに対して天然若しくは外来のものであり得る。このような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列及び転写ターミネータが挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列は、プロモータ並びに転写及び翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域と制御配列とのライゲーションを促進する特定の制限部位を導入するためにリンカーと共に提供され得る。
ヨーロッパ生産有効性指数（ＥＰＥＦ）：用語「ヨーロッパ生産有効性指数」は、生産効率を決定し、且つ飼料転換、死亡率及び毎日の増加を考慮する一用語である。ＥＥＦは、［（生存率（％）×体重増加（ｋｇ））／（研究期間日数×ＦＣＲ）］×１００として算出される。
発現：用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌を含むが、これらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含む。
発現ベクター：用語「発現ベクター」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、且つその発現を提供する制御配列に作動可能に連結される線状又は環状のＤＮＡ分子を意味する。
飼料転換比：用語「飼料転換比」は、指定された量による、動物の体重を増大させるために動物に与えられる飼料の量である。飼料転換比の向上は、より低い飼料転換比を意味する。「より低い飼料転換比」又は「飼料転換比の向上」とは、飼料への飼料添加組成物の使用により、指定された量による、動物の体重を増大させるために動物に与えられるのに必要とされる飼料の量が、飼料が前記飼料添加組成物を含まない場合の、同じ量による、動物の体重を増大させるのに必要とされる飼料の量と比較してより低くなることを意味する。
飼料効率：用語「飼料効率」は、動物が自由摂食又は期間中に指定量の飼料で給餌されるときの単位飼料あたりの体重増加の量を意味する。「飼料効率の上昇」により、飼料において本発明による飼料添加物組成物の使用が、存在している前記飼料添加物組成物がない状態で給餌される動物と比較して単位飼料摂取量あたりの体重増加の上昇をもたらすことが意味される。
飼草：本明細書で定義される用語「飼草」は、粗飼料を含む。飼草は、飼草植物、牧草及び他の飼草植物の乾草並びにサイレージ、海藻、発芽した穀物並びにマメ科植物又はこれらの任意の組合せなどの新鮮な植物材料である。飼草植物の例は、アルファルファ（ルツェルン）、ミヤコグサ、アブラナ属（ｂｒａｓｓｉｃａ）（例えば、ケール、ナタネ（キャノーラ）、ルタバガ（カブハボタン）、カブ）、クローバー（例えば、タチオランダゲンゲ、ムラサキツメクサ、ジモグリツメクサ、シロツメクサ）、牧草（例えば、バミューダグラス、スズメノチャヒキ、オオカニツリ、フェスク属（ｆｅｓｃｕｅ）、ヒースグラス、ナガハグサ、カモガヤ、ドクムギ、チモシー牧草）、コーン（トウモロコシ）、キビ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、モロコシ、ダイズ及びコムギ並びにビートなどの野菜である。飼草は、穀物生産（トウモロコシ茎葉；コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ及び他の穀物のわらなど）からの農作物の残余、ビートトップのような野菜の残余；ダイズ、ナタネ及び他のマメ科植物の茎及び葉のような脂肪種子生産の残余；並びに動物若しくはヒトの消費のための穀物の精製からの又は燃料生産若しくは他の産業からの画分をさらに含む。
断片：用語「断片」は、成熟ポリペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端で欠けている１つ以上（例えば、数個）のアミノ酸を有するポリペプチドを意味し、断片は、プロテアーゼ活性を有する。
一態様において、断片は、成熟ポリペプチドの長さの少なくとも９０％、例えば配列番号１の少なくとも２８３個のアミノ酸、配列番号２の少なくとも２７９個のアミノ酸又は配列番号３の少なくとも２７９個のアミノ酸を含む。
一態様において、断片は、成熟ポリペプチドの長さの少なくとも９２％、例えば配列番号１の少なくとも２９０個のアミノ酸、配列番号２の少なくとも２８６個のアミノ酸又は配列番号３の少なくとも２８６個のアミノ酸を含む。
一態様において、断片は、成熟ポリペプチドの長さの少なくとも９４％、例えば配列番号１の少なくとも２９５個のアミノ酸、配列番号２の少なくとも２９２個のアミノ酸又は配列番号３の少なくとも２９２個のアミノ酸を含む。
一態様において、断片は、成熟ポリペプチドの長さの少なくとも９６％、例えば配列番号１の少なくとも３０１個のアミノ酸、配列番号２の少なくとも２９８個のアミノ酸又は配列番号３の少なくとも２９８個のアミノ酸を含む。
一態様において、断片は、成熟ポリペプチドの長さの少なくとも９８％、例えば配列番号１の少なくとも３０８個のアミノ酸、配列番号２の少なくとも３０４個のアミノ酸又は配列番号３の少なくとも３０４個のアミノ酸を含む。
一態様において、断片は、成熟ポリペプチドの長さの少なくとも９９％、例えば配列番号１の少なくとも３１１個のアミノ酸、配列番号２の少なくとも３０７個のアミノ酸又は配列番号３の少なくとも３０７個のアミノ酸を含む。
宿主細胞：用語「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物又は発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、トランスダクションなどを受けやすい任意の細胞型を意味する。用語「宿主細胞」は、複製中に起こる変異に起因して親細胞と同一でない親細胞の任意の後代を包含する。
見掛けの回腸窒素消化率：用語「見掛けの回腸窒素消化率」（又はＡＩＤＮ）は、小腸管の終端（回腸）での乾物の見掛けの消失を考慮したときの、回腸消化物と飼料との窒素濃度の差のパーセンテージである。ＡＩＤＮは、小腸管内因性タンパク質の放出を考慮しない、小腸管粗化合物タンパク質消化率の推定値として用いられる。これは、粗タンパク質の真の消化率が常にＡＩＤＮと比較してより大きいことを意味する。ＡＩＤＮの増大は、アミノ酸の小腸管吸収の増大と概して相関しており、動物の性能の向上のマーカーである。見掛けの回腸窒素消化率（ＡＩＤＮ）は、以下の式を用いて算出される。
ＡＩＤＮ（％）＝１００－［（ＣＭｆ／ＣＭｅ）×（ＣＮｅ／ＣＮｆ）］×１００
式中、
ＣＭｆ＝飼料中のマーカーの濃度；ＣＭｅ＝回腸消化物中のマーカーの濃度；
ＣＮｆ＝飼料中の栄養素の濃度；ＣＮｅ＝回腸消化物中の栄養素の濃度。
用語「陰性対照と比較して回腸窒素消化率が少なくともｘ％（例えば、４％）向上させる」は、陰性対照（すなわち同じ飼料であるが、プロテアーゼを食餌に加えていない）についての見掛けの回腸窒素消化率のパーセンテージがｙ％（例えば、７５％）であれば、プロテアーゼを有する群についての見掛けの回腸窒素消化率のパーセンテージが少なくともｙ％＋ｘ％（すなわちこの例では＞７９％）であることを意味する。
単離された：用語「単離された」は、天然に存在しない形態又は環境における物質を意味する。単離された物質の例としては、（１）天然に存在しない任意の物質、（２）限定されるものではないが、任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド若しくは補因子を含む、天然で会合している天然に存在する成分の１つ以上又は全てから少なくとも部分的に取り出された任意の物質；（３）天然に見出される物質に対して人間の手により修飾された任意の物質；又は（４）天然で会合している他の成分に対する物質の量の増加（例えば、宿主細胞中の組換え体産生；物質をコードする遺伝子の多重コピー；及び物質をコードする遺伝子と天然で会合しているプロモータよりも強力なプロモータの使用）により修飾された任意の物質が挙げられる。
成熟ポリペプチド：用語「成熟ポリペプチド」は、翻訳及びＮ末端プロセシング、Ｃ末端短縮化、グリコシル化、リン酸化などの任意の翻訳後修飾後の最終形態のポリペプチドを意味する。一態様において、成熟ポリペプチドは、ＥＤＭＡＮ Ｎ末端配列決定データ及びインタクトＭＳデータに基づいて配列番号１のアミノ酸１～３１４である。一態様において、成熟ポリペプチドは、ＥＤＭＡＮ Ｎ末端配列決定データ及びインタクトＭＳデータに基づいて配列番号２のアミノ酸１～３１１である。一態様において、成熟ポリペプチドは、ＥＤＭＡＮ Ｎ末端配列決定データ及びインタクトＭＳデータに基づいて配列番号３のアミノ酸１～３１１である。
宿主細胞が、同じポリヌクレオチドによって発現される２つ以上の異なる成熟ポリペプチド（すなわち異なるＣ末端及び／又はＮ末端アミノ酸を有する）の混合物を生成する場合があることが当技術分野で知られている。異なる宿主細胞がポリペプチドを別様にプロセシングし、それにより、ポリヌクレオチドを発現するある宿主細胞が、同じポリヌクレオチドを発現する別の宿主細胞と比較して異なる成熟ポリペプチド（例えば、異なるＣ末端及び／又はＮ末端アミノ酸を有する）を産生する場合があることも当技術分野で知られている。
核酸構築物：用語「核酸構築物」は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又はそうでなければ天然に存在しないであろう様式の核酸のセグメントを含有するように修飾されるか又は合成的である、１つ以上の制御配列を含む一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸分子を意味する。
～から得られるか又は入手可能な：用語「～から得られるか又は入手可能な」は、ポリペプチドを特定の分類上の階級由来の生物中に見出し得ることを意味する。一実施形態において、ポリペプチドは、バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目から得られるか又は入手可能である。ここで、用語目は、分類上の階級である。別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科、プラノコッカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科又はパエニバチラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科から得られるか又は入手可能である。ここで、用語科は、分類上の階級である。別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属から得られるか又は入手可能である。ここで、用語属は、分類上の階級である。
ポリペプチドの分類学上のランクが知られていない場合、それは、ポリペプチドのＢＬＡＳＴＰ検索（例えば、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のウェブサイト － ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を使用する）を実施し、それを最も近縁のホモログと比較することにより、当業者により容易に決定することができる。既知のポリペプチドの断片である未知のポリペプチドは、同じ分類学上の種のものであると見なされる。最大１０カ所で置換、欠失及び／又は挿入を含む未知の天然ポリペプチド又は人工変異体は、既知のポリペプチドと同じ分類学上の種のものであると見なされる。
作動可能に連結される：用語「作動可能に連結される」は、制御配列が、コード配列の発現を誘導するようにポリペプチドのコード配列に対して適切な位置に置かれる配置を意味する。
ペレット：用語「ペレット」及び／又は「ペレット化」は、固体の丸い、球形の、且つ／又は円筒状のタブレット又はペレット並びにそのような固体の形状、特に飼料ペレット及び固体の押し出された動物用飼料を形成するプロセスに言及する。本明細書で用いられる用語「押出し」又は「押出成形」は、当技術分野において周知の用語であり、本明細書に記載される組成物を圧力下でオリフィスに強制的に通過させるプロセスを指す。
性能パラメータ：用語「性能パラメータ」は、体重増加、ヨーロッパ生産効率指数（ＥＰＥＦ）、ヨーロッパ生産有効性指数（ＥＦＦ）及びＦＣＲからなるリストから選択される用語の１つ以上を意味する。用語「１つ以上の性能パラメータの向上」は、１つ以上の動物の体重増加の増大、ヨーロッパ生産効率指数（ＥＰＥＦ）の増大、ヨーロッパ生産有効性指数（ＥＦＦ）の増大及び／又はＦＣＲの低下があることを意味する。
プロテアーゼ：用語「プロテアーゼ」は、本明細書では、ペプチド結合を加水分解する酵素と定義される。プロテアーゼとして、ＥＣ３．４酵素群（その１３のサブクラスをそれぞれ含む（ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃａｔｅｇｏｒｙ：ＥＣ＿３．４））に属するあらゆる酵素が挙げられる。ＥＣ番号は、ＮＣ－ＩＵＢＭＢ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＥｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３：１－５（１９９４）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：１－６（１９９５）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７：１－５（１９９６）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５０：１－６（１９９７）；及びＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６４：６１０－６５０（１９９９）中にそれぞれ公開されている補足１～５を含む）を参照する。用語「スブチラーゼ」は、Ｓｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ．４：７１９－７３７及びＳｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：５０１－５２３に従うセリンプロテアーゼのサブグループに言及する。セリンプロテアーゼ又はセリンペプチダーゼは、活性部位内において、基質と共有結合付加物を形成するセリンを有することによって特徴付けられるプロテアーゼのサブグループである。さらに、スブチラーゼ（及びセリンプロテアーゼ）は、セリンの他に２つの活性部位アミノ酸残基、すなわちヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基を有することによって特徴付けられる。スブチラーゼは、６つの下位区分、すなわちスブチリシンファミリー、テルミターゼファミリー、プロテイナーゼＫファミリー、ランチビオティックペプチダーゼファミリー、ケキシン（Ｋｅｘｉｎ）ファミリー及びピロリシン（Ｐｙｒｏｌｙｓｉｎ）ファミリーに分けることができる。
プロテアーゼ活性：用語「プロテアーゼ活性」は、タンパク質分解活性を意味する（ＥＣ３．４）。プロテアーゼ活性を有するポリペプチド又はプロテアーゼは、ときにペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ペプチドヒドロラーゼ又はタンパク質分解酵素とも呼ばれる。プロテアーゼは、エキソ型（そのいずれかの末端から始まってペプチドを加水分解する）であり得るか、又はエンド型（ポリペプチド鎖内で内部的に作用する（エンドペプチターゼ））であり得る。エンドペプチターゼは、対象のプロテアーゼの特異性に関連する、Ｎ末端でブロックされたペプチド基質及びＣ末端でブロックされたペプチド基質に及ぶ活性を示す。
いくつかのプロテアーゼ活性型があり、例えばＡｒｇ残基及びＬｙｓ残基のカルボキシ末端側でのトリプシン様プロテアーゼ切断及び疎水性アミノ酸残基のカルボキシ末端側でのキモトリプシン様プロテアーゼ切断がある。本発明のプロテアーゼは、わずかにアルカリｐＨが最適な（最適ｐＨ８～９．５）セリンエンドペプチターゼ（ＥＣ３．４．２１）である。
プロテアーゼ活性は、対象のプロテアーゼの特異性に関連するペプチド結合を含む基質が使用されるあらゆるアッセイを用いて測定することができる。アッセイｐＨ及びアッセイ温度は、同様に、対象のプロテアーゼに適合される。アッセイｐＨ値の例は、ｐＨ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２である。アッセイ温度の例は、１５、２０、２５、３０、３５、３７、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０又は９５℃である。一般的なプロテアーゼ基質の例は、カゼイン、ウシ血清アルブミン及びヘモグロビンである。古典的なＡｎｓｏｎ及びＭｉｒｓｋｙ法では、変性ヘモグロビンを基質として用いて、対象のプロテアーゼとのアッセイインキュベーション後のトリクロロ酢酸可溶性のヘモグロビンの量をプロテアーゼ活性の尺度として判定する（Ａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｍｉｒｓｋｙ，１９３２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６：５９及びＡｎｓｏｎ，１９３８，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２：７９）。
本発明について、プロテアーゼ活性を、「材料及び方法」に記載されるアッセイ、例えばＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡアッセイ及びＰｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫアッセイを用いて求めた。Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫアッセイについて、不溶性のＰｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫ（Ａｚｕｒｉｎｅ－Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ Ｃａｓｅｉｎ）基質は、プロテアーゼとインキュベートされると、青色を遊離させ、この色をプロテアーゼ活性の尺度として判定する。Ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡアッセイについて、無色のＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ基質は、プロテアーゼとインキュベートされると、黄色のパラニトロアニリンを遊離させ、黄色をプロテアーゼ活性の尺度として判定する。
本発明のポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドのプロテアーゼ活性の少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％及び少なくとも１００％を有する。
粗飼料：用語「粗飼料」は、種子及び穀物及び農作物の残余（茎葉、コプラ、わら、籾殻、サトウダイコンの廃棄物など）からの繊維、糠、穀皮などの高レベルの繊維を有する乾燥植物材料を意味する。
配列同一性：２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「配列同一性」によって説明される。
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の度合いは、好ましくは、バージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を用いて判定される。バージョン６．１．０を用いた。用いられる任意選択的なパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性パーセントとして用いられ、以下のとおり算出される：
（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）。
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド酸配列間の配列同一性の度合いは、好ましくは、バージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００、前出）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、前出）を用いて判定される。バージョン６．１．０を用いた。用いられる任意選択的なパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性パーセントとして用いられ、以下のとおり算出される：
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）。
サイレージ：用語「サイレージ」は、発酵した高水分貯蔵飼葉を意味し、これは、反芻動物（食い戻し動物、例えばウシ及びヒツジ）に与えることができるか、又は嫌気性ダイジェスタのためのバイオ燃料フィードストックとして用いることができる。これは、エンシレージ、エンサイリング又はサイレージングと呼ばれるプロセスにおいて発酵且つ貯蔵され、通常、イネ科作物又は禾穀類（例えば、トウモロコシ、モロコシ、エンバク、ライムギ、チモシー等、飼草イネ科植物）又はクローバー／シロツメクサ、アルファルファ、ベッチのようなマメ科作物から、（穀粒のみならず）緑葉植物体全体を用いて製造される。サイレージは、多くの農作物から製造することができ、特殊用語がタイプに応じて用いられる場合がある（エンバクについてオートレージ、アルファルファについてヘイレージ）。サイレージは、切断された緑葉植物をサイロ内に配置することにより、これをプラスチックシートでカバーした大きいヒープ内に詰め込むことによって又は大きい包みをプラスチックフィルム内に包装することによって製造される。
実質的に純粋なポリペプチド：用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、最大１０重量％、最大８重量％、最大６重量％、最大５重量％、最大４重量％、最大３重量％、最大２重量％、最大１重量％及び最大０．５重量％の天然に又は組み換え的に結合した他のポリペプチド材料を含有する調製物を意味する。好ましくは、ポリペプチドは、調製物中に存在する全ポリペプチド材料の重量に対して少なくとも９２％純粋、例えば少なくとも９４％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９６％純粋、少なくとも９７％純粋、少なくとも９８％純粋、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％純粋及び１００％純粋である。本発明のポリペプチドは、実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは、例えば、よく知られている組換え法又は古典的な精製方法によってポリペプチドを調製することにより達成され得る。
変異体：用語「変異体」は、改変、すなわち１つ以上（数カ所）の位置での１つ以上（数個）のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失を含むプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、ある位置のアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味し；欠失とは、ある位置のアミノ酸の除去を意味し；また、挿入とは、ある位置のアミノ酸に隣接する１～３個のアミノ酸を付加することを意味する。本発明の変異体は、配列番号１のプロテアーゼ活性の少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％を有する。
命名法
本発明の目的のために、命名法［Ｅ／Ｑ］は、この位置のアミノ酸がグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）又はグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）であり得ることを意味する。同様に、命名法［Ｖ／Ｇ／Ａ／Ｉ］は、この位置のアミノ酸がバリン（Ｖａｌ、Ｖ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）であり得ることを意味し、本明細書に記載される他の組合せについても同様である。他でさらに限定されない限り、アミノ酸Ｘは、２０種の天然アミノ酸のいずれかであり得ると定義される。
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む動物用飼料添加物
プロテアーゼは、タンパク質を、動物によってより容易に消化及び利用されるより小さい断片に分解することによって機能する。動物用食餌は、主に、炭水化物源（例えば、トウモロコシ、コムギ、ライムギ）及びタンパク質源（典型的にはダイズミール）を含み、その後、少量の脂肪及び例えばビタミン及びミネラルを含有するプレミックスが補充される。プロテアーゼは、主に、タンパク質源の消化を補助し、この利用を測定する一方法は、動物、例えばブロイラーにおける回腸窒素消化率を求める。回腸窒素消化率が高いほど、タンパク質が適切に分解して、典型的には動物において体重増加及びＦＣＲが向上する。
プロテアーゼが回腸窒素消化率を実際に向上させたかを判定するために、陽性対照及び陰性対照の両方でインビボ治験をランすることが所望される。酵素は、陰性対照の最上部に加えられる一方、陽性対照は、ダイズミールの一部をダイズタンパク質濃縮物等のより消化可能なタンパク質源と交換する。ＰＣは、通常、ＮＣと比較して回腸窒素消化率の向上を示すが、ＮＣ内のタンパク質含有量が高度に消化可能であれば、差は、非常に小さくなり得る。しかしながら、注目するプロテアーゼ、例えば本発明のプロテアーゼは、ＮＣ及び好ましくはＰＣとも比較して回腸窒素消化率の向上を示す。
このように、第１の態様において、本発明は、プロテアーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを含む動物用飼料添加物であって、ポリペプチドは、Ｓ８プロテアーゼであり、且つ配列番号１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、動物用飼料添加物に関する。一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１由来のアミノ酸と最大５０個、例えばアミノ酸と１～５０個、例えばアミノ酸と１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０若しくは１～５個又はアミノ酸と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０個異なる。
動物用飼料添加物は、好ましくは、配列番号１若しくはその対立遺伝子変異体を含むか若しくはそれからなり；配列番号１並びにＮ末端及び／若しくはＣ末端のＨｉｓ－タグ及び／若しくはＨＱ－タグを含み；配列番号１並びに１～１０個のアミノ酸のＮ末端及び／若しくはＣ末端伸長を含み；又はプロテアーゼ活性を有し、且つ配列番号１の長さの少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％を有するその断片である。別の実施形態において、動物用飼料添加物は、配列番号１のアミノ酸１～３１４を含むか又はそれからなる。別の実施形態において、動物用飼料添加物は、配列番号１のアミノ酸２～３１４を含むか又はそれからなる。別の実施形態において、動物用飼料添加物は、配列番号１のアミノ酸４～３１４を含むか又はそれからなる。一実施形態において、ポリペプチドは、単離されている。
第１の態様の続きで、本発明は、配列番号１の１つ以上の変異体を含む動物用飼料添加物であって、変異体は、プロテアーゼ活性を有するＳ８プロテアーゼであり、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは欠失、及び／若しくは挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む、動物用飼料添加物に関する。一実施形態において、配列番号１における、置換、及び／若しくは欠失、及び／若しくは挿入又はそれらの任意の組合せを含む位置の数は、１～５０、例えば１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０又は１～５位置である。一実施形態において、配列番号１における、置換、及び／若しくは欠失、及び／若しくは挿入又はそれらの任意の組合せを含む位置の数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。別の実施形態において、配列番号１における置換、及び／又は欠失、及び／又は挿入の数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。さらなる実施形態において、配列番号１における置換、好ましくは保存的置換の数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。
述べたように、本発明の実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９の変異体を含む動物用飼料又は動物用飼料添加物であって、変異体は、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む、動物用飼料又は動物用飼料添加物に関する。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の単一の突然変異の変異体及び複数の突然変異の変異体のいくつかが調製された。実施例１２、実施例１４及び実施例１５は、配列番号１の胃安定性及びインビボ性能を示す。単一の突然変異の変異体（データ示さず）及び複数の突然変異の変異体が試験されて、配列番号１の親ポリペプチドと比較してより良好な酸安定性、胃安定性及び残留活性を有することが見出された。したがって、本発明の実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９又はその変異体を含む動物用飼料添加物又は動物用飼料組成物であって、変異体は、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置、典型的には１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０、より典型的には１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０位置、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５位置、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２位置に含む、動物用飼料添加物又は動物用飼料組成物に関する。
突然変異Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐの組合せを有する変異体は、配列番号１と比較して酸安定性が向上しており、これをさらなる突然変異のための出発点として用いた。したがって、本発明の一実施形態において、ポリペプチドは、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ突然変異を含む配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。興味深いことに、配列番号２の突然変異形態である配列番号３は、突然変異Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐを含む。実施例に示すように、動物用飼料添加物は、適切には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる、より典型的には配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するＳ８プロテアーゼを含み、ポリペプチドは、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｙ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ８３Ｔ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｙ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｙ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ及びＬ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐからなる群から選択される突然変異のいずれも含まないか又はそれらの１つ以上を含む。
動物用飼料添加物は、本発明の一実施形態において、典型的には配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９からなる群から選択されるポリペプチド又はその変異体を含み、変異体は、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを含み、１つ以上の置換は、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｙ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ８３Ｔ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｙ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｙ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ及びＬ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐからなる群から選択される突然変異を含む複数の突然変異である。
さらに、いくつかのホモログを調製した。配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９は、互いにホモログである。
Figure 0007515396000001
本発明の実施形態は、本発明の動物用飼料添加物であって、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％の配列同一性を有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種－１３３８０由来のＳ８プロテアーゼ、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するバチルス・イドリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｄｒｉｅｎｓｉｓ）由来のＳ８プロテアーゼ、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種－６２４５１由来のＳ８プロテアーゼ及び配列番号１と少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％の配列同一性を有するバチルス・オセアニセディミニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｃｅａｎｉｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）由来のＳ８プロテアーゼからなる群から選択されるＳ８プロテアーゼである、動物用飼料添加物に関する。本発明のさらなる実施形態は、配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するＳ８プロテアーゼを含む飼料添加物に関する。
第１の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、１つ以上のモチーフＴＧＸＫ［Ｖ／Ｔ］［Ｉ／Ｖ］Ｘ［Ｎ／Ｓ］ＭＳＬＧ（配列番号４）を含む。第１の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、分類上の目バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目、好ましくは分類上の科バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科又はより好ましくは分類上の属バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属から得られるか又は入手可能である。
第１の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、配列番号１のポリペプチドのプロテアーゼ活性の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％を有する。第１の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、回腸窒素消化率を、プロテアーゼ（変異体）が食餌に加えられていない陰性対照と比較して少なくとも１％、例えば少なくとも１．５％、少なくとも２．０％、少なくとも２．５％、少なくとも３．０％、少なくとも３．５％又は少なくとも４．０％向上させる。
アミノ酸の変化は、タンパク質の折り畳み及び／又は活性に著しく影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換又は挿入；典型的には１～３０アミノ酸の小規模な欠失；アミノ末端メチオニン残基などの小規模なアミノ末端又はカルボキシル末端伸長；最大２０～２５残基の小さいリンカーペプチド；又は正味の電荷又は別の機能を変えることにより精製を容易にする、ポリヒスチジン配列、抗原エピトープ又は結合ドメインなどの小規模な伸長である軽微なものであり得る。
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）並びに小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）の群に含まれる。概して比活性を変えないアミノ酸置換は、当技術分野で知られており、例えばＨ． Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋによって記載されている。一般的な置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ，及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。保存的置換の他の例は、ＧからＡ；ＡからＧ、Ｓ；ＶからＩ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｓ；ＩからＶ、Ｌ、Ｍ；ＬからＩ、Ｍ、Ｖ；ＭからＬ、Ｉ、Ｖ；ＰからＡ、Ｓ、Ｎ；ＦからＹ、Ｗ、Ｈ；ＹからＦ、Ｗ、Ｈ；ＷからＹ、Ｆ、Ｈ；ＲからＫ、Ｅ、Ｄ；ＫからＲ、Ｅ、Ｄ；ＨからＱ、Ｎ、Ｓ；ＤからＮ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｑ；ＥからＱ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎ；ＳからＴ、Ａ；ＴからＳ、Ｖ、Ａ；ＣからＳ、Ｔ、Ａ；ＮからＤ、Ｑ、Ｈ、Ｓ；ＱからＥ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｒである。
ポリペプチドにおいて必須のアミノ酸は、部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発などの当技術分野で知られる手順に従って同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５）。後者の技術は、１つのアラニン変異を分子のあらゆる残基に導入し、得られた変異体分子をプロテアーゼ活性について試験して、分子の活性に対して重大な意味を持つアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９－４７０８も参照されたい。酵素の活性部位又は他の生物学的相互作用は、推定される接触部位アミノ酸の変異との組合せにより、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折又は光親和性標識などの技術によって測定される構造の物理的分析によって判定することもできる。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６－３１２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９－９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９－６４を参照されたい。必須アミノ酸の同一性は、関連するポリペプチドとのアライメントから推定することもできる。
ペプチダーゼファミリーＳ８は、セリンエンドペプチターゼを含有し、配列数及び特徴付けられているペプチダーゼの両方に関して２番目に大きいセリンペプチダーゼファミリーである。サブファミリーＳ８Ａにおいて、活性部位残基は、多くの場合、モチーフＡｓｐ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ－Ｇｌｙ、Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ及びＧｌｙ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｘａａ－Ｐｒｏ内に存在する。これから、触媒残基をＡｓｐ－３５、Ｈｉｓ－７２及びＳｅｒ－２５１と同定し、第４の活性部位アミノ酸を配列番号１、２及び３についてＡｓｎ－１７０と同定した。触媒残基のいずれかのアミノ酸の突然変異が酵素活性の変化又は低下をもたらす。
単一又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入は、既知の変異誘発、組換え及び／又はシャッフリングの方法、続いてＲｅｉｄｈａａｒ－Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３－５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２－２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；又は国際公開第９５／２２６２５号パンフレットによって開示されるものなど、関連したスクリーニング手順を用いて実施及び試験され得る。使用することができる他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２－１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４パンフレット）及び領域特異的変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）が挙げられる。
変異誘発／シャッフリング方法は、宿主細胞によって発現されるクローン化された変異誘発ポリペプチドの活性を検出するためのハイスループットの自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る（Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３－８９６）。活性ポリペプチドをコードする変異誘発ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、当技術分野における標準的な方法を用いて迅速に配列決定することができる。これら方法は、ポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能にする。
ポリペプチドは、あるポリペプチドの領域が別のポリペプチドの領域のＮ末端又はＣ末端に融合しているハイブリッドポリペプチドであり得る。
ポリペプチドは、別のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合している融合ポリペプチド又は切断可能融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、別のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合させることによって生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、当技術分野において知られており、それらのポリペプチドをコードするコーディング配列同士を、フレーム内にあるように、且つ融合ポリペプチドの発現が同じプロモータ及びターミネータの制御下にあるようにライゲートすることを含む。融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドが翻訳後にもたらされるインテイン技術（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２５７５－２５８３；Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６－７７９）を用いても構築され得る。
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチド間に切断部位をさらに含み得る。融合タンパク質の分泌直後にその部位が切断されて、２つのポリペプチドを放出する。切断部位の例として、以下に限定されないが、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８－５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５－２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ－Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８－３４９３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：４９８－５０３；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：３７８－３８１；Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：５０５－５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ－Ｒａｃｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：９８２－９８７；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：２４０－２４８；及びＳｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ４：３５－４８に開示される部位が挙げられる。
第２の態様において、本発明は、プロテアーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを含む動物用飼料添加物であって、ポリペプチドは、Ｓ８プロテアーゼであり、且つ配列番号２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、動物用飼料添加物に関する。一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２由来のアミノ酸と最大５０個、例えばアミノ酸と１～５０個、例えばアミノ酸と１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０若しくは１～５個又はアミノ酸と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０個異なる。
動物用飼料添加物は、好ましくは、配列番号２若しくはその対立遺伝子変異体を含むか若しくはそれからなり；配列番号２並びにＮ末端及び／若しくはＣ末端のＨｉｓ－タグ及び／若しくはＨＱ－タグを含み；配列番号２並びに１～１０個のアミノ酸のＮ末端及び／若しくはＣ末端伸長を含み；又はプロテアーゼ活性を有し、且つ配列番号２の長さの少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％を有するその断片である。別の実施形態において、動物用飼料添加物は、配列番号２のアミノ酸１～３１１を含むか又はそれからなる。一実施形態において、ポリペプチドは、単離されている。
第２の態様の続きで、本発明は、配列番号２の１つ以上の変異体を含む動物用飼料添加物であって、変異体は、プロテアーゼ活性を有するＳ８プロテアーゼであり、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは欠失、及び／若しくは挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む、動物用飼料添加物に関する。一実施形態において、配列番号２における、置換、及び／若しくは欠失、及び／若しくは挿入又はそれらの任意の組合せを含む位置の数は、１～５０、例えば１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０又は１～５位置である。一実施形態において、配列番号２における、置換、及び／若しくは欠失、及び／若しくは挿入又はそれらの任意の組合せを含む位置の数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。別の実施形態において、配列番号２における置換、及び／又は欠失、及び／又は挿入の数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。さらなる実施形態において、配列番号２における置換、好ましくは保存的置換の数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。アミノ酸の変化、保存的置換及び融合ペプチドの例が本明細書の第２の態様に記載されている。
第２の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、１つ以上のモチーフＴＧＸＫ［Ｖ／Ｔ］［Ｉ／Ｖ］Ｘ［Ｎ／Ｓ］ＭＳＬＧ（配列番号４）を含む。第２の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、分類上の目バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目、好ましくは分類上の科バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科又はより好ましくは分類上の属バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属から得られるか又は入手可能である。
