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CN106995819B - 用于调控靶基因表达的重组dna构建体和方法 - Google Patents

用于调控靶基因表达的重组dna构建体和方法 Download PDF

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CN106995819B CN201611067956.9A CN201611067956A CN106995819B CN 106995819 B CN106995819 B CN 106995819B CN 201611067956 A CN201611067956 A CN 201611067956A CN 106995819 B CN106995819 B CN 106995819B
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Abstract

本发明提供重组DNA构建体和用于通过干扰小RNA和其靶基因结合来操纵由小RNA调节的靶基因表达的方法。更具体地，本发明公开了编码用于调节靶基因表达的切割阻断剂、5‑修饰的切割阻断剂和翻译抑制剂的重组DNA构建体及其使用方法。还公开了可用于设计包含miRNA‑无应答转基因、miRNA诱饵、切割阻断剂、5‑修饰切割阻断剂和翻译抑制剂的重组DNA构建体的miRNA靶标，及其使用方法，以及含有这种构建体的转基因真核细胞和生物体。

Description

用于调控靶基因表达的重组DNA构建体和方法
本申请是申请日为2009年7月1日、申请号为200980131696.9、发明名称为“用于调控靶基因表达的重组DNA构建体和方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用以及序列表的合并
本申请要求于2008年7月1日申请的美国临时专利申请61/077,244的优先权权益，该申请以引用方式全部并入本文。在2008年6月27日创建并以电子提交方式与美国临时专利申请61/077，244一起于2008年7月1日提交的名称为“38-21_55745_A.txt”的文件中含有的序列表(用操作系统MS-Windows统计为2574千字节)以引用方式全部合并入本文。创建于2009年9月1日并且于2009年9月10日电子提交的名称为“38-21_55745_B_替换.txt”的文件中含有的序列表(用操作系统MS-Windows统计为2611千字节)以引用方式合并入本文。
技术领域
本发明公开了重组DNA构建体，所述构建体具有将加工成RNA的DNA，所述RNA为靶基因转录物提供RNA酶III切割抗性。这种RNA用作可用于调节靶基因表达的切割阻断剂和翻译抑制剂。还公开了miRNA识别位点序列及其在设计重组DNA构建体中的用途，所述重组DNA构建体包括miRNA-无应答转基因、miRNA诱饵(decoy)、切割阻断剂和翻译抑制剂。还公开了在其基因组中含有本发明重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞、植物和种子。还公开了利用本发明重组DNA构建体来调控靶基因表达的方法。
背景技术
已经描述了参与RNA介导的基因抑制的若干细胞途径，其各自在 特征性途径和具体组成上不同。通常，RNA介导的基因抑制包括在单个RNA分子内形成或在两个RNA分子间形成的双链RNA(dsRNA)中间体。该较长的dsRNA中间体由RNA酶III家族的核糖核酸酶(Dicer或Dicer样核糖核酸酶)加工成一条或多条小双链RNA，其中一条链由核糖核酸酶合并入RNA诱导的沉默复合物(“RISC”)。认为哪条链合并入RISC中取决于双链小RNA的某种热力学特性，如Schwarz et al.(2003)Cell,115:199-208和Khvorova等(2003)Cell,115:209-216所描写的那些。
siRNA途径包括将较长双链RNA中间体非定相切割(non-phased cleavage)为小干扰RNA(“siRNA”)。认为siRNA的大小是约19至约25个碱基对，但是常见种类的siRNA包括含有21个碱基对至24个碱基对的那些。例如参见Hamilton等(2002)EMBO J.,21:4671-4679。
