CN107034234B - 一种用于敲除cho细胞中fut8和dhfr两种基因的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于敲除CHO细胞中FUT8基因和DHFR基因的试剂盒，它包括SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3所述的sgRNA序列，以及SEQ ID NO：23所述的sgRNA序列。本发明还提供了一种同时敲除CHO细胞中FUT8和DHFR基因的方法及其工程细胞株。本发明试剂盒可以用于快速、高效地敲除CHO细胞的FUT8和DHFR基因，可用于高效表达无岩藻糖修饰的抗体类药物，而且抗体产量高，应用前景良好。

Description

一种用于敲除CHO细胞中FUT8和DHFR两种基因的试剂盒

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种用于敲除CHO细胞中FUT8基因和DHFR基因的试剂盒。

背景技术

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO细胞)是目前生产药物蛋白最常用的宿主细胞，被广泛应用于抗体、重组蛋白药物和疫苗等产品的研发和生产。抗体药物是当前最主要的生物技术类药物，如何进一步提高CHO细胞抗体药物的效能和产量，是目前研究的热点。

α-1,6岩藻糖基转移酶(α-1,6fucosyltrasnferase,FUT8)是岩藻糖基转移酶基因超家族的一员，FUT8催化的核心岩藻糖基化是糖蛋白重要的翻译后修饰和功能调控方式。利用宿主细胞表达抗体药物时，抗体的糖基化修饰影响其在体内的功能和稳定性。研究表明，与岩藻糖基化的抗体相比，去除或降低岩藻糖基化的抗体会表现出更强的ADCC效应(抗体依赖性细胞毒性)，抗体性能佳。因此，敲除工程细胞株的FUT8，使表达的抗体无岩藻糖基化修饰，是提高抗体性能的有效手段。

二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)是一种催化5，6-二氢叶酸还原为5，6，7，8-四氢叶酸的蛋白酶，参与细胞内的嘌呤代谢过程。当细胞株缺失了DHFR基因，将携带DHFR基因的表达载体转染细胞，阳性细胞也就获得了DHFR基因，此时在培养基中加入甲氨喋呤(Methotrexate，MTX)，会导致DHFR基因扩增，连带其两侧片段也得到相应扩增，可使目的基因的拷贝数增加几百到几千倍，从而达到目的基因的高效表达。因此，急需要敲除CHO细胞株的DHFR基因，以提高外源基因蛋白表达量。

Crispr/Cas9系统，是细菌和古细菌在进化过程中演变出来的一种用于抵御外来侵害的免疫入侵系统，在现代基因工程应用领域与TALEN(transcription activator-likeeffector nuclease)以及ZFN(zinc-finger nuclease)技术并列成为三大基因组编辑工具。CRISPR-Cas9技术具有特异性DNA识别能力，Cas9核酸内切酶在向导核糖核酸(guideRNA，sgRNA)引导下切割双链DNA，造成基因组双链断裂，利用细胞基因组修复的不稳定性产生非特异重组来产生修复错误(插入或者缺失)，从而可能产生移码突变而造成基因功能的丧失，实现基因敲除的目的。相比较于TALEN及ZFN技术，其sgRNA的设计和合成工作量远远小于TALEN和ZFN识别模块的构建过程，易于操作，而且效率更高、更容易得到纯合子突变体。

目前研究中，未见通过CRISPR-Cas9系统，敲除CHO细胞中FUT8和DHFR两种基因的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于敲除CHO细胞中FUT8基因和DHFR基因的的试剂盒及其用途。

FUT8基因：为α-(1,6)-岩藻糖基转移酶基因；

DHFR基因：为二氢叶酸还原酶基因。

本发明提供了一种用于敲除CHO细胞中FUT8基因和DHFR基因的试剂盒，它包括SEQID NO：1和/或SEQ ID NO：3所述的sgRNA序列，以及SEQ ID NO：23所述的sgRNA序列。

本发明还提供了一种用于敲除CHO细胞中FUT8基因和DHFR基因的试剂盒，它包括SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：31所述的sgRNA序列

本发明还提供了上述试剂盒在用于敲除CHO细胞中FUT8和DHFR两种基因的用途。

本发明还提供了上述试剂盒在制备FUT8和DHFR基因同时缺失的细胞株中的用途。

本发明还提供了一种同时敲除CHO细胞中FUT8和DHFR基因的方法，它是利用CRISPR/Cas9系统在CHO细胞中对两种基因进行改造，步骤如下：

a、合成SEQ ID NO：1和/或3所述的序列及其互补链，变性、退火，形成双链，插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到重组表达质粒；

b、将步骤a的重组表达载体转染CHO细胞，挑取单个细胞，接种培养；

c、待单个细胞增殖为单克隆后，鉴定并确认FUT8基因被敲除，并获得FUT8基因缺失的细胞株FUT8-/-，备用；

d、合成SEQ ID NO：23所述的序列及其互补链，变性、退火，形成双链，插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到重组表达质粒；

e、取步骤c的FUT8-/-细胞株，用步骤d的重组表达载体转染，挑取单个细胞，接种培养；

f、待单个细胞增殖为单克隆后，鉴定并确认DHFR基因被敲除，并获得FUT8基因和DHFR基因同时缺失的细胞株。

其中，所述CHO细胞为CHO-S亚型细胞。

其中，所述Cas9表达载体为CRISPR/Cas9载体。

本发明还提供了上述方法制备得到的FUT8缺失细胞株。

本发明还提供了上述方法制备得到的FUT8和DHFR基因同时缺失的细胞株。

本发明包含sgRNA序列的试剂盒，可以用于快速、高效同时敲除CHO细胞的FUT8和DHFR基因，实现了在基因组水平对FUT8和DHFR基因的沉默，操作简便易行；获得的FUT8和DHFR基因同时缺失的细胞株，与野生型CHO-S细胞具有相同的细胞形态和生长特性，但是扩增效率更高，可用于高效表达无岩藻糖修饰的抗体类药物，而且抗体产量高，为抗体表达提供一种良好的工程细胞株选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为CHO-S/FUT8-/-/SD8细胞生长特性图。