第２の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、配列番号１のポリペプチドのプロテアーゼ活性の少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％を有する。第２の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、回腸窒素消化率を、プロテアーゼ（変異体）が食餌に加えられていない陰性対照と比較して少なくとも１％、例えば少なくとも１．５％、少なくとも２．０％、少なくとも２．５％、少なくとも３．０％、少なくとも３．５％又は少なくとも４．０％向上させる。
第３の態様において、本発明は、プロテアーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを含む動物用飼料添加物であって、ポリペプチドは、Ｓ８プロテアーゼであり、且つ配列番号３と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、動物用飼料添加物に関する。一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３由来のアミノ酸と最大５０個、例えばアミノ酸と１～５０個、例えばアミノ酸と１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０若しくは１～５個又はアミノ酸と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０個異なる。
動物用飼料添加物は、好ましくは、配列番号３若しくはその対立遺伝子変異体を含むか若しくはそれからなり；配列番号３並びにＮ末端及び／若しくはＣ末端のＨｉｓ－タグ及び／若しくはＨＱ－タグを含み；配列番号３並びに１～１０個のアミノ酸のＮ末端及び／若しくはＣ末端伸長を含み；又はプロテアーゼ活性を有し、且つ配列番号３の長さの少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％を有するその断片である。別の実施形態において、動物用飼料添加物は、配列番号３のアミノ酸１～３１１を含むか又はそれからなる。一実施形態において、ポリペプチドは、単離されている。
第３の態様の続きで、本発明は、配列番号３の１つ以上の変異体を含む動物用飼料添加物であって、変異体は、プロテアーゼ活性を有するＳ８プロテアーゼであり、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは欠失、及び／若しくは挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む、動物用飼料添加物に関する。一実施形態において、配列番号３における、置換、及び／若しくは欠失、及び／若しくは挿入又はそれらの任意の組合せを含む位置の数は、１～５０、例えば１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０又は１～５位置である。一実施形態において、配列番号３における、置換、及び／若しくは欠失、及び／若しくは挿入又はそれらの任意の組合せを含む位置の数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。別の実施形態において、配列番号３における置換、及び／又は欠失、及び／又は挿入の数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。さらなる実施形態において、配列番号３における置換、好ましくは保存的置換の数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。アミノ酸の変化、保存的置換及び融合ペプチドの例が本明細書の第２の態様に記載されている。
本発明のさらに興味深い態様は、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＳ８プロテアーゼを含む飼料添加物に関する。配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列は、１３位置において異なる。したがって、本発明の実施形態は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３、特に配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＳ８プロテアーゼを含む飼料添加物であって、ポリペプチドは、突然変異を位置２７、１０９、１１１、１７１、１７３、１７４、１７５、１８０、１８２、１８４、１９８、１９９及び２９７のいずれにおいても含まないか又はそれらの１つ以上において含む、飼料添加物に関する。本発明の動物用飼料添加物は、好ましくは、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するＳ８プロテアーゼを含むか、又はＳ８プロテアーゼは、突然変異を配列番号２若しくは配列番号３の位置２７、１０９、１１１、１７１、１７３、１７４、１７５、１８０、１８２、１８４、１９８、１９９及び２９７のいずれにおいても含まないか若しくはそれらの１つ以上において含むポリペプチドである。本発明の実施形態は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３、典型的には配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＳ８プロテアーゼを含む飼料添加物であって、ポリペプチドは、Ｓ２７Ｋ、Ｎ１０９Ｋ、Ｓ１１１Ｅ、Ｓ１７１Ｅ、Ｓ１７３Ｐ、Ｇ１７４Ｋ、Ｓ１７５Ｐ、Ｆ１８０Ｙ、Ｇ１８２Ａ、Ｌ１８４Ｆ、Ｑ１９８Ｅ、Ｎ１９９Ｋ及びＴ２９７Ｐからなる群から選択される突然変異のいずれも含まないか又はそれらの１つ以上を含む、飼料添加物に関する。
本発明の実施形態は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３、典型的には配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＳ８プロテアーゼを含む飼料添加物であって、ポリペプチドは、Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ、Ｓ２７Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ２７Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ２７Ｋ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ２７Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ２７Ｋ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｇ１８２Ａ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ、Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｆ１８０Ｙ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ及びＱ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋからなる群から選択される突然変異のいずれも含まないか又はそれらの１つ以上を含む、飼料添加物に関する。
本発明の実施形態は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３、典型的には配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するＳ８プロテアーゼを含む飼料添加物であって、ポリペプチドは、Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ、Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ２７Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ２７Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ２７Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ２７Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ２７Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ２７Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ２７Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ２７Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ２７Ｋ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１８２Ａ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１８２Ａ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１８２Ａ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｎ１０９Ｋ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１１１Ｅ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７１Ｅ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７３Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｇ１７４Ｋ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｓ１７５Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ及びＬ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋからなる群から選択される突然変異のいずれも含まないか又はそれらの１つ以上を含む、飼料添加物に関する。
本発明の実施形態は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３、典型的には配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するＳ８プロテアーゼを含む飼料添加物であって、ポリペプチドは、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、及び
Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ
からなる群から選択される突然変異のいずれも含まないか又はそれらの１つ以上を含む、飼料添加物に関する。
本発明の実施形態は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３、典型的には配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するＳ８プロテアーゼを含む飼料添加物であって、ポリペプチドは、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、及び
Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ
からなる群から選択される突然変異のいずれも含まないか又はそれらの１つ以上を含む、飼料添加物に関する。
本発明の実施形態は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３、典型的には配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するＳ８プロテアーゼを含む飼料添加物であって、ポリペプチドは、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、
Ｓ２７Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ、及び
Ｎ１０９Ｋ＋Ｓ１１１Ｅ＋Ｓ１７１Ｅ＋Ｓ１７３Ｐ＋Ｇ１７４Ｋ＋Ｓ１７５Ｐ＋Ｆ１８０Ｙ＋Ｇ１８２Ａ＋Ｌ１８４Ｆ＋Ｑ１９８Ｅ＋Ｎ１９９Ｋ
からなる群から選択される突然変異のいずれも含まないか又はそれらの１つ以上を含む、飼料添加物に関する。
第３の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、１つ以上のモチーフＴＧＸＫ［Ｖ／Ｔ］［Ｉ／Ｖ］Ｘ［Ｎ／Ｓ］ＭＳＬＧ（配列番号４）を含む。第３の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、分類上の目バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目、好ましくは分類上の科バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科又はより好ましくは分類上の属バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属から得られるか又は入手可能である。
第３の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、配列番号１のポリペプチドのプロテアーゼ活性の少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％を有する。第３の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、回腸窒素消化率を、プロテアーゼ（変異体）が食餌に加えられていない陰性対照と比較して少なくとも１％、例えば少なくとも１．５％、少なくとも２．０％、少なくとも２．５％、少なくとも３．０％、少なくとも３．５％又は少なくとも４．０％向上させる。
態様１、２又は３のいずれかの動物用飼料添加物は、１つ以上の配合剤と；１つ以上の追加の酵素と；１つ以上の微生物と；１つ以上のビタミンと；１つ以上のミネラルと；１つ以上のアミノ酸と；１つ以上のプレバイオティクスと；１つ以上のファイトジェニクスと；１つ以上の有機酸と；１つ以上の他の飼料成分とからなるリストから選択される１つ以上の構成要素をさらに含み得る。
態様１、２又は３のいずれかの動物用飼料添加物は、以下の製剤化の節で考察される１つ以上の配合剤をさらに含み得る。好ましい配合剤として、グリセロール、エチレングリコール、１，２－プロピレングリコール若しくは１，３－プロピレングリコール、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラクトース、デンプン及びセルロース又はそれらの任意の組合せがある。
態様１、２又は３のいずれかの動物用飼料添加物は、以下の酵素の節で考察される１つ以上の追加の酵素をさらに含み得る。好ましい酵素として、アセチルキシランエステラーゼ、アシルグリセロールリパーゼ、アミラーゼ、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、ガラクタナーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、リゾホスホリパーゼ、リゾチーム、α－マンノシダーゼ、β－マンノシダーゼ（マンナナーゼ）、フィターゼ、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＤ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、ペクチンエステラーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、キシラナーゼ、β－キシロシダーゼ又はそれらの任意の組合せがある。
態様１、２又は３のいずれかの動物用飼料添加物は、以下のプロバイオティクスの節で考察される１つ以上の微生物をさらに含み得る。好ましい微生物は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属種、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属種、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｓｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属種、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種又はそれらの任意の組合せ由来である。
態様１、２又は３のいずれかの動物用飼料添加物は、以下のビタミン及びミネラルの節で考察される１つ以上のビタミンをさらに含み得る。態様１、２又は３のいずれかの動物用飼料添加物は、以下のビタミン及びミネラルの節で考察される１つ以上のミネラルをさらに含み得る。態様１、２又は３のいずれかの動物用飼料添加物は、以下のアミノ酸の節で考察される１つ以上のアミノ酸をさらに含み得る。態様１、２又は３のいずれかの動物用飼料添加物は、以下のプレバイオティクスの節で考察される１つ以上のプレバイオティクスをさらに含み得る。態様１、２又は３のいずれかの動物用飼料添加物は、以下のファイトジェニクスの節で考察される１つ以上のファイトジェニクスをさらに含み得る。態様１、２又は３のいずれかの動物用飼料添加物は、以下の有機酸の節で考察される１つ以上の有機酸をさらに含み得る。
一実施形態において、動物用飼料添加物中のＳ８プロテアーゼは、顆粒として製剤化される。一実施形態において、動物用飼料添加物中のＳ８プロテアーゼは、顆粒として製剤化され、顆粒は、コア粒子及び１つ以上のコーティングを含む。一実施形態において、動物用飼料添加物中のＳ８プロテアーゼは、コア粒子及び１つ以上のコーティングを含む顆粒として製剤化され、コーティングは、塩、及び／又はワックス、及び／又は小麦粉を含む。
一実施形態において、動物用飼料添加物は、液体製剤の形態である。一実施形態において、動物用飼料添加物は、液体製剤の形態であり、Ｓ８プロテアーゼは、液体製剤の０．００１％～２５％ｗ／ｗ、好ましくは０．０１％～２５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０５％～２０％ｗ／ｗ、より好ましくは０．２％～１５％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは０．５％～１５％ｗ／ｗ又は最も好ましくは１．０％～１０％ｗ／ｗのポリペプチドで投与される。
一実施形態において、動物用飼料添加物は、液体製剤の形態であり、液体製剤は、２０％～８０％ｗ／ｗのポリオールを含む。一実施形態において、動物用飼料添加物は、２０％～８０％ｗ／ｗのポリオールを含む液体製剤の形態であり、ポリオールは、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール（ＭＰＧ）、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、１，２－プロピレングリコール若しくは１，３－プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、平均分子量が約６００未満のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び平均分子量が約６００未満のポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一実施形態において、動物用飼料添加物は、液体製剤の形態であり、液体製剤は、０．０１％～２．０％ｗ／ｗの保存剤を含む。一実施形態において、動物用飼料添加物は、０．０１％～２．０％ｗ／ｗの保存剤を含む液体製剤の形態であり、保存剤は、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム及び安息香酸カリウム又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一実施形態において、動物用飼料添加物は、
（Ａ）０．００１％～２５％ｗ／ｗの本発明のＳ８プロテアーゼ（上述の態様１、２又は３に記載されている）と；
（Ｂ）２０％～８０％ｗ／ｗのポリオールと；
（Ｃ）０．００１％～２．０％ｗ／ｗの保存剤と；
（Ｄ）水と
を含む液体製剤の形態である。
ポリオール及び保存剤の好ましい例は、以下の段落に記載されている。
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む顆粒
第４の態様において、本発明は、プロテアーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを含む顆粒であって、ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｂ）配列番号２と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｃ）配列番号３と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｄ）配列番号１の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｅ）配列番号２の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｆ）配列番号３の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチド並びにＮ末端及び／又はＣ末端のＨｉｓ－タグ及び／又はＨＱ－タグを含むポリペプチドと；
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチド並びに最大１０個のアミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸のＮ末端及び／又はＣ末端伸長を含むポリペプチドと；
（ｉ）プロテアーゼ活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも９０％を有する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択されるＳ８プロテアーゼである、顆粒に関する。
第４の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、１つ以上のモチーフＴＧＸＫ［Ｖ／Ｔ］［Ｉ／Ｖ］Ｘ［Ｎ／Ｓ］ＭＳＬＧ（配列番号４）を含む。第４の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、分類上の目バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目、好ましくは分類上の科バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科又はより好ましくは分類上の属バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属から得られるか又は入手可能である。
第４の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、配列番号１のポリペプチドのプロテアーゼ活性の少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％を有する。第４の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、回腸窒素消化率を、プロテアーゼ（変異体）が食餌に加えられていない陰性対照と比較して少なくとも１％、例えば少なくとも１．５％、少なくとも２．０％、少なくとも２．５％、少なくとも３．０％、少なくとも３．５％又は少なくとも４．０％向上させる。
第４の態様の一実施形態において、顆粒は、コア粒子及び１つ以上のコーティングを含む。一実施形態において、顆粒は、コア粒子及び１つ以上のコーティングを含み、コーティングは、塩、及び／又はワックス、及び／又は小麦粉を含む。
第４の態様の顆粒は、１つ以上の配合剤と；１つ以上の追加の酵素と；１つ以上の微生物と；１つ以上のビタミンと；１つ以上のミネラルと；１つ以上のアミノ酸と；１つ以上のプレバイオティクスと；１つ以上のファイトジェニクスと；１つ以上の有機酸と；１つ以上の他の飼料成分とからなる群から選択される１つ以上の構成要素をさらに含み得る。
第４の態様の顆粒は、以下の製剤化の節で考察される１つ以上の配合剤をさらに含み得る。好ましい配合剤として、グリセロール、エチレングリコール、１，２－プロピレングリコール若しくは１，３－プロピレングリコール、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラクトース、デンプン及びセルロース又はそれらの任意の組合せがある。
第４の態様の顆粒は、以下の酵素の節で考察される１つ以上の追加の酵素をさらに含み得る。好ましい酵素として、アセチルキシランエステラーゼ、アシルグリセロールリパーゼ、アミラーゼ、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、ガラクタナーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、リゾホスホリパーゼ、リゾチーム、α－マンノシダーゼ、β－マンノシダーゼ（マンナナーゼ）、フィターゼ、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＤ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、ペクチンエステラーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、キシラナーゼ、β－キシロシダーゼ又はそれらの任意の組合せがある。
第４の態様の顆粒は、以下のプロバイオティクスの節で考察される１つ以上の微生物をさらに含み得る。好ましい微生物は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属種、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属種、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｓｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属種、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種又はそれらの任意の組合せ由来である。
第４の態様の顆粒は、以下のビタミン及びミネラルの節で考察される１つ以上のビタミンをさらに含み得る。第４の態様の顆粒は、以下のビタミン及びミネラルの節で考察される１つ以上のミネラルをさらに含み得る。第４の態様の顆粒は、以下のアミノ酸の節で考察される１つ以上のアミノ酸をさらに含み得る。第４の態様の顆粒は、以下のプレバイオティクスの節で考察される１つ以上のプレバイオティクスをさらに含み得る。第４の態様の顆粒は、以下のファイトジェニクスの節で考察される１つ以上のファイトジェニクスをさらに含み得る。第４の態様の顆粒は、以下の有機酸の節で考察される１つ以上の有機酸をさらに含み得る。
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む液体製剤
第５の態様において、本発明は、
（Ａ）プロテアーゼ活性を有する０．００１％～２５％ｗ／ｗの１つ以上のポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｂ）配列番号２と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｃ）配列番号３と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｄ）配列番号１の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｅ）配列番号２の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｆ）配列番号３の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチド並びにＮ末端及び／又はＣ末端のＨｉｓ－タグ及び／又はＨＱ－タグを含むポリペプチドと；
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチド並びに最大１０個のアミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸のＮ末端及び／又はＣ末端伸長を含むポリペプチドと；
（ｉ）プロテアーゼ活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも９０％を有する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドの断片と
からなるリストから選択されるＳ８プロテアーゼであるポリペプチドと；
（Ｂ）水と
を含む液体製剤に関する。
第５の態様の一実施形態において、本発明は、
（Ａ）プロテアーゼ活性を有する０．００１％～２５％ｗ／ｗの１つ以上のポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｂ）配列番号２と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｃ）配列番号３と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｄ）配列番号１の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｅ）配列番号２の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｆ）配列番号３の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチド並びにＮ末端及び／又はＣ末端のＨｉｓ－タグ及び／又はＨＱ－タグを含むポリペプチドと；
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチド並びに最大１０個のアミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸のＮ末端及び／又はＣ末端伸長を含むポリペプチドと；
（ｉ）プロテアーゼ活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも９０％を有する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドの断片と
からなるリストから選択されるＳ８プロテアーゼであるポリペプチドと；
（Ｂ）２０％～８０％ｗ／ｗのポリオールと；
（Ｃ）任意選択的に、０．００１％～２．０％ｗ／ｗの保存剤と；
（Ｄ）水と
を含む液体製剤に関する。
第５の態様の一実施形態において、本発明は、
（Ａ）プロテアーゼ活性を有する０．００１％～２５％ｗ／ｗの１つ以上のポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｂ）配列番号２と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｃ）配列番号３と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｄ）配列番号１の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｅ）配列番号２の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｆ）配列番号３の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチド並びにＮ末端及び／又はＣ末端のＨｉｓ－タグ及び／又はＨＱ－タグを含むポリペプチドと；
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチド並びに最大１０個のアミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸のＮ末端及び／又はＣ末端伸長を含むポリペプチドと；
（ｉ）プロテアーゼ活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも９０％を有する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドの断片と
からなるリストから選択されるＳ８プロテアーゼであるポリペプチドと；
（Ｂ）０．００１％～２．０％ｗ／ｗの保存剤と；
（Ｃ）任意選択的に、２０％～８０％ｗ／ｗのポリオールと；
（Ｄ）水と
を含む液体製剤に関する。
第５の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、１つ以上のモチーフＴＧＸＫ［Ｖ／Ｔ］［Ｉ／Ｖ］Ｘ［Ｎ／Ｓ］ＭＳＬＧ（配列番号４）を含む。第５の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、分類上の目バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目、好ましくは分類上の科バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科又はより好ましくは分類上の属バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属から得られるか又は入手可能である。
第５の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、配列番号１のポリペプチドのプロテアーゼ活性の少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％を有する。第５の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、ポリペプチド（又は変異体）は、回腸窒素消化率を、プロテアーゼ（変異体）が食餌に加えられていない陰性対照と比較して少なくとも１％、例えば少なくとも１．５％、少なくとも２．０％、少なくとも２．５％、少なくとも３．０％、少なくとも３．５％又は少なくとも４．０％向上させる。
第５の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、液体製剤は、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール（ＭＰＧ）、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、１，２－プロピレングリコール若しくは１，３－プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、平均分子量が約６００未満のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び平均分子量が約６００未満のポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）からなる群から選択される、より好ましくはグリセロール、ソルビトール及びプロピレングリコール（ＭＰＧ）又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上のポリオール、好ましくは１つのポリオールを含む。
第５の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、液体製剤は、２０％～８０％のポリオール（すなわちポリオールの総量）、好ましくは２５％～７５％のポリオール、より好ましくは３０％～７０％のポリオール、より好ましくは３５％～６５％のポリオール又は最も好ましくは４０％～６０％のポリオールを含む。第５の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、液体製剤は、２０％～８０％のポリオール、好ましくは２５％～７５％のポリオール、より好ましくは３０％～７０％のポリオール、より好ましくは３５％～６５％のポリオール又は最も好ましくは４０％～６０％のポリオールを含み、ポリオールは、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール（ＭＰＧ）、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、１，２－プロピレングリコール若しくは１，３－プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、平均分子量が約６００未満のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び平均分子量が約６００未満のポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）からなる群から選択される。第５の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、液体製剤は、２０％～８０％のポリオール（すなわちポリオールの総量）、好ましくは２５％～７５％のポリオール、より好ましくは３０％～７０％のポリオール、より好ましくは３５％～６５％のポリオール又は最も好ましくは４０％～６０％のポリオールを含み、ポリオールは、グリセロール、ソルビトール及びプロピレングリコール（ＭＰＧ）からなる群から選択される。
第５の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、保存剤は、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム及び安息香酸カリウム又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一実施形態において、液体製剤は、０．０２％～１．５％ｗ／ｗの保存剤、より好ましくは０．０５％～１．０％ｗ／ｗの保存剤又は最も好ましくは０．１％～０．５％ｗ／ｗの保存剤を含む。一実施形態において、液体製剤は、０．００１％～２．０％ｗ／ｗの保存剤（すなわち保存剤の総量）、好ましくは０．０２％～１．５％ｗ／ｗの保存剤、より好ましくは０．０５％～１．０％ｗ／ｗの保存剤又は最も好ましくは０．１％～０．５％ｗ／ｗの保存剤を含み、保存剤は、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム及び安息香酸カリウム又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
第５の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、Ｓ８プロテアーゼは、液体製剤の０．００１％～２５％ｗ／ｗ、好ましくは０．０１％～２５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０５％～２０％ｗ／ｗ、より好ましくは０．２％～１５％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは０．５％～１５％ｗ／ｗ又は最も好ましくは１．０％～１０％ｗ／ｗのポリペプチドで投与される。
第５の態様のあらゆる部分の液体製剤は、１つ以上の配合剤と；１つ以上の追加の酵素と；１つ以上の微生物と；１つ以上のビタミンと；１つ以上のミネラルと；１つ以上のアミノ酸と；１つ以上のプレバイオティクスと；１つ以上のファイトジェニクスと；１つ以上の有機酸と；１つ以上の他の飼料成分とからなるリストから選択される１つ以上の構成要素をさらに含み得る。
第５の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、液体製剤は、グリセロール、エチレングリコール、１，２－プロピレングリコール又は１，３－プロピレングリコール、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラクトース、デンプン、ＰＶＡ、アセタート及びホスファートからなるリストから選択される、好ましくは１，２－プロピレングリコール、１，３－プロピレングリコール、硫酸ナトリウム、デキストリン、セルロース、チオ硫酸ナトリウム、カオリン及び炭酸カルシウムからなるリストから選択される１つ以上の配合剤（例えば、本明細書に記載されるもの）、好ましくは１つの配合剤を含む。
第５の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、液体製剤は、１つ以上の追加の酵素を含む。１つ以上の追加の酵素は、好ましくは、アセチルキシランエステラーゼ、アシルグリセロールリパーゼ、アミラーゼ、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、ガラクタナーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、リゾホスホリパーゼ、リゾチーム、α－マンノシダーゼ、β－マンノシダーゼ（マンナナーゼ）、フィターゼ、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＤ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、ペクチンエステラーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、キシラナーゼ、β－キシロシダーゼ又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
第５の態様のあらゆる部分に対する一実施形態において、液体製剤は、１つ以上のプロバイオティクスを含む。１つ以上のプロバイオティクスは、好ましくは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属種、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属種、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｓｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属種、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種及びストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
第５の態様のあらゆる部分の液体製剤は、以下のビタミン及びミネラルの節で考察される１つ以上のビタミンをさらに含み得る。第５の態様のあらゆる部分の液体製剤は、以下のビタミン及びミネラルの節で考察される１つ以上のミネラルをさらに含み得る。第５の態様のあらゆる部分の液体製剤は、以下のアミノ酸の節で考察される１つ以上のアミノ酸をさらに含み得る。第５の態様のあらゆる部分の液体製剤は、以下のプレバイオティクスの節で考察される１つ以上のプレバイオティクスをさらに含み得る。第５の態様のあらゆる部分の液体製剤は、以下のファイトジェニクスの節で考察される１つ以上のファイトジェニクスをさらに含み得る。第５の態様のあらゆる部分の液体製剤は、以下の有機酸の節で考察される１つ以上の有機酸をさらに含み得る。
性質
ｐＨ活性
プロテアーゼのｐＨ活性プロファイルをキネティックＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡアッセイに記載されるように求め得る。より低いｐＨ（例えば、４～７）での活性は、動物におけるタンパク質の消化に有利であり得る。
ｐＨ安定性
プロテアーゼのｐＨ安定性プロファイルをキネティックＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡアッセイに記載されるように求め得る。より低いｐＨ（例えば、ｐＨ３）での安定性は、プロテアーゼが動物の消化管条件を生き残るのに有利であり得る。
熱安定性
熱安定性を実施例５に記載されるように求め得る。すなわち、ＤＳＣ測定を用いて、精製されたプロテアーゼタンパク質の変性温度Ｔｄを求め得る。Ｔｄは、タンパク質の熱安定性を示す。Ｔｄが高いほど、熱安定性が高い。したがって、好ましい実施形態において、本発明のプロテアーゼは、Ｔｄが参照プロテアーゼのＴｄよりも高く、Ｔｄは、精製されたプロテアーゼサンプル（好ましくはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって判定して少なくとも９０％又は９５％の純度である）で求められる。
好ましい実施形態において、本発明のプロテアーゼの残留活性、変性温度Ｔｄ又は他のパラメータによってもたらされる熱的性質、例えば熱安定性（ｈｅａｔ－ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、温度安定性、熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、蒸気安定性及び／又はペレット化安定性は、配列番号１のプロテアーゼの対応する値、例えば残留活性又はＴｄよりも高く、より好ましくはその少なくとも１０１％又はその少なくとも１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％又は少なくとも１１０％である。さらにより好ましくは、本発明のプロテアーゼのパラメータ、例えば残留活性又はＴｄの値は、配列番号１のプロテアーゼについての値の少なくとも１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％又は少なくとも１９０％である。
さらなる特定の実施形態において、本発明の熱安定プロテアーゼは、実施例５に記載される示差走査熱量測定（ＤＳＣ）（すなわち２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中）を用いて求められる融解温度Ｔｍ（又は変性温度Ｔｄ）が少なくとも５０℃である。さらなる特定の実施形態において、Ｔｍは、少なくとも５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は少なくとも１００℃である。
蒸気安定性
蒸気安定性を、実施例６に記載されるように、８５℃又は９０℃での短時間の蒸気処理後のプロテアーゼ分子の残留活性を判定することによって求め得る。
ペレット化安定性
ペレット化安定性を、実施例７に記載されるように、飼料と予め混合した酵素粒状体を用いることによって求め得る。ミキサー由来の飼料を蒸気で９５℃に調整する。調整後、飼料をペレットに圧縮成形して残留活性を求める。
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドの供給源
本発明によるプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、任意の属の微生物から得ることができる。本発明の目的のために、所与の供給源と関連させて本明細書で使用する場合の用語「～から得られる」は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、供給源によって又は供給源に由来するポリヌクレオチドが挿入された株によって産生されることを意味するものとする。一態様において、所与の供給源から得られるポリペプチドは、細胞外に分泌される。
ポリペプチドは、細菌のポリペプチドであり得る。例えば、ポリペプチドは、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門等の門内のグラム陽性細菌由来又はプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）門等の門内のグラム陰性細菌由来の、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。
一態様において、ポリペプチドは、バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目の細菌由来又はバチラス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科若しくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のプロテアーゼである。
前述の種に関して、本発明は、完全及び不完全な状態の両方並びにそれらが知られている種の名称にかかわらず、他の分類学上の均等物、例えばアナモルフを包含することが理解されるであろう。当業者であれば、適切な均等物の同一性を容易に認識するであろう。
これらの種の株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）及びＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などのいくつかのカルチャーコレクションにおいて公共に容易に利用可能である。
ポリペプチドを、上記のプローブを用いて、自然界（例えば、土壌、堆肥、水など）から単離される微生物又は天然の物質（例えば、土壌、堆肥、水など）から直接得られるＤＮＡ試料を含む他の供給源から同定し且つ得ることができる。自然の生育地から微生物及びＤＮＡを直接単離する技術は、当技術分野で知られている。次に、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、別の微生物のゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡライブラリー又は混合ＤＮＡ試料を同様にスクリーニングすることによって得ることができる。１つ又は複数のプローブを用いてポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出してから、当業者に知られる技術を利用することにより、ポリヌクレオチドを単離又はクローン化することができる（例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。
ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書で記載されるとおり、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、単離されている。