微RNA途径包括微RNA(“miRNA”)，是通常介于约19至约25个核苷酸(在植物中通常为约20-24个核苷酸)之间的非蛋白质编码RNA，其指导靶标转录物的反式切割，负调节参与各种调节和发育途径的基因的表达；参见Ambros等(2003)RNA,9:277-279。天然存在的miRNA由初级转录物(“pri-miRNA”)衍生，该初级转录物天然加工成较短的转录物(“pre-miRNA”)，后者进一步加工成成熟的miRNA。有关植物和动物中的miRNA生物起源的最新综述，可参见Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.,6:376-385。经由miRNA对生物途径的基因调控可在多种水平以不同方式发生，包括单基因或多基因调控、转录调节剂的调控、选择性剪接的调控；参见Makeyev&Maniatis(2008)Science,319:1789-1790。miRNA、其前体、其识别位点及其启动子的各种应用详细描写在共同转让美国专利申请公布说明书2006/0200878 A1中，特别以引用方式合并入本文，其包括：(1)表达天然miRNA或miRNA前体序列以抑制靶基因；(2)表达工程改造(非天然)的miRNA或miRNA前体序列以抑制靶基因；(3)表达带有miRNA识别位点的转基因，其中当内源或转基因地表达相应成熟miRNA时，该转基因被抑制；以及(4)表达由miRNA启动子驱动的转基因。
在反式作用siRNA(“ta-siRNA”)途径中，miRNA的作用是在需要 RNA依赖性RNA聚合酶来产生双链RNA前体的过程中指导siRNA初级转录物的同步加工；反式作用siRNA定义为缺乏二级结构，缺乏启动双链RNA产生的miRNA靶位点，需要DCL4和RNA依赖性RNA聚合酶(RDR6)并产生多个完美定相的～21-nt小RNA，其具有含2个核苷酸的3’突出端的完美匹配的双链体(参见Allen等(2005)Cell,121:207–221；Vazquez等(2004)Mol.Cell,16:69-79)。
定相小RNA(“phased sRNA”)途径(参见PCT专利申请PCT/US2007/019283，以WO2008/027592公开)基于称为“定相小RNA基因座”的内源基因座，其转录为形成单一折回结构的RNA转录物，所述结构在体内定相切割成多个能够抑制靶基因的小双链RNA(称为“定相小RNA”)。和siRNA相反，定相小RNA转录物是定相切割的。和miRNA相反，定相小RNA转录物被DCL4或DCL4样直向同源核糖核酸酶(非DCL1)切割成多个大量的能够沉默靶基因的小RNA。和ta-siRNA途径相反，定相小RNA基因座转录为RNA转录物，该RNA转录物形成与RNA依赖性RNA聚合酶无关的杂交RNA，且不带有启动双链RNA生成的miRNA靶位点。
据报道，由加工自天然反义转录物的小RNA介导的基因抑制有至少两种途径。在天然反义转录物小干扰RNA(“nat-siRNA”)途径(Borsani等(2005)Cell，123:1279-1291)中，siRNA由DCL1切割在一对基因的反义转录物(顺式-反义基因对)之间形成的双链RNA而生成。没有报道类似的天然反义转录物微RNA(“nat-miRNA”)途径(Lu等(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,105:4951-4956)。在多细胞动物中，据报道称为Piwi-相互作用RNAs(“piRNAs”)的小RNA也具有沉默基因活性(Lau等(2006)Science,313:363-367；O’Donnell&Boeke(2007)Cell,129:37-44)。
发明简述
一方面，本发明提供重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性。
本发明的另一方面提供编码“切割阻断剂”的重组DNA构建体，所述“切割阻断剂”用于抑制双链RNA介导的至少一个靶基因的抑制，从而增加靶基因的表达(相对于不存在切割阻断剂时的表达)。一种实施方式是含有将加工成RNA的DNA的重组DNA构建体，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中单链RNA和转录物的结合(以及杂交片段的最终形成)抑制双链RNA介导的至少一个靶基因的抑制。