图2为CHO-S/FUT8-/-/SD8细胞支原体检测图(PC:阳性对照；NC:阴性对照；SE2/SD8/SE7:单克隆细胞株编号)。

图3为细胞表面岩藻糖基检测及细胞形态观察图，

左上和左下：wtCHO-S细胞；右上和右下：CHO-S/FUT8-/-/SD8细胞。

图4为TNFR2-Fc蛋白鉴定图。

图5为毛细管电泳分析TNFR2-Fc蛋白糖基大小图。

图6为CHO-S细胞DHFR基因Exon1部分序列及sgRNA靶向序列图。

图7为荧光素酶法鉴定各sgRNA引导Cas9切割目标DNA的效率图。

图8为CHO-S/DHFR-/-/G3单克隆细胞生长速度图。

图9为细胞形态观察图，

左图：CHO-S/DHFR-/-/G3单克隆细胞；右图：野生型CHO-S细胞(对照)；

图10为CHO-S/DHFR-/-/G3细胞支原体检测图(PC：阳性对照；NC：阴性对照；A2，G3：单克隆细胞株编号)。

图11为不同MTX剂量处理下TNFR2-Fc表达量图。

图12为CHO-S/FUT8-/-/DHFR-/-/G3细胞生长特性图。

图13为CHO-S/FUT8-/-/DHFR-/-/G3细胞支原体检测图(PC:阳性对照；NC:阴性对照；B8/D11:单克隆细胞株编号)。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明所用的实验试剂如下：

Lipofectamine 2000,Invitrogen公司,REF.11668-030,lot.1828123；

Trypsin0.25％,Hyclone公司，SH42605.01,Cas.9002-07-7；

DEME/F-12,Gibco公司，REF.C11330500CP，Lot.8115411；

Foetal Bovine Serum，Hyclone公司，Cat.SH30084.03，Lot.YK0119；

Opti-MEM，Gibco公司，REF.31985-062，Lot.1800574；

Phosphate Buffered Saline，Hyclone公司，Cat.SH30256.01B,Lot.NAG1428

DEME,Gibco公司，REF.C11995500CP,Lot.8116413；

Renilla Luciferase Assay Substrate，Promega公司，REF.E289A,Lot.0000119245；

Renilla Luciferase Assay Buffer，Promega公司，REF.E290A,Lot.0000141517；

Stop&Glo Substrate，Promega公司，REF.E640A,Lot.0000133610；

HT Supplement，Gibco公司，REF.11067-030,Lot.1797757；

UCA CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒，百奥塞图公司，Cat.BCG-DX001,Lot.BBCTG201409。

CHO-S细胞：购自invitrogen公司，货号：A1155701。

实施例1利用本发明试剂盒敲除CHO细胞的FUT8和DHFR基因

一、敲除CHO-S细胞内的FUT8基因

1、设计靶向CHO-S细胞FUT8基因的sgRNA

根据Genbank公布的CHO细胞的FUT8基因序列，设计针对不同外显子(Exon)的sgRNA序列，设计的sgRNA序列如表1：

表1 sgRNAs序列

序号	SgRNA序列(5‐‐‐3)	方向	PAM序列	SgRNA序列位置
					SgRNA2‐f(SEQ ID NO：1)	UGGGAUACCCACCACACUGC	反向	AGG	Exon8
SgRNA4‐f(SEQ ID NO：2)	ACAUGGACUCUGGGGAGAAG	反向	TGG	Exon9
					SgRNA5‐f(SEQ ID NO：3)	GUCCAGCUUUGCAAGAAUCU	反向	TGG	Exon1

提取CHO-S细胞基因组DNA，使用表2引物扩增基因组DNA，凝胶回收扩增产物，连接至precut pUCA(LUC)载体，涂Amp抗性平板，挑取4个克隆(分别标记precut pUCA(LUC)-FUT8-2/precut pUCA(LUC)-FUT8-4/precut pUCA(LUC)-FUT8-5，对应sgRNA2、4和5)进行测序，并和Genbank公布的FUT8基因序列比对，检测sgRNA靶点位置序列有无突变，结果显示sgRNA靶点序列无突变。

表2扩增FUT8基因sgRNA靶点所用引物

SEQ ID NO：10 FUT8基因sgRNA2-f靶点周围DNA序列

SEQ ID NO：11 FUT8基因sgRNA4-f靶点周围DNA序列

SEQ ID NO：12 FUT8基因sgRNA5-f靶点周围DNA序列

2、构建靶向FUT8基因的CRISPR/Cas9/sgRNA载体

分别合成sgRNA正向和反向互补序列，并在正向序列5端加入CACC接头序列，在反向序列5端加入AAAC接头序列，合成序列如表3，通过变性退火方法组建双链sgRNA片段。