ポリヌクレオチドの単離又はクローン化に使用される技術は、当技術分野で知られており、ゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ又はその組合せからの単離を含む。ゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローニングは、例えば、よく知られたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は共有される構造的特徴を有するクローン化されたＤＮＡ断片を検出する発現ライブラリーの抗体スクリーニングを使用することによってもたらされ得る。例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）及びポリヌクレオチドベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の核酸増幅方法が使用され得る。ポリヌクレオチドは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の株又はバチラス（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目由来の関連生物からクローニングされ得るため、例えばポリヌクレオチドのポリペプチドコーディング領域の対立遺伝子変異体又は種変異体であり得る。
核酸構築物
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、ポリヌクレオチドは、制御配列と適合する条件下で好適な宿主細胞においてコード配列の発現を誘導する１つ以上の制御配列に作動可能に連結されている、核酸構築物にも関する。
ポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現をもたらす様々な方法において操作され得る。ベクターに挿入する前のポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに応じて望ましいか又は必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は、当技術分野で知られている。
制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるプロモータのポリヌクレオチドであり得る。プロモータは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、変異体、短縮型及びハイブリッドプロモータを含む、宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであり得、宿主と同種又は異種のいずれかの細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
細菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写を誘導するための好適なプロモータの例は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のα－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Ａｇａｉｓｓｅ ａｎｄ Ｌｅｒｅｃｌｕｓ，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３：９７－１０７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｔｒｃプロモータ（Ｅｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）及び原核生物のβ－ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７－３７３１）並びにｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１－２５）から得られるプロモータである。さらなるプロモータは、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：７４－９４における「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」；及び前出のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９において記載される。タンデムプロモータの例は、国際公開第９９／４３８３５号パンフレットにおいて記載される。
糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写を誘導するための好適なプロモータの例は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の中性α－アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の酸安定性α－アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）のグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のトリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）のダリア（Ｄａｒｉａ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）のクイン（Ｑｕｉｎｎ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のリパーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のβ－グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のキシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のキシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のキシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のβ－キシロシダーゼ及びトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の翻訳伸長因子に関する遺伝子から得られるプロモータ並びにＮＡ２－ｔｐｉプロモータ（非翻訳リーダーがアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーによって置き換えられたアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の中性α－アミラーゼ遺伝子に由来する改変プロモータ；非限定的な例としては、非翻訳リーダーが、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーによって置き換えられたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の中性α－アミラーゼ遺伝子に由来する改変プロモータが挙げられる）；並びにその変異体、短縮型及びハイブリッドプロモータである。他のプロモータは、米国特許第６，０１１，１４７号明細書に記載されている。
酵母宿主において、有用なプロモータは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のメタロチオネイン（ＣＵＰ１）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の３－ホスホグリセリン酸キナーゼに関する遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３－４８８によって記載されている。
制御配列は、宿主細胞によって認識される、転写を終結するための転写ターミネータでもあり得る。ターミネータは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結される。宿主細胞において機能できる任意のターミネータが本発明において使用され得る。
細菌宿主細胞のために好ましいターミネータは、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）のアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のα－アミラーゼ（ａｍｙＬ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のリボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）に関する遺伝子から得られる。
糸状真菌宿主細胞のために好ましいターミネータは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアントラニル酸合成酵素、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のα－グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のβ－グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のキシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のキシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のキシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のβ－キシロシダーゼ及びトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の翻訳伸長因子に関する遺伝子から得られる。
酵母宿主のために好ましいターミネータは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のシトクロムＣ（ＣＹＣ１）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のグリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素に関する遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネータは、前出のＲｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２によって記載されている。
制御配列は、プロモータの下流及び遺伝子の発現を増大させる遺伝子のコード配列の上流のｍＲＮＡ安定化領域でもあり得る。
好適なｍＲＮＡ安定化領域の例は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号パンフレット）及びバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：３４６５－３４７１）から得られる。
制御配列は、宿主細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡのリーダー非翻訳領域でもあり得る。リーダーは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に作動可能に連結される。宿主細胞において機能できる任意のリーダーが本発明において使用され得る。
糸状真菌宿主細胞のために好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のトリオースリン酸イソメラーゼに関する遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のために好適なリーダーは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα因子及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）に関する遺伝子から得られる。
制御配列は、ポリアデニル化配列でもあり得、これは、ポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結し、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞に認識される配列である。宿主細胞において機能できる任意のポリアデニル化配列が使用され得る。
糸状真菌宿主細胞のために好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアントラニル酸合成酵素、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のα－グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ及びフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼに関する遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のために有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．１５：５９８３－５９９０によって記載されている。
制御配列は、ポリペプチドのＮ末端に連結されるシグナルペプチドをコードし、且つポリペプチドを細胞の分泌経路に導くシグナルペプチドコード領域でもあり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’末端は、ポリペプチドをコードするコード配列のセグメントと共に、翻訳読み枠において本来連結されるシグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。代わりに、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード配列を本来含有していない場合、外来性のシグナルペプチドコード配列が必要とされる場合がある。代わりに、外来性のシグナルペプチドコード配列により、ポリペプチドの分泌を増強するために天然のシグナルペプチドコード配列を単に置き換え得る。しかしながら、発現されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導く任意のシグナルペプチドコード配列が使用され得る。
細菌宿主細胞のために効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＢＩ １１８３７マルトース生成アミラーゼ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のサブチリシン、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のβ－ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のα－アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）及びバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｐｒｓＡに関する遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１０９－１３７によって記載されている。
糸状真菌宿主細胞のために効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）のセルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）のエンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）のリパーゼ及びリゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼに関する遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
酵母宿主細胞のために有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα因子及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のインベルターゼに関する遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列は、前出のＲｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２によって記載されている。
制御配列は、ポリペプチドのＮ末端に位置するプロペプチドをコードするポリペプチドコード配列でもあり得る。得られたポリペプチドはプロ酵素又はプロポリペプチド（又は場合によりチモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは、一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的切断によって活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード配列は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）のラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα因子に関する遺伝子から得ることができる。
シグナルペプチド及びプロペプチド配列の両方が存在する場合、プロペプチド配列は、ポリペプチドのＮ末端の隣に位置し、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ末端の隣に位置する。
宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現を制御する制御配列を加えることが望ましい場合もある。制御配列の例は、制御化合物の存在を含む化学的刺激又は物理的刺激に対して応答して、遺伝子の発現をオン又はオフさせるものである。原核生物系における制御配列としては、ｌａｃ、ｔａｃ及びｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系が使用され得る。糸状真菌では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡα－アミラーゼプロモータ及びアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のグルコアミラーゼプロモータ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼＩプロモータ及びトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼＩＩプロモータが使用され得る。制御配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらの制御配列として、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素及び重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを制御配列に作動可能に連結することになる。
発現ベクター
本発明は、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ並びに転写及び翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターにも関する。種々のヌクレオチド及び制御配列が共に連結されて、１つ以上の好都合な制限部位をこのような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入又は置換を可能とするために含み得る組換え発現ベクターが生成され得る。代わりに、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が発現に適切な制御配列に作動可能に連結するようにベクター中に配置される。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法を都合よく受けることが可能であり、且つポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能である任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であり得る。ベクターの選択は、通常、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの適合性に依存することになる。ベクターは、直鎖状又は閉環状プラスミドであり得る。
ベクターは、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体又は人工染色体など、自己複製ベクター、すなわち染色体外の実体として存在し、その複製が染色体複製に依存しないベクターであり得る。ベクターは、自己複製を確実なものにするための任意の手段を含有し得る。代わりに、ベクターは、宿主細胞に導入される際にゲノム中に統合され、且つ内部に統合された１つ又は複数の染色体と共に複製されるものであり得る。さらに、単一のベクター若しくはプラスミド、又は宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを共に含有する２つ以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンが使用され得る。
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、トランスダクションなどされた細胞の選択を容易にする１つ以上の選択マーカーを含有することが好ましい。選択マーカーは、その生成物が殺生物剤又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性などをもたらす遺伝子である。
細菌性選択マーカーの例は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）若しくはバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｄａｌ遺伝子又はアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン若しくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための好適なマーカーとしては、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１及びＵＲＡ３が挙げられるが、これらに限定されない。糸状真菌宿主細胞において使用される選択マーカーとしては、ａｄｅＡ（ホスホリボシルアミノイミダゾール－サクシノカルボキサミド合成酵素）、ａｄｅＢ（ホスホリボシル－アミノイミダゾール合成酵素）、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）及びｔｒｐＣ（アントラニル酸合成酵素）並びにこれらの均等物が挙げられるが、これらに限定されない。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞における使用に好適であるのは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子並びにストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子である。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞における使用に好適であるのは、ａｄｅＡ、ａｄｅＢ、ａｍｄＳ、ｈｐｈ及びｐｙｒＧ遺伝子である。
選択マーカーは、国際公開第２０１０／０３９８８９号パンフレットに記載される二重の選択マーカー系であり得る。一態様において、二重の選択マーカーは、ｈｐｈ－ｔｋの二重の選択マーカー系である。
ベクターは、好ましくは、宿主細胞のゲノム中へのベクターの組込み又はゲノムとは独立して細胞内でのベクターの自律複製を可能にする１つ又は複数の要素を含有する。
宿主細胞ゲノム中への組込みに関して、ベクターは、相同又は非相同組換えによるゲノム中への組込みのために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列又はベクターの任意の他の要素に依存し得る。代わりに、ベクターは、１つ又は複数の染色体中の正確な位置での宿主細胞のゲノム中への相同組換えによる組込みを誘導するために追加のポリヌクレオチドを含有し得る。正確な位置での組込みの可能性を増大させるために、組込みエレメントは、相同的組換えの可能性を高めるように対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する十分な数の核酸、例えば１００～１０，０００塩基対、４００～１０，０００塩基対及び８００～１０，０００塩基対を含有すべきである。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同な任意の配列であり得る。さらに、組込みエレメントは、非コード又はコードポリヌクレオチドであり得る。他方では、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
自律複製のために、ベクターは、対象の宿主細胞内でベクターの自律複製を可能にする複製起点をさらに含み得る。複製起点は、細胞内で機能する自律複製を媒介する任意のプラスミドレプリケーターであり得る。用語「複製起点」又は「プラスミドレプリケーター」は、インビボでプラスミド又はベクターの複製を可能にするポリヌクレオチドを意味する。
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７及びｐＡＣＹＣ１８４並びにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０及びｐＡＭβ１の複製起点である。
酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ及びＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せである。
糸状真菌細胞において有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１及びＡＮＳ１である（Ｇｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ ９８：６１－６７；Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９１６３－９１７５、国際公開第００／２４８８３号パンフレット）。ＡＭＡ１遺伝子の単離及びこの遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示される方法に従って実施することができる。
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを宿主細胞内に挿入して、ポリペプチドの産生を増加させ得る。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノム中に組み込むことによるか、又はポリヌクレオチドと共に増幅可能選択マーカー遺伝子を含むことにより達成することができ、この場合、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、それによってポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択薬剤の存在下で細胞を培養することにより選択することができる。
上記のエレメントを結合して本発明の組換え発現ベクターを構築するために使用される手順は、当業者によく知られている（例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。
宿主細胞
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの産生を誘導する１つ以上の制御配列に作動可能に連結されている、組換え宿主細胞にも関する。ポリヌクレオチドを含む構築物又はベクターは、構築物又はベクターが染色体組込み体として又は先に記載される自己複製染色体外ベクターとして維持されるように宿主細胞中に導入される。用語「宿主細胞」は、複製中に起こる変異に起因して親細胞と同一ではない親細胞の任意の後代を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその供給源に大きく依存することになる。
宿主細胞は、本発明のポリペプチドの組換え体産生において有用な任意の細胞、例えば原核生物又は真核生物であり得る。
原核生物の宿主細胞は、任意のグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌であり得る。グラム陽性細菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌としては、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及びウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
細菌宿主細胞としては、限定されるものではないが、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の細胞を含む任意のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
細菌宿主細胞は、限定されるものではないが、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ユベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）及びストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）の細胞を含む任意のストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞でもあり得る。
細菌宿主細胞は、限定されるものではないが、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）及びストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の細胞を含む任意のストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞でもあり得る。
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１－１１５を参照されたい）により、コンピテント細胞形質転換（例えば、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３－８２９又はＤｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ－Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９－２２１を参照されたい）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２－７５１を参照されたい）又はコンジュゲーション（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１－５２７８を参照されたい）によって行われ得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７－５８０を参照されたい）又はエレクトロポレーション（例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７－６１４５を参照されたい）によって行われ得る。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞内へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション（例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９－４０５を参照されたい）、コンジュゲーション（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３－３５８５を参照されたい）又はトランスダクション（例えば、Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６２８９－６２９４を参照されたい）によって行われ得る。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞内へのＤＮＡの導入は、エレクトロポレーション（例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３９１－３９７を参照されたい）又はコンジュゲーション（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ ａｎｄ Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１－５７を参照されたい）によって行われ得る。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞内へのＤＮＡの導入は、自然形質転換能（例えば、Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５－１２９７を参照されたい）、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃａｔｔ ａｎｄ Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ ６８：１８９－２０７を参照されたい）、エレクトロポレーション（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００－３８０４を参照されたい）又はコンジュゲーション（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９－４３６を参照されたい）によって行われ得る。しかしながら、宿主細胞内にＤＮＡを導入するための当技術分野で知られる任意の方法を使用することができる。
宿主細胞は、真核生物、例えば哺乳動物、昆虫、植物又は真菌の細胞でもあり得る。
宿主細胞は、真菌細胞であり得る。本明細書で使用する場合、「真菌」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）及び接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）並びに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）及び全ての不完全菌類（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより定義される）を含む。
真菌宿主細胞は、酵母細胞であり得る。本明細書で使用する場合、「酵母」は、子嚢酵母（エンドミケス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子胞子酵母及び不完全菌類に属する酵母（不完全酵母菌綱（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））を含む。酵母の分類は、将来変更される可能性があるため、本発明の目的のために、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，ａｎｄ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．９，１９８０）に記載されるとおりに定義されるものとする。
酵母宿主細胞は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞、例えばクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クリュイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オヴィフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の細胞であり得る。
真菌宿主細胞は、糸状真菌細胞であり得る。「糸状真菌」は、細分類の真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（前出のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５により定義される）の全ての糸状形態を含む。糸状真菌は、一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合ポリサッカリドで構成される菌糸体壁により特徴付けられる。栄養生長は、菌糸伸長によるものであり、炭素異化は、偏性好気性である。対照的に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母による栄養生長は、単細胞葉状体の出芽によるものであり、炭素異化は、発酵性であり得る。
糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ヤケイロタケ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、カワラタケ属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ヒラタケ属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラディウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ホウロクタケ属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞であり得る。
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベッセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パノンシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・サブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・サベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンズランジカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トプロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コリオラス・ハースタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオプソラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアータ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）の細胞であり得る。
真菌細胞は、それ自体知られている方法において、プロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換及び細胞壁の再生を含む方法により形質転換され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換のための好適な手順は、欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０－１４７４及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１４１９－１４２２において記載される。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換するための好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７－１５６及び国際公開第９６／００７８７号パンフレットによって記載されている。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ １８２－１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；並びにＨｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２０によって記載される手順を用いて形質転換され得る。
生成の方法
本発明は、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）野生型形態において、ポリペプチドを、ポリペプチドの生成を引き起こす条件下で生成する細胞を培養することと；（ｂ）任意選択的に、ポリペプチドを単離することと；（ｃ）ポリペプチドを回収することとを含む方法にも関する。一態様において、細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細胞である。別の態様において、細胞は、バチルス・ホルネキアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｎｅｃｋｉａｅ）細胞である。
本発明は、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、
（ａ）本発明のポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む組換えバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属宿主細胞を培養するステップであって、ポリヌクレオチドは、発現され、及びポリペプチドは、生成される、ステップと；
（ｂ）任意選択的に、ポリペプチドを単離するステップと；
（ｃ）任意選択的に、ポリペプチドを回収するステップと
を含む方法にも関する。
一実施形態において、組換えバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属宿主細胞は、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなるリストから選択される。好ましい実施形態において、組換えバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属宿主細胞は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなるリストから選択される。
宿主細胞は、当技術分野において知られる方法を用いるポリペプチドの産生に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中において並びにポリペプチドの発現及び／又は単離が可能になる条件下での、実験用又は工業用発酵槽におけるフラスコ振盪培養又は小規模若しくは大規模発酵（連続、バッチ、流加又は固体発酵を含む）により培養され得る。培養は、当技術分野において知られる手順を用いて、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む好適な栄養培地において行われる。好適な培地は、市販業者から入手可能であるか又は公開されている組成物に従って調製され得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの目録中）。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは、培地から直接的に回収することができる。ポリペプチドが分泌されない場合、それは、細胞可溶化物から回収することができる。
ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的である、当技術分野において知られる方法を用いて検出され得る。これらの検出法としては、特異抗体の使用、酵素生成物の形成又は酵素基質の消失が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、酵素アッセイを用いてポリペプチドの活性を判定し得る。
ポリペプチドは、当技術分野において知られる方法を用いて回収され得る。例えば、ポリペプチドは、採取、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿を含むが、これらに限定されない従来の手順によって栄養培地から回収され得る。一態様において、ポリペプチドを含む発酵ブロスが回収される。
ポリペプチドは、実質的に純粋な変異体を得るための、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点電気泳動）溶解度の相違（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ又は抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）を含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られる様々な手順によって精製され得る。
別の態様において、ポリペプチドは、回収されず、ポリペプチドを発現する本発明の宿主細胞がポリペプチド源として用いられる。
植物
本発明は、回収可能な量でポリペプチド又はドメインを発現及び産生するように本発明のポリヌクレオチドを含む単離された植物、例えばトランスジェニック植物、植物部分又は植物細胞にも関する。ポリペプチド又はドメインは、植物又は植物部分から回収され得る。代わりに、ポリペプチド又はドメインを含有する植物又は植物部分は、例えば、食品又は飼料の品質を改善する、例えば栄養価、嗜好性及び流体学的性質を向上させるため又は非栄養因子を破壊するために使用され得る。
トランスジェニック植物は、双子葉の（双子葉植物）又は単子葉の（単子葉植物）であり得る。単子葉植物の例は、ナガハグサ（ブルーグラス、ポア属（Ｐｏａ））などのイネ科牧草、フェツカ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、ロリウム属（Ｌｏｌｉｕｍ）などの飼料草、ヌカボ属（Ａｒｇｏｓｔｉｓ）などの寒地型イネ科牧草並びに穀類、例えばコムギ、カラスムギ、ライムギ、オオムギ、イネ、モロコシ及びトウモロコシ（コーン）である。
双子葉植物の例は、タバコ、ルピナスなどのマメ科植物、ジャガイモ、サトウダイコン、エンドウマメ、マメ及びダイズ、並びに例えばカリフラワー、ナタネなどのアブラナ科植物（アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ））、並びに密接に関係したモデル生物であるシロイロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）である。
植物部分の例は、茎、カルス、葉、根、果実、種子及び塊茎並びにこれらの部分を含む個々の組織、例えば表皮、葉肉、柔組織、維管束組織、分裂組織である。
植物細胞及び特定の植物細胞区画、例えば葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソーム及び細胞質も植物部分であると見なされる。
さらに、このような植物、植物部分及び植物細胞の後代も本発明の範囲に含まれる。
当技術分野で知られる方法に従い、ポリペプチド又はドメインを発現するトランスジェニック植物又は植物細胞を構築し得る。
本発明は、本発明のポリペプチド又はドメインを生成する方法であって、（ａ）ポリペプチド又はドメインの産生を促す条件下において、ポリペプチド又はドメインをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物若しくは植物部分を培養すること；及び（ｂ）ポリペプチド又はドメインを回収することを含む方法にも関する。
発酵ブロス製剤又は細胞組成物
本発明は、本発明のポリペプチドを含む発酵ブロス製剤又は細胞組成物にも関する。発酵ブロス産物は、例えば、細胞（本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する宿主細胞であって、目的のポリペプチドの産生に使用される宿主細胞を含む）、細胞片、バイオマス、発酵培地及び／又は発酵産物などの発酵プロセスで用いられる追加の成分をさらに含む。いくつかの実施形態において、組成物は、１つ又は複数の有機酸、死細胞及び／又は細胞片並びに培養培地を含有する死滅した細胞の全ブロスである。
用語「発酵ブロス」は、本明細書で使用する場合、回収及び／又は精製を全く行わないか又は最小限にのみ行う細胞発酵により産生される調製物を指す。例えば、発酵ブロスは、微生物培養物を飽和するまで増殖させ、炭素制限条件下でインキュベートしてタンパク質を合成させて（例えば、宿主細胞による酵素の発現）、細胞培養培地中に分泌させるときに作製される。発酵ブロスは、発酵の終了時に得られる発酵材料の未分画又は分画内容物を含有し得る。通常、発酵ブロスは、未分画であり、使用済みの培養培地及び微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）が例えば遠心分離により除去された後に存在する細胞片を含む。いくつかの実施形態において、発酵ブロスは、使用済みの細胞培養培地、細胞外酵素並びに生存及び／又は非生存微生物細胞を含有する。
実施形態において、発酵ブロス製剤及び細胞組成物は、少なくとも１つの１～５炭素の有機酸及び／又はその塩を含む第１の有機酸成分並びに少なくとも１つの６炭素以上の有機酸及び／又はその塩を含む第２の有機酸成分を含む。特定の実施形態において、第１の有機酸成分は、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、その塩又は前述の２つ以上の混合物であり、第２の有機酸成分は、安息香酸、シクロヘキサンカルボン酸、４－メチル吉草酸、フェニル酢酸、その塩又は前述の２つ以上の混合物である。
一態様において、組成物は、１つ又は複数の有機酸を含有し、且つ任意選択的に死細胞及び／又は細胞片をさらに含有する。一実施形態において、死細胞及び／又は細胞片は、死滅した細胞の全ブロスから除去されて、これらの成分を含まない組成物が提供される。
発酵ブロス製剤又は細胞組成物は、限定されないが、ソルビトール、塩化ナトリウム、ソルビン酸カリウム及び当技術分野において知られる他のものを含む保存剤及び／又は抗菌剤（例えば、静菌剤）をさらに含み得る。