本发明的另一方面提供编码“5’-修饰的切割阻断剂”的重组DNA构建体。一个实施方式包括重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中单链RNA和转录物的结合(以及杂交片段的最终形成)抑制双链RNA介导的至少一个靶基因的抑制，其中通过RNA酶III核糖核酸酶的切割由成熟miRNA的结合介导，所述结合位于转录物的miRNA识别位点(其由成熟miRNA识别)，转录物的切割发生在miRNA识别位点，且所述杂交片段至少部分在miRNA识别位点内形成，且所述杂交片段在对应于天然结合至识别位点的成熟miRNA的5’端的位置包括A、G或C(而不是U)，但不要求在单链RNA和miRNA识别位点之间在对应于成熟miRNA位置9、10或11(以3'到5'方向)的miRNA识别位点的位置上有错配，或在单链RNA中在对应于成熟miRNA位置10或11(以3'到5'方向)的miRNA识别位点的位置上有插入。
本发明的另一方面提供编码“翻译抑制剂”的重组DNA构建体，所述“翻译抑制剂”用于抑制转录物的翻译，从而减少靶基因的表达(相对于不存在构建体表达时的表达)。一种实施方式是含有将加工成RNA的DNA的重组DNA构建体，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核 酸酶的切割具有抗性，其中单链RNA和转录物的结合(以及杂交片段的形成)抑制转录物的翻译。
本发明的其他方面提供用于调控由植物品种表达miRNA靶基因的方法。本发明的实施方式包括通过在所述作物中表达本发明重组DNA构建体来增加或提高作物产量的方法，所述构建体例如，编码天然miRNA前体序列或人工前体序列的重组DNA构建体，或编码切割阻断剂或翻译抑制剂或诱饵的重组DNA构建体。
本发明的其他方面提供在其基因组中含有本发明重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞。还提供含有本发明转基因植物细胞的非天然转基因植物，由本发明转基因植物细胞生长得到的非天然转基因植物，和由该转基因植物产生的非天然转基因种子，以及由本发明非天然转基因植物细胞、植物或种子制造的商品。
附图说明
图1描绘了天然miRNA miRMON1前体(图1A)、合成的miRNA miRGL1前体(图1B)、合成的切割阻断剂miRGL1-CB(图1C)、合成的5’-修饰的miRGL1切割阻断剂的预测折回结构(图1D)、以及靶基因GL1、成熟miRGL1、成熟miRGL1-CB中的miRNA识别位点和miRGL1-感受器中的人工GL1识别位点的比对(图1E)，如实施例1和2所描写。
图2描绘了玉米转化基础载体(pMON93039、SEQ ID NO:2065)，如实施例5所描写。
图3描绘了大豆或棉花转化基础载体(pMON82053、SEQ ID NO:2066)，如实施例5所描写。
图4描绘了棉花转化基础载体(pMON99053、SEQ ID NO:2067)，如实施例5所描写。
发明详述
除非另有说明，本说明书文本中的核酸序列当从左到右阅读时，按5’→3’方向给出。按照说明，核酸序列可以DNA或RNA形式提供；一个公开必定限定另一个，这是本领域技术人员已知的。本文所使用的术 语“miRNA前体”指的是天然加工以生成成熟miRNA的RNA转录物。当给出的术语为单数时，本发明人也考虑以该术语的复数形式描述的本发明的所述方面。
加工成RNA的重组DNA构建体，所述RNA为靶基因转录物提供RNA酶III抗性
一方面，本发明提供重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性。所述重组DNA构建体由本领域已知技术制备，例如名称为“制备和使用重组DNA构建体”描述的及其工作实施例所说明的那些。该重组DNA构建体对于制造“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”中所讨论的转基因植物细胞、转基因植物和转基因种子而言特别有用。因此，本发明包括以下实施方式，其中所述重组DNA构建体位于用于转化植物细胞的载体内(例如位于质粒或病毒载体内)，或位于用于转化植物细胞的生物弹(biolistic)颗粒上，或位于非天然转基因植物细胞的染色体或质体内，或位于非天然转基因细胞、非天然转基因植物组织、非天然转基因植物种子、非天然转基因花粉粒、或非天然转基因或者部分转基因植物内。还包括以下实施方式，其中所述重组DNA构建体位于由本发明非天然转基因细胞、非天然转基因植物组织、非天然转基因植物种子、非天然转基因花粉粒、或非天然转基因或者部分转基因植物制造的商品中；这样的商品包括但不限于收获的叶、根、苗、块茎、茎、果实、种子、或植物的其他部分、粗粉、油类、提取物、发酵或消化产物、碾碎或完整的谷物或植物种子、或任何食品或非食品(包含由本发明转基因植物细胞、植物或种子制备的商品)。
