CN106755091A - 基因敲除载体，mh7a细胞nlrp1基因敲除方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种基因敲除载体及其构建方法与应用，MH7A细胞NLRP1基因敲除方法。本发明采用CRISPR‑Cas9基因敲除系统，以NLRP1为靶基因进行CRISPR靶向序列设计并制备出了针对NLRP1基因的敲除载体，利用其对MH7A细胞进行转染，能高效地敲除MH7A细胞中的NLRP1基因，从而有效搭建起一个类风湿关节炎的研究平台，大大促进类风湿关节炎发病机制的研究，并可促进对NLRP1炎性体与各种炎性因子相互作用对类风湿关节炎及滑膜炎发病相关的分子机制的研究。

Description

基因敲除载体，MH7A细胞NLRP1基因敲除方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种基因敲除载体及其构建方法与应用，MH7A细胞NLRP1基因敲除方法。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为主要特征的慢性自身免疫性疾病，我国RA发病率约为0.3％～0.6％，发病率高，致残率高，严重危害人类健康。

RA病因至今仍不是很明确，但今年来的研究表明其发病可能与核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1(nucleotide-binding，leucine-rich repeat pyrin domaincontaining protein 1，NLRP1)相关。先天性免疫系统通过特定的模式识别受体(pattern-recognition receptor，PRR)识别入侵的微生物以及体内的危险信号。PRR主要分为两类，其中一类即为位于胞质内的Nod样受体(NOD-like receptor，NLR)，NLP在凋亡相关斑点样蛋白和半胱天冬氨酸酶等蛋白的参与下，可以形成一种蛋白质复合物，称为炎性体。其中，NLRP1炎性体是NLRP1在识别胞内病原相关分子模式(PAMP)后与凋亡相关斑点样蛋白(ASC)以及半胱天冬氨酸酶(Caspase-1、Caspase-5)前体等分子结合形成的蛋白复合物，活化后促进IL-1β、IL-18、IL-33等炎症因子的成熟和释放，在先天性免疫中发挥重要作用。

类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(MH7A)是研究类风湿关节炎的常用模式细胞，因此，若能构建出一种敲除NLRP1基因的MH7A细胞，将能有效搭建起一个类风湿关节炎的研究平台，大大促进类风湿关节炎发病机制的研究，并可促进对NLRP1炎性体与各种炎性因子相互作用对类风湿关节炎及滑膜炎发病相关的分子机制的研究。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因敲除载体，所述的基因敲除载体可用于敲除人NLRP1基因。

本发明还提供了该基因敲除载体的构建方法与应用；具体的，该应用为一种在MH7A细胞NLRP1基因敲除方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种基因敲除载体，所述基因敲除载体为将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列连入可表达CRISPR-Cas9基因编辑系统相关酶的质粒即得。

CRISPR(clustered,regularly interspaced，short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。

目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。

由于PAM序列结构简单(5’-NGG-3’)，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。

在本申请中，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列即为从NLRP1公共编码区中筛选得到的带有PAM序列靶点序列。这两个靶点序列特异性好，不易脱靶，敲除效率高。

优选的，如上所述的基因敲除载体，所述可表达CRISPR-Cas9基因编辑系统相关酶的质粒为pGK1.1linear vector。

如上所述的基因敲除载体的构建方法，包括以下步骤：

1)、选取NLRP1基因五个转录本的公共编码区的第一个外显子进行CRISPR靶向序列设计，得到SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；

2)、根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列设计正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

3)、将所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列进行退火反应形成双链寡核苷酸；

4)、将所述双链寡核苷酸连入线性化的可表达CRISPR-Cas9基因编辑系统相关酶的质粒得到基因敲除载体。

正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列的设计方法是根据所用的可表达CRISPR-Cas9基因编辑系统相关酶的质粒的粘性末端进行设计的，在本申请的一个实施例中，有针对pGK1.1linear vector设计正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列的具体实施方式。