死滅した細胞の全ブロス又は組成物は、発酵の終了時に得られる発酵材料の未分画内容物を含有し得る。通常、死滅した細胞の全ブロス又は組成物は、微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）を飽和するまで増殖させ、炭素制限条件下でインキュベートしてタンパク質を合成させた後に存在する使用済みの培養培地及び細胞片を含有する。いくつかの実施形態において、死滅した細胞の全ブロス又は組成物は、使用済みの細胞培養培地、細胞外酵素及び糸状真菌の死細胞を含有する。いくつかの実施形態において、死滅した細胞の全ブロス又は組成物中に存在する微生物細胞は、当技術分野において知られる方法を用いて透過処理及び／又は溶解され得る。
本明細書に記載されるとおりの全ブロス又は細胞組成物は、通常、液体であるが、死細胞、細胞片、培養培地成分及び／又は１つ若しくは複数の不溶性酵素などの不溶性成分を含有し得る。いくつかの実施形態において、不溶性成分が除去されて清澄化された液体組成物が提供され得る。
本発明の全ブロス製剤及び細胞組成物は、国際公開第９０／１５８６１号パンフレット又は国際公開第２０１０／０９６６７３号パンフレットに記載される方法によって作製され得る。
酵素組成物
本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物にも関する。好ましくは、組成物は、本発明のポリペプチドにおいて濃縮される。用語「濃縮される」は、組成物のプロテアーゼ活性が、例えば少なくとも１．１、例えば少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも２．０、少なくとも３．０、少なくとも４．０、少なくとも５．０、少なくとも１０の濃縮倍率で増加していることを示す。
製剤
本発明の酵素は、液体又は固体として配合され得る。液体製剤について、配合剤は、ポリオール（例えば、グリセロール、エチレングリコール又はプロピレングリコールなど）、塩（例えば、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウムなど）又は糖若しくは糖誘導体（例えば、デキストリン、グルコース、スクロース及びソルビトールなど）を含み得る。したがって、一実施形態において、組成物は、本発明のポリペプチド並びにグリセロール、エチレングリコール、１，２－プロピレングリコール、１，３－プロピレングリコール、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、デキストリン、グルコース、スクロース及びソルビトールからなるリストから選択される１つ以上の配合剤を含む液体組成物である。液体製剤は、飼料をペレット化した後にそれに噴霧され得るか、又は動物に与える飲用水に添加され得る。
固体製剤について、製剤は、例えば、顆粒、噴霧乾燥粉末又は集塊物としてであり得る（例えば、国際公開第００／７００３４号パンフレットに開示されるとおり）。配合剤は、塩（有機又は無機亜鉛、ナトリウム、カリウム又はカルシウム塩、例えば酢酸カルシウム、安息香酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カリウム、安息香酸カリウム、炭酸カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸カリウム、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸亜鉛、安息香酸亜鉛、炭酸亜鉛、塩化亜鉛、クエン酸亜鉛、ソルビン酸亜鉛、硫酸亜鉛）、デンプン又は糖若しくは糖誘導体（例えば、スクロース、デキストリン、グルコース、ラクトース、ソルビトールなど）を含み得る。
一実施形態において、組成物は、本発明のプロテアーゼ並びに塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラクトース、デンプン及びセルロースからなるリストから選択される１つ以上の配合剤を含む噴霧乾燥組成物などの固体組成物である。好ましい実施形態において、配合剤は、次の化合物：硫酸ナトリウム、デキストリン、セルロース、チオ硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び炭酸カルシウムの１つ以上から選択される。
本発明は、本発明のプロテアーゼを任意選択的に１つ以上の追加の酵素と組み合わせて含む酵素顆粒／粒子にも関する。顆粒は、コア及び任意選択的にコアを取り囲む１つ以上のコーティング（外層）で構成される。
通常、顆粒の顆粒／粒子サイズは、同等の球体直径（体積基準の平均粒径）として計測して、２０～２０００μｍ、特に５０～１５００μｍ、１００～１５００μｍ又は２５０～１２００μｍである。
コアは、例えば、結晶化、沈殿、パンコーティング、流動層コーティング、流動層凝集、回転噴霧、押出、プリリング、球形化、破砕法、ドラム造粒及び／又は高せん断造粒などの造粒技術を含む方法により、原料のブレンドを造粒することにより調製することができる。
コアの調製方法については、Ｃ．Ｅ．Ｃａｐｅｓ；Ｖｏｌｕｍｅ １；１９８０；ＥｌｓｅｖｉｅｒによるＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｏｗｄｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔにおいて見出すことができる。調製方法は、既知の飼料及び顆粒形成技術を含み、例えば、
ａ）噴霧乾燥生成物、ここで、液体酵素含有溶液は、噴霧乾燥塔で霧化されて小さい液滴を形成し、それらが乾燥塔内を下る間に乾燥して酵素含有粒子材料を形成する；
ｂ）積層生成物、ここで、酵素は、予め形成された不活性コア粒子の周りの層としてコーティングされ、通常、予め形成されたコア粒子が流動化されている流動層装置で酵素含有溶液が霧化され、酵素含有溶液がコア粒子に付着して乾ききると、コア粒子の表面上に乾燥酵素の層が残る。所望の粒径の有用なコア粒子を見出すことができる場合、このようにして所望の粒径の粒子を得ることができる。この種の生成物については、例えば、国際公開第９７／２３６０６号パンフレットに記載される；
ｃ）吸収コア粒子、ここで、酵素をコアの周りに層としてコーティングするというよりむしろ、酵素がコアの表面上及び／又はその中に吸収される。このようなプロセスは、国際公開第９７／３９１１６号パンフレットに記載されている。
ｄ）押出し又はペレット化された生成物、ここで、酵素含有ペーストが加圧によりペレット化されるか、又は圧力下で小さい開口を通じて押し出されて切断されることにより粒子となり、続いて乾燥される。押出し開口が作られる材料（通常、穿孔を有するプレート）が押出し開口に対する許容圧力降下を制限するため、このような粒子は、通常、かなりのサイズを有する。また、小さい開口を用いる場合に押出し圧力が極めて高くなると酵素ペーストの熱生成が増加し、これは、酵素にとって有害である；
ｅ）プリリング生成物、ここで、酵素含有粉末は、溶融ワックス中において懸濁され、この懸濁液が例えば回転ディスク噴霧器を通じて冷却チャンバー内へと噴霧され、そこで液滴が急速に固化する（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ．Ｓｈｏｗｅｌｌ（編者）；Ｐｏｗｄｅｒｅｄ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ；Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ；１９９８；ｖｏｌ．７１；頁１４０－１４２；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）。得られる生成物は、酵素が不活性材料の表面に集中する代わりに、その全体にわたって均一に分布しているものである。米国特許第４，０１６，０４０号明細書及び米国特許第４，７１３，２４５号明細書もこの技術に関する；
ｆ）ミキサー造粒生成物、ここで、例えば従来の造粒成分の乾燥粉末組成物に液体が添加され、酵素は、液体又は粉末のいずれか又は両方によって導入される。この液体と粉末とが混合され、液体の水分が乾燥粉末に吸収されるにつれて乾燥粉末の成分が付着して凝集し始めることになり、粒子が構築されて、酵素を含む顆粒が形成されることになる。このようなプロセスは、米国特許第４，１０６，９９１号明細書及び関連文献の欧州特許第１７０３６０号明細書、欧州特許第３０４３３２号明細書、欧州特許第３０４３３１号明細書、国際公開第９０／０９４４０号パンフレット及び国際公開第９０／０９４２８号パンフレットに記載されている。様々な高せん断ミキサーが造粒器として使用され得るこのプロセスの特定の生成物では、酵素、充填剤及び結合剤などからなる顆粒をセルロース繊維と混合して粒子を強化することにより、いわゆるＴ－顆粒が得られる。より強固である強化粒子は、放出される酵素粉塵が少ない。
ｇ）破砕、ここで、酵素を含有する大きい粒子、ペレット、錠剤、ブリケットなどの粉砕又は破砕によってコアが作製される。求められるコア粒子画分は、粉砕又は破砕生成物を篩分けすることによって得られる。過大及び過小な粒径の粒子は、再利用することができる。破砕については、（Ｍａｒｔｉｎ Ｒｈｏｄｅｓ（編者）；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｗｄｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１９９０；Ｃｈａｐｔｅｒ １０；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に記載される；
ｈ）流動層造粒、これは、微粒子を気流中に懸濁させ、その流動化粒子にノズルを介して液体を噴霧することを伴う。噴霧液滴が当たった粒子は、湿って粘着性になる。この粘着性粒子が他の粒子に衝突してそれらに付着し、顆粒を形成する；
ｉ）コアは、流動層乾燥機などで乾燥に供され得る。飼料又は洗剤工業における顆粒を乾燥させるための他の既知の方法が当業者によって用いられ得る。乾燥は、好ましくは、２５～９０℃の生成物温度で行われる。いくつかの酵素について、酵素を含むコアがコーティング前に少量の水を含有することが重要である。過剰な水が除去される前に感水性の酵素がコーティングされる場合、それがコア内に捕捉されることになり、酵素の活性に悪影響を及ぼし得る。乾燥後、コアは、好ましくは、０．１～１０％ｗ／ｗの水を含有する。
コアは、充填材、繊維材（セルロース又は合成繊維）、安定化剤、可溶化剤、懸濁剤、粘度調節剤、軽質量の球体、可塑剤、塩、潤滑剤及び芳香剤などの追加の材料を含み得る。
コアは、合成ポリマー、ワックス、脂肪又は炭水化物などの結合剤を含み得る。
コアは、多価カチオンの塩、還元剤、抗酸化剤、過酸化物分解触媒及び／又は酸性緩衝剤成分を典型的には均質なブレンドとして含み得る。
一実施形態において、コアは、塩（酢酸カルシウム、安息香酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カリウム、安息香酸カリウム、炭酸カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸カリウム、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸亜鉛、安息香酸亜鉛、炭酸亜鉛、塩化亜鉛、クエン酸亜鉛、ソルビン酸亜鉛、硫酸亜鉛など）、デンプン又は糖若しくは糖誘導体（例えば、スクロース、デキストリン、グルコース、ラクトース、ソルビトールなど）、糖又は糖誘導体（例えば、スクロース、デキストリン、グルコース、ラクトース、ソルビトールなど）、有機小分子、デンプン、小麦粉、セルロース及びミネラル及び粘土鉱物（含水フィロケイ酸アルミニウムとしても知られる）からなる群から選択される材料を含む。一実施形態において、コアは、カオリナイト又はカオリンなどの粘土鉱物を含む。
コアは、酵素が内部に吸収される不活性粒子又は例えば流動層コーティングにより酵素が表面に塗布される不活性粒子を含み得る。
コアは、２０～２０００μｍ、特に５０～１５００μｍ、１００～１５００μｍ又は２５０～１２００μｍの直径を有し得る。
例えば、貯蔵安定性を向上させるか、取り扱い中の粉塵形成を低減するか、又は顆粒を着色するために、コアを少なくとも１つのコーティングによって取り囲み得る。任意選択的なコーティングは、塩、及び／若しくはワックス、及び／若しくは小麦粉コーティング又は他の好適なコーティング材料を含み得る。
コーティングは、コアの少なくとも０．１重量％、例えば少なくとも０．５％、１％又は５％などの量で塗布され得る。この量は、最大１００％、７０％、５０％、４０％又は３０％であり得る。
コーティングは、厚さが少なくとも０．１μｍ、特に少なくとも０．５μｍ、少なくとも１μｍ又は少なくとも５μｍであるのが好ましい。いくつかの実施形態において、コーティングの厚さは、１００μｍ未満、例えば６０μｍ未満又は４０μｍ未満である。
コーティングは、実質的に連続した層を形成することにより、コアユニットを被包する必要がある。実質的に連続的な層とは、孔がほとんど又は全くないコーティングであり、そのため、コーティングされていない範囲がほとんど又は全くない状態でコアユニットが被包又は封入されるものと理解されるべきである。特定の実施形態において、層又はコーティングは、厚さが均一でなければならない。
コーティングは、当技術分野で知られる他の材料、例えば充填材、固着防止剤、顔料、染料、可塑剤及び／又は結合剤、例えば二酸化チタン、カオリン、炭酸カルシウム又はタルクをさらに含有することができる。
塩コーティングは、少なくとも６０重量％、例えば少なくとも６５重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％又は少なくとも９９重量％の塩を含み得る。
塩は、塩を完全に溶解させた塩溶液又は微粒子が１０μｍ未満若しくは５μｍ未満など、５０μｍ未満である塩懸濁液から添加され得る。
塩コーティングは、単一の塩又は３種以上の塩の混合物を含み得る。塩は、水溶性であり、特に２０℃で１００ｇの水中で少なくとも０．１ｇ、好ましくは水１００ｇあたり少なくとも０．５ｇ、例えば水１００ｇあたり少なくとも１ｇ、例えば水１００ｇあたり少なくとも５ｇの溶解度を有し得る。
塩は、無機塩、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、硝酸塩、塩化物若しくは炭酸塩の塩又はクエン酸塩、マロン酸塩若しくは酢酸塩などの単純な有機酸（炭素数１０未満、例えば炭素数６以下）の塩であり得る。これらの塩のカチオンの例は、アルカリ若しくはアルカリ土類金属イオン、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛若しくはアルミニウムなどの第一遷移金属のアンモニウムイオン又は金属イオンである。アニオンの例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、一塩基リン酸塩、二塩基リン酸塩、次亜リン酸塩、ピロリン酸二水素、四ホウ酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、メタケイ酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、ソルビン酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、酪酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩又はグルコン酸塩が挙げられる。特に、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、硝酸塩、塩化物若しくは炭酸塩のアルカリ若しくはアルカリ土類金属塩又はクエン酸塩、マロン酸塩若しくは酢酸塩などの単純な有機酸の塩が使用され得る。
コーティング中の塩は、２０℃で６０％超、特に７０％超、８０％超若しくは８５％超の一定湿度を有するか、又はこのような塩の別の水和物形態（例えば、無水物）であり得る。塩コーティングは、国際公開第９７／０５２４５号パンフレット、国際公開第９８／５４９８０号パンフレット、国際公開第９８／５５５９９号パンフレット、国際公開第００／７００３４号パンフレット、国際公開第０６／０３４７１０号パンフレット、国際公開第２００８／０１７６６１号パンフレット、国際公開第２００８／０１７６５９号パンフレット、国際公開第００／０２０５６９号パンフレット、国際公開第０１／００４２７９号パンフレット、国際公開第９７／０５２４５号パンフレット、国際公開第００／０１７９３号パンフレット、国際公開第２００３／０５９０８６号パンフレット、国際公開第２００３／０５９０８７号パンフレット、国際公開第２００７／０３１４８３号パンフレット、国際公開第２００７／０３１４８５号パンフレット、国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレット、国際公開第２０１３／１９２０４３号パンフレット、国際公開第２０１４／０１４６４７号パンフレット及び国際公開第２０１５／１９７７１９号パンフレットに記載されるとおりか、又は国際公開第０１／０００４２号パンフレットに記載されるなどのポリマーコーティングであり得る。
好適な塩の具体的な例は、ＮａＣｌ（ＣＨ２０℃＝７６％）、Ｎａ２ＣＯ３（ＣＨ２０℃＝９２％）、ＮａＮＯ３（ＣＨ２０℃＝７３％）、Ｎａ２ＨＰＯ４（ＣＨ２０℃＝９５％）、Ｎａ３ＰＯ４（ＣＨ２５℃＝９２％）、ＮＨ４Ｃｌ（ＣＨ２０℃＝７９．５％）、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４（ＣＨ２０℃＝９３，０％）、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（ＣＨ２０℃＝９３．１％）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（ＣＨ２０℃＝８１．１％）、ＫＣｌ（ＣＨ２０℃＝８５％）、Ｋ２ＨＰＯ４（ＣＨ２０℃＝９２％）、ＫＨ２ＰＯ４（ＣＨ２０℃＝９６．５％）、ＫＮＯ３（ＣＨ２０℃＝９３．５％）、Ｎａ２ＳＯ４（ＣＨ２０℃＝９３％）、Ｋ２ＳＯ４（ＣＨ２０℃＝９８％）、ＫＨＳＯ４（ＣＨ２０℃＝８６％）、ＭｇＳＯ４（ＣＨ２０℃＝９０％）、ＺｎＳＯ４（ＣＨ２０℃＝９０％）及びクエン酸ナトリウム（ＣＨ２５℃＝８６％）である。他の例としては、ＮａＨ２ＰＯ４、（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、ＣｕＳＯ４、Ｍｇ（ＮＯ３）２、酢酸マグネシウム、酢酸カルシウム、安息香酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カリウム、安息香酸カリウム、炭酸カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸亜鉛、安息香酸亜鉛、炭酸亜鉛、塩化亜鉛、クエン酸亜鉛及びソルビン酸亜鉛が挙げられる。
塩は、無水形態であり得、又は水和塩、すなわち国際公開第９９／３２５９５号パンフレットに記載されているものなど、結晶化の結合水を含む結晶塩水和物であり得る。具体例としては、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、リン酸ナトリウム二塩基性七水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４．７Ｈ２Ｏ）、硝酸マグネシウム六水和物（Ｍｇ（ＮＯ３）２（６Ｈ２Ｏ））、クエン酸ナトリウム二水和物及び酢酸マグネシウム四水和物が挙げられる。
好ましくは、塩は、例えば、流動層を用いて塩の溶液として塗布される。
ワックスコーティングは、少なくとも６０重量％、例えば少なくとも６５重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％又は少なくとも９９重量％のワックスを含み得る。
ワックスの具体例は、ポリエチレングリコール類；ポリプロピレン類；カルナウバ蝋；カンデリラ蝋；蜜蝋；水素添加植物油又は獣脂、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルヒドロキシプロピルセルロース（ＭＨＰＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、水素添加牛脂、水素添加パーム油、水素添加綿実及び／又は水素添加ダイズ油；脂肪酸アルコール類；モノグリセリド類及び／又はジグリセリド類、例えばステアリン酸グリセリル（ここでステアリン酸塩はステアリン酸とパルミチン酸との混合物である）；微結晶性ワックス；パラフィン；及び脂肪酸、例えば水素添加直鎖長鎖脂肪酸及びその誘導体である。好ましいワックスは、パーム油又は水素添加パーム油である。
顆粒は、本発明のプロテアーゼを含むコアと、１つ以上の塩コーティングと、１つ以上のワックスコーティングとを含み得る。複数のコーティングを伴う酵素顆粒の例は、国際公開第９３／０７２６３号パンフレット、国際公開第９７／２３６０６号パンフレット及び国際公開第２０１６／１４９６３６号パンフレットに示されている。
非粉塵性顆粒は、例えば、米国特許第４，１０６，９９１号明細書及び同第４，６６１，４５２号明細書に開示されるとおり作製され得、任意選択的に当技術分野において知られる方法によってコーティングされ得る。コーティング材料は、蝋様コーティング材料及び薄膜形成コーティング材料であり得る。ワックスコーティング材料の例は、平均モル重量が１０００～２００００のポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６～５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２～２０個の炭素原子を含有し、且つ１５～８０のエチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ－及びジ－及びトリグリセリドである。流動層技術による用途に好適な薄膜形成コーティング材料の例は、英国特許第１４８３５９１号明細書に記載されている。
顆粒は、１つ以上の酵素をさらに含み得る。その際、各酵素がより多くの顆粒に存在して、より均一な酵素分布を確保することになり、また粒径が異なることに起因する各種酵素の物理的な分離も減少する。多酵素の共顆粒を作製する方法は、ｉｐ．ｃｏｍ開示ＩＰＣＯＭ０００２００７３９Ｄに開示されている。
共顆粒の使用による酵素製剤の別の例は、国際公開第２０１３／１８８３３１号パンフレットに開示されている。
本発明は、欧州特許第２３８，２１６号明細書に開示される方法に従って作製される保護酵素にも関する。
したがって、さらなる態様において、本発明は、
（ａ）本発明によるプロテアーゼを含むコア、及び
（ｂ）コアを取り囲む１つ以上の層からなるコーティング
を含む顆粒を提供する。
一実施形態において、コーティングは、本明細書に記載されるとおりの塩コーティングを含む。一実施形態において、コーティングは、本明細書に記載されるとおりのワックスコーティングを含む。一実施形態において、コーティングは、本明細書に記載されるとおりの塩コーティングに続くワックスコーティングを含む。
動物用飼料
本発明は、本発明の１つ以上のプロテアーゼを含む動物用飼料にも関する。一実施形態において、本発明は、態様１、２又は３の動物用飼料添加物と、植物ベースの材料とを含む動物用飼料に関する。一実施形態において、本発明は、態様４の顆粒と、植物ベースの材料とを含む動物用飼料に関する。一実施形態において、本発明は、態様５の液体製剤と、植物ベースの材料とを含む動物用飼料に関する。
本発明は、ペレット化された動物用飼料にさらに関する。ペレット化された動物用飼料は、先の段落に記載される動物用飼料をペレット化することによって調製され得る。したがって、一実施形態において、本発明は、態様１、２又は３の動物用飼料添加物と、植物ベースの材料とを含むペレット化された動物用飼料に関する。一実施形態において、本発明は、態様４の顆粒と、植物ベースの材料とを含むペレット化された動物用飼料に関する。一実施形態において、本発明は、態様５の液体製剤と、植物ベースの材料とを含むペレット化された動物用飼料に関する。
一実施形態において、植物ベースの材料は、豆類、穀物、エンバク、ライムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワ、ダイズ、野生ダイズ、インゲンマメ、ルピナス、テパリービーン、ベニバナインゲン、スリムジムビーン（ｓｌｉｍｊｉｍ ｂｅａｎ）、ライマメ、サヤインゲン、ソラマメ（Ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ）（ソラマメ（ｆａｖａ ｂｅａｎ））、ヒヨコマメ、レンズマメ、ピーナッツ、スパニッシュピーナッツ、キャノーラ、ナタネ（セイヨウアブラナ）、イネ、テンサイ、キャベツ、サトウダイコン、ホウレンソウ、キノア又はエンドウマメをその加工形態（例えば、ダイズミール、ナタネミール）又はそれらの任意の組合せで含む。好ましい実施形態において、植物ベースの材料は、ダイズミールである。
動物用飼料組成物又は食餌は、比較的高い含量のタンパク質を有する。家禽及びブタの食餌は、国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの表Ｂの列２～３に示されるとおり特徴付けることができる。魚の食餌は、この表Ｂの列４に示されるとおり特徴付けることができる。さらに、このような魚の食餌は、通常、２００～３１０ｇ／ｋｇの粗脂肪含量を有する。
本発明による動物用飼料組成物は、５０～８００ｇ／ｋｇの粗タンパク質含量を有し、且つ少なくとも１つの本明細書で特許請求されるとおりのプロテアーゼをさらに含む。
さらに又は（上記に示される粗タンパク質含量の）代替として、本発明の動物用飼料組成物は、１０～３０ＭＪ／ｋｇの代謝可能エネルギー含量；及び／又は０．１～２００ｇ／ｋｇのカルシウム含量；及び／又は０．１～２００ｇ／ｋｇの利用可能なリン含量；及び／又は０．１～１００ｇ／ｋｇのメチオニン含量；及び／又は０．１～１５０ｇ／ｋｇのメチオニン＋システイン含量；及び／又は０．５～５０ｇ／のリジン含量を有する。
特定の実施形態において、代謝可能エネルギー、粗タンパク質、カルシウム、リン、メチオニン、メチオニン＋システイン及び／又はリジンの含量は、国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの表Ｂにある範囲２、３、４又は５（Ｒ．２～５）のいずれか１つの範囲内である。
粗タンパク質は、窒素（Ｎ）に係数６．２５を乗じることにより計算され、すなわち粗タンパク質（ｇ／ｋｇ）＝Ｎ（ｇ／ｋｇ）×６．２５である。窒素含量は、ケルダール法（Ａ．Ｏ．Ａ．Ｃ．，１９８４、Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ １４ｔｈ ｅｄ．，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ）によって決定される。
代謝可能エネルギーは、ＮＲＣ刊行物Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｗｉｎｅ，ｎｉｎｔｈ ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄｉｔｉｏｎ １９８８，ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｓｗｉｎｅ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ａｎｉｍａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， ｂｏａｒｄ ｏｆ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｕｎｃｉｌ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．２－６及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｔａｂｌｅ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ Ｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｆｅｅｄ－ｓｔｕｆｆｓ，Ｓｐｅｌｄｅｒｈｏｌｔ ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ ｐｏｕｌｔｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，７３６１ ＤＡ Ｂｅｅｋｂｅｒｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．Ｇｒａｆｉｓｃｈ ｂｅｄｒｉｊｆ Ｐｏｎｓｅｎ＆ｌｏｏｉｊｅｎ ｂｖ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ．ＩＳＢＮ ９０－７１４６３－１２－５に基づいて計算することができる。
完全動物食餌中のカルシウム、利用可能リン及びアミノ酸の食餌含量は、Ｖｅｅｖｏｅｄｅｒｔａｂｅｌ １９９７，ｇｅｇｅｖｅｎｓ ｏｖｅｒ ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ ｓａｍｅｎｓｔｅｌｌｉｎｇ，ｖｅｒｔｅｅｒｂａａｒｈｅｉｄ ｅｎ ｖｏｅｄｅｒｗａａｒｄｅ ｖａｎ ｖｏｅｄｅｒｍｉｄｄｅｌｅｎ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｖｅｅｖｏｅｄｅｒｂｕｒｅａｕ，Ｒｕｎｄｅｒｗｅｇ ６，８２１９ ｐｋ Ｌｅｌｙｓｔａｄ．ＩＳＢＮ ９０－７２８３９－１３－７などの飼料表に基づいて計算される。
特定の実施形態において、本発明の動物用飼料組成物は、上で定義されるとおりの少なくとも１つの植物性タンパク質を含有する。
本発明の動物用飼料組成物は、肉骨粉、羽毛粉及び／又は魚粉などの動物性タンパク質を通常０～２５％の量で含有することもできる。本発明の動物用飼料組成物は、可溶成分を含む乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）を通常０～３０％の量で含むこともできる。
またさらなる特定の実施形態において、本発明の動物用飼料組成物は、０～８０％トウモロコシ；及び／又は０～８０％モロコシ；及び／又は０～７０％コムギ；及び／又は０～７０％オオムギ；及び／又は０～３０％カラスムギ；及び／又は０～４０％ダイズミール；及び／又は０～２５％魚粉；及び／又は０～２５％肉骨粉；及び／又は０～２０％乳清を含有する。
動物用飼料は、植物性タンパク質を含み得る。特定の実施形態において、植物性タンパク質のタンパク質含量は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％（ｗ／ｗ）である。植物性タンパク質は、マメ科植物及び穀類、例えばマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）（マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ））、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）及びイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）の植物からの材料、例えばダイズミール、ルピナスミール、ナタネミール及びこれらの組合せなどの植物性タンパク質供給源に由来し得る。
実施形態において、植物性タンパク質供給源は、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）の１つ以上の植物からの材料、例えばダイズ、ルピナス、エンドウマメ又はマメである。別の実施形態において、植物性タンパク質供給源は、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）の１つ以上の植物からの材料、例えばテンサイ、サトウダイコン、ホウレンソウ又はキノアである。植物性タンパク質供給源の他の例は、ナタネ及びキャベツである。別の実施形態において、ダイズは、好ましい植物性タンパク質供給源である。植物性タンパク質供給源の他の例は、オオムギ、コムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ（コーン）、イネ及びモロコシなどの穀類である。
動物の食餌は、例えばマッシュ飼料（非ペレット状）又はペレット状飼料として製造することができる。通常、粉砕飼料原料が混合され、目的の種に関する規格に従って十分な量の必須ビタミン及びミネラルが加えられる。酵素は、固体又は液体酵素製剤として加えることができる。例えば、マッシュ飼料について、固体又は液体酵素製剤は、原料混合工程前又はその間に加えられ得る。ペレット状飼料について、（液体又は固体）プロテアーゼ／酵素調製物も飼料原料工程前又はその間に加えられ得る。通常、液体プロテアーゼ／酵素調製物は、本発明のプロテアーゼを任意選択的にグリセロール、エチレングリコール又はプロピレングリコールなどのポリオールと共に含み、液体製剤をペレットに噴霧することによるなど、ペレット化工程後に加えられる。酵素も飼料添加物又はプレミックスに取り込まれ得る。
代わりに、プロテアーゼは、粉末ダイズミールなどの増量剤との液体酵素溶液の混合物を冷凍し、続いてその混合物を凍結乾燥することにより調製され得る。
食餌中の最終的な酵素濃度は、食餌１ｋｇあたり０．０１～２００ｍｇの酵素タンパク質、好ましくは０．０５～１００ｍｇ／ｋｇ食餌、より好ましくは０．１～５０ｍｇ、さらにより好ましくは動物の食餌１ｋｇあたり０．２～２０ｍｇの酵素タンパク質の範囲内である。
現在、酵素は、以下の量（投与量範囲）：０．０１～２００；０．０５～１００；０．１～５０；０．２～２０；０．１～１；０．２～２；０．５～５；又は１～１０（－ これらの範囲は、全て飼料１ｋｇあたりのプロテアーゼタンパク質のｍｇ（ｐｐｍ）である）の１つ以上で投与されることが企図される。
飼料１ｋｇあたりのプロテアーゼタンパク質のｍｇを決定するために、プロテアーゼが飼料組成物から精製され、適切なアッセイを用いて精製プロテアーゼの比活性が決定される（プロテアーゼ活性の項を参照されたい）。したがって、飼料組成物のプロテアーゼ活性も同じアッセイを用いて決定され、これらの２つの決定に基づいて、飼料１ｋｇあたりのプロテアーゼタンパク質のｍｇにおける投与量が計算される。
特定の実施形態において、本発明の動物用飼料添加物は、動物の食餌又は飼料中に０．０１～１０．０％；より詳細には０．０５～５．０％；又は０．２～１．０％（％は１００ｇの飼料あたりの添加物のｇを意味する）のレベルで含まれることが意図される（又は含まれる必要があると規定される）。したがって、これは、特にプレミックス用である。
同じ原則が飼料添加物中のプロテアーゼタンパク質のｍｇの決定に適用される。当然のことながら、飼料添加物又は飼料を調製するために使用されるプロテアーゼの試料が利用可能である場合、比活性は、この試料から決定される（飼料組成物又は添加物からプロテアーゼを精製する必要はない）。
追加の酵素
別の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、任意選択的に、１つ以上の酵素を含む。酵素は、ＮＣ－ＩＵＢＭＢ，１９９２）からのハンドブックＥｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅに基づいて分類することができ、インターネット：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｅｎｚｙｍｅ／のＥＮＺＹＭＥサイトも参照されたい。ＥＮＺＹＭＥは、酵素の命名法に関する情報のリポジトリである。これは、主として国際生化学分子生物学連合（ＩＵＢ－ＭＢ）の命名法委員会、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９２の勧告に基づき、ＥＣ（酵素委員会）番号が付与された特徴付けられている各種酵素について記載している（Ｂａｉｒｏｃｈ，２０００，Ｔｈｅ ＥＮＺＹＭＥ ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：３０４－３０５）。このＩＵＢ－ＭＢ酵素命名法は、その基質特異性に基づき、且つ場合によりその分子機構に基づき；このような分類は、これらの酵素の構造的特徴を反映しない。
エンドグルカナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、デキストラナーゼ、リゾチーム及びガラクトシダーゼなどのある種のグリコシドヒドロラーゼ酵素の別の分類は、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ） ｉｎ ２０１３”，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１４）４２（Ｄ１）：Ｄ４９０－Ｄ４９５に記載されている；ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇも参照されたい。
したがって、本発明の組成物は、アセチルキシランエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．２３）、アシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．７２）、α－アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）、β－アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）、アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）、セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、フェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）、ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．８９）、α－ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）、β－ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）、β－グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．６）、β－グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）、リゾホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．５）、リゾチーム（ＥＣ３．２．１．１７）、α－マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２４）、β－マンノシダーゼ（マンナナーゼ）（ＥＣ３．２．１．２５）、フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８、ＥＣ３．１．３．２６、ＥＣ３．１．３．７２）、ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ３．１．１．３２）、ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ３．１．１．４）、ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）、プロテアーゼ（ＥＣ３．４）、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、ペクチンエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１１）、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８、ＥＣ３．２．１．１３６）、β－キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの他の酵素も含み得る。
一実施形態において、本発明の組成物は、ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．８９）及びβ－ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）を含む。
一実施形態において、本発明の組成物は、フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８又は３．１．３．２６）を含む。市販のフィターゼの例として、Ｂｉｏ－Ｆｅｅｄ（商標）Ｐｈｙｔａｓｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｐ、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＮＰ及びＲｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＨｉＰｈｏｓ（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｎａｔｕｐｈｏｓ（商標）（ＢＡＳＦ）、Ｎａｔｕｐｈｏｓ（商標）Ｅ（ＢＡＳＦ）、Ｆｉｎａｓｅ（登録商標）及びＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）Ｂｌｕｅ（ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ）、ＯｐｔｉＰｈｏｓ（登録商標）（Ｈｕｖｅｐｈａｒｍａ）、ＡｖｅＭｉｘ（登録商標）Ｐｈｙｔａｓｅ（Ａｖｅｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｐｈｙｚｙｍｅ（登録商標）ＸＰ（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ／ＤｕＰｏｎｔ）並びにＡｘｔｒａ（登録商標）ＰＨＹ（ＤｕＰｏｎｔ）が挙げられる。他の好ましいフィターゼとして、例えば国際公開第９８／２８４０８号パンフレット、国際公開第００／４３５０３号パンフレット及び国際公開第０３／０６６８４７号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
一実施形態において、本発明の組成物は、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）を含む。市販のキシラナーゼの例として、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＷＸ（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｅｃｏｎａｓｅ（登録商標）ＸＴ及びＢａｒｌｅｙ（ＡＢ Ｖｉｓｔａ）、Ｘｙｌａｔｈｉｎ（登録商標）（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ）、Ｈｏｓｔａｚｙｍ（登録商標）Ｘ（Ｈｕｖｅｐｈａｒｍａ）、Ａｘｔｒａ（登録商標）ＸＢ（キシラナーゼ／β－グルカナーゼ、ＤｕＰｏｎｔ）及びＡｘｔｒａ（登録商標）ＸＡＰ（キシラナーゼ／アミラーゼ／プロテアーゼ、ＤｕＰｏｎｔ）、ＡｖｅＭｉｘ（登録商標）ＸＧ １０（キシラナーゼ／グルカナーゼ）及びＡｖｅＭｉｘ（登録商標）０２ ＣＳ（キシラナーゼ／グルカナーゼ／ペクチナーゼ、Ａｖｅｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ）並びにＮａｔｕｒｇｒａｉｎ（ＢＡＳＦ）が挙げられる。
一実施形態において、本発明の組成物は、プロテアーゼ（ＥＣ３．４）を含む。市販のプロテアーゼの例として、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＰｒｏＡｃｔ（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｗｉｎｚｙｍｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ（登録商標）（Ｓｕｎｔａｑ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ）及びＣｉｂｅｎｚａ（登録商標）ＤＰ１００（Ｎｏｖｕｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）が挙げられる。
一実施形態において、本発明の組成物は、α－アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）を含む。市販のα－アミラーゼの例として、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）Ａ及びＲＯＮＯＺＹＭＥ（登録商標）ＲｕｍｉＳｔａｒ（商標）（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が挙げられる。
一実施形態において、本発明の組成物は、多成分酵素製品、例えばＦＲＡ（登録商標）Ｏｃｔａｚｙｍｅ（Ｆｒａｍｅｌｃｏ）、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ２、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＶＰ及びＲｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＭｕｌｔｉＧｒａｉｎ（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｒｏｖａｂｉｏ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ又はＲｏｖａｂｉｏ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（Ａｄｉｓｓｅｏ）、Ｅｎｄｏｆｅｅｄ（登録商標）ＤＣ（エンド－１，３（４）－β－グルカナーゼ及びエンド－１，４－β－キシラナーゼ、Ａｎｄｒｅｓ Ｐｉｎｔａｌｕｂａ ＳＡ）又はＡｍｙｌｏｆｅｅｄ（登録商標）（エンド－１，３（４）－β－グルカナーゼ及びエンド－１，４－β－キシラナーゼ及びα－アミラーゼ、Ａｎｄｒｅｓ Ｐｉｎｔａｌｕｂａ ＳＡ）を含む。
ユーバイオティクス
ユーバイオティクスは、胃腸管内の健常なミクロフローラのバランスをもたらすように設計される化合物である。ユーバイオティクスは、以下にさらに詳細に記載されるプロバイオティクス、プレバイオティクス、植物抽出物（精油）及び有機酸など、いくつかの異なる飼料添加物を包含する。
プロバイオティクス
実施形態において、動物用飼料組成物は、１つ以上の追加のプロバイオティクスをさらに含む。実施形態において、動物用飼料組成物は、以下の属：ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）及びメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）の１つ以上からの細菌又はこれらの任意の組合せをさらに含む。
実施形態において、動物用飼料組成物は、以下の株：バチルス・サブティルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）及びペディオコッカス属種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）、ビフィドバクテリウム属種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｓｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｓｐ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、メガスフェラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）属種の１つ以上からの細菌をさらに含む。
実施形態において、組成物、動物用飼料添加物又は動物用飼料は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の以下の株：３Ａ－Ｐ４（ＰＴＡ－６５０６）、１５Ａ－Ｐ４（ＰＴＡ－６５０７）、２２Ｃ－Ｐ１（ＰＴＡ－６５０８）、２０８４（ＮＲＲＬ Ｂ－５００１３０）、ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ－Ｂ－５０１０４）、ＢＳ２７（ＮＲＲＬ Ｂ－５０１ ０５）、ＢＳ １８（ＮＲＲＬ Ｂ－５０６３３）、ＢＳ ２７８（ＮＲＲＬ Ｂ－５０６３４）、ＤＳＭ ２９８７０、ＤＳＭ ２９８７１、ＤＳＭ ３２３１５、ＮＲＲＬ Ｂ－５０１３６、ＮＲＲＬ Ｂ－５０６０５、ＮＲＲＬ Ｂ－５０６０６、ＮＲＲＬ Ｂ－５０６２２及びＰＴＡ－７５４７の１つ以上からの細菌をさらに含む。
実施形態において、組成物、動物用飼料添加物又は動物用飼料は、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）の以下の株：ＮＲＲＬ Ｂ－５００１６、ＡＴＣＣ ７００３８５、ＮＲＲＬ Ｂ－５０８８５又はＮＲＲＬ Ｂ－５０８８６の１つ以上からの細菌をさらに含む。
実施形態において、組成物、動物用飼料添加物又は動物用飼料は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ）の以下の株：ＮＲＲＬ Ｂ ５００１５、ＮＲＲＬ Ｂ－５０６２１又はＮＲＲＬ Ｂ－５０６２３の１つ以上からの細菌をさらに含む。
実施形態において、組成物、動物用飼料添加物又は動物用飼料は、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の以下の株：ＤＳＭ ２９８６９、ＤＳＭ ２９８６９、ＮＲＲＬ Ｂ ５０６０７、ＰＴＡ－７５４３、ＰＴＡ－７５４９、ＮＲＲＬ Ｂ－５０３４９、ＮＲＲＬ Ｂ－５０６０６、ＮＲＲＬ Ｂ－５００１３、ＮＲＲＬ Ｂ－５０１５１、ＮＲＲＬ Ｂ－５０１４１、ＮＲＲＬ Ｂ－５０１４７又はＮＲＲＬ Ｂ－５０８８８の１つ以上からの細菌をさらに含む。
動物用飼料組成物中の細菌株の各々の細菌数は、１×１０４～１×１０１４ＣＦＵ／乾燥物質ｋｇ、好ましくは１×１０６～１×１０１２ＣＦＵ／乾燥物質ｋｇ及びより好ましくは１×１０７～１×１０１１ＣＦＵ／乾燥物質ｋｇである。実施形態において、動物用飼料組成物中の細菌株の各々の細菌数は、１×１０８～１×１０１０ＣＦＵ／乾燥物質ｋｇである。
動物用飼料組成物中の細菌株の各々の細菌数は、１×１０５～１×１０１５ＣＦＵ／動物／日、好ましくは１×１０７～１×１０１３ＣＦＵ／動物／日及びより好ましくは１×１０８～１×１０１２ＣＦＵ／動物／日である。実施形態において、動物用飼料組成物中の細菌株の各々の細菌数は、１×１０９～１×１０１１ＣＦＵ／動物／日である。一実施形態において、プロバイオティクスの量は、組成物の重量を基準として０．００１％～１０％である。
別の実施形態において、１つ以上の細菌株は、安定した胞子の形態で存在する。
市販の製品の例は、Ｃｙｌａｃｔｉｎ（登録商標）（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ａｌｔｅｒｉｏｎ（Ａｄｉｓｓｅｏ）、Ｅｎｖｉｖａ ＰＲＯ（ＤｕＰｏｎｔ Ａｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、Ｓｙｎｃｒａ（登録商標）（ミックス酵素＋プロバイオティクス、ＤｕＰｏｎｔ Ａｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、Ｅｃｏｂｉｏｌ（登録商標）及びＦｅｃｉｎｏｒ（登録商標）（Ｎｏｒｅｌ／Ｅｖｏｎｉｋ）及びＧｕｔＣａｒｅ（登録商標）ＰＹ１（Ｅｖｏｎｉｋ）である。