DNA的加工包括将DNA转录为初级RNA转录物，其可以经历一个或多个额外的产生与至少一个靶基因的转录物结合的单链RNA的天然加工步骤。在一个实施方式中，DNA的加工包括将DNA转录为含有一条或多条双链RNA茎的RNA中间体；所述一条或多条双链RNA茎再加工为单链RNA。DNA加工的最终产物是包括与至少一个靶基因的 转录物结合的单链RNA的RNA。
例如，所述重组DNA构建体包含转录为初级转录物的DNA，所述初级转录物具有由天然pri-miRNA或pre-miRNA序列获得的序列，形成包含一条或多条双链茎的次级结构，然后将初级转录物加工成较短的、至少部分双链的中间体(类似于pre-miRNA)，然后该中间体由RNA酶III核糖核酸酶(核糖核酸酶III，例如Drosha或DCL1或DCL1样的直向同源核糖核酸酶)切割为一对单链RNA(类似于miRNA和miRNA*对)。在另一个实例中，所述重组DNA构建体包含转录为初级转录物的DNA，所述初级转录物形成包含一条或多条双链茎的次级结构，然后由RNA酶III核糖核酸酶将双链RNA茎切割成一对或多对单链小RNA(类似于siRNA双链体)。在另一个实例中，所述重组DNA包含转录为初级转录物的DNA，所述初级转录物包含可通过内含子加工移除的一个或多个可剪接内含子。在又一个实例中，所述重组DNA包含转录为初级转录物的DNA，所述初级转录物包含一种或多种自切割核酶(例如参见Tang&Breaker(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:5784-5789)；除去核酶得到包括与至少一个靶基因的转录物结合的单链RNA的RNA。
由DNA加工得到的RNA包括结合至至少一个靶基因的转录物的至少一个单链RNA。在一个实施方式中，由DNA加工得到的RNA由结合至一个靶基因的转录物的一个单链RNA分子组成。在另一个实施方式中，由DNA加工得到的RNA由结合至多个靶基因的转录物的一个单链RNA分子组成。在另一个实施方式中，由DNA加工得到的RNA由结合至至少一个靶基因的转录物的多个单链RNA分子组成；例如这可以由加工含有多个片段的初级RNA转录物得到，各片段含有结合至至少一个靶基因的转录物的单链RNA，例如，其中所述多个片段(其可以具有相同或不同的序列)被自切割核酶分开，且核酶的切割产生多条单链RNA。在另一个实施方式中，由DNA加工得到的RNA包含结合至至少一个靶基因的转录物的单链RNA，以及其他RNA成分(其可以是单链或双链或两者都有)，例如但不限于：RNA适配子、RNA核糖开关(riboswitch)、核酶、位点特异性重组酶识别位点、或用于调节结合至至少一个靶基因转录物的单链RNA的转录的RNA序列。
在多个实施方式中，所述至少一个靶基因包括：编码序列、非编码序列、或编码序列和非编码序列两者；单一靶基因或多个靶基因(例如，靶基因的多个等位基因或多个不同的靶基因)；或一个或多个(a)真核生物的内源基因，(b)转基因植物的转基因，(c)植物的害虫或病原体的内源基因，和(d)与植物的害虫或病原体有关的原核或真核共生体的内源基因。可由本发明重组DNA构建体调节的靶基因在下文名为“靶基因”的部分中详细描述。
所述单链RNA结合至至少一个靶基因的转录物以形成至少部分(有时完全)双链RNA的杂交片段。在一些实施方式中，单链RNA和至少一个靶基因转录物之间的互补性百分比是100％。然而，很清楚Watson-Crick碱基配对在单链RNA和至少一个靶基因转录物之间不必是完全的，但至少是足够的，使得在生理条件下在两者之间形成至少部分双链的RNA的稳定杂交片段。