表3组建CRISPR/Cas9/sgRNA载体用各sgRNA正向和反向序列

序号	方向	SgRNA序列(5---3)
			SgRNA2-f(SEQ ID NO：13)	正向	CACCGTGGGATACCCACCACACTGC
SgRNA2-f(SEQ ID NO：14)	反向	AAACGCAGTGTGGTGGGTATCCCAC
			SgRNA4-f(SEQ ID NO：15)	正向	CACCGACATGGACTCTGGGGAGAAG
SgRNA4-f(SEQ ID NO：16)	反向	AAACCTTCTCCCCAGAGTCCATGTC
			SgRNA5-f(SEQ ID NO：17)	正向	CACCGTCCAGCTTTGCAAGAATCT
SgRNA5-f(SEQ ID NO：18)	反向	AAACAGATTCTTGCAAAGCTGGAC

用BsmB I酶切CRISPR/Cas9载体(百奥赛图公司的UCA CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒中试剂)，1％琼脂糖凝胶回收目的片段，T4DNA连接酶连接各sgRNA片段和酶切载体，并转化DH5a感受态细胞，涂Amp抗性平板，每个平板挑选5个阳性克隆进行测序核实。对测序正确质粒用高纯度试剂盒进行纯化和保存。

4、针对FUT8基因的sgRNA活性鉴定

采取测序法鉴定各sgRNA引导Cas9切割靶基因的活性。具体步骤为：传代CHO-S细胞(细胞培养基为：DEME/F12+10％FBS)至24孔板，次日用脂质体转染法转染CRISPR-Cas9-sgRNA-f和precut pUCA(LUC)-FUT8载体(其中，Lipofectamine 2000转染试剂2ul，CRISPR-Cas9-sgRNA-f载体0.8ug，precut pUCA(LUC)-FUT8 0.2ug)，转染72小时后提取细胞基因组DNA，PCR扩增各sgRNA靶区域基因，连接至T载体后转化DH5a感受态细胞，而后涂Amp平板，每个sgRNA对应平板上各挑取30个细菌克隆进行测序，分析sgRNA靶基因位点序列突变情况。测序情况见表4。

表4测序分析各sgRNA引导Cas9切割目标DNA的效率

	总测序数	靶基因突变数	突变率
				SgRNA2-f	30	10	33％
SgRNA4-f	30	4	13％
				SgRNA5-f	30	8	26％

可见，携带SgRNA2-f、SgRNA5-f的质粒转染细胞后，对靶基因FUT8的突变效果较好，突变率最高可达33％，而携带SgRNA4-f的质粒转染细胞后，对靶基因的突变效果不佳。为提高失活CHO-S细胞内FUT8基因功能的效率，后续试验中采用混合转染CRISPR-Cas9-sgRNA2-f和CRISPR-Cas9-sgRNA5-f。

5、敲除CHO-S细胞内的FUT8基因

复苏CHO-S细胞，传至6孔板，采用脂质体转染法，选择CRISPR-Cas9-sgRNA2-f和CRISPR-Cas9-sgRNA5-f两个质粒共转染CHO-S细胞(转染时：Lipofectamine 2000转染试剂4ul，CRISPR-Cas9-sgRNA2-f载体1ug，CRISPR-Cas9-sgRNA5-f载体1ug)，次日传至25cm²方瓶中，选用含有75ug/ml小扁豆凝集素的无血清生长培养基进行加压筛选，每2-3天更换新鲜培养基，加压2周后，对存活细胞进行有限稀释法单克隆(培养基中含有50ug/ml小扁豆凝集素)，培养至4块96孔板中，继续培养2周。

6、CHO-S/FUT8-/-单克隆细胞筛选

96孔板中细胞培养约2周，挑选30个细胞形态好、生长速度快的单克隆进行消化，1/3细胞传至一块48孔板(A板)，另2/3细胞传至另一块48孔板(B板)，次日提取B板上细胞基因组DNA(30个DNA样本)，使用表2的引物分别扩增sgRNA2-f和sgRNA5-f靶点周围序列，琼脂糖凝胶回收目的片段，而后连接至T载体，转化DH5a感受态细胞，涂Amp抗性平板(共60块平板)，次日从每个平板上挑取5个克隆测序。

和原序列进行比对分析，选择全部为错意突变、细胞生长状态好、生长速度快的单克隆进行二次单克隆培养。从二次单克隆中挑选5个单克隆进行鉴定，挑选全部为错意突变、细胞生长状态好、生长速度快且支原体检测阴性的单克隆进行放大培养和冻存。

对最终选取的单克隆(CHO-S/FUT8-/-/SD8)细胞进行生长速度、细胞形态观察分析和支原体检测，结果显示敲除FUT8基因的CHO-S/FUT8-/-/SD8单克隆细胞生长速度(见图1)、形态(见图3)与野生型CHO-S细胞无明显差异，且无支原体感染(见图2)。

其中，CHO-S/FUT8-/-/SD8单克隆细胞的突变情况如下：双链DNA突变不一样，而且插入/缺失bp数都不是3的整倍数，其中一条链(突变体A-)缺少4bp，另一条链(突变体B-)多1bp。

SEQ ID NO：19 CHO-S/FUT8-/-/SD8单克隆细胞测序(突变体A-缺4bp)

SEQ ID NO：20 CHO-S/FUT8-/-/SD8单克隆细胞测序(突变体B-多1bp)

7、CHO-S/FUT8-/-细胞的性能验证

7.1细胞表面岩藻糖检测

铺CHO-S/FUT8-/-/SD8细胞和wtCHO-S细胞至48孔板，次日去除培养基，添加10ug/ml的荧光素酶标记的小扁豆凝集素，37度孵育20分钟，PBS清洗2遍，加入100ul PBS，用荧光显微镜观察细胞情况。结果显示CHO-S/FUT8-/-/SD8细胞无绿色荧光，而wtCHO-S细胞膜上呈现绿色荧光(见图3)。