プレバイオティクス
プレバイオティクスは、宿主の良好な状態に寄与する微生物（例えば、細菌及び真菌）の増殖又は活性を誘導する物質である。プレバイオティクスは、通常、胃腸管の上部を消化されずに通過し、大腸に定着する有利な細菌の増殖又は活性を、それらのための基質として作用することにより刺激する難消化性繊維化合物である。通常、プレバイオティクスは、胃腸管内のビフィズス菌及び乳酸菌の数又は活性を増加させる。
酵母派生物（不活化全酵母又は酵母細胞壁）もプレバイオティクスと見なすことができる。それらは、マンナンオリゴ糖、酵母βグルカン又はタンパク質内容物を含むことが多く、通常、酵母、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞壁に由来する。
一実施形態において、プレバイオティクスの量は、組成物の重量を基準として０．００１％～１０％である。酵母製品の例は、Ｙａｎｇ（登録商標）及びＡｇｒｉｍｏｓ（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）である。
植物抽出物
植物抽出物は、ハーブ、香辛料又は他の植物に由来する、飼料添加物として使用される天然の成長促進物質又は非抗生物質系成長促進物質の群である。植物抽出物は、精油／抽出物から調製される単一の物質、精油／抽出物、単一の植物及び植物の混合物（ハーブ生成物）又は精油／抽出物／植物の混合物（特殊化された生成物）であり得る。
植物抽出物の例は、ローズマリー、セージ、オレガノ、タイム、チョウジ及びレモングラスである。精油の例は、チモール、オイゲノール、メタクレゾール、バニリン、サリチル酸塩、レゾルシン、グアイアコール、ギンゲロール、ラベンダー油、イオノン類、イロン、ユーカリプトール、メントール、ハッカ油、α－ピネン；リモネン、アネトール、リナロール、ジヒドロジャスモン酸メチル、カルバクロール、プロピオン酸／プロピオン酸塩、酢酸／酢酸塩、酪酸／酪酸塩、ローズマリー油、チョウジ油、ゲラニオール、テルピネオール、シトロネロール、アミル及び／又はサリチル酸ベンジル、シンナムアルデヒド、植物性ポリフェノール（タンニン）、ターメリック並びにウコン抽出物である。
一実施形態において、植物抽出物の量は、組成物の重量を基準として０．００１％～１０％である。市販の製品の例は、Ｃｒｉｎａ（登録商標）（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）；Ｃｉｎｅｒｇｙ（商標）、Ｂｉａｃｉｄ（商標）、ＰｒｏＨａｃｉｄ（商標）Ｃｌａｓｓｉｃ及びＰｒｏＨａｃｉｄ（商標）Ａｄｖａｎｃｅ（商標）（全てＰｒｏｍｉｖｉ／Ｃａｒｇｉｌｌ）及びＥｎｖｉｖｏ ＥＯ（ＤｕＰｏｎｔ Ａｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）である。
有機酸
有機酸（Ｃ１～Ｃ７）は、植物又は動物組織の通常の構成要素として自然界に広く分布している。それらは、主に大腸内の炭水化物の微生物発酵を通しても形成される。それらは、ニワトリの壊死性腸炎及び子ブタの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）感染のような、腸の問題に対する予防効果を有するため、ブタ及び家禽生産において抗生物質系成長促進物質の代用品として使用されることが多い。有機酸は、単成分として又は典型的には２つ若しくは３つの異なる有機酸の混合物として販売されている場合がある。有機酸の例として、短鎖脂肪酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸）、中鎖脂肪酸（例えば、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸）、ジ／トリカルボン酸（例えばフマル酸）、ヒドロキシ酸（例えば、乳酸）、芳香族酸（例えば、安息香酸）、クエン酸、ソルビン酸、リンゴ酸及び酒石酸又はそれらの塩（典型的にはナトリウム塩又はカリウム塩、例えば二ギ酸カリウム又は酪酸ナトリウム）がある。
一実施形態において、有機酸の量は、組成物の重量を基準として０．００１％～１０％である。市販の製品の例は、ＶｅｖｏＶｉｔａｌｌ（登録商標）（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ａｍａｓｉｌ（登録商標）、Ｌｕｐｒｉｓｉｌ（登録商標）、Ｌｕｐｒｏ－Ｇｒａｉｎ（登録商標）、Ｌｕｐｒｏ－Ｃｉｄ（登録商標）、Ｌｕｐｒｏ－Ｍｉｘ（登録商標）（ＢＡＳＦ）、ｎ－Ｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ ＡＦ（ＯＸＥＡ）及びＡｄｉｍｉｘ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ（Ｎｕｔｒｉａｄ）である。
プレミックス
本明細書で上に例示されるとおりの飼料添加物の組成物の動物用飼料、例えば家禽飼料への取り込みは、実際には濃縮物又はプレミックスを使用して行われる。プレミックスは、１つ以上の微量原料と希釈剤及び／又は担体との好ましくは均一な混合物を意味する。プレミックスは、より大量の混合物中における微量原料の一様な分布を促進するために用いられる。本発明によるプレミックスは、飼料原料又は飲用水に固体として（例えば、水溶性粉末として）又は液体として加えることができる。
アミノ酸
本発明の組成物は、１つ以上のアミノ酸をさらに含み得る。動物用飼料中に使用されるアミノ酸の例は、リジン、アラニン、β－アラニン、スレオニン、メチオニン及びトリプトファンである。一実施形態において、アミノ酸の量は、組成物の重量を基準として０．００１％～１０％である。
ビタミン及びミネラル
別の実施形態において、動物用飼料は、１つ以上の脂溶性ビタミン及び／又は１つ以上の水溶性ビタミンなど、１つ以上のビタミンを含み得る。別の実施形態において、動物用飼料は、任意選択的に、１つ以上の微量ミネラル及び／又は１つ以上の大量のミネラルなど、１つ以上のミネラルを含み得る。
通常、脂溶性及び水溶性ビタミン並びに微量ミネラルは、飼料への添加が意図されるいわゆるプレミックスの一部を形成する一方、多量ミネラルは、通常、飼料に別々に添加される。
脂溶性ビタミンの非限定的な例としては、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ及びビタミンＫ、例えばビタミンＫ３が挙げられる。
水溶性ビタミンの非限定的な例としては、ビタミンＣ、ビタミンＢ１２、ビオチン及びコリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸及びパントテン酸、例えばＣａ－Ｄ－パントテン酸が挙げられる。
微量ミネラルの非限定的な例としては、ホウ素、コバルト、塩化物、クロム、銅、フッ化物、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ヨウ素、セレン及び亜鉛が挙げられる。
多量ミネラルの非限定的な例としては、カルシウム、マグネシウム、リン、カリウム及びナトリウムが挙げられる。
一実施形態において、ビタミンの量は、組成物の重量を基準として０．００１％～１０％である。一実施形態において、ミネラルの量は、組成物の重量を基準として０．００１％～１０％である。
これらの成分の（家禽及び子ブタ／ブタにより例示される）栄養所要量は、国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの表Ａに挙げられている。栄養所要量とは、これらの成分が指定の濃度で食餌に供給される必要があることを意味する。
代替として、本発明の動物用飼料添加物は、国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの表Ａに指定される個別の成分の少なくとも１つを含む。少なくとも１つとは、１つ、又は２つ、又は３つ、又は４つなど、全てで最大１３又は全てで最大１５の個別の成分のいずれか、１つ又は２つ以上を意味する。より具体的には、この少なくとも１つの個別の成分は、表Ａの第４列、又は第５列、又は第６列に示される範囲内の飼料中濃度を提供するような量で本発明の添加物に含まれる。
さらに別の実施形態において、本発明の動物用飼料添加物は、以下のビタミンの少なくとも１つを含み、好ましくは以下の表１に指定される範囲内の飼料中濃度を（それぞれ子ブタの食餌及びブロイラーの食餌について）提供する。
Figure 0007515396000002
他の飼料原料
本発明の組成物は、着色剤、安定剤、成長向上添加物及びアロマ化合物／香味剤、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）；活性酸素発生種、抗酸化剤、抗菌ペプチド、抗真菌ポリペプチド及びマイコトキシン管理化合物をさらに含み得る。
着色剤の例は、β－カロチン、アスタキサンチン及びルテインなどのカロテノイド類である。
アロマ化合物／香味剤の例は、クレオソール、アネトール、デカラクトン、ウンデカラクトン及び／又はドデカラクトン、イオノン類、イロン、ギンゲロール、ピペリジン、プロピリデンフタライド（ｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ ｐｈａｔａｌｉｄｅ）、ブチリデンフタライド（ｂｕｔｙｌｉｄｅｎｅ ｐｈａｔａｌｉｄｅ）、カプサイシン及びタンニンである。
抗菌ペプチド（ＡＭＰ）の例は、国際公開第０３／０４４０４９号パンフレット及び国際公開第０３／０４８１４８号パンフレットに開示される化合物及びポリペプチドを含む、ＣＡＰ１８、ロイコシンＡ（Ｌｅｕｃｏｃｉｎ Ａ）、トリトルプチシン、プロテグリン－１、タナチン、デフェンシン、ラクトフェリン、ラクトフェリシン及びノビスピリン（Ｒｏｂｅｒｔ Ｌｅｈｒｅｒ，２０００）などのオビスピリン、プレクタシン類及びスタチン類並びに抗菌活性を保持する上記の変異体又は断片である。
抗真菌ポリペプチド（ＡＦＰ）の例は、国際公開第９４／０１４５９号パンフレット及び国際公開第０２／９０３８４号パンフレットに開示されるとおりの、アスペルギルス・ギガンテウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ペプチド並びに抗真菌活性を保持するその変異体及び断片である。
多価不飽和脂肪酸の例は、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸及びγ－リノール酸など、Ｃ１８、Ｃ２０及びＣ２２多価不飽和脂肪酸である。
活性酸素発生種の例は、過ホウ酸塩、過硫酸塩又は過炭酸塩などの化学物質；及びオキシダーゼ、オキシゲナーゼ又はシンテターゼなどの酵素である。
抗酸化剤を使用して、発生し得る活性酸素種の数を制限して、活性酸素種レベルを抗酸化剤と均衡させることができる。
動物用飼料中にデオキシニバレノール、アフラトキシン、ゼアラレノン及びフモニシンなどのマイコトキシンが見出される場合があり、負の動物性能又は病気をもたらし得る。マイコトキシンの失活によるか、又はマイコトキシンの結合によるなどしてマイコトキシンレベルを管理することができる化合物を飼料に添加して、これらの負の効果を改善することができる。マイコトキシン管理化合物の例は、Ｖｉｔａｆｉｘ（登録商標）、Ｖｉｔａｆｉｘ Ｕｌｔｒａ（Ｎｕｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｍｙｃｏｆｉｘ（登録商標）、Ｍｙｃｏｆｉｘ（登録商標）Ｓｅｃｕｒｅ、ＦＵＭｚｙｍｅ（登録商標）、Ｂｉｏｍｉｎ（登録商標）ＢＢＳＨ、Ｂｉｏｍｉｎ（登録商標）ＭＴＶ（Ｂｉｏｍｉｎ）、Ｍｏｌｄ－Ｎｉｌ（登録商標）、Ｔｏｘｙ－Ｎｉｌ（登録商標）及びＵｎｉｋｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ（Ｎｕｔｒｉａｄ）である。
動物用飼料を調製する方法
本発明は、動物用飼料を調製する方法であって、態様１、２又は３の動物用飼料添加物を少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質源と混合することを含む方法にさらに関する。本発明は、動物用飼料を調製する方法であって、態様４の顆粒を少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質源と混合することを含む方法にさらに関する。本発明は、動物用飼料を調製する方法であって、態様５の液体製剤を少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質源と混合することを含む方法にさらに関する。
一実施形態において、タンパク質又はタンパク質源は、豆類、穀物、エンバク、ライムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワ、ダイズ、野生ダイズ、インゲンマメ、ルピナス、テパリービーン、ベニバナインゲン、スリムジムビーン、ライマメ、サヤインゲン、ソラマメ（Ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ）（ソラマメ（ｆａｖａ ｂｅａｎ））、ヒヨコマメ、レンズマメ、ピーナッツ、スパニッシュピーナッツ、キャノーラ、ナタネ（セイヨウアブラナ）、イネ、テンサイ、キャベツ、サトウダイコン、ホウレンソウ、キノア又はエンドウマメをその加工形態（例えば、ダイズミール、ナタネミール）又はそれらの任意の組合せで含む。好ましい実施形態において、タンパク質又はタンパク質源は、ダイズミールである。
本発明は、動物用飼料を調製する方法であって、態様５の液体製剤を植物ベースの材料に塗布することを含む方法にさらに関する。一実施形態において、液体製剤は、スプレーを介して塗布される。さらなる実施形態において、植物ベースの材料は、豆類、穀物、エンバク、ライムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワ、ダイズ、野生ダイズ、インゲンマメ、ルピナス、テパリービーン、ベニバナインゲン、スリムジムビーン、ライマメ、サヤインゲン、ソラマメ（Ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ）（ソラマメ（ｆａｖａ ｂｅａｎ））、ヒヨコマメ、レンズマメ、ピーナッツ、スパニッシュピーナッツ、キャノーラ、ナタネ（セイヨウアブラナ）、イネ、テンサイ、キャベツ、サトウダイコン、ホウレンソウ、キノア又はエンドウマメをその加工形態（例えば、ダイズミール、ナタネミール）又はそれらの任意の組合せで含む。好ましい実施形態において、植物ベースの材料は、ダイズミールである。
動物性能を向上させる方法
本発明は、動物の１つ以上の性能パラメータを向上させる方法であって、１つ以上の動物に態様１、２又は３の動物用飼料添加物を投与することを含む方法にさらに関する。本発明は、動物の１つ以上の性能パラメータを向上させる方法であって、１つ以上の動物に態様４の顆粒を投与することを含む方法にさらに関する。本発明は、動物の１つ以上の性能パラメータを向上させる方法であって、１つ以上の動物に態様５の液体製剤を投与することを含む方法にさらに関する。
一実施形態において、動物用飼料は、本明細書に記載され、且つ動物に投与される動物用飼料添加物、顆粒又は液体製剤から調製される。本発明は、動物の１つ以上の性能パラメータを向上させる方法であって、１つ以上の動物に、本発明のＳ８プロテアーゼを含む動物用飼料又はペレット化された動物用飼料を投与することを含む方法にさらに関する。
一実施形態において、「動物の性能を向上させる」は、体重増加の上昇があることを意味する。別の実施形態において、「動物の性能を向上させる」は、飼料要求率の向上があることを意味する。さらなる実施形態において、「動物の性能を向上させる」は、飼料効率の上昇があることを意味する。さらなる実施形態において、「動物の性能を向上させる」は、体重増加の上昇、及び／又は飼料要求率の向上、及び／又は飼料効率の上昇があることを意味する。
動物用飼料の栄養価を向上させる方法
用語動物用飼料の栄養価の向上は、飼料中の栄養素の可用性を向上させることを意味する。本発明において、栄養価の向上は、特に、飼料のタンパク質画分の可用性を向上させることにより、タンパク質抽出の増大、より高いタンパク質収率及び／又はタンパク質利用の向上をもたらすことを指す。飼料の栄養価が増大すると、タンパク質及び／又はアミノ酸の消化率が増大し、動物の成長率及び／又は体重増加及び／又は飼料転換（すなわち体重増加に対する、摂取される飼料の重さ）が向上し得る。
したがって、本発明は、動物用飼料の栄養価を向上させる方法であって、態様１、２又は３の動物用飼料添加物を飼料に加えることを含む方法にさらに関する。したがって、本発明は、動物用飼料の栄養価を向上させる方法であって、態様４の顆粒を飼料に加えることを含む方法にさらに関する。したがって、本発明は、動物用飼料の栄養価を向上させる方法であって、態様５の液体製剤を飼料に加えることを含む方法にさらに関する。
一実施形態において、飼料は、豆類、穀物、エンバク、ライムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワ、ダイズ、野生ダイズ、インゲンマメ、ルピナス、テパリービーン、ベニバナインゲン、スリムジムビーン、ライマメ、サヤインゲン、ソラマメ（Ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ）（ソラマメ（ｆａｖａ ｂｅａｎ））、ヒヨコマメ、レンズマメ、ピーナッツ、スパニッシュピーナッツ、キャノーラ、ナタネ（セイヨウアブラナ）、イネ、テンサイ、キャベツ、サトウダイコン、ホウレンソウ、キノア又はエンドウマメをその加工形態（例えば、ダイズミール、ナタネミール）又はそれらの任意の組合せで含む。好ましい実施形態において、飼料は、ダイズミールを含む。
使用
本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチド又はその組成物を例えば動物用飼料に用いる方法にも関する。
動物用飼料中での使用
本発明のプロテアーゼは、動物用飼料に用いられ得る。一実施形態において、本発明は、動物用飼料組成物を調製する方法であって、本発明の１つ以上のプロテアーゼを１つ以上の動物用飼料成分に加えることを含む方法を提供する。
本発明の１つ以上のプロテアーゼは、国際公開第００／２１３８１号パンフレット及び国際公開第２００４／０２６３３４号パンフレットに従い、動物用飼料中において、飼料消化率を向上させて利用効率を増大させる飼料増強酵素としても用いられ得る。
さらなる実施形態において、本発明のプロテアーゼは、動物用飼料中において又は飼料添加物として用いられ得、動物の消化管にプラスの作用をもたらすことで、体重増加、飼料転換比（ＦＣＲ）、ヨーロッパ生産効率指数（ＥＰＥＦ）、ヨーロッパ生産有効性指数（ＥＦＦ）に従う動物性能を向上させるか又は動物の健康を向上させ、例えば死亡率を引き下げ得る。ＦＣＲは、体重増加ｇ／動物に対する飼料摂取ｇ／動物として算出される。
本発明に従う使用では、プロテアーゼを動物に食餌前、食餌後又は食餌と同時に供給することができる。後者が好ましい。
一実施形態において、プロテアーゼの形態は、飼料に加えられる場合又は飼料添加物内に含まれる場合、明確に定義される。明確に定義されるとは、プロテアーゼ調製物が、サイズ－排除クロマトグラフィ（国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの実施例１２を参照されたい）によって判定されて少なくとも５０％純粋であることを意味する。他の実施形態において、プロテアーゼ調製物は、この方法によって判定されて少なくとも６０、７０、８０、８５、８８、９０、９２、９４又は少なくとも９５％純粋である。
明確に定義されたプロテアーゼ調製物が有利である。例えば、飼料にプロテアーゼを、他のプロテアーゼへの干渉も混入も本質的にないように正確に投与することがかなり容易となる。用語用量は、特に、一貫した且つ不変の結果を得る目的及び所望の作用に基づいて投与量を最適化する能力に正確に言及する。
しかしながら、動物用飼料に用いるのに、プロテアーゼは、純粋である必要がなく、例えば他の酵素を含み得、その場合、プロテアーゼ調製物と呼ぶ場合がある。
プロテアーゼ調製物は、（ａ）飼料に直接加えることができるか、又は（ｂ）１つ以上の中間組成物、例えば後に飼料に加えられる（又は処理プロセスに用いられる）飼料添加物又はプレミックスの生成に用いることができる。先に記載される純度の程度は、上述の（ａ）又は（ｂ）に従って用いられるかにかかわらず、元のプロテアーゼ調製物の純度に言及する。
この規模の純度のプロテアーゼ調製物は、特に、組換え生成方法を用いて入手可能であるが、プロテアーゼが従来の発酵方法によって生成される場合、それほど容易に得られず、そのうえ非常に高いバッチ間変動の影響を受ける。
そのようなプロテアーゼ調製物は、当然のことながら、他の酵素と混合され得る。
タンパク質は、動物用タンパク質、例えば肉骨粉、羽毛粉及び／又は魚粉であり得るか、又は植物性タンパク質であり得る。
本明細書で用いられる用語植物性タンパク質は、修飾タンパク質及びタンパク質誘導体が挙げられる、植物に由来又は起源する少なくとも１つのタンパク質を含むあらゆる化合物、組成物、調製物又は混合物を指す。一実施形態において、植物性タンパク質のタンパク質含有量は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０又は６０％（ｗ／ｗ）である。
植物性タンパク質は、植物性タンパク質源、例えば豆類及び穀物に由来し得、例えばマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ））、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）及びイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）の植物由来の材料、例えばダイズミール、ルピナスミール、ナタネミールがある。
一実施形態において、植物性タンパク質源は、マメ科の１つ以上の植物、例えばダイズ、ルピナス、エンドウ又はインゲンマメ由来の材料である。
別の実施形態において、植物性タンパク質源は、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）の１つ以上の植物、例えばテンサイ、サトウダイコン、ホウレンソウ又はキノア由来の材料である。
植物性タンパク質供給源の他の例として、ナタネ、ヒマワリの種、綿実及びキャベツがある。
ダイズは、好ましい植物性タンパク質源である。
植物性タンパク質源の他の例として、穀物、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ（コーン）、イネ、ライコムギ及びモロコシがある。
処理プロセスの実施形態において、対象のプロテアーゼは、タンパク質、例えば植物性タンパク質又はタンパク質源に影響を与える（又は作用するか又は加水分解作用若しくは分解作用を及ぼす）。これを達成するために、タンパク質又はタンパク質源は、典型的に、溶媒、例えば水性溶媒、例えば水中に懸濁され、ｐＨ及び温度の値は、対象の酵素の特性を十分に考慮して調整される。例えば、処理は、実際のプロテアーゼの活性が少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は少なくとも９０％であるｐＨ値において行われ得る。同様に、例えば、処理は、実際のプロテアーゼの活性が少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は少なくとも９０％である温度において行われ得る。上述のパーセンテージ活性指標は、最大活性に対するものである。酵素反応は、所望の結果が達成されるまで続けられ、その後、酵素を不活化することにより、例えば熱処理ステップにより止められても止められなくてもよい。
本発明の処理プロセスの別の実施形態において、プロテアーゼ作用は、持続する。これは、例えば、プロテアーゼがタンパク質に加えられるが、その加水分解作用がいわば必要に応じてより後までスイッチオンされず、それが、適切な加水分解条件が確立されると、又はあらゆる酵素阻害物質が不活化されるか、若しくは何であれ他の手段が用いられて酵素の作用を延期することができると、スイッチされることを意味する。
一実施形態において、処理は、動物用飼料又は動物用飼料に用いられるタンパク質の前処理である。すなわち、タンパク質は、摂取前に加水分解される。
用語動物用飼料の栄養価の向上は、飼料中の栄養素の可用性を向上させることを意味する。本発明において、栄養価の向上は、特に、飼料のタンパク質画分の可用性を向上させることにより、タンパク質抽出の増大、より高いタンパク質収率及び／又はタンパク質利用の向上をもたらすことを指す。飼料の栄養価が増大すると、タンパク質及び／又はアミノ酸の消化率が増大し、動物の成長率及び／又は体重増加及び／又は飼料転換（すなわち体重増加に対する、摂取される飼料の重さ）が向上し得る。
プロテアーゼは、あらゆる形態で飼料に加えることができ、比較的純粋なプロテアーゼとして又は動物用飼料への添加が意図される他の構成要素との混合物で、すなわち動物用飼料添加物、例えば動物用飼料のためのいわゆるプレミックスの形態で加えることができる。
本発明の適切な実施形態
本発明の好ましい実施形態は、以下の項目のセットに記載される。
１．１つ以上のビタミン及びプロテアーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを含む動物用飼料添加物であって、ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｂ）配列番号２と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｃ）配列番号３と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｄ）配列番号４と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｅ）配列番号５と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｆ）配列番号６と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｇ）配列番号７と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｈ）配列番号８と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｉ）配列番号９と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
（ｊ）配列番号１の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｋ）配列番号２の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｌ）配列番号３の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｍ）配列番号５の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｎ）配列番号６の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｏ）配列番号７の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｐ）配列番号８の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｑ）配列番号９の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０位置に含む変異体と；
（ｒ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のポリペプチド並びにＮ末端及び／又はＣ末端のＨｉｓ－タグ及び／又はＨＱ－タグを含むポリペプチドと；
（ｓ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のポリペプチド並びに最大１０個のアミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸のＮ末端及び／又はＣ末端伸長を含むポリペプチドと；
（ｔ）プロテアーゼ活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも９０％を有する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択されるＳ８プロテアーゼである、動物用飼料添加物。
２．Ｓ８プロテアーゼは、分類上の目バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目、好ましくは分類上の科バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科又はより好ましくは分類上の属バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属から得られるか又は入手可能である、項目１の動物用飼料添加物。
３．Ｓ８プロテアーゼは、モチーフＴＧＸＫ［Ｖ／Ｔ］［Ｉ／Ｖ］Ｘ［Ｎ／Ｓ］ＭＳＬＧ（配列番号４）を含む、項目１～２のいずれかの動物用飼料添加物。
４．界面活性剤を含まない、項目１～３のいずれかの動物用飼料添加物。
５．Ｓ８プロテアーゼは、配列番号１のポリペプチドのプロテアーゼ活性の少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％を有する、項目１～４のいずれかの動物用飼料添加物。
６．Ｓ８プロテアーゼは、陰性対照と比較して回腸窒素消化率を少なくとも１％、例えば少なくとも１．５％、少なくとも２．０％、少なくとも２．５％、少なくとも３．０％、少なくとも３．５％又は少なくとも４．０％向上させる、項目１～４のいずれかの動物用飼料添加物。
７．ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～３１４、配列番号２のアミノ酸１～３１１又は配列番号３のアミノ酸１～３１１を含むか又はそれからなる、項目１～６のいずれかの動物用飼料添加物。
８．１つ以上のビタミンと；
１つ以上のミネラルと；
１つ以上のアミノ酸と；
１つ以上のプレバイオティクスと；
１つ以上のファイトジェニクスと；
１つ以上の有機酸と；
１つ以上の他の飼料成分と
からなるリストから選択される１つ以上の構成要素をさらに含む、項目１～７のいずれかの動物用飼料添加物。
９．１つ以上の配合剤をさらに含む、項目１～８のいずれかの動物用飼料添加物。
１０．１つ以上の配合剤は、グリセロール、エチレングリコール、１，２－プロピレングリコール又は１，３－プロピレングリコール、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラクトース、デンプン及びセルロース又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目９に記載の動物用飼料添加物。
１１．１つ以上の追加の酵素をさらに含む、項目１～１０のいずれかに記載の動物用飼料添加物。
１２．１つ以上の追加の酵素は、アセチルキシランエステラーゼ、アシルグリセロールリパーゼ、アミラーゼ、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、ガラクタナーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、リゾホスホリパーゼ、リゾチーム、α－マンノシダーゼ、β－マンノシダーゼ（マンナナーゼ）、フィターゼ、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＤ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、ペクチンエステラーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、キシラナーゼ、β－キシロシダーゼ又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目１１の動物用飼料添加物。
１３．１つ以上の微生物をさらに含む、項目１～１２のいずれかに記載の動物用飼料添加物。
１４．１つ以上の微生物は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属種、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属種、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｓｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属種、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種及びストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目１３に記載の動物用飼料添加物。
１５．Ｓ８プロテアーゼは、顆粒として製剤化されている、項目１～１４のいずれかの動物用飼料添加物。
１６．顆粒は、コア粒子及び１つ以上のコーティングを含む、項目１５の動物用飼料添加物。
１７．コーティングは、塩、及び／又はワックス、及び／又は小麦粉を含む、項目１６の動物用飼料添加物。
１８．液体製剤の形態である、項目１～１４のいずれかの動物用飼料添加物。
１９．Ｓ８プロテアーゼは、液体製剤の０．００１％～２５％ｗ／ｗ、好ましくは０．０１％～２５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０５％～２０％ｗ／ｗ、より好ましくは０．２％～１５％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは０．５％～１５％ｗ／ｗ又は最も好ましくは１．０％～１０％ｗ／ｗのポリペプチドで投与される、項目１８の動物用飼料添加物。
２０．製剤は、２０％～８０％ｗ／ｗのポリオールをさらに含む、項目１８又は１９の動物用飼料添加物。
２１．ポリオールは、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール（ＭＰＧ）、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、１，２－プロピレングリコール若しくは１，３－プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、平均分子量が約６００未満のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び平均分子量が約６００未満のポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目２０の動物用飼料添加物。
２２．製剤は、０．０１％～２．０％ｗ／ｗの保存剤をさらに含む、項目１８～２１のいずれかの動物用飼料添加物。
２３．保存剤は、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム及び安息香酸カリウム又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目２２の動物用飼料添加物。
２４．項目１～１４のいずれかの動物用飼料添加物を含む顆粒。
２５．コア粒子及び１つ以上のコーティングを含む、項目２４の顆粒。
２６．コーティングは、塩、及び／又はワックス、及び／又は小麦粉を含む、項目２５の顆粒。
２７．項目１～１４のいずれかの動物用飼料添加物を含む液体製剤。
２８．Ｓ８プロテアーゼは、液体製剤の０．００１％～２５％ｗ／ｗ、好ましくは０．０１％～２５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０５％～２０％ｗ／ｗ、より好ましくは０．２％～１５％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは０．５％～１５％ｗ／ｗ又は最も好ましくは１．０％～１０％ｗ／ｗのポリペプチドで投与される、項目２７の液体製剤。
２９．２０％～８０％ｗ／ｗのポリオールをさらに含む、項目２７又は２８に記載の液体製剤。
３０．ポリオールは、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール（ＭＰＧ）、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、１，２－プロピレングリコール又は１，３－プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、約６００未満の平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び約６００未満の平均分子量を有するポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目２９に記載の液体製剤。
３１．０．０１％～２．０％ｗ／ｗの保存剤をさらに含む、項目２７～３０のいずれかに記載の液体製剤。
３２．保存剤は、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム及び安息香酸カリウム又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目３１に記載の液体製剤。
３３．動物用飼料を作製する方法であって、項目２７～３２のいずれかに記載の液体製剤を植物系材料上に塗布することを含む方法。
３４．液体製剤は、スプレーによって塗布される、項目３３に記載の方法。
３５．植物系材料は、マメ科植物、穀類、カラスムギ、ライムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワ、ダイズ、野生ダイズ、マメ、ルピナス、テパリービーン、ベニバナインゲン、スリムジムビーン（ｓｌｉｍｊｉｍ ｂｅａｎ）、ライマメ、サヤインゲン、ソラマメ（Ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ）（ソラマメ（ｆａｖａ ｂｅａｎ））、ヒヨコマメ、レンズマメ、ピーナッツ、スパニッシュピーナッツ、キャノーラ、ナタネ（セイヨウアブラナ）、イネ、テンサイ、キャベツ、サトウダイコン、ホウレンソウ、キノア又はエンドウマメ、これらの加工形態（ダイズミール、ナタネミールなど）又はこれらの任意の組合せを含む、項目３３又は３４に記載の方法。
３６．植物系材料は、ペレット化された形態である、項目３３～３５のいずれかに記載の方法。
３７．項目１～２３のいずれかの動物用飼料添加物、項目２４～２６のいずれかの顆粒又は項目２７～３２のいずれかの液体製剤と、植物ベースの材料とを含む動物用飼料。
３８．植物ベースの材料は、豆類、穀物、エンバク、ライムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワ、ダイズ、野生ダイズ、インゲンマメ、ルピナス、テパリービーン、ベニバナインゲン、スリムジムビーン、ライマメ、サヤインゲン、ソラマメ（Ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ）（ソラマメ（ｆａｖａ ｂｅａｎ））、ヒヨコマメ、レンズマメ、ピーナッツ、スパニッシュピーナッツ、キャノーラ、ナタネ（セイヨウアブラナ）、イネ、テンサイ、キャベツ、サトウダイコン、ホウレンソウ、キノア又はエンドウマメをその加工形態（例えば、ダイズミール、ナタネミール）又はそれらの任意の組合せで含む、項目３７の動物用飼料。
３９．項目３３～３６のいずれかの方法を用いて又は項目３７若しくは３８の動物用飼料をペレット化することによって調製されたペレット化された動物用飼料。
４０．動物の１つ以上の性能パラメータを向上させる方法であって、１つ以上の動物に項目１～２３のいずれかの動物用飼料添加物、項目２４～２６のいずれかの顆粒、項目２７～３２のいずれかの液体製剤、項目３７若しくは３８の動物用飼料又は項目３９のペレット化された動物用飼料を投与することを含む方法。
４１．動物の性能を向上させることは、体重増加の向上、ヨーロッパ生産効率指数（ＥＰＥＦ）の向上及び／又はＦＣＲの向上を意味する、項目４０の方法。
４２．動物用飼料を調製する方法であって、項目１～２３のいずれかの動物用飼料添加物、項目２４～２６のいずれかの顆粒又は項目２７～３２のいずれかの液体製剤を少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質源と混合することを含む方法。
４３．タンパク質を処理する方法であって、項目１～２３のいずれかの動物用飼料添加物、項目２４～２６のいずれかの顆粒又は項目２７～３２のいずれかの液体製剤を少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質源に加えるステップを含む方法。
４４．タンパク質の消化率及び／又は可溶性を増大させる方法であって、項目１～２３のいずれかの動物用飼料添加物、項目２４～２６のいずれかの顆粒又は項目２７～３２のいずれかの液体製剤を少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質源と混合することを含む方法。
４５．タンパク質又はタンパク質源は、豆類、穀物、エンバク、ライムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワ、ダイズ、野生ダイズ、インゲンマメ、ルピナス、テパリービーン、ベニバナインゲン、スリムジムビーン、ライマメ、サヤインゲン、ソラマメ（Ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ）（ソラマメ（ｆａｖａ ｂｅａｎ））、ヒヨコマメ、レンズマメ、ピーナッツ、スパニッシュピーナッツ、キャノーラ、ナタネ（セイヨウアブラナ）、イネ、テンサイ、キャベツ、サトウダイコン、ホウレンソウ、キノア又はエンドウマメをその加工形態（例えば、ダイズミール、ナタネミール）又はそれらの任意の組合せで含む、項目４０～４４のいずれかの方法。
４６．動物用飼料の栄養価を向上させる方法であって、項目１～２３のいずれかの動物用飼料添加物、項目２４～２６のいずれかの顆粒又は項目２７～３２のいずれかの液体製剤を飼料に加えること含む方法。
４７．動物用飼料は、豆類、穀物、エンバク、ライムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワ、ダイズ、野生ダイズ、インゲンマメ、ルピナス、テパリービーン、ベニバナインゲン、スリムジムビーン、ライマメ、サヤインゲン、ソラマメ（Ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ）（ソラマメ（ｆａｖａ ｂｅａｎ））、ヒヨコマメ、レンズマメ、ピーナッツ、スパニッシュピーナッツ、キャノーラ、ナタネ（セイヨウアブラナ）、イネ、テンサイ、キャベツ、サトウダイコン、ホウレンソウ、キノア又はエンドウマメをその加工形態（例えば、ダイズミール、ナタネミール）又はそれらの任意の組合せで含む、項目４６の方法。
４８．項目１～２３のいずれかの動物用飼料添加物、項目２４～２６のいずれかの顆粒又は項目２７～３２のいずれかの液体製剤の、動物用飼料に用いる組成物の調製における、
動物用飼料の栄養価を向上させるための；
消化可能な且つ／若しくは可溶性のタンパク質を動物用飼料中で増大させるための；
動物用食餌中でのタンパク質の加水分解の程度を増大させるための；
動物において１つ以上の性能パラメータを向上させるための；及び／又は
タンパク質を処理するための使用。
４９．ポリペプチドを生成する方法であって、
（ａ）項目１に規定されるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む組換えバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属宿主細胞を培養するステップであって、ポリヌクレオチドは、発現され、及びポリペプチドは、生成される、ステップと；任意選択的に、
（ｂ）ポリペプチドを回収するステップと
を含む方法。
５０．外因性ポリヌクレオチドは、宿主細胞の染色体中に組み込まれて、プロモータと作動可能に連結される、項目４９の方法。
株
国際公開第２０１５／０９１９９０号パンフレットに開示されるように、バチルス・ホルネキアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｎｅｃｋｉａｅ）株を１９９５年以前にトルコの環境サンプルから単離した。
国際公開第９２／１７５７７号パンフレットに開示されるように、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種ＴＹ１４５をおよそ１９８９年の南極土のサンプルから単離した。
プロテアーゼアッセイ
１）キネティックＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡアッセイ：
ｐＮＡ基質：Ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ Ｌ－１４００）。
温度：室温（２５℃）
アッセイバッファ：１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＢＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＨＣｌ又はＮａＯＨでｐＨ値２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０及び１１．０に調整）。
２０μｌプロテアーゼ（０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中に希釈）を１００μｌアッセイバッファと混合した。１００μｌ ｐＮＡ基質（５０ｍｇを１．０ｍｌ ＤＭＳＯ中に溶解して、さらに０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で４５×希釈した）を加えることによってアッセイを始めた。ＯＤ４０５の増大をプロテアーゼ活性の尺度として監視した。
２）エンドポイントＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡアッセイ：
ｐＮＡ基質：Ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ Ｌ－１４００）。
温度：制御（アッセイ温度）。
アッセイバッファ：１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＢＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ７．０。
２００μｌ ｐＮＡ基質（５０ｍｇを１．０ｍｌ ＤＭＳＯ中に溶解して、さらにアッセイバッファで５０×希釈した）をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中にピペットで取って氷上に置いた。２０μｌペプチダーゼサンプル（０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中に希釈）を加えた。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブを、アッセイ温度にセットしたＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーに移すことによってアッセイを開始した。チューブをＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサー上でその最高振盪速度（１４００ｒｐｍ）において１５分間インキュベートした。チューブを氷浴に戻して、６００μｌ ５００ｍＭコハク酸、ｐＨ３．５を加えることによってインキュベーションを止めた。２００μｌの上清をマイクロタイタープレートに移した。ＯＤ４０５をペプチダーゼ活性の尺度として読んだ。バッファブラインドを（酵素の代わりに）アッセイに含めた。
２）Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫアッセイ：
基質：Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫタブレット（架橋且つ染色されたカゼイン；Ｍｅｇａｚｙｍｅ由来）
温度：制御（アッセイ温度）。
アッセイバッファ：１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＢＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ９．０。
Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫタブレットを、穏やかな撹拌により、２．０ｍｌ ０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中に懸濁させた。この懸濁液５００μｌ及びアッセイバッファ５００μｌをＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に分配して、氷上に置いた。２０μｌプロテアーゼサンプル（０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中に希釈）を加えた。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブを、アッセイ温度にセットしたＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーに移すことによってアッセイを開始した。チューブをＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサー上でその最高振盪速度（１４００ｒｐｍ）において１５分間インキュベートした。チューブを氷浴に戻すことによってインキュベーションを止めた。次に、チューブを、氷冷した遠心分離機内で数分間遠心分離して、２００μｌの上清をマイクロタイタープレートに移した。ＯＤ６５０をプロテアーゼ活性の尺度として読んだ。バッファブラインドを（酵素の代わりに）アッセイに含めた。
３）ｏ－フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）アッセイ：
このアッセイは、一級アミンを検出するため、プロテアーゼによるペプチド結合の切断をプロテアーゼ処理サンプルと対照サンプルとの間の吸光度の差として測定することができる。アッセイをＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｆｏｏｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ”，Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．６６：６４２－６４６）に本質的に従って行った。