含有如上所述基因敲除载体的宿主细胞。

由于NLRP1基因较为保守，所以本发明提供的基因敲除载体适用于几乎所有哺乳动物表达NLRP1基因的细胞。

一种MH7A细胞NLRP1基因敲除方法，包括以下步骤：

a)、将权利要求2所述基因敲除载体转化G10Competent Cell，并用含有对应所述基因敲除载体抗性的抗生素的培养基进行培养；

b)、利用pGK1.1linear vector的通用引物VSP primer作为上游引物，用SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2设计出的反向寡核苷酸序列作为下游引物筛选阳性克隆并测序验证；

c)、提取步骤b)中经验证正确的阳性克隆中的质粒并转染MH7A细胞得到细胞池细胞；

d)、转染24h后对所述细胞池细胞进行嘌呤霉素药杀处理；

e)、转染72h后有限稀释法稀释MH7A细胞至96孔板制备单克隆并对其得到的单克隆进行培养；

f)、以所述单克隆的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列为引物进行PCR扩增；

g)、用Cruiser^TM对扩增产物进行酶切初筛阳性克隆并测序验证。

本发明所用MH7A细胞购自上海弘顺生物科技有限公司，细胞货号：C0878,来源于日本RICKEN细胞库。

优选的，如上所述的MH7A细胞NLRP1基因敲除方法，在步骤c)中，所述质粒的浓度为1μg/μl～3μg/μl，所述MH7A细胞的浓度为2×10⁶～3×10⁶个/mL。

进一步优选的，在步骤c)中，所述转染为电转；

所述电转的条件为：所述电转的条件为：电转电压1000V～1100V、电转时间28ms～32ms、电转1次。

本发明所用电转杯体积为200μl。

在本发明的一个实施例中，提供了电转条件摸索的一个具体实施过程。

优选的，如上所述的MH7A细胞NLRP1基因敲除方法，在步骤d)中，对所述细胞池细胞进行嘌呤霉素药杀处理时，所用嘌呤霉素的浓度为0.45μg/mL～0.55μg/mL。

优选的，如上所述的MH7A细胞NLRP1基因敲除方法，在步骤g)之后，还包括以下步骤：

对于步骤g)中验证正确的阳性克隆中两等位基因突变情况不一样的阳性克隆重新做TA克隆后送测序，跟野生型比对，确定每个等位基因的突变情况。

通常人细胞是二倍体，如果阳性克隆细胞两个亲本缺失碱基情况不一致的话，单克隆测序峰图是出现套峰，需要进一步PCR扩增出阳性克隆细胞目的基因片段，然后连接到T载体上，采用通用测序引物测序看看两个亲本碱基缺失分别是什么情况。

优选的，如上所述MH7A细胞NLRP1基因敲除方法制备的敲除了NLRP1基因的MH7A细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用CRISPR-Cas9基因敲除系统，以NLRP1为靶基因进行CRISPR靶向序列设计并制备出了针对NLRP1基因的敲除载体，利用其对MH7A细胞进行转染，能高效地敲除MH7A细胞中的NLRP1基因，从而有效搭建起一个类风湿关节炎的研究平台，大大促进类风湿关节炎发病机制的研究，并可促进对NLRP1炎性体与各种炎性因子相互作用对类风湿关节炎及滑膜炎发病相关的分子机制的研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中1000V，30ms，1pulse条件电转后24h后在显微镜下的照片；图1A为光镜下的照片；图1B为电转后细胞所发的绿色荧光照片；

图2为pGK1.1linear vector的质粒图谱；

图3为实施例2步骤3中用BbsI酶切pGK1.1载体回收后载体片段核酸电泳图；

图4为实施例3步骤2中用VSP primer和下游负链Oligo引物进行菌落PCR扩增后的电泳图。

图5为Guide#1位点的pool测序峰图；

图6为Guide#2位点的pool测序峰图；

图7为Guide#3位点的pool测序峰图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1预实验操作

1、单克隆生长验证试验。

有限稀释：将MH7A细胞制成细胞悬液细胞计数后取一定量细胞悬液进行稀释，使最终96孔板中每孔细胞数为1个或5个，(每孔100μl)在确定稀释准确后，将稀释后于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养；7～10天后镜下观察发现可形成单克隆，细胞有增殖趋势且能形成细胞簇。