可见，敲除FUT8的CHO-S/FUT8-/-/SD8细胞株不表达岩藻糖。

7.2表达产物的糖基化修饰检测

1)CHO-S/FUT8-/-/SD8细胞和CHO-S细胞表达TNFR2-Fc

构建含有TNFR2-Fc融合基因(即肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白)的表达载体pcDNA3.1-TNFR2-Fc(构建方法为：合成TNFR2-Fc基因，使用NheI和XhoI双酶切TFNR2-Fc和pcDNA3.1，1％琼脂糖凝胶回收目的片段，T4DNA连接酶连接后转化DH5a感受态细胞，涂Amp抗性平板，挑克隆测序，选择测序正确克隆，使用高纯度质粒提取试剂盒提取质粒即可)，转染CHO-S/FUT8-/-/SD8细胞株和wtCHO-S细胞株，并进行细胞加压培养(G418，800ug/ml)和单克隆筛选，挑选表达较高的细胞株，在225cm²方瓶中进行细胞培养和蛋白表达。

TNFR2-Fc蛋白鉴定：用GE公司的Protein A亲和层析柱纯化回收Fc融合蛋白(详细方法见公司说明书)，通过BCA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶分析蛋白纯度和大小。结果显示回收蛋白条带单一，纯度达97％，分子量与预期一致。使用去糖基化酶处理TNFR2-Fc融合蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳显示蛋白糖基大小约3kda。结果见图4。

2)CHO-S/FUT8-/-/SD8细胞表达的TNFR2-Fc蛋白糖基化分析

用糖基化酶切割TNFR2-Fc融合蛋白的糖基，毛细管电泳分析糖基大小，分子Ladder为甘露糖Marker。结果见图5，CHO-S/FUT8-/-/SD8细胞株表达的抗体糖基比wtCHO-S细胞表达的抗体糖基小一个甘露糖分子大小，分子量约160，而岩藻糖基也是约160，从图中结果来看，和预期是一致的，说明CHO-S/FUT8-/-/SD8的岩藻糖生成关键基因FUT8被破坏后，可以产生岩藻糖缺失的重组蛋白分子。

可见，使用本发明sgRNA序列敲除CHO细胞的FUT8基因后，表达的抗体(TNFR2-Fc融合蛋白)无岩藻糖修饰，进而提高抗体的ADCC效能。

二、靶向CHO-S细胞DHFR基因的sgRNA设计及敲除效果验证

1、设计靶向CHO-S细胞DHFR基因的sgRNA

根据Genbank公布的CHO细胞的DHFR基因序列，针对第一外显子(Exon1)，设计不同的sgRNA序列，设计的sgRNA序列见表5：

表5 sgRNAs序列

序号	SgRNA序列(5‐‐‐3)	方向	PAM序列	SgRNA序列位置
					SgRNA1‐h(SEQ ID NO：21)	GCAAGAACGGAGACCUUCCC	正向	TGG	Exon1
SgRNA2‐h(SEQ ID NO：22)	GUCGCCGUGUCCCAGAAUAU	正向	GGG	Exon1
					SgRNA3‐h(SEQ ID NO：23)	GCCAAUGCUCAGGUACUGGC	正向	TGG	Exon1

CHO-S细胞DHFR基因Exon1部分序列及sgRNA靶向序列见图6。

提取CHO-S细胞基因组DNA，使用表6引物扩增基因组DNA，凝胶回收扩增产物，连接至precut pUCA(LUC)载体(百奥赛图公司的UCA CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒中试剂)，标记为precut pUCA(LUC)-DHFR，涂Kna抗性平板，挑取4个克隆进行测序，并和Genbank公布的DHFR基因序列比对，检测sgRNA靶点位置序列有无突变，结果显示sgRNA靶点序列无突变。

表6扩增DHFR基因sgRNA靶点所用引物

SEQ ID NO：26 DHFR基因SgRNA1-h、2-h、3-h靶点周围DNA序列

2、构建靶向DHFR基因的CRISPR/Cas9/sgRNA载体

分别合成sgRNA正向和反向互补序列，并在正向序列5端加入CACC接头序列，在反向序列5端加入AAAC接头序列，合成序列见表7，通过变性退火方法组建双链sgRNA片段。

表7组建CRISPR/Cas9/sgRNA载体用各sgRNA正向和反向序列

序号	SgRNA序列(5---3)
		SgRNA1-h-正向(SEQ ID NO：27)	CACCGCAAGAACGGAGACCTTCCC
SgRNA1-h-反向(SEQ ID NO：28)	AAACGGGAAGGTCTCCGTTCTTGC
		SgRNA2-h-正向(SEQ ID NO：29)	CACCGTCGCCGTGTCCCAGAATAT
SgRNA2-h-反向(SEQ ID NO：30)	AAACATATTCTGGGACACGGCGAC
		SgRNA3-h-正向(SEQ ID NO：31)	CACCGCCAATGCTCAGGTACTGGC
SgRNA3-h-反向(SEQ ID NO：32)	AAACGCCAGTACCTGAGCATTGGC

用BsmB I酶切CRISPR/Cas9载体(百奥赛图公司的UCA CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒中试剂)，1％琼脂糖凝胶回收目的片段，T4DNA连接酶连接各sgRNA片段和酶切载体，并转化DH5a感受态细胞，涂Amp抗性平板，每个平板挑选5个阳性克隆进行测序核实。对测序正确质粒用高纯度试剂盒进行纯化和保存。