０．５ｍｌサンプルをＰＡＬＬ９６ウェルフィルタープレートＰＮ８１７５（１０分、２７００ｒｐｍ、５℃）で濾過した。サンプルを脱イオン水中に適切に（例えば、１０、５０又は１００倍）希釈して、２５μｌの各サンプルを９６ウェルマイクロタイタープレート中にロードした（５反復）。２００μｌ ＯＰＡ試薬（１００ｍＭ四ホウ酸二ナトリウム十水和物、３．５ｍＭドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５．７ｍＭジチオスレイトール（ＤＤＴ）、６ｍＭ ｏ－フタルジアルデヒド）を全てのウェル中に分配して、プレートを振盪させて（６０秒、６５０ｒｐｍ）、吸光度を３４０ｎｍにおいて測定した。
実施例１：バチルス・ホルネキアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｎｅｃｋｉａｅ）からのＳ８プロテアーゼの発現及び精製
国際公開第２０１５／０９１９９０号パンフレットの実施例１に記載されるように、バチルス・ホルネキアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｎｅｃｋｉａｅ）由来のＳ８プロテアーゼ（配列番号１）を発現させ且つ精製した。キネティックＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡアッセイを用いて、ｐＨ活性プロファイル及びｐＨ安定性プロファイルを得た。エンドポイントＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡアッセイを用いて、ｐＨ７での温度－活性プロファイルを得た。
バチルス・ホルネキアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｎｅｃｋｉａｅ）由来のＳ８プロテアーゼ（配列番号１）の特性
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって判定した相対分子量は、およそＭｒ＝３５ｋＤａであった。
ＥＤＭＡＮ分解によって決定したＮ末端配列は、ＥＶＴＡＴＰＳであった。
インタクト分子量分析によって判定した主ピーク（およそ５０％）の分子量は、３２１３２．０Ｄａであった。
主ピークの成熟配列（ＥＤＭＡＮ Ｎ末端配列決定データ及びインタクトＭＳデータ由来）：
Figure 0007515396000003
この成熟配列から算出した分子量は、３２１３２．０Ｄａである。
インタクト分子量の分析は、産物のおよそ１０％がアミノ酸２～３１４であり、産物のおよそ４０％がアミノ酸４～３１４であることを示した。
実施例２．１：バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種ＴＹ１４５からのＳ８プロテアーゼの発現及び精製
国際公開第９２／１７５７７号パンフレットの実施例１に記載されるように、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種ＴＹ１４５由来のＳ８プロテアーゼ（配列番号２）を発現させ且つ精製した。キネティックＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡアッセイを用いて、ｐＨ活性プロファイル及びｐＨ安定性プロファイルを得た。Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫアッセイを用いて、ｐＨ９での温度－活性プロファイルを得た。
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種ＴＹ１４５由来のＳ８プロテアーゼ（配列番号２）の特性
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって判定した相対分子量は、およそＭｒ＝３４ｋＤａであった。
ＥＤＭＡＮ分解によって決定したＮ末端配列は、ＡＶＰＳＴＱＴであった。
インタクト分子量分析によって判定した分子量は、３１７８４Ｄａであった。
成熟配列（ＥＤＭＡＮ Ｎ末端配列決定データ及びインタクトＭＳデータ由来）：
Figure 0007515396000004
この成熟配列から算出した分子量は、３１７８３．７Ｄａである。
また、インタクト分子量の分析は、産物のおよそ１０％がＮ末端上に余分なＥＶＴを含むことを示した。
実施例２．２ バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来の５つのＳ８プロテアーゼ（配列番号１の相同体）についての発現例
５つのさらなるＳ８プロテアーゼを枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内で発現させた。配列番号５の発現：バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種－１３３８０（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種－１、ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＢＤＶ６１０３２）由来のＳ８プロテアーゼ１は、国際公開第２０１７０６４２５３号パンフレットに記載されている。配列番号６の発現：バチルス・イドリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｄｒｉｅｎｓｉｓ）（ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＢＣＢ４０１４２）由来のＳ８プロテアーゼ。配列番号７の発現：バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種－１３３８０（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種－１、ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＢＣＢ４０１４０）由来のＳ８プロテアーゼ２；配列番号８の発現：バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種－６２４５１由来のＳ８プロテアーゼ（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種－２、ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＢＣＢ４０１４４）は、国際公開第２０１５０９１９８９号パンフレットに記載されている。
バチルス・オセアニセディミニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｃｅａｎｉｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）（配列番号９）からのＳ８プロテアーゼの発現を以下のように行った。Ｓ８プロテアーゼバチルス・オセアニセディミニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｃｅａｎｉｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）（配列番号１０）をコードする遺伝子をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｖｅｎｌａａｎ １２Ａ，Ｂ－３００１ Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によってコドン最適化して合成した。遺伝子を、遺伝子の天然分泌シグナルがバチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）分泌シグナルで置き換えられている（後に続くアミノ酸配列：ＭＫＫＰＬＧＫＩＶＡＳＴＡＬＬＩＳＶＡＦＳＳＳＩＡＳＡ）分泌酵素として発現させた。構築体を直鎖状組込み型構築体として形成し、そこで、合成遺伝子を、２つの枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）相同染色体領域間のＰＣＲにより、ストロングプロモータ及びクロラムフェニコール耐性マーカーと共に融合させた。融合をＳＯＥ ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．（１９８９）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇｅｎｅ ７７：６１－６８）によってもたらした。ＳＯＥ ＰＣＲ法は、国際公開第２００３０９５６５８号パンフレットにも記載されている。両方の構築体において、遺伝子を、（国際公開第９９／４３８３５号パンフレットに記載されるように）バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）由来のプロモータ及びバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡプロモータ（安定化配列を含む）からなる三重プロモータ系の制御下で発現させた。直鎖状ＰＣＲ構築体を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中に形質転換した。形質転換体を、１ｍｌあたり６μｇのクロラムフェニコールで補充したＬＢプレート上で選択した。組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）クローンを液体培養で増殖させた。組換え酵素が自然な細胞溶解直後の上清中に蓄積した。実施例１に記載されているように、酵素含有上清を収穫して、酵素を精製した。
実施例３：Ｓ８プロテアーゼ変異体（配列番号３）の構築、発現及び精製
国際公開第２０１６／０９７３５４号パンフレットの実施例１に記載されるように、ＴＹ１４５プロテアーゼの変異体（配列番号３）を構築し、発現させ且つ精製した。キネティックＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡアッセイを用いて、ｐＨ活性プロファイル及びｐＨ安定性プロファイルを得た。Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫアッセイを用いて、ｐＨ９での温度－活性プロファイルを得た。
Ｓ８プロテアーゼ変異体（配列番号３）の特性
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって判定した相対分子量は、およそＭｒ＝３７ｋＤａであった。
ＥＤＭＡＮ分解によって決定したＮ末端配列は、ＡＶＰＳＴＱＴであった。
インタクト分子量分析によって判定した分子量は、３２０８９．１Ｄａであった。
成熟配列（ＥＤＭＡＮ Ｎ末端配列決定データ及びインタクトＭＳデータ由来）：
Figure 0007515396000005
この成熟配列から算出した分子量は、３２０８９．３Ｄａである。
また、インタクト分子量の分析は、産物のおよそ１０％が余分なＥＶＴ又はＶＴをＮ末端上に含むことを示した。
実施例４：ＳＢＭ－トウモロコシスラリーのｐＨ曲線
トウモロコシ－ダイズミールスラリーに対する本発明のＳ８プロテアーゼのｐＨ活性曲線を以下の方法に従って求めた。
基質：ＳＢＭ－トウモロコシ（３０：７０）
温度：４０℃
アッセイバッファ：１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＢＳバッファ、１２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＮａＯＨ又はＨＣｌで所望のｐＨ（３、４、５、６、７）に調整）
２ｇのＳＢＭ－トウモロコシ（３０：７０）基質に、ＮａＯＨ又はＨＣｌで所望のｐＨに調整した２０ｍｌのアッセイバッファを加えた。スラリーを５分間撹拌して、スラリーの２ｍｌ部を、加熱及び磁気混合を組み合わせたプレートミキサー上の２４ウェル－プレート内の各ウェルに移した。サンプルを４０℃において３０分間プレインキュベートした。プロテアーゼを１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（９．５６５ｇ／Ｌ ＮａＯＡｃ、１．７５ｇ／Ｌ酢酸、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０１％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）中で１００μｌに希釈して、２００ｍｇ ＥＰ／ｋｇ基質の最終濃度を達成して、ウェルに加えた。磁気撹拌下で４０℃において３時間後にプレートを遠心分離して（１０分、４０００ｒｐｍ、０℃）、上清を、ＯＰＡ（ｏ－フタルジアルデヒド）アッセイを用いて分析した。プロテアーゼの活性は、３４０ｎｍでの吸光度マイナスブランク（酵素なしでランさせたサンプル）によって求めたフリーα－アミノ末端の量であり、以下の表４に記載する。
Figure 0007515396000006
実施例５：熱安定性
プロテアーゼのタンパク質サンプルのアリコートを脱塩するか、又はプレパッケージングしたＰＤ－１０カラムを用いて２０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ４．０にバッファ交換するか、又は２×５００ｍｌの２０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ４．０に対して４℃において、２～３時間のステップに続く一晩のステップ内で透析した。サンプルを０．４５μｍフィルターで濾過して、バッファでおよそ２Ａ２８０ユニットに希釈する。透析バッファを示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の基準として用いる。サンプルを、真空吸引及び撹拌を用いておよそ１０分間脱ガスする。
ＤＳＣスキャンを２０～９０℃まで１．５℃／分の一定のスキャン速度においてＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－ＤＳＣで実行する。ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（バージョン４．１０）を用いてデータハンドリングを実行して、変性融点Ｔｄ（融解温度Ｔｍとも呼ばれる）をサーモグラムにおけるピークの頂点での温度として定義する。
実施例６：蒸気安定性
蒸気処理後のプロテアーゼの残留活性を以下のアッセイを用いて評価することができる。
この実験において、修飾セットアップを用いることにより、蒸気が蒸気発生器から供給されて、ボックス中に導かれる。プレート上に置いたサンプルを、温度がおよそ９３～９４℃に達したときにドゥロワーによりボックス中に挿入する。サンプルを挿入して直ちに温度を４℃下げる。温度をおよそ９０℃において一定にしたまま、インキュベーションを３０秒間実行する。その後、プレートをボックスから迅速に取り出してサンプルを氷上に置いて、再懸濁させて、例えばＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ又はｏ－フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）アッセイを用いてプロテアーゼ活性に関して評価する。各酵素サンプルを、蒸気処理しなかった類似のサンプルと比較して残留活性を算出する。
実施例７：ペレット化安定性試験
酵素を米国特許第４，１０６，９９１号明細書、実施例１に記載されるようにして顆粒化する。得られた粒状体を流動層内で水含有量１％未満に乾燥させて、篩を通して粒子範囲２５０μｍ～８５０μｍの産物を得る。最後に、産物を米国特許第４，１０６，９９１号明細書、実施例２２に記載されるようにしてパーム油及び炭酸カルシウムでコーティングする。
およそ５０ｇの酵素粒状体を小さい水平ミキサー内で１０分間、１０ｋｇの飼料と予め混合する。このプレミックスをより大きい水平ミキサー内で１０分間、９０ｋｇの飼料と混合する。ミキサーから飼料をおよそ３００ｋｇ／時の速度においてコンディショナ（蒸気注入によるカスケードミキサー）に導く。コンディショナは、蒸気を注入することにより、飼料を（放出口で測定して）９５℃に加熱する。コンディショナ内での滞留時間は、３０秒である。コンディショナから飼料を、３．０×３５ｍｍ水平ダイを備えるＳｉｍｏｎ Ｈｅｅｓｅｎプレスに導いて、およそ１５ｍｍの長さのペレットに圧縮成形した。圧縮成形後、ペレットを空冷機内に入れて１５分間冷却する。
Ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡアッセイを用いて、ペレット化前に且つペレット化後の飼料ペレット内でプロテアーゼ活性を測定する。非ペレット化飼料中の活性に対するペレット化飼料中のプロテアーゼ活性を比較することにより、ペレット化安定性を求める。
実施例８：バチルス・ホルネキアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｎｅｃｋｉａｅ）由来のＳ８プロテアーゼ（配列番号１）を用いた、ブロイラーにおける回腸窒素消化率の治験
動物及び給餌
民間の孵化場（Ａｃｃｏｕｖｏｉｒ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｅｕｒ Ｇｒｅｌｉｅｒ，Ｌａ Ｂｏｈａｒｄｉｅｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た１日齢ニワトリ（Ｃｏｂｂ５００）を用いた。ニワトリをワイヤー－フロアバッテリーケージ（０．７５ｍ２／ケージ、ニワトリ６羽／ケージ）内に収容して、飼料及び水を不断給餌した。給餌をニワトリの栄養必要量に従って２つの相、スターター及びグロウアー（それぞれ１～７及び８～２１）に分けた。ケージ中へのニワトリの割当ては、１日目の体重に基づいてケージ間での体重変動を最小にした。育成の最初の１６日間、全羽を同じ給餌戦略にかけてから、１７～２１日目までの５日の実験期間を設けた。実験期間中、ケージを、陰性対照食餌（ＮＣ）、陽性対照食餌（ＰＣ）又は液体プロテアーゼ溶液をスプレーしたＮＣから構築した酵素処理に割り当てた。表５を参照されたい。ＰＣを、ＮＣと同じ代謝エネルギー、粗タンパク質、リシン及びメチオニン濃度を保持するように配合したが、ＮＣと比較してより大きい消化率のタンパク質源を用いた。全ての食餌は、消化率マーカーとしてＴｉＯ２を含有した。
Figure 0007515396000007
データ及びサンプル収集
総ケージ体重及び飼料消費を１６日目～２１日目に得た。２１日目に全てのニワトリを頚椎脱臼により犠牲にした。ニワトリを解剖して、末端回腸の内容物を収集した。末端回腸は、Ｊａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３，Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｃｏｎｔｅｎｔ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｒｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｌｅｕｍ ｏｎ ｔｈｅ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ａｐｐａｒｅｎｔ ｉｌｅａｌ ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｂｒｏｉｌｅｒ ｃｈｉｃｋｅｎｓ，Ｂｒ．Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．４４：８０７－８０９）によって記載されるように、回腸－盲腸接合部前２ｃｍの点の近位１７ｃｍと定義した。回腸消化物をケージ内でプールして、凍結乾燥して、化学分析のためにすり潰した。粗タンパク質及びＴｉＯ２の濃度を、表６に記載する見掛けの回腸窒素消化率ＡＩＤＮ（％）の後の推定のために消化物及び飼料サンプルの両方で求めた。
ＡＩＤＮ（％）＝１００－［（ＣＭｆ／ＣＭｅ）×（ＣＮｅ／ＣＮｆ）］×１００
式中、
ＣＭｆ＝飼料中のマーカーの濃度；ＣＭｅ＝回腸消化物中のマーカーの濃度；
ＣＮｆ＝飼料中の栄養素の濃度；ＣＮｅ＝回腸消化物中の栄養素の濃度。
窒素含有量をＤｕｍａｓ法（Ｄｕｍａｓ，１８３１，Ｐｒｏｃｅｄｅｓ ｄｅ ｌ’Ａｎａｌｙｓｅ Ｏｒｇａｎｉｑｕｅ，Ａｎｎ．Ｃｈｉｍ．Ｐｈｙｓ．２４７：１９８－２１３）に従ってＬＥＣＯ装置ＦＰ－５２８（ＬＥＣＯ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって求めた。６．２５の係数を用いて、窒素含有量を粗タンパク質に変換した。
サンプルのＨ２ＳＯ４ミネラル化後、ＤＩＮ ＥＮ ＩＳＯ １１８８５：１９９７（ＤＩＮ ＥＮ ＩＳＯ １９９８）に従い、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）装置ＩＣＰ－ＯＥＳ ５１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、飼料及び消化物中の二酸化チタン濃度を求めた。
Figure 0007515396000008
バチルス・ホルネキアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｎｅｃｋｉａｅ）プロテアーゼは、ＮＣ及びＰＣの両方と比較して見掛けの回腸窒素消化率を有意に（Ｐ＜０．０１、ＮＣと比較）増大させた。
実施例９：バチルス・ホルネキアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｎｅｃｋｉａｅ）由来のＳ８プロテアーゼ（配列番号１）及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種由来の変異Ｓ８プロテアーゼを用いた、ブロイラーにおける回腸窒素消化率の治験
治験を実施例８に記載するようにランして、ＡＩＤＮ結果を以下の表７に示す。
Figure 0007515396000009
バチルス・ホルネキアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｎｅｃｋｉａｅ）プロテアーゼ及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種由来のプロテアーゼ変異体の両方は、ＮＣ及びＰＣの両方と比較して見掛けの回腸窒素消化率を増大させた。このインビボ治験では、飼料成分の内在タンパク質消化率は、予想外に高かった。これは、ＰＣが、ＮＣと比較して消化率の最小の増大のみを示したことを意味する。そうであっても、プロテアーゼはなお、ＰＣと比較して見掛けの回腸窒素消化率を増大させた。これは、プロテアーゼが品質の良い食餌にも機能し得ることを示す。
実施例１０：動物用飼料及び動物用飼料添加物
顆粒
本発明のプロテアーゼをフィラー、例えば硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム及び／又はセルロースで顆粒化し、任意選択的に、その後、顆粒をワックスコーティング（例えば、水添パーム油）又は塩コーティング（例えば、硫酸ナトリウム及び／又は硫酸マグネシウム）でコーティングすることによって顆粒を調製する。
代わりに、本発明のプロテアーゼの液体溶液を不活性コア上に吸収させ、任意選択的に、その後、顆粒をワックスコーティング（例えば、水添パーム油）又は塩コーティング（例えば、硫酸ナトリウム及び／又は硫酸マグネシウム）でコーティングすることによって顆粒を調製する。
液体製剤
本発明のプロテアーゼの液体製剤は、０．１％～１０％ｗ／ｗ酵素タンパク質、４０～６０％グリセロール、０．１～０．５％安息香酸ナトリウム及び水を含む。液体製剤を、先に記載したペレット化された動物用飼料上又はマッシュ飼料上にスプレーする。
動物用飼料添加物
プレミックス１キロあたり０．０１ｇ～１０ｇの酵素タンパク質を含有する本発明のプロテアーゼのプレミックス製剤（任意選択的に、コーティングした顆粒として製剤化されている）を以下のプレミックスに加える。
Figure 0007515396000010
動物用飼料の例
これは、先に記載した動物用飼料添加物を含むブロイラー飼料の例である：
６２．５５％ トウモロコシ
３３．８％ ダイズミール（５０％粗タンパク質）
１．０％ 大豆油
０．２％ ＤＬ－メチオニン
０．２２％ ＤＣＰ（リン酸二カルシウム）
０．７６％ ＣａＣＯ３（炭酸カルシウム）
０．３２％ 砂
０．１５％ ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）
１％ 上述の動物用飼料添加物（プレミックス）。
成分を混合して、飼料を所望の温度、例えば６０、６５、７５、８０、８５、９０又は９５℃においてペレット化する。
単なる一例として、ニワトリ、例えばブロイラーニワトリのための飼料は、一覧にした成分の１つ以上を、以下の表８．１に記載するパーセンテージ例で含み得る。
Figure 0007515396000011
単なる一例として、ニワトリ、例えばブロイラーニワトリのための食餌加工品（ｄｉｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、以下の表８．２に示すとおりであり得る。
Figure 0007515396000012
単なる一例として、産卵鶏のための飼料は、一覧にした成分の１つ以上を、以下の表８．３に記載するパーセンテージ例で含み得る。
Figure 0007515396000013
単なる一例として、産卵鶏のための食餌加工品は、以下の表８．４に示すとおりであり得る。
Figure 0007515396000014
単なる一例として、シチメンチョウのための飼料は、一覧にした成分の１つ以上を、以下の表８．５に記載するパーセンテージ例で含み得る。
Figure 0007515396000015
単なる一例として、シチメンチョウのための食餌加工品は、以下の表８．６に示すとおりであり得る。
Figure 0007515396000016
単なる一例として、子ブタのための飼料は、一覧にした成分の１つ以上を、以下の表８．７に記載するパーセンテージ例で含み得る。
Figure 0007515396000017
単なる一例として、子ブタのための食餌加工品は、以下の表８．８に示すとおりであり得る。
Figure 0007515396000018
単なる一例として、グロウアー／フィニッシャーブタのための飼料は、一覧にした成分の１つ以上を、以下の表８．９に記載するパーセンテージ例で含み得る。
Figure 0007515396000019
単なる一例として、グロウアー／フィニッシャーブタのための食餌加工品は、以下の表８．１０に示すとおりであり得る。
Figure 0007515396000020
実施例１１：ベンチマーク（Ｃｉｂｅｎｚａ）と比較した、新しいプロテアーゼについてのブロイラーにおける見掛けの空腸窒素消化率の治験
動物及び給餌
民間の孵化場（Ａｃｃｏｕｖｏｉｒ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｅｕｒ Ｇｒｅｌｉｅｒ，Ｌａ Ｂｏｈａｒｄｉｅｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た１日齢ニワトリ（Ｃｏｂｂ５００）を用いた。ニワトリをワイヤー－フロアバッテリーケージ（０．７５ｍ２／ケージ、ニワトリ６羽／ケージ）内に収容した。７日目まで、表９に記載する飼料及び水を不断給餌した。７日目にニワトリの体重を量って、体重を基準として用いて６処理の１つに割り当てた。１６日目まで同じ食餌をニワトリに与えた。その後、実験期間は、ニワトリ育成の１６～２１日目まで及んだ。実験期間中、ニワトリに陽性対照食餌（ＰＣ）、陰性対照食餌（ＮＣ）又はＮＣ＋試験酵素（表９）を給餌した。実験に用いた試験酵素は、配列番号１（Ｓ８、バチルス・ホルネキアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｎｅｃｋｉａｅ））及び配列番号３（Ｓ８、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種－１１２３８）である。
酵素を液体形態で提供して、Ｆｏｒｂｅｒｇ Ｆ６０ミキサーと連結させた超低圧系を用いたスプレーによって処理に用いた。ＰＣを、ＮＣと同じ代謝エネルギー、粗タンパク質、リシン及びメチオニン濃度を実現するように配合したが、ＮＣと比較してより大きい消化率のタンパク質源を含有した。全ての食餌は、消化率マーカーとしてＴｉＯ２を含有させた。
Figure 0007515396000021
データ及びサンプル収集
１ケージあたり及び１処理あたりの平均体重及び飼料消費を１６日目～２１日目に得た。２１日目に全てのニワトリを頚椎脱臼により犠牲にした。ニワトリを解剖して、空腸の内容物を収集した。空腸は、膵臓ループ（十二指腸）の終端において始まって、Ｍｅｃｋｅｌの憩室の近位１ｃｍにおいて末端が終わる小腸管のセグメントと定義した。空腸消化物をケージ内でプールして、凍結乾燥して、化学分析のためにすり潰した。粗タンパク質及びＴｉＯ２の濃度を、表１０に記載する見掛けの空腸窒素消化率ＡＪＤＮ（％）の後の推定のために消化物及び飼料サンプルの両方で求めた。
ＡＪＤＮ（％）＝１００－［（ＣＭｆ／ＣＭｅ）×（ＣＮｅ／ＣＮｆ）］×１００
式中、
ＣＭｆ＝飼料中のマーカーの濃度；ＣＭｅ＝空腸消化物中のマーカーの濃度；
ＣＮｆ＝飼料中の栄養素の濃度；ＣＮｅ＝空腸消化物中の栄養素の濃度。
窒素含有量をＤｕｍａｓ法（Ｄｕｍａｓ，１８３１，Ｐｒｏｃｅｄｅｓ ｄｅ ｌ’Ａｎａｌｙｓｅ Ｏｒｇａｎｉｑｕｅ，Ａｎｎ．Ｃｈｉｍ．Ｐｈｙｓ．２４７：１９８－２１３）に従ってＬＥＣＯ装置ＦＰ－５２８（ＬＥＣＯ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて求めた。６．２５の係数を用いて、窒素含有量を粗タンパク質に変換した。
サンプルのＨ２ＳＯ４ミネラル化後、ＤＩＮ ＥＮ ＩＳＯ １１８８５：１９９７（ＤＩＮ ＥＮ ＩＳＯ １９９８）に従い、ＩＣＰ－ＯＥＳ ５１００機器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて飼料及び消化物中の二酸化チタン濃度を求めた。
Figure 0007515396000022
結果は、プロテアーゼが、ＮＣ及びＰＣの両方並びにベンチマーク（Ｃｉｂｅｎｚａ）と比較して見掛けの空腸窒素消化率を増大させたことを実証する。
実施例１２：ベンチマーク（Ｃｉｂｅｎｚａ）と比較した、新しいプロテアーゼ相同体についてのブロイラーにおける見掛けの空腸窒素消化率の治験
動物及び給餌
民間の孵化場（Ａｃｃｏｕｖｏｉｒ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｅｕｒ Ｇｒｅｌｉｅｒ，Ｌａ Ｂｏｈａｒｄｉｅｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た１日齢ニワトリ（Ｃｏｂｂ５００）を用いた。ニワトリをワイヤー－フロアバッテリーケージ（０．７５ｍ２／ケージ、ニワトリ６羽／ケージ）内に収容した。７日目まで飼料［どのような飼料？］及び水を不断給餌した。７日目にニワトリの体重を量って、体重を基準として用いて８処理の１つに割り当てた。１６日目まで同様の食餌［食餌を記載する？］をニワトリに与えた。その後、実験期間は、ニワトリ育成の１６～２１日目まで及んだ。実験期間中、ニワトリに陽性対照食餌（ＰＣ）、陰性対照食餌（ＮＣ）又はＮＣ＋試験酵素（表１１）を給餌した。実験に用いた試験酵素は、以下のとおりであった。
Figure 0007515396000023
酵素を液体形態で提供して、Ｆｏｒｂｅｒｇ Ｆ６０ミキサーと連結させた超低圧系を用いたスプレーによって処理に用いた。ＰＣを、ＮＣと同じ代謝エネルギー、粗タンパク質、リシン及びメチオニン濃度を実現するように配合したが、ＮＣと比較してより大きい消化率のタンパク質源を含有した。全ての食餌は、消化率マーカーとしてＴｉＯ２を含有させた。
Figure 0007515396000024
データ及びサンプル収集
１ケージあたり及び１処理あたりの平均体重及び飼料消費を１６日目～２１日目に得た。２１日目に全てのニワトリを頚椎脱臼により犠牲にした。ニワトリを解剖して、空腸の内容物を収集した。空腸は、膵臓ループ（十二指腸）の終端において始まって、Ｍｅｃｋｅｌの憩室の近位１ｃｍにおいて末端が終わる小腸管のセグメントと定義した。空腸消化物をケージ内でプールして、凍結乾燥して、化学分析のためにすり潰した。粗タンパク質及びＴｉＯ２の濃度を、表１２に記載する見掛けの空腸窒素消化率ＡＪＤＮ（％）の後の推定のために消化物及び飼料サンプルの両方で求めた。
ＡＪＤＮ（％）＝１００－［（ＣＭｆ／ＣＭｅ）×（ＣＮｅ／ＣＮｆ）］×１００
式中、
ＣＭｆ＝飼料中のマーカーの濃度；ＣＭｅ＝空腸消化物中のマーカーの濃度；
ＣＮｆ＝飼料中の栄養素の濃度；ＣＮｅ＝空腸消化物中の栄養素の濃度。
窒素含有量をＤｕｍａｓ法（Ｄｕｍａｓ，Ｊ．Ｂ．Ａ．，Ｐｒｏｃｅｄｅｓ ｄｅ ｌ’Ａｎａｌｙｓｅ Ｏｒｇａｎｉｑｕｅ，Ａｎｎ．Ｃｈｉｍ．Ｐｈｙｓ．２４７：１９８－２１３（１８３１））に従ってＬＥＣＯ装置ＦＰ－５２８（ＬＥＣＯ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて求めた。係数６．２５を用いて、窒素含有量を粗タンパク質に変換した。
サンプルのＨ２ＳＯ４ミネラル化後、ＤＩＮ ＥＮ ＩＳＯ １１８８５：１９９７（ＤＩＮ ＥＮ ＩＳＯ １９９８）に従い、ＩＣＰ－ＯＥＳ ５１００機器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて飼料及び消化物中の二酸化チタン濃度を求めた。
Figure 0007515396000025
結果は、プロテアーゼが、ＮＣ及びベンチマーク（Ｃｉｂｅｎｚａ）の両方と比較して見掛けの空腸窒素消化率を増大させたことを実証する。
本明細書に記載され、且つ特許請求される本発明は、開示される本明細書の特定の態様による範囲に限定されるべきではなく、なぜなら、これらの態様は、本発明のいくつかの態様の例示であることが意図されているためである。任意の均等な態様が本発明の範囲内であることが意図される。実際に、本明細書に示され、記載されるものに追加した本発明の種々の変更形態が前述の記載から当業者に明らかとなるであろう。このような変更形態も添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。競合する場合、定義を含む本開示が優先されることとなる。
実施例１２．配列番号１の１０個のＰＥ－変異体の、飼料関連材料（ＳＢＭ／コーン）に対するｐＨ７での活性
プロテアーゼをｐＨ７のＳＢＭ－コーンスラリーと撹拌下で４０℃においてインキュベートする。インキュベーション後、プロテアーゼの作用をＯＰＡ法によって測定した。バッファストック（１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＰＳ、１２．５ｍＭ ＣａＣｌ２ ＊２Ｈ２Ｏ、３０６ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を製造して、１０Ｍ ＮａＯＨ又は３７％ＨＣｌでｐＨ７．３６に調整する。１．４ｇの粉砕ＳＢＭ（ダイズミール）、０．６ｇの粉砕コーンを２０ｍｌのバッファストックと混合すると、結果的にｐＨ７のスラリーが与えられる。スラリーを磁気スターラーで室温において５分間、予め混合する。
２４－ウェルプレート（交差磁石を有する）を、加熱及び撹拌を組み合わせた装置上に置いて４０℃において予熱する。ｐＨ７の２ｍｌスラリーを各ウェルに移して、プレートをシーリングテープで閉じて、３０分間予めインキュベートする。１００μｌバッファ（ブランク）又は酵素溶液をウェルに加えて（２００ｍｇ酵素／ｋｇ飼料に相当する）、シーリングテープを閉じて、プレートを３時間インキュベートする。プレートを０℃、４０００ｒｐｍ（２５００×ｇ）において１０分間遠心分離する。上清をｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移して、先に記載したＯＰＡ方法論を用いて分析する。
試験した全てのＰＥ変異体は、ｐＨ７において、ＳＢＭ：コーンに対する活性が野生型よりも高い。
Figure 0007515396000026
実施例１３．配列番号３．飼料関連材料に関するインビトロデータ
上記と同じ手順。
Figure 0007515396000027
ｐＨ７において、配列番号３は、ＳＢＭ：コーンに対する活性がＰｒｏＡｃｔ（登録商標）よりも高い。
実施例１４ 配列番号１のＰＥ変異体についてのクローニング及び発現の例
実施例１４．１：部位特異的突然変異誘発による変異体の構築
本発明に従う特定の置換を含むバチルス・ホルネキアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｎｅｃｋｉａｅ）セリンプロテアーゼＳ８Ａ（配列番号１）の部位特異的変異体を構築した。適切に設計した突然変異誘発性オリゴヌクレオチド（結果として生じる配列内に所望の突然変異を導入し、全ての当業者が反復することができる）と一緒にＰＣＲを用いる、ＤＮＡ断片の従来のクローニング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）によって変異体を製造した。
突然変異誘発性オリゴを、突然変異の所望の部位の側面に位置するＤＮＡ配列に対応させて設計して、挿入／欠失／置換を定義するＤＮＡ塩基対によってグループ分けして、オリゴベンダー、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入した。本発明のプロテアーゼ変異体を試験するために、本発明の変異体を含む突然変異したＤＮＡをコンピテント枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株中に相同組換えによって組み込んで、標準的なプロトコル（酵母抽出物ベースの培地、４日、３０℃）を用いて発酵させて、活性アッセイによってスクリーニングする。
実施例１４．２：活性アッセイのための発現
構築した変異体を、６μｇ／ｍｌクロラムフェニコールで補充したＬＢアガー上にプレーティングして、３７℃において１日増殖させる。増殖後、コロニーを選択し、６μｇ／ｍｌクロラムフェニコール及び微量金属（５０ｍＭ ＦｅＣｌ３、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１０ｍＭ ＺｎＳＯ４、２ｍＭ ＣｕＣｌ２及び２ｍＭ ＮｉＣｌ２）で補充した３ｍＬ ＴＢｇｌｙブロスを含有する標準的な２４ディープウェルプレート（ＤＷＰ）の個々のウェルに移した（Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｓｔｕｄｉｅｒ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｔｏ－ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｓ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，４１（２００５）２０７－２３４）。
また、野生型バチルス・ホルネキアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｎｅｃｋｉａｅ）セリンプロテアーゼＳ８Ａを各プレート上の４つのウェル内に基準として植菌した。ＤＷＰプレートを２２０ｒｐｍにおいて振盪させながら３０℃において４日間増殖させた。増殖後、プレートを２５００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離し、上清を、９６ウェルマイクロタイタープレートに再グリッド（ｒｅ－ｇｒｉｄｄｅｄ）してから、残留活性についてのスクリーニングに用いた。
実施例１４．３：精製のための発酵
当技術分野において周知の又は以下の方法によって発酵を実行することができる。変異体を保有する様々な枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株をＬＢアガープレート上にストリークして、３７℃において一晩増殖させた。コロニーを５００ｍｌ振盪フラスコ内の１００ｍｌ ＰＳ－１培地（ＰＳ－１：１００ｇ／Ｌスクロース（Ｄａｎｉｓｃｏ ｃａｔ．ｎｏ．１０９－０４２９）、４０ｇ／Ｌクラスト大豆（大豆粉）、１０ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ（Ｍｅｒｃｋ ｃａｔ．ｎｏ．６５７９）、０．１ｍｌ／Ｌ ｒｅｐｌａｃｅ－Ｄｏｗｆａｘ６３Ｎ１０（Ｄｏｗ）に移した。培養は、典型的に、３０℃において２７０ｒｐｍでの振盪を４日要する。細胞及び他の未溶解の材料を４５００ｒｐｍ、２０～２５分間の遠心分離によって発酵ブロスから除去した。
実施例１５ 胃安定性の向上について配列番号１変異体をスクリーニングするためのアッセイの記載
培地及び溶液
１リットルの１００ｍＭ酢酸／ＭＥＳ／ＨＥＰＥＳ／グリシンバッファを８．２ｇ酢酸ナトリウム、１９．５ｇ ＭＥＳ、２３．８ｇ ＨＥＰＥＳ、７．５ｇグリシンで構成した。このバッファを１ｍＬ ＣａＣｌ２（１Ｍ）、５０ｍＬ ２０％ＳＤＳ、１ｍＬ １０％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘで補充して、ｐＨを５Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７に調整した。
７１５ｍｌの０．１Ｍクエン酸及び２８５ｍｌの０，２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４を混合することによって胃チャレンジバッファｐＨ３．４を調製した。
停止試薬を０，２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４で構成した。
Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫアッセイプレートｐＨ７をＶ底Ｎｕｎｃ Ｕ９６ＰＰ ０，５ｍｌ ９６ウェル－プレート内で調製した。１００個のＰｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫタブレット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｔ－ＰＲＡＫ－２００Ｔ）（およそ１０．８２５ｇ）を、室温において１０分間の撹拌により、２００ｍｌの酢酸／ＭＥ／ＨＥＰＥＳ／グリシン／ＣａＣｌ２／ＳＤＳ／Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００中に溶解した。この溶液の１８０μＬを、８チャンネルピペット及びワイドボアチップを用いて、ＭＴＰ Ｖ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ Ｕ９６ＰＰ ０，５ｍｌ）中に分注した。使用までアッセイプレートをシールして凍結させた。
配列番号１変異体のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属ブロスを２つの同一グリッド内に分注した。各グリッドは、二反復のサンプルを含有し、２つの基準骨格も全てのプレートの各グリッドに存在した。
アッセイの説明
アッセイをＢｉｏｍｅｋ ＦＸｐ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）でランした。アッセイは、配列番号１の異なる変異体について、２３℃において１０分間（一次スクリーニング）及び１５分間（一次スクリーニング由来の突然変異の組合せに行った二次スクリーニング）のｐＨ３．４へのｐＨ降下（胃チャレンジ）からなった。インキュベーション時間中、異なる変異体の骨格安定性は、ｐＨ降下によって異なって影響された。停止試薬を加えてチャレンジグリッド内での反応を中和することによって胃チャレンジアッセイを止めた。プレート間変動を回避するために、この胃チャレンジアッセイについて試験したサンプルを９６ウェルプレート上で２つのグリッド：ｐＨ降下に提示しなかった対照グリッド及びｐＨ降下によってストレスを加えたチャレンジグリッドに分けた。
アッセイの第２部は、胃チャレンジアッセイ後、Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫ ｐＨ７プレート上でのインキュベーションによって残留活性を明らかにすることからなった。Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫアッセイでは、５００ｒｐｍ振盪下で２３℃において１５分間インキュベートした。遠心分離によって反応を止めて、上清をリーディング分光光度計プレートに移した。（チャレンジグリッド由来の平均吸光度変化）／（対照グリッド由来の平均吸光度変化）＊１００の比率を算出することにより、各変異体について残留活性（ＲＡ）比を算出した。このＲＡ数を用いて、胃安定性の向上について変異体をランク付けした。２ラウンドのスクリーニング：最も見込みがある一次突然変異を同定する第１のラウンド及び一次突然変異の組合せから形成される最も安定した変異体を同定する第２のラウンドを実行した。分光光度計プレートの吸光度を５９０ｎｍにおいて分析した。
実施例１６ プロテアーゼのＰＥ－変異体の精製
活性アッセイ
Ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡアッセイ：
ｐＮＡ基質：Ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ Ｌ－１４００）
温度：室温（２５℃）
アッセイバッファ：１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＢＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ９．０。
２０μｌのプロテアーゼ（０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中に希釈）を１００μｌのアッセイバッファと混合した。１００μｌのｐＮＡ基質（５０ｍｇを１．０ｍｌ ＤＭＳＯ中に溶解して、さらに０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で４５×希釈した）を加えることによってアッセイを開始した。ＯＤ４０５の増大をプロテアーゼ活性の尺度として監視した。
配列番号１ ＰＥ－変異体の精製
ＰＥ－変異体を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内で発現させた。培養ブロスを遠心分離（２６０００×ｇ、２０分）して、上清を沈殿物から慎重にデカントした。上清をＮａｌｇｅｎｅ ０．２μｍ濾過ユニットで濾過して、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属宿主細胞の残りを除去した。０．２μｍ濾液を３．０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４と１：１で混合して、混合液を、５０ｍＭ Ｈ３ＢＯ３、１０ｍＭ ＭＥＳ／ＮａＯＨ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ６．０内で平衡化したＰｈｅｎｙｌ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）にアプライした。平衡バッファでカラムを洗浄した後、プロテアーゼを５０ｍＭ Ｈ３ＢＯ３、１０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０で段階溶出（ｓｔｅｐ－ｅｌｕｔｅ）した。溶出ピーク（プロテアーゼ活性を有する）を収集して、５０ｍＭ Ｈ３ＢＯ３、１０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０内で平衡化したＢａｃｉｔｒａｃｉｎアガロースカラム（Ｕｐｆｒｏｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ由来）にアプライした。平衡バッファでカラムを充分に洗浄した後、プロテアーゼを５０ｍＭ Ｈ３ＢＯ３、１０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０（２５％（ｖ／ｖ）２－プロパノール入り）で溶出した。溶出ピーク（プロテアーゼ活性を有する）をＧ２５ ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）上の２０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０に移した。Ｇ２５に移したピークは、精製された調製物であり、さらなる実験に用いた。
精製したＰＥ－変異体プロテアーゼ調製物を非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析して、ゲルをクマシーで染色すると、ＰＥ－変異体プロテアーゼは、およそ３４～３７ｋＤａにおいて主要な支配的バンドとして見られた。
実施例１７．インビボブロイラー治験
材料及び方法
４つの独立したフロア檻治験及び１つのケージ檻ブロイラー研究を実行して、成長性能及び窒素の見掛けの回腸消化率を評価した。
動物及びハウジング
到着日（１日目）にニワトリ（Ｒｏｓｓ ３０８／７０８、Ｃｏｂｂ ５００）を体重によって１８～２５羽の群に分けた。各群を、木材の削りくずを散りばめた１つのフロア－檻内に配置して、様々な処理の１つに割り当てた。ケージ檻治験では、１反復あたり５羽を用いた。
各処理を８～１２群で反復した。ニワトリを、環境的に制御された室内に収容した。室温をニワトリの齢に適合させた。ニワトリに飼料及び水を不断給餌した。
飼料の組成、処理及び給餌の長さ
給餌相：
・スターター（０～１４）
・グローワー（１４～２８日）
・フィニッシャー（２８～３５日）
酵素補充した実験食餌：０～３５日
飼料分配：ペレット化後又はマッシュ
酵素を液体形態で提供して、ペレット化後又はマッシュ上に塗布した。
生成溶液の最終容量：約２００ｋｇ食餌について３００～５００ｍｌ。
実験食餌（スターター及びグローワー）は、トウモロコシ－ダイズミールに基づいた（以下の表を参照されたい）。食餌を、２１５～２２０ｇの粗タンパク質並びにスターター期間について１２．９ＭＪ／ｋｇ ＭＥＮ、グローワー期間について１９０～１９５ｇの粗タンパク質及び１３．４ＭＪ／ｋｇ ＭＥＮを含有するように配合した。基礎食餌は、現地の慣行に従って抗コクシジウム剤を含有した。
Figure 0007515396000028
以下を補充しない（陰性対照、Ｃ）又は補充した食餌を与えた。
１．配列番号１、１ｋｇ飼料あたり１０ｍｇ酵素タンパク質、又は
２．配列番号２、１ｋｇ飼料あたり１０ｍｇ酵素タンパク質、又は
３．陽性対照中の合成アミノ酸。
ペレット化後の塗布について、適切な量のプロテアーゼの液体調製物を水中に希釈して、ペレット化されたそれぞれの飼料上にスプレーして、様々な処理に対応する飼料の最終濃度を得た。また、全処理の手続き的バランスのために、同じ容量の水を対照食餌のペレット上にスプレーした。
実験パラメータ及び分析
実験について、１、２４、２８及び３５日目に（反復群として）ニワトリの体重を量った。中間期間中の飼料消費を求めた。体重増加及び飼料転換比（飼料／増加）を算出した。また、回腸内容物を、窒素の見掛けの回腸消化率の判定のために治験の終了後（３５日目）に収集した。
結果及び結論
研究で得られた結果は、プロテアーゼの包含が、食餌を与えたブロイラーの飼料転換比の向上に有効であることを示した。特に、結果は、酵素処理が、本発明の試験した全ての酵素の全体にわたって一貫して性能を向上させることを示した。この一貫性及び向上レベルは、業界において求められているものである。