2、MH7A细胞电转条件摸索

MH7A细胞制成均匀的单细胞悬液后，取一部分混匀进行血小板台盼蓝染色计数(活细胞率＞95％方能进行电转)，计算出细胞悬液浓度；取1×10⁷个细胞悬于无菌管中，1000rpm离心4min；取细胞沉淀，向其中加入一定量DPBS，混匀后加入pEGFP-N1质粒(总量10μg，去内毒素处理)，使最终总体系在410μl左右；混匀后用电转枪头分别加入2个电击杯中，使管口液面凸起，杯内无气泡形成，盖上盖进行标记后，进行电转。电转电压条件为：1000V、1100V；(30ms，1pulse)；混匀电击后细胞取等部分细胞分别置于准备好的预热6孔板各孔中。24h～48h后镜下观察，(可见及荧光视野)拍照，电转24h后细胞状态如图1所示。从图1可知1000V电转的细胞活率及发绿色荧光细胞百分率相对更佳。

3、MH7A细胞最小全致死浓度摸索(Puro)

贴壁细胞：细胞悬液计数后，于24孔板每孔接种50000个细胞(每孔500ul)，待细胞贴壁后向其中加入不同浓度的嘌呤霉素(Puro，母液浓度1mg/ml，药杀浓度梯度为：0，0.5，1ug/ml)，2～3天后镜下观察细胞，选择细胞全致死的最低浓度作为后续实验的药物筛选浓度。摸索得到的Puro药物筛选浓度为0.5μg/ml。

实施例2基因敲除载体的构建方法

在本实施例中，提供了一种用于敲除NLRP1基因的基因敲除载体的构建方法，包括如下步骤：

1、靶位点设计及合成

1)设计CRISPR-Cas9敲除靶位点

首先，需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的Oligo DNA，通过以下在线工具设计：

麻省理工学院的CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/

选取NLRP1基因五个转录本的公共CDS区，找出公共CDS区的第一个外显子进行靶位点设计。最好一次只输入一个外显子，避免Guide序列跨内含子的。

其中，大写字母的碱基代表的是外显子，加粗和带下划线标记的碱基代表的是选定的靶序列。

靶序列的NCBI打分情况如下：

2、引物添加接头

引物合成需在靶序列头部添加额外的碱基，正向引物添加CACC，反向引物添加AAAC，需要特别注意的是靶序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的靶序列第一个碱基不是G，可自行在靶序列前加一个G，靶序列引物设计如下：

Guide#1

NLRP1-1F:TCGCCAATAAAGCGCACTCC

NLRP1-1R:GGAGTGCGCTTTATTGGCGA

Guide#2

NLRP1-2F:CATGGAGGTGGCCTCGTACC

NLRP1-2R:GGTACGAGGCCACCTCCATG

Guide#3

NLRP1-3F:GGCCGCCTGGCCTGTTACT

NLRP1-3R:AGTAACAGGCCAGGCGGCCC

其中，加粗和下划线的部分为额外加入的序列，是要与BbsI酶切后的载体相互补的部分。

3、敲除载体构建

1)Oligo杂交，敲除载体连接反应

将合成后的2条单链Oligo DNA稀释成10μM，退火形成dsDNA，再与线性化后的pGK1.1linear vector载体连接，可直接用T4DNA Ligase连接，退火反应体系如下：

用BbsI酶切将pGK1.1linear vector载体

pGK1.1linear vector是线性化载体，无需酶切处理，可直接用于T4DNA Ligase连接反应，pGK1.1载体已经优化过，其转染和敲除的效率比一般CRISPR载体更高。pGK1.1linear vector的质粒图谱如图2所示。构建靶位点敲除载体前，用BbsI酶切pGK1.1载体后胶回收载体片段，回收后载体片段核酸电泳图如图3所示。

将以上体系瞬时离心后，置于PCR仪中95℃孵育3min，孵育后自然冷却20min。取1μl的杂交后的dsDNA进行T4DNA连接酶连接反应，反应体系如下：

将以上体系瞬时离心后，置于PCR仪中16℃孵育30min。

实施例3

在本实施例中，提供了一种MH7A细胞NLRP1基因敲除方法。

1、将实施例2中得到的基因敲除载体转化进G10Competent Cell：

从-80℃冰箱中取1管G10Competent Cell，置冰上融解。

融解后加入10μl连接产物，轻弹混匀，冰上孵育30min。

42℃水浴热击60sec，迅速拿出置冰上冷却2～3min。

向管中加入800μl无抗SOC液体培养基，至摇床(37℃/160rpm)恢复培养培养45min。

4500rpm离心5min，弃去800μl上清，将沉淀悬在剩余的100μl上清中，均匀涂布于含Kan抗性的的筛选平板上，倒置培养过夜。

2、筛选阳性重组子

转染第二天使用上游引物VSP primer与各自的下游负链Oligo引物进行菌落PCR筛选，阳性克隆PCR正确大小应为100bp，PCR扩增后的电泳结果如图4所示，筛选到的阳性克隆抽质粒进一步测序验证。