3、针对DHFR基因的sgRNA活性鉴定

采取luciferase法鉴定各sgRNA引导Cas9切割靶基因的活性，具体步骤为：传代293细胞(293细胞培养基为：高糖DEME+10％FBS)至24孔板，次日用脂质体转染法转染CRISPR-Cas9-sgRNA-h和SSA luciferase-cut-gene载体(每种sgRNA做3次转染)(其中，Lipofectamine 2000转染试剂2ul，CRISPR-Cas9-sgRNA-h载体0.8ug，SSA-luciferase-cut-gene 0.2ug)，以含有活性sgRNA的CRISPR-Cas9和SSA luciferase-cut-gene载体转染作为阳性对照(标记为positive)。

转染72小时后取上清40ul，并添加10ul luciferase底物，检测luciferase强度。检测结果见表8和图7。

表8荧光素酶法鉴定各sgRNA引导Cas9切割目标DNA的效率

	SgRNA1-h	SgRNA2-h	SgRNA3-h	Positive
					A	435880	538070	1554960	858650
B	441770	632550	1455950	1075760
					C	427220	515720	1672710	1011520
Ave.	434956.7	562113.3	1561207	981976.7
					sgRNA/PC	0.44294	0.57243	1.589861	1

可见，携带SgRNA3-h的质粒转染细胞后，产生的荧光强度显著优于阳性对照，说明其活性好，切割目标DNA的效率高，而其它sgRNA的效果不佳。

4、敲除CHO-S细胞内的DHFR基因

复苏CHO-S细胞，传至6孔板，采用脂质体转染法，选择CRISPR-Cas9-SgRNA3-h质粒转染CHO-S细胞(转染时：Lipofectamine 2000转染试剂4ul，CRISPR-Cas9-SgRNA3-h载体2ug)，次日传至25cm²方瓶中，选用含有750ug/ml G418、0.5mM次黄嘌呤钠、0.08mM胸腺嘧啶的无血清生长培养基进行加压筛选，每2-3天更换新鲜培养基，加压2周后，对存活细胞进行有限稀释法单克隆，培养至4块96孔板中，继续培养2周。

5、挑选CHO-S/DHFR-/-单克隆细胞

挑选30个细胞形态好、生长速度快的单克隆进行消化，细胞传至一块48孔板，次日提取48孔板上细胞基因组DNA(30个DNA样本)，使用表6的引物分别扩增SgRNA3-h靶点周围序列，琼脂糖凝胶回收目的片段，而后连接至T载体，转化DH5a感受态细胞，涂Amp抗性平板(共60块平板)，次日从每个平板上挑取5个克隆测序。和原序列进行比对分析，选择全部为错意突变、细胞生长状态好、生长速度快的单克隆进行二次单克隆培养。从二次单克隆中挑选5个单克隆进行鉴定，挑选全部为错意突变、细胞生长状态好、生长速度快且支原体检测阴性的单克隆进行放大培养和冻存。

对最终选取的单克隆细胞(编号CHO-S/DHFR-/-/G3、A2)进行生长速度(图8)、细胞形态观察分析(图9)和支原体检测(图10)，结果显示挑选得到的单克隆细胞生长速度与野生型CHO-S细胞相近，细胞形态无明显差异，且没有支原体污染。

其中，CHO-S/DHFR-/-/G3单克隆细胞的突变情况如下：双链DNA突变不一样，而且插入/缺失bp数都不是3的整倍数，其中一条链(突变体A-)多2bp，另一条链(突变体B-)少4bp。

SEQ ID NO：33 CHO-S/DHFR-/-/G3单克隆细胞测序(突变体A-多2bp)

SEQ ID NO：34 CHO-S/DHFR-/-/G3单克隆细胞测序(突变体B-少4bp)

可知，本发明sgRNA序列可以用于敲除CHO细胞的二氢叶酸还原酶基因，并且获得了二氢叶酸还原酶基因缺失细胞株。获得的细胞株与野生型CHO-S细胞具有相同的细胞形态和倍增速度，可用于后续的功能性重组蛋白的表达。

6、DHFR基因敲除后，表达外源蛋白的效果验证

按照分子克隆方法，构建含有TNFR2-Fc和DHFR基因的表达载体(构建方法为：将pcDNA3.1载体上的Neo抗性片段替换为DHFR基因，命名为pcDNA3.1/DHFR,合成TNFR2-Fc基因，将其插入到pcDNA3.1/DHFR载体的多克隆位点区即可)。并分别转染本发明的CHO-S/DHFR-/-/G3细胞株和wtCHO-S细胞株(野生型)，使用2ug/ml的嘌呤霉素加压5天(杀死未转染质粒的CHO细胞)。取等量细胞至6孔板中，添加不同剂量的MTX加压2周，更换新的生长培养基，24小时后收集培养基，ELISA检测培养上清中Fc融合蛋白表达情况。

结果显示CHO-S/DHFR-/-细胞表达的TNFR2-Fc远高于CHO-S细胞，而且随着MTX浓度的升高，其TNFR2-Fc表达量也提高(图11)。

三、敲除CHO-S/FUT8-/-/SD8细胞的DHFR基因

复苏CHO-S/FUT8-/-/SD8细胞，传至6孔板，采用脂质体转染法，选择CRISPR-Cas9-sgRNA3-h质粒转染CHO-S/FUT8-/-/SD8细胞(转染时：Lipofectamine 2000转染试剂4ul，CRISPR-Cas9-SgRNA3-h载体2ug)，次日传至25cm²方瓶中，选用含有750ug/ml G418、0.5mM次黄嘌呤钠、0.08mM胸腺嘧啶的无血清生长培养基进行加压筛选，每2-3天更换新鲜培养基，加压2周后，对存活细胞进行有限稀释法单克隆，培养至4块96孔板中，继续培养2周。后续挑选DHFR和FUT8基因同时缺失单克隆细胞的方法同步骤二的5(挑选CHO-S/DHFR-/-单克隆细胞)。