Claims (23)

  1. プロテアーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを含む動物用飼料添加物であって、前記ポリペプチドは、
    （ａ）配列番号１と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
    （ｂ）配列番号２と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
    （ｃ）配列番号３と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
    （ｄ）配列番号４と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
    （ｅ）配列番号５と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
    （ｆ）配列番号６と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
    （ｇ）配列番号７と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
    （ｈ）配列番号８と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
    （ｉ）配列番号９と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと；
    （ｊ）配列番号１の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０位置に含む変異体と；
    （ｋ）配列番号２の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０位置に含む変異体と；
    （ｌ）配列番号３の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０位置に含む変異体と；
    （ｍ）配列番号５の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０位置に含む変異体と；
    （ｎ）配列番号６の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０位置に含む変異体と；
    （ｏ）配列番号７の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０位置に含む変異体と；
    （ｐ）配列番号８の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０位置に含む変異体と；
    （ｑ）配列番号９の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０位置に含む変異体と；
    （ｒ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）の前記ポリペプチド並びにＮ末端及び／又はＣ末端のＨｉｓ－タグ及び／又はＨＱ－タグを含むポリペプチドと；
    （ｓ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）の前記ポリペプチド並びに最大１０個のアミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸のＮ末端及び／又はＣ末端伸長を含むポリペプチドと；
    （ｔ）プロテアーゼ活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも９０％を有する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）の前記ポリペプチドの断片と
    からなる群から選択されるＳ８プロテアーゼである、動物用飼料添加物。
  2. 前記Ｓ８プロテアーゼは、モチーフＴＧＸＫ［Ｖ／Ｔ］［Ｉ／Ｖ］Ｘ［Ｎ／Ｓ］ＭＳＬＧ（配列番号４）を含む、請求項１に記載の動物用飼料添加物。
  3. １つ以上のビタミンをさらに含む、請求項１又は２に記載の動物用飼料添加物。
  4. プロテアーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは、
    （ａ）配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
    （ｂ）配列番号２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
    （ｃ）配列番号３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
    （ｄ）配列番号４と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
    （ｅ）配列番号５と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
    （ｆ）配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
    （ｇ）配列番号７と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
    （ｈ）配列番号８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
    （ｉ）配列番号９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
    （ｊ）配列番号１の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０位置に含む変異体；
    （ｋ）配列番号２の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０位置に含む変異体；
    （ｌ）配列番号３の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０位置に含む変異体；
    （ｍ）配列番号５の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０位置に含む変異体；
    （ｎ）配列番号６の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０位置に含む変異体；
    （ｏ）配列番号７の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０位置に含む変異体；
    （ｐ）配列番号８の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又は３０位置に含む変異体；
    （ｑ）配列番号９の変異体であって、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０位置に含む変異体
    からなる群から選択されるＳ８プロテアーゼである、請求項１～３のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物。
  5. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９又はその変異体を含み、前記変異体は、プロテアーゼ活性を有し、且つ１つ以上の置換、及び／若しくは１つ以上の欠失、及び／若しくは１つ以上の挿入又はそれらの任意の組合せを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５位置、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２位置に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物。
  6. 前記置換は、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｙ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ８３Ｔ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｙ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｙ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；及びＬ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐからなる群から選択される突然変異を含む複数の突然変異である、請求項１～４のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物。
  7. 前記Ｓ８プロテアーゼは、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、前記ポリペプチドは、Ｓ２７Ｋ、Ｎ１０９Ｋ、Ｓ１１１Ｅ、Ｓ１７１Ｅ、Ｓ１７３Ｐ、Ｇ１７４Ｋ、Ｓ１７５Ｐ、Ｆ１８０Ｙ、Ｇ１８２Ａ、Ｌ１８４Ｆ、Ｑ１９８Ｅ、Ｎ１９９Ｋ及びＴ２９７Ｐからなる群から選択される突然変異のいずれも含まないか又はそれらの１つ以上を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物。
  8. 配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＳ８プロテアーゼを含み、前記ポリペプチドは、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｙ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ８３Ｔ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｙ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｐ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｙ、Ｖ１２４Ａ、Ｒ１３０Ｄ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｈ８３Ｔ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｅ１２７Ｎ、Ｓ１２９Ｍ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ１２３Ｗ、Ｖ１２４Ａ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｐ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ；Ｈ３９Ｄ、Ｉ４３Ｐ、Ｎ５９Ｄ、Ｌ６１Ｙ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐ及びＬ６１Ｙ、Ｈ８３Ｔ、Ｓ１７３Ｐ、Ｓ１７５Ｐ、Ｔ２９７Ｐからなる群から選択される突然変異のいずれも含まないか又はそれらの１つ以上を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物。
  9. 配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＳ８プロテアーゼを含み、前記ポリペプチドは、突然変異を配列番号１、配列番号２又は配列番号３の位置２７、１０９、１１１、１７１、１７３、１７４、１７５、１８０、１８２、１８４、１９８、１９９及び２９７のいずれにおいても含まないか又はそれらの１つ以上において含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物。
  10. 配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＳ８プロテアーゼを含むか、又は前記Ｓ８プロテアーゼは、突然変異を配列番号２又は配列番号３の位置２７、１０９、１１１、１７１、１７３、１７４、１７５、１８０、１８２、１８４、１９８、１９９及び２９７のいずれにおいても含まないか又はそれらの１つ以上において含むポリペプチドである、請求項９に記載の動物用飼料添加物。
  11. 前記ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％の配列同一性を有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種－１３３８０由来のＳ８プロテアーゼ、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するバチルス・イドリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｄｒｉｅｎｓｉｓ）由来のＳ８プロテアーゼ、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種－６２４５１由来のＳ８プロテアーゼ及び配列番号１と少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％の配列同一性を有するバチルス・オセアニセディミニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｃｅａｎｉｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）由来のＳ８プロテアーゼからなる群から選択されるＳ８プロテアーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物。
  12. 界面活性剤を含まない、請求項１～１１のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物。
  13. １つ以上の配合剤と；
    １つ以上の追加の酵素と；
    １つ以上の微生物と；
    １つ以上のビタミンと；
    １つ以上のミネラルと；
    １つ以上のアミノ酸と；
    １つ以上のプレバイオティクスと；
    １つ以上のファイトジェニクスと；
    １つ以上の有機酸と；
    １つ以上の他の飼料成分と
    からなるリストから選択される１つ以上の構成要素をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物。
  14. 前記Ｓ８プロテアーゼは、顆粒として製剤化されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物。
  15. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物と、２０％～８０％ｗ／ｗのポリオールとを含む液体製剤。
  16. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物又は請求項１５に記載の液体製剤と、植物ベースの材料とを含む動物用飼料。
  17. 動物の１つ以上の性能パラメータを向上させる方法であって、１つ以上の動物に、請求項１～１１のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物、請求項１５に記載の液体製剤又は請求項１６に記載の動物用飼料を投与することを含む方法。
  18. 動物用飼料を調製する方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物又は請求項１５に記載の液体製剤を少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質源と混合することを含む方法。
  19. タンパク質を処理する方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物又は請求項１５に記載の液体製剤を少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質源に加えることを含む方法。
  20. タンパク質の消化率及び／又は可溶性を増大させる方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物又は請求項１５に記載の液体製剤を少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質源と混合することを含む方法。
  21. 動物用飼料の栄養価を向上させる方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物又は請求項１５に記載の液体製剤を前記飼料に加えることを含む方法。
  22. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の動物用飼料添加物又は請求項１５に記載の液体製剤の、動物用飼料に用いる組成物の調製における、
    動物用飼料の栄養価を向上させるための；
    消化可能な且つ／若しくは可溶性のタンパク質を動物用飼料中で増大させるための；
    動物用食餌中でのタンパク質の加水分解の程度を増大させるための；
    動物において１つ以上の性能パラメータを向上させるための；及び／又は
    タンパク質を処理するための使用。
  23. ポリペプチドを生成する方法であって、
    （ａ）請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む組換えバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属宿主細胞を培養するステップであって、前記ポリヌクレオチドは、発現され、及び前記ポリペプチドは、生成される、ステップと；任意選択的に、
    （ｂ）前記ポリペプチドを回収するステップと
    を含む方法。
JP2020512477A 2017-09-01 2018-08-31 プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む動物用飼料添加物及びその使用 Active JP7515396B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17189061.9 2017-09-01
EP17189061 2017-09-01
PCT/EP2018/073529 WO2019043191A1 (en) 2017-09-01 2018-08-31 ANIMAL FOOD ADDITIVES COMPRISING A POLYPEPTIDE HAVING PROTEASE ACTIVITY AND USES THEREOF