所述双链RNA杂交片段使得转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶(例如，Drosha或Dicer或Dicer样蛋白，包括但不限于DCL1、DCL2、DCL3、DCL4、DCL1样、DCL2样、DCL3样或DCL4样蛋白)的切割具有抗性。在很多情况下，所赋予的抗性是对杂交片段内的RNA酶III核糖核酸酶切割的抗性。例如，当单链RNA在被内源miRNA识别并结合的转录物中的miRNA识别位点处与至少一个靶基因转录物结合，使得杂交片段包括miRNA识别位点时，双链RNA的杂交片段使得转录物对miRNA识别位点处(即在杂交片段内)的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性。在其他情况下，所赋予的抗性对在杂交片段附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性。例如，当单链RNA结合至与至少一个被内源miRNA识别并结合的转录物中的miRNA识别位点直接邻近或者紧密邻近的靶基因转录物，使得杂交片段不包括miRNA识别位点但足够接近从而阻止内源miRNA结合至转录物时，双链RNA的杂交片段使得转录物对miRNA识别位点处(即在杂交片段附近，但不在杂交片段内)的RNA酶III核糖核酸酶切割具有抗性。
单链RNA的长度不必等于杂交片段的长度，因为不是所有的单链RNA都必须结合至至少一个靶基因的转录物。在一些实施方式中，单 链RNA的长度约等于或正好等于杂交片段的长度。在其他实施方式中，单链RNA的长度大于杂交片段的长度。以连续核苷酸数目表示，通常单链RNA的长度为约10个核苷酸到约500个核苷酸，或为约20个核苷酸到约500个核苷酸，或为约20个核苷酸到约100个核苷酸，例如，约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、约30、约35、约40、约45、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约160、约180、约200、约240、约280、约320、约360、约400或约500个核苷酸。以连续核苷酸(并认可杂交片段可包括非碱基配对的核苷酸)的数目表示，通常单链RNA的长度为约10个核苷酸到约100个核苷酸，或为约10个核苷酸到约24个核苷酸，或为约20个核苷酸到约100个核苷酸，或为约26个核苷酸到约100个核苷酸，虽然其可以大于约100个核苷酸，但在一些优选的实施方式中，其优选小于100个核苷酸(例如在翻译抑制剂的一些实施方式中，如以下标题为“翻译抑制剂”的部分描述)。在优选实施方式中，杂交片段的长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、约30、约35、约40、约45、约50、约60、约70、约80、约90或约100个核苷酸。在一个特别优选的实施方式中，杂交片段的长度为约10个到24个核苷酸，例如约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸。
在许多实施方式中，本发明重组DNA构建体除将加工成RNA的DNA之外还包括其他DNA元件，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性。这些其他DNA元件包括选自以下元件的至少一种元件：
(a)在真核(植物、动物、真菌或原生生物)细胞中具有功能的启动子，如标题为“启动子”的部分描述的任何启动子；
(b)Pol III启动子(参见下文“启动子”)，其与将加工成包含单链RNA的RNA的DNA操作性连接；
(c)将加工成RNA适配子(如标题为“适配子”的部分所描述)的DNA；
(d)转基因转录单位(如标题为“转基因转录单位”的部分所描述)；
(e)编码可剪接内含子(如标题为“内含子”的部分所描述)的DNA；
(f)编码自剪接核酶(如标题为“核酶”的部分所描述)的DNA；
(g)编码位点特异性重组酶识别位点(如标题为“重组酶”的部分所描述)的DNA；
(h)编码基因抑制元件(如标题为“基因抑制元件”的部分所描述)的DNA；以及
(i)编码转录调控元件(如标题为“转录调控元件”的部分所描述)的DNA。
根据RNA与靶基因转录物的相互作用，本发明的重组DNA构建体特别可用于提供用作“切割阻断剂”或“翻译抑制剂”的RNA。以下详细描述切割阻断剂和翻译抑制剂。