选取DHFR和FUT8基因同时缺失单克隆细胞(编号CHO-S/FUT8-/-/DHFR-/-/B8和D11)，进行检测，结果显示其生长特性和突变前原细胞相比无明显差异，也无支原体污染。(见图12、13)

其中，CHO-S/FUT8-/-/DHFR-/-/B8单克隆细胞的突变情况如下：双链DNA突变不一样，而且插入/缺失bp数都不是3的整倍数，其中一条链(突变体A-)少7bp，另一条链(突变体B-)少1bp。

SEQ ID NO：35 CHO-S/FUT8-/-/DHFR-/-/B8单克隆细胞测序(突变体A-少7bp)

SEQ ID NO：36 CHO-S/FUT8-/-/DHFR-/-/B8单克隆细胞测序(突变体B-少1bp)

因此，本发明sgRNA序列可以用于敲除CHO细胞的FUT8和DHFR基因，并且获得了二种基因同时缺失的细胞株。二种基因被敲除后，CHO细胞株表达的抗体无岩藻糖基化修饰，且产量高，应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川丰讯科技发展有限公司

<120> 一种用于敲除CHO细胞中FUT8和DHFR两种基因的试剂盒

<130> GY456-17P1185

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> SgRNA2-f序列

<400> 1

ugggauaccc accacacugc 20

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> SgRNA4-f序列

<400> 2

acauggacuc uggggagaag 20

<210> 3

<211> 20

<212> RNA

<213> SgRNA5-f序列

<400> 3

guccagcuuu gcaagaaucu 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Fut8-2sg12-U1引物

<400> 4

agtggtcgag ctccccattg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Fut8-2sg12-D1序列

<400> 5

gcagaaggac acactgcacc a 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Fut8-2sg34-U1引物

<400> 6

tctgttgatt ccaggttccc at 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Fut8-2sg34-D1序列

<400> 7

tgcatcagat acagctagta agg 23

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Fut8-2sg5-U1序列

<400> 8

gtaagagtca tcacagtata ccaga 25

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Fut8-2sg5-D1序列

<400> 9

gactatatag atgtatcact gact 24

<210> 10

<211> 413

<212> DNA

<213> FUT8基因sgRNA2-f靶点周围DNA序列

<400> 10

agtggtcgag ctccccattg tagacagcct ccatcctcgt cctccttact tacccttggc 60

tgtaccagaa gaccttgcag atcgactcct gagagtccat ggtgatcctg cagtgtggtg 120

ggtatcccag tttgtcaaat acttgatccg tccacaacct tggctggaaa gggaaataga 180

agaaaccacc aagaagcttg gcttcaaaca tccagttatt gggtaagaat ctatccccct 240

ccccttaaac agtaatatat agcagtagtt gtatgtgttt actttttact gtagatttta 300

taatatttaa tagtcatagt cccaccaaag aacaaagatt ctaaaactta aaagactatt 360

ctccctttgt tcagttaggg cagcagagca aatggtgcag tgtgtccttc tgc 413

<210> 11

<211> 621

<212> DNA

<213> FUT8基因sgRNA4-f靶点周围DNA序列

<400> 11

tctgttgatt ccaggttccc atatattctt ggatatgcca attacttttt ctgtaagcaa 60

gtgtttcata aaacttttac ttaactttca tattgacctg tactattcaa cattcagcta 120

tgttaaagta tttgtgaagt gttttgaaat gattttatat tttctaaggt gagaataaat 180

gagaaaatgt tttaatatgt ctccagtgcc cccatgacta gggatactaa ttgagtacca 240

gtacattatc agtgtgctct ccacttctcc ccagagtcca tgtcagacgc actgacaaag 300

tgggaacaga agcagccttc catcccattg aggaatacat ggtacacgtt gaagaacatt 360

ttcagcttct cgaacgcaga atgaaagtgg ataaaaaaag agtgtatctg gccactgatg 420

acccttcttt gttaaaggag gcaaagacaa agtaagttag accaacaagt ggttctgtat 480

gggattatct cttagttgaa gaaaatcctt aattctggga acttgtggtt cttgttgcta 540

actaataggt tccaaaatca aagactacat gtgcaaatat taatctaatc aagtcatacc 600

ttactagctg tatctgatgc a 621

<210> 12

<211> 524

<212> DNA

<213> FUT8基因sgRNA5-f靶点周围DNA序列

<400> 12

gtaagagtca tcacagtata ccagagagac taattttgtc tgaagcatca tgtgttgaaa 60

caacagaaac ttattttcct gtgtggctaa ctagaaccag agtacaatgt ttccaattct 120

ttgagctccg agaagacaga agggagttga aactctgaaa atgcgggcat ggactggttc 180

ctggcgttgg attatgctca ttctttttgc ctgggggacc ttattgtttt atataggtgg 240

tcatttggtt cgagataatg accaccctga ccattctagc agagaactct ccaagattct 300

tgcaaagctg gagcgcttaa aacaacaaaa tgaagacttg aggagaatgg ctgagtctct 360

ccggtaggtt tgaaatactc aaggatttga tgaaatactg tgcttgacct ttaggtatag 420

ggtctcagtc tgctgttgaa aaatataatt tctacaaacc gtctttgtaa aattttaagt 480

attgtagcag actttttaaa agtcagtgat acatctatat agtc 524

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> SgRNA2-f正向引物

<400> 13

caccgtggga tacccaccac actgc 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> SgRNA2-f反向引物

<400> 14

aaacgcagtg tggtgggtat cccac 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> SgRNA4-f正向引物