测序正确的质粒浓缩到1μg/μl浓度以上。

上游引物VSP primer的序列为：GGACTATCATATGCTTACCG。

3、电转染靶细胞

1)、取状态良好的对数生长期MH7A细胞悬液台盼蓝计数，确定细胞数及细胞活力(细胞活力>95％).

2)、取5×10⁶细胞于15ml离心管中，离心弃上清(1000rpm/4min)。

3)、将细胞沉淀悬浮于210μl DPBS中，转移至1.5ml EP管中，加入所需量构建好的敲除质粒5μg～8μg(质粒浓度要求1μg/μl～3μg/μl)，轻轻混匀。

4)、将上述细胞质粒混合液用专用电转枪头转移至电击杯中，确定电击杯中溶液无气泡，且液面凸起后，盖上电击杯盖并至于电转仪，设定好电转条件后进行电转。待显示峰图正常后取出细胞液转移至六孔板培养基中(培养基需事先37℃预热且无抗生素)；电转后得到pool细胞

所述电转的条件为：1000V、30ms、1pulse。

5、pool细胞测序检测敲除效率

电转后24h puro药杀处理；所用puro的浓度为0.5μg/mL。

电转72hr后，pool细胞台盼蓝计数；

在筛选阳性克隆之前，需对pool细胞(混合克隆)的敲除效率进行体内验证，但其结果只能作为参考；

一般靶位点附近的序列测序中，阳性样品应在靶点位置及之后的序列中出现套峰，如敲除效率较低时，信号强度往往较低，影响判断。从pool测序峰图(图5、图6、图7)的结果来看，Guide#3靶位点附近几乎没有套峰，敲除效率低；因而舍去该位点，只保留Guide#1和Guide#2位点。即最终本申请得到的基因敲除载体为将SEQ ID NO:1(Guide#1序列去除末端的AGG)或SEQ ID NO:2(Guide#2序列去除末端的TGG)所示核苷酸序列连入pGK1.1linearvector得到。

6、单克隆的制备和生长

有限稀释法稀释细胞至10块96孔板中，37℃，CO₂培养箱中静置培养；一周后观察单克隆生长情况，约两周后将长起来的单克隆转移至48孔中扩大培养；当细胞长满48孔1/2时，即可取出一部分(10²～10⁴)，使用Genloci TNA抽提试剂盒(cat.no.GP0155，GP0156)提取细胞基因组。

7、单克隆基因组DNA的提取

1)、取10²～10⁴个细胞于1.5ml EP管中，室温1500rpm离心5min，小心吸掉培养液。

2)、加入150μl PBS重悬细胞，室温1500rpm离心5min，小心弃去上清。

3)、重复步骤2一次。

4)、向离心管中加入适量体积(推荐体积为50μl～200μl)预先配制的溶液A与溶液B的混合液，枪头吹打5次，冰上放置10min，使细胞充分裂解。

5)、加入两倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，-20℃条件下沉淀20min以上。

6)、4℃，12000rpm，离心20min，弃上清。

7)、加入400μl～500μl预冷的75％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm，离心10min，小心弃去上清，自然晾干(不超过5min为宜)。