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2020531037A JP2020531037A (ja) 2020-11-05
JP7515396B2 true JP7515396B2 (ja) 2024-07-12

Family

ID=59761856

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020512477A Active JP7515396B2 (ja) 2017-09-01 2018-08-31 プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む動物用飼料添加物及びその使用

Country Status (15)

Country Link
US (2) US11744263B2 (ja)
EP (2) EP3675647B1 (ja)
JP (1) JP7515396B2 (ja)
CN (1) CN111050566A (ja)
AR (1) AR112955A1 (ja)
AU (1) AU2018322867B2 (ja)
BR (1) BR112020003854A2 (ja)
CA (1) CA3070193A1 (ja)
CL (1) CL2020000466A1 (ja)
ES (1) ES2993983T3 (ja)
HU (1) HUE069804T2 (ja)
MX (2) MX2020002177A (ja)
PL (1) PL3675647T3 (ja)
WO (1) WO2019043191A1 (ja)
ZA (1) ZA202002281B (ja)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108715844A (zh) * 2018-04-11 2018-10-30 河北工业大学 一种仿生矿化固定化酶和辅因子的制备方法及仿生矿化固定化酶和辅因子
EP3843552A1 (en) * 2018-08-31 2021-07-07 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
JP2023537982A (ja) 2020-08-13 2023-09-06 ノボザイムス アクティーゼルスカブ フィターゼ変異体及びそれをコードするポリヌクレオチド
CA3191718A1 (en) * 2020-08-14 2022-02-17 Steuben Foods, Inc. Plant based milk comprising protein hydrolysate and divalent cation compositions having improved taste and stability
EP4213641A1 (en) * 2020-09-15 2023-07-26 Novozymes A/S Animal feed comprising insects or insect meal
JP7619557B2 (ja) 2020-10-14 2025-01-22 ジェックス株式会社 バクテリアタブレット
CN112876581A (zh) * 2021-02-07 2021-06-01 西南大学 一种豆腐柴低酯果胶及其制备方法和应用
WO2022179757A1 (en) * 2021-02-26 2022-09-01 Dsm Ip Assets B.V. Method of improving carbohydrate digestibility by a carbohydratase in an animal feed by employing serine protease
CN116887689A (zh) * 2021-02-26 2023-10-13 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 通过使用丝氨酸蛋白酶改善动物饲料中糖酶对碳水化合物的可消化性的方法
CN114223777B (zh) * 2021-12-14 2023-07-07 辽宁省海洋水产科学研究院 一种养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂
KR20240124373A (ko) 2021-12-23 2024-08-16 노보자임스 에이/에스 동물의 암모니아 배출을 감소시키는 방법
KR102498755B1 (ko) * 2022-06-15 2023-02-10 김석록 동애등에 유충을 이용한 사료 원료
US20240148801A1 (en) * 2022-11-09 2024-05-09 Purina Animal Nutrition Llc Mitigation of pathogens in porcine species
CN120265141A (zh) * 2022-12-08 2025-07-04 诺维信公司 用于动物饲料的共颗粒
WO2025124468A1 (en) * 2023-12-13 2025-06-19 Novozymes A/S Stable liquid protease compositions for use in animal feed

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003521907A (ja) 2000-02-08 2003-07-22 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 動物飼料における酸安定性ズブチリシンプロテアーゼの使用
JP2004283034A (ja) 2003-03-20 2004-10-14 Bussan Biotech Kk 消化率を改善した飼料
JP2008301779A (ja) 2007-06-08 2008-12-18 Iris Ohyama Inc ペットフード
JP2008546395A (ja) 2005-06-24 2008-12-25 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 医薬使用のためのプロテアーゼ
DE102007036756A1 (de) 2007-08-03 2009-02-05 Henkel Ag & Co. Kgaa Neue Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Proteasen
WO2015014790A2 (en) 2013-07-29 2015-02-05 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
US20160160159A1 (en) 2013-07-29 2016-06-09 Henkel Ag & Co. Kgaa Detergent composition comprising protease variants

Family Cites Families (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4016040A (en) 1969-12-10 1977-04-05 Colgate-Palmolive Company Preparation of enzyme-containing beads
GB1483591A (en) 1973-07-23 1977-08-24 Novo Industri As Process for coating water soluble or water dispersible particles by means of the fluid bed technique
GB1590432A (en) 1976-07-07 1981-06-03 Novo Industri As Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced
DK263584D0 (da) 1984-05-29 1984-05-29 Novo Industri As Enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver
US5801038A (en) * 1984-05-29 1998-09-01 Genencor International Inc. Modified subtilisins having amino acid alterations
US4713245A (en) 1984-06-04 1987-12-15 Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated Granule containing physiologically-active substance, method for preparing same and use thereof
EG18543A (en) 1986-02-20 1993-07-30 Albright & Wilson Protected enzyme systems
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5989870A (en) 1986-04-30 1999-11-23 Rohm Enzyme Finland Oy Method for cloning active promoters
DK435587D0 (da) 1987-08-21 1987-08-21 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af et enzymholdigt granulat
DK435687D0 (da) 1987-08-21 1987-08-21 Novo Industri As Enzymholdigt granulat og fremgangsmaade til fremstilling deraf
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DK78189D0 (da) 1989-02-20 1989-02-20 Novo Industri As Enzymholdigt granulat og fremgangsmaade til fremstilling deraf
DK78089D0 (da) 1989-02-20 1989-02-20 Novo Industri As Detergentholdigt granulat og fremgangsmaade til fremstilling deraf
CA2058633C (en) 1989-06-13 2000-03-21 Virgil B. Lawlis, Jr. A method for killing cells without lysis
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
DK58491D0 (da) * 1991-04-03 1991-04-03 Novo Nordisk As Hidtil ukendte proteaser
EP0610321B1 (en) 1991-10-07 2001-12-12 Genencor International, Inc. Coated enzyme containing granule
US5879920A (en) 1991-10-07 1999-03-09 Genencor International, Inc. Coated enzyme-containing granule
DK91192D0 (da) 1992-07-10 1992-07-10 Novo Nordisk As Protein
FR2704860B1 (fr) 1993-05-05 1995-07-13 Pasteur Institut Sequences de nucleotides du locus cryiiia pour le controle de l'expression de sequences d'adn dans un hote cellulaire.
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
AU694954B2 (en) 1994-06-03 1998-08-06 Novo Nordisk A/S Purified myceliophthora laccases and nucleic acids encoding same
ATE294871T1 (de) 1994-06-30 2005-05-15 Novozymes Biotech Inc Nicht-toxisches, nicht-toxigenes, nicht- pathogenes fusarium expressionssystem und darin zu verwendende promotoren und terminatoren
ATE268817T1 (de) 1995-07-28 2004-06-15 Basf Ag Salz-stabilisierte enzymzubereitung
CN1135265C (zh) 1996-04-12 2004-01-21 诺沃奇梅兹有限公司 含酶颗粒及其生产方法
AU5309698A (en) 1996-12-20 1998-07-17 Novo Nordisk A/S Peniophora phytase
ID24116A (id) 1997-06-04 2000-07-06 Dsm Nv Komposisi-komposisi fitase aktivitas tinggi
DK1042443T3 (da) 1997-12-20 2007-03-05 Genencor Int Granulom med hydratiseret barrieremateriale
US5955310A (en) 1998-02-26 1999-09-21 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell
JP2002519052A (ja) 1998-06-30 2002-07-02 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 新規改良型酵素含有粒子
ATE238415T1 (de) 1998-10-02 2003-05-15 Novozymes As Feste phytase-zusammensetzungen
AU753232B2 (en) 1998-10-15 2002-10-10 Dsm N.V. Antimicrobial enzymes in animal feed
DK1124949T3 (da) 1998-10-26 2006-11-06 Novozymes As Konstruktion og screening af et DNA-bibliotek af interesse i trådformede svampeceller
WO2000043503A1 (en) 1999-01-22 2000-07-27 Novozymes A/S Improved phytases
CN100532561C (zh) 1999-03-22 2009-08-26 诺沃奇梅兹有限公司 新的葡糖淀粉酶及编码它的核酸序列
DE19922753A1 (de) 1999-05-18 2000-11-23 Basf Ag Enzym-Instantformulierungen für die Tierernährung
DE19929257A1 (de) 1999-06-25 2000-12-28 Basf Ag Polymerbeschichtete, granulierte enzymhaltige Futtermittelzusätze und Verfahren zu deren Herstellung
ES2436602T3 (es) 1999-07-09 2014-01-03 Novozymes A/S Proceso para la preparación de un gránulo que contiene enzimas
US6855548B2 (en) * 2000-02-08 2005-02-15 F. Hoffman-La Roche Ag Use of acid-stable proteases in animal feed
US7319087B2 (en) 2001-05-04 2008-01-15 Novozymes A/S Antimicrobial polypeptide from Aspergillus niger
US7157416B2 (en) * 2001-07-20 2007-01-02 Genencor International, Inc. Stabilization of enzymes
KR100960576B1 (ko) 2001-11-20 2010-06-03 노보자임스 아데니움 바이오테크 에이/에스 슈도플렉타니아 니그렐라로부터의 항균 폴리펩티드
EP1453819A2 (en) 2001-12-03 2004-09-08 Novozymes A/S Statin-like compounds
MXPA04006217A (es) 2002-01-15 2004-11-01 Basf Ag Granulados que contienen enzimas para alimentos animales.
RU2348175C9 (ru) 2002-01-15 2011-12-20 Басф Акциенгезелльшафт Способ получения ферментсодержащего гранулята для животных, ферментсодержащий гранулят для животных, кормовая композиция и способ стимулирования роста животного
JP4426307B2 (ja) 2002-02-08 2010-03-03 ノボザイムス アクティーゼルスカブ フィターゼ変異体
WO2003095658A1 (en) 2002-05-07 2003-11-20 Novozymes A/S Homologous recombination into bacterium for the generation of polynucleotide libraries
US7425528B2 (en) * 2002-07-01 2008-09-16 Novozymes A/S Stabilization of granules
CA2404356A1 (en) 2002-09-18 2004-03-18 Canadian Inovatech Inc. Gram-positive antibacterial composition and method for use
US7294499B2 (en) * 2003-01-30 2007-11-13 Novozymes A/S Subtilases
AU2004216921A1 (en) * 2003-03-07 2004-09-16 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food. Use of proteolytic enzymes to increase feed utilization in ruminant diets
CN101056540A (zh) 2004-09-27 2007-10-17 诺维信公司 酶颗粒
DE102005043324A1 (de) 2005-09-12 2007-03-15 Basf Ag Phytasehaltiges Enzymgranulat II
DE102005043323A1 (de) 2005-09-12 2007-03-15 Basf Ag Phytasehaltiges Enzymgranulat I
EP2497373A3 (en) 2005-10-12 2013-11-20 Danisco US Inc. Stable, durable granules with active agents
US9578891B2 (en) 2006-08-07 2017-02-28 Novozymes A/S Enzyme granules for animal feed
ES2712466T3 (es) 2006-08-07 2019-05-13 Novozymes As Gránulos de enzima para pienso para animales
CN105671027A (zh) 2008-09-30 2016-06-15 诺维信股份有限公司 在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法
EP2398889B1 (en) 2009-02-20 2018-04-25 Danisco US Inc. Fermentation broth formulations
US10174301B2 (en) * 2011-12-28 2019-01-08 Novozymes A/S Methods for improving the nutritional value of the animal feed using a protease
EP2674475A1 (en) 2012-06-11 2013-12-18 The Procter & Gamble Company Detergent composition
US20150140172A1 (en) 2012-06-20 2015-05-21 Danisco Us Inc. Sandwich granule
CN104470371A (zh) 2012-07-18 2015-03-25 丹尼斯科美国公司 熔化延迟的颗粒
US9551042B2 (en) * 2012-12-21 2017-01-24 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
US20160298102A1 (en) * 2013-12-20 2016-10-13 Novozymes A/S Polypeptides Having Protease Activity and Polynucleotides Encoding Same
EP3453757B1 (en) 2013-12-20 2020-06-17 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
GB201411197D0 (en) 2014-06-24 2014-08-06 Dupont Nutrition Biosci Aps Composition and use thereof
AU2015279057B2 (en) 2014-06-27 2019-02-28 Dsm Ip Assets B.V. A method for improving the nutritional value of animal feed
EP3215615B1 (en) 2014-11-04 2025-05-21 Novozymes A/S Polypeptides having serine protease activity and polynucleotides encoding same and their application in animal feed
US11518987B2 (en) 2014-12-19 2022-12-06 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
US10590367B2 (en) 2014-12-19 2020-03-17 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
EP3270893B1 (en) 2015-03-19 2021-07-28 Danisco US Inc. Stable granules with low internal water activity
CN108291215A (zh) 2015-10-14 2018-07-17 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003521907A (ja) 2000-02-08 2003-07-22 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 動物飼料における酸安定性ズブチリシンプロテアーゼの使用
JP2004283034A (ja) 2003-03-20 2004-10-14 Bussan Biotech Kk 消化率を改善した飼料
JP2008546395A (ja) 2005-06-24 2008-12-25 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 医薬使用のためのプロテアーゼ
US20110110910A1 (en) 2005-06-24 2011-05-12 Novozymes A/S Proteases for Pharmaceutical Use
JP2008301779A (ja) 2007-06-08 2008-12-18 Iris Ohyama Inc ペットフード
DE102007036756A1 (de) 2007-08-03 2009-02-05 Henkel Ag & Co. Kgaa Neue Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Proteasen
WO2015014790A2 (en) 2013-07-29 2015-02-05 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
US20160160159A1 (en) 2013-07-29 2016-06-09 Henkel Ag & Co. Kgaa Detergent composition comprising protease variants

Also Published As

Publication number Publication date
US20230309577A1 (en) 2023-10-05
MX2020002177A (es) 2020-07-14
ZA202002281B (en) 2025-01-29
AR112955A1 (es) 2020-01-08
CN111050566A (zh) 2020-04-21
AU2018322867A1 (en) 2020-01-16
WO2019043191A1 (en) 2019-03-07
EP3675647A1 (en) 2020-07-08
JP2020531037A (ja) 2020-11-05
EP3675647C0 (en) 2024-10-09
MX2024001047A (es) 2024-05-07
CL2020000466A1 (es) 2020-08-21
ES2993983T3 (en) 2025-01-15
BR112020003854A2 (pt) 2020-09-08
HUE069804T2 (hu) 2025-04-28
EP4501130A2 (en) 2025-02-05
US11744263B2 (en) 2023-09-05
US20200229463A1 (en) 2020-07-23
EP3675647B1 (en) 2024-10-09
EP4501130A3 (en) 2025-04-23
PL3675647T3 (pl) 2025-02-24
AU2018322867B2 (en) 2024-05-09
CA3070193A1 (en) 2019-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7515396B2 (ja) プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む動物用飼料添加物及びその使用
US11896034B2 (en) Polypeptides having lysozyme activity, polynucleotides encoding same and uses and compositions thereof
US20240124862A1 (en) Polypeptides having lyzozyme activity, polunucleotides encoding same and uses and compositions thereof
AU2018322865B2 (en) Animal feed additives comprising polypeptide having protease activity and uses thereof
US11058129B2 (en) Animal feed additives
US10808268B2 (en) Polypeptides having alpha-galactosidase activity and polynucleotides encoding same
US11473076B2 (en) Animal feed additives and compositions comprising an S8 serine protease
US10927359B2 (en) Compositions comprising polypeptides having galactanase activity and polypeptides having beta-galactosidase activity
US20190352627A1 (en) Polypeptides having Xylanase Activity and Polynucleotides Encoding Same

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210824

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20220805

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20221011

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230106

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230411

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230801

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20231031

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240201

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20240604

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20240702

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7515396

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150