<400> 15

caccgacatg gactctgggg agaag 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> SgRNA4-f反向引物

<400> 16

aaaccttctc cccagagtcc atgtc 25

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> SgRNA5-f正向引物

<400> 17

caccgtccag ctttgcaaga atct 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> SgRNA5-f反向引物

<400> 18

aaacagattc ttgcaaagct ggac 24

<210> 19

<211> 523

<212> DNA

<213> CHO-S/FUT8-/-/SD8单克隆细胞测序，链A

<400> 19

ttggtaccga gctcggatcc actagtaacg gccgccagtg tgctggaatt gcccttcagc 60

agaaggacac ctgcaccatt tgctctgctg ccctaactga acaaagggag aatagtcttt 120

taagttttag aatctttgtt ctttggtggg actatgacta ttaaatatta taaaatctac 180

agtaaaaagt aaacacatac aactactgct atatattact gtttaagggg agggggatag 240

attcttaccc aataactgga tgtttgaagc caagcttctt ggtggtttct tctatttccc 300

tttccagcct tgtggacgga tcaagtattt gacaaactgg gatacccacc acactgcagg 360

atcaccatgg actctcagga gtcgatctgc aaggtcttct ggtacagcca agggtaagta 420

aggaggacga ggatggaggc tgtctacaat ggggagcaag ggcaattctg cagatatcca 480

tcacactggc ggccgctcga gcatgcatct agagggccca att 523

<210> 20

<211> 528

<212> DNA

<213> CHO-S/FUT8-/-/SD8单克隆细胞测序，链B

<400> 20

ttggtaccga gctcggatcc actagtaacg gccgccagtg tgctggaatt gcccttcagc 60

agaaggacca ctgcaccatt tgctctgctg ctctaactga acaaagggag aatagtcttt 120

taagttttgg aatctttgtt ctttggtggg actatgacta ttaaatatta taaaatctac 180

agtaaaaagt aaacacatac aactactgct atatattact gtttaagggg agggggatag 240

attcttaccc aataactgga tgtttgaagc caagcttctt ggtggtttct tctatttccc 300

tttccagcca aaggttgtgg acggatcaag tatttgacaa actgggatac ccaccacact 360

gcaggatcac catggactct caggagtcga tctgcaaggt cttctggtac agccaagggt 420

aagtaaggag gacgaggatg gaggctgtct acaatgggga gcaagggcaa ttctgcagat 480

atccatcaca ctggcggccg ctcgagcatg catctagagg gcccaatt 528

<210> 21

<211> 20

<212> RNA

<213> SgRNA1-h序列

<400> 21

gcaagaacgg agaccuuccc 20

<210> 22

<211> 20

<212> RNA

<213> SgRNA2-h序列

<400> 22

gucgccgugu cccagaauau 20

<210> 23

<211> 20

<212> RNA

<213> SgRNA3-h序列

<400> 23

gccaaugcuc agguacuggc 20

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> DHFR-EXO1-F2引物

<400> 24

cggggcctct gatgttcaaa tagga 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> DHFR-EXO1-R2引物

<400> 25

tgaggaggtg gtggtcattc tttgg 25

<210> 26

<211> 584

<212> DNA

<213> DHFR基因SgRNA1-h、2-h、3-h靶点周围DNA序列

<400> 26

cggggcctct gatgttcaaa taggatgcta ggcttgttga gggcgtggcc tccgattcac 60

aagtgggaag cagcgccggg cgactgcaat ttcgcgccaa acttggggga agcacagcgt 120

acaggctgcc taggtgatcg ctgctgctgt catggttcga ccgctgaact gcatcgtcgc 180

cgtgtcccag aatatgggca tcggcaagaa cggagacctt ccctggccaa tgctcaggta 240

ctggctggat tgggttaggg aaaccgaggc ggttcgctga atcgggtcga gcacttggcg 300

gagacgcgcg ggccaactac ttagggacag tcatgagggg taggcccgcc ggctgcagcc 360

cttgcccatg cccgcggtga tccccatgct gtgccagcct ttgcccagag gcgctctagc 420

tgggagcaaa gtccggtcac tgggcagcac caccccccgg acttgcatgg gtagccgctg 480

agatggagcc tgagcacacg tgacagggtc cctgttaacg cagtgtttct ctaactttca 540

ggaacgaatt caagtacttc caaagaatga ccaccacctc ctca 584

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> SgRNA1-h-正向引物

<400> 27

caccgcaaga acggagacct tccc 24

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> SgRNA1-h-反向引物

<400> 28

aaacgggaag gtctccgttc ttgc 24

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> SgRNA2-h-正向引物

<400> 29

caccgtcgcc gtgtcccaga atat 24

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> SgRNA2-h-反向引物

<400> 30

aaacatattc tgggacacgg cgac 24

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> SgRNA3-h-正向引物

<400> 31

caccgccaat gctcaggtac tggc 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> SgRNA3-h-反向引物