8)、加入适量体积(推荐体积为10μl～30μl)灭菌的双蒸水溶解沉淀，溶液可直接用于PCR反应，或于-20℃保存。

8、PCR扩增目的片段

1)、物设计引

在敲除靶位点附近设计高特异性的Primers，扩增产物长度为约340bp。Primers引物序列如下：

PrimerF:SEQ ID NO:3

PrimerR:SEQ ID NO:4

2)、PCR扩增获得杂交DNA

在灭菌PCR管中配制如下反应体系，使用高特异性的Primers，扩增获得野生型和突变型充分杂交的DNA产物。

3)、PCR反应程序如下：

自然冷却至40℃以下(野生型片段与突变型片段杂交)。

PCR结束后，取2～3μl进行电泳检测，要求目的片段明亮并且单一。

9、Cruiser^TM Enzyme酶切筛选阳性克隆

在灭菌PCR管中配制如下反应体系：

PCR扩增产物

45℃反应20min后立即向上述10μl反应体系内加入2μl 6×Stop Buffer，随后进行琼脂糖电泳检测或置于-20℃保存。

10、测序筛选阳性克隆

对Crusier酶切初步筛选出来的阳性克隆进行测序验证，进一步确认阳性克隆。

11、TA克隆

对于阳性克隆中，两个等位基因突变情况不一样的阳性克隆，重新做TA克隆后送测序，跟野生型比对，确定每个等位基因的突变情况。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆西南医院

<120> 基因敲除载体，MH7A细胞NLRP1基因敲除方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcgccaataa agcgcactcc 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catggaggtg gcctcgtacc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taagagccaa ggcaaaggac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagtgacctc agccccatct 20

Claims (10)

1.一种基因敲除载体，其特征在于，所述基因敲除载体为将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列连入可表达CRISPR-Cas9基因编辑系统相关酶的质粒即得。

2.根据权利要求1所述的基因敲除载体，其特征在于，所述可表达CRISPR-Cas9基因编辑系统相关酶的质粒为pGK1.1linear vector。

3.权利要求1或2所述的基因敲除载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、选取NLRP1基因五个转录本的公共编码区的第一个外显子进行CRISPR靶向序列设计，得到SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；

2)、根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列设计正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

3)、将所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列进行退火反应形成双链寡核苷酸；

4)、将所述双链寡核苷酸连入线性化的可表达CRISPR-Cas9基因编辑系统相关酶的质粒得到基因敲除载体。

4.含有权利要求1或2所述基因敲除载体的宿主细胞。

5.MH7A细胞NLRP1基因敲除方法，其特征在于，括以下步骤：

a)、将权利要求2所述基因敲除载体转化G10Competent Cell，并用含有对应所述基因敲除载体抗性的抗生素的培养基进行培养；

b)、利用pGK1.1linear vector的通用引物VSP primer作为上游引物，用SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2设计出的反向寡核苷酸序列作为下游引物筛选阳性克隆并测序验证；

c)、提取步骤b)中经验证正确的阳性克隆中的质粒并转染MH7A细胞得到细胞池细胞；

d)、转染24h后对所述细胞池细胞进行嘌呤霉素药杀处理；

e)、转染72h后有限稀释法稀释MH7A细胞至96孔板制备单克隆并对其得到的单克隆进行培养；

f)、以所述单克隆的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列为引物进行PCR扩增；

g)、用Cruiser^TM对扩增产物进行酶切初筛阳性克隆并测序验证。

6.根据权利要求5所述的MH7A细胞NLRP1基因敲除方法，其特征在于，在步骤c)中，所述质粒的浓度为1μg/μl～3μg/μl，所述MH7A细胞的浓度为2×10⁶～3×10⁶个/mL。

7.根据权利要求6所述的MH7A细胞NLRP1基因敲除方法，其特征在于，在步骤c)中，所述转染为电转；

所述电转的条件为：电转电压1000V～1100V、电转时间28ms～32ms、电转1次。

8.根据权利要求5所述的MH7A细胞NLRP1基因敲除方法，其特征在于，在步骤d)中，对所述细胞池细胞进行嘌呤霉素药杀处理时，所用嘌呤霉素的浓度为0.45μg/mL～0.55μg/mL。

9.根据权利要求5～8任一项所述的MH7A细胞NLRP1基因敲除方法，其特征在于，在步骤g)之后，还包括以下步骤：

对于步骤g)中验证正确的阳性克隆中两等位基因突变情况不一样的阳性克隆重新做TA克隆后送测序，跟野生型比对，确定每个等位基因的突变情况。

10.权利要求5～9任一项所述MH7A细胞NLRP1基因敲除方法制备的敲除了NLRP1基因的MH7A细胞。