<400> 32

aaacgccagt acctgagcat tggc 24

<210> 33

<211> 472

<212> DNA

<213> CHO-S/DHFR-/-/G3单克隆细胞测序，链A

<400> 33

ggggcctctg atgttcaaat aggatgctag gcttgttgag ggcgtggcct ccgattcaca 60

agtgggaagc agcgccgggc gactgcaatt tcgcgccaaa cttgggggaa gcacagcgta 120

caggctgcct aggtgatcgc tgctgctgtc atggttcgac cgctgaactg catcgtcgcc 180

gtgtcccaga atatgggcat cggcaagaac ggagaccttg tccctggcca atgctcaggt 240

actggctgga ttgggttagg gaaaccgagg cggttcgctg aatcgggtcg agcacttggc 300

ggagacgcgc gggccaacta cttagggaca gtcatgaggg gtaggcccgc cggctgcagc 360

ccttgcccat gcccgcggtg atccccatgc tgtgccagcc tttgcccaga ggcgctctag 420

ctgggagcaa agtccggtca ctgggcagca ccaccccccg gacttgcatg gg 472

<210> 34

<211> 466

<212> DNA

<213> CHO-S/DHFR-/- /G3单克隆细胞测序，链B

<400> 34

ggggcctctg atgttcaaat aggatgctag gcttgttgag ggcgtggcct ccgattcaca 60

agtgggaagc agcgccgggc gactgcaatt tcgcgccaaa cttgggggaa gcacagcgta 120

caggctgcct aggtgatcgc tgctgctgtc atggttcgac cgctgaactg catcgtcgcc 180

gtgtcccaga atatgggcat cggcaagaac ggagaccctg gccaatgctc aggtactggc 240

tggattgggt tagggaaacc gaggcggttc gctgaatcgg gtcgagcact tggcggagac 300

gcgcgggcca actacttagg gacagtcatg aggggtaggc ccgccggctg cagcccttgc 360

ccatgcccgc ggtgatcccc atgctgtgcc agcctttgcc cagaggcgct ctagctggga 420

gcaaagtccg gtcactgggc agcaccaccc cccggacttg catggg 466

<210> 35

<211> 540

<212> DNA

<213> CHO-S/FUT8-/-/DHFR-/-/B8单克隆细胞测序，链A

<400> 35

ggaatctacg actgagcttg atatcgaatt cgcgtgtcgc ccttcggggc ctctgatgtt 60

caaataggat gctaggcttg ttgagggcgt ggcctccgat tcacaagtgg gaagcagcgc 120

cgggcgactg caatttcgcg ccaaacttgg gggaagcaca gcgtacaggc tgcctaggtg 180

atcgctgctg ctgtcatggt tcgaccgctg aactgcatcg tcgccgtgtc ccagaatatg 240

ggcatcggca agaacggaga ccttcaatgc tcaggtactg gctggattgg gttagggaaa 300

ccggggcggt tcgctgaatc gggtcgagca cttggcggag acgcgcgggc caactactta 360

gggacagtca tgaggggtag gcccgccggc tgcagccctt gcccatgccc gcggtgatcc 420

ccatgctgtg ccagcctttg cccagaggcg ctctagctgg gagcaaagtc cggtcactgg 480

gcagcaccac cccccggact tgcatgggta gccgctgaga tggagcctga gcacacgtga 540

<210> 36

<211> 480

<212> DNA

<213> CHO-S/FUT8-/-/DHFR-/-/B8单克隆细胞测序，链B

<400> 36

ggggctctcg actgagcttg atatcgaatt cgctgtcgcc cttgaggagg tggtggtcat 60

tctttggaag tacttgaatt cgttcctgaa agttagagaa acactgcgtt aacagggacc 120

ctgtcacgtg tgctcaggct ccatctcagc ggctacccat gcaagtccgg ggggtggtgc 180

tgcccagtga ccggactttg ctcccagcta gagcgcctct gggcaaaggc tggcacagca 240

tggggatcac cgcgggcatg ggcaagggct gcagccggcg ggcctacccc tcatgactgt 300

ccctaagtag ttggcccgcg cgtctccgcc aagtgctcga cccgattcag cgaaccgcct 360

cggtttccct aacccaatcc agccagtacc tgagcattgg ccagggaggt ctccgttctt 420

gccgatgccc atattctggg acacggcgac gatgcagttc agcggtcgaa ccatgacagc 480

Claims (9)

1.一种用于敲除CHO细胞中FUT8基因和DHFR基因的试剂盒，其特征在于，它包括SEQ IDNO：1和/或SEQ ID NO：3所述的sgRNA序列，以及SEQ ID NO：23所述的sgRNA序列。

2.一种用于敲除CHO细胞中FUT8基因和DHFR基因的试剂盒，其特征在于，它包括SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：31所述的sgRNA序列。

3.权利要求1或2所述试剂盒在用于敲除CHO细胞中FUT8和DHFR两种基因的用途。

4.权利要求1或2所述试剂盒在制备FUT8和DHFR基因同时缺失的细胞株中的用途。

5.一种同时敲除CHO细胞中FUT8和DHFR基因的方法，其特征在于，它是利用CRISPR/Cas9系统在CHO细胞中对两种基因进行改造，步骤如下：

a、合成SEQ ID NO：1和/或3所示的序列及其互补链，变性、退火，形成双链，插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到重组表达质粒；

b、将步骤a的重组表达载体转染CHO细胞，挑取单个细胞，接种培养；

c、待单个细胞增殖为单克隆后，鉴定并确认FUT8基因被敲除，并获得FUT8基因缺失的细胞株FUT8‐/‐，备用；

d、合成SEQ ID NO：23所述的序列及其互补链，变性、退火，形成双链，插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到重组表达质粒；

e、取步骤c的FUT8‐/‐细胞株，用步骤d的重组表达载体转染，挑取单个细胞，接种培养；

f、待单个细胞增殖为单克隆后，鉴定并确认DHFR基因被敲除，并获得FUT8基因和DHFR基因同时缺失的细胞株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHO‐S亚型细胞。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Cas9表达载体为CRISPR/Cas9载体。

8.权利要求5‐7任意一项所述方法制备得到的FUT8缺失细胞株。

9.权利要求5‐7任意一项所述方法制备得到的FUT8和DHFR基因同时缺失的细胞株。