切割阻断剂
本发明的一个方面是重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中单链RNA与转录物的结合(以及杂交片段的最终形成)抑制至少一个靶基因的双链RNA介导的抑制。本文中，术语“切割阻断剂”通常指的是包含结合至至少一个靶基因转录物的单链RNA的RNA，更具体地，指的是和转录物形成至少部分双链的RNA的杂交片段的单链RNA部分。切割阻断剂抑制至少一个靶基因的双链RNA介导的抑制，从而增加靶基因的表达(相对于不存在切割阻断剂时的表达)。
通常，经由RNA酶III核糖核酸酶的切割由小RNA(最优选与沉默复合物有关的小RNA)与转录物的结合介导。在优选的实施方式中，小RNA选自下组：miRNA、siRNA、反式作用siRNA、定相小RNA、天然反义转录siRNA和天然反义转录miRNA；然而，所述小RNA可以是与沉默复合物例如RISC或Argonaute或Argonaute样蛋白有关的任何小RNA。在一些实施方式中，小RNA是内源小RNA(例如内源miRNA)； 在其他实施方式中，小RNA是转基因小RNA(例如转基因表达的基因工程miRNA)。
在多个实施方式中，杂交片段的长度包括约10个碱基对到约100个碱基对，尽管可以大于约100个碱基对。在优选的实施方式中(并认可杂交片段可包括非碱基配对的核苷酸)，杂交片段的长度包括约10个碱基对到约100个碱基对，例如约10个到约20个、或约10个到约24个、或约10个到约30个、或约10个到约40个、或约10个到约50个、或约18个到约28个、或约18个到约25个、或约18个到约24个、或约20个到约30个、或约20个到约40个、或约20个到约50个碱基对。在优选的实施方式中，杂交片段的长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、约30、约34、约40、约45、约50、约60、约70、约80、约90或约100个碱基对，其中所述杂交片段任选包括其他不碱基配对的且当以碱基对表示时不计算在杂交片段长度中的核苷酸。在特别优选的实施方式中，杂交片段的长度为约18到约28个碱基对(即18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碱基对)，或约10到约24个碱基对(即10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个碱基对)，或约18到约24个碱基对(即18、19、20、21、22、23或24个碱基对)，其中所述杂交片段任选包括其他不碱基配对的且当以碱基对表示时不计算在杂交片段长度中的核苷酸。本领域技术人员能够确定多少数目的非配对核苷酸对于给定的杂交片段而言是可接受的，即，其仍将允许形成在生理条件下稳定且对RNA酶III核糖核酸酶切割具有抗性的杂交片段。
在一些实施方式中，杂交片段完全碱基配对，即包含与靶基因转录物的连续核苷酸序列长度相同且完全互补的连续核苷酸序列。然而，在特别优选的实施方式中，所述杂交片段不完全碱基配对，且杂交片段在抑制转录物被RNA酶III核糖核酸酶切割的位置上包含至少一个错配或至少一个插入。
本发明的一个方面提供“miRNA切割阻断剂”。一个优选的实施方式是重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单 链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中单链RNA与转录物的结合(以及杂交片段的最终形成)抑制至少一个靶基因的双链RNA介导的抑制，其中所述经由RNA酶III核糖核酸酶的切割由成熟miRNA的结合介导，该结合位于转录物中的miRNA识别位点(即由成熟miRNA识别)上，转录物的切割发生在miRNA识别位点，且所述杂交片段至少部分形成于miRNA识别位点内。在该实施方式中，重组DNA构建体产生与靶基因转录物的miRNA识别位点结合(或在其附近)的miRNA切割阻断剂RNA，形成本身对RNA酶III核糖核酸酶切割具有抗性(或阻止杂交片段附近的转录物被RNA酶III核糖核酸酶切割)的杂交片段，从而阻止正常识别miRNA识别位点的成熟miRNA与miRNA识别位点结合并阻止介导靶基因转录物的RNA酶III核糖核酸酶的切割。在特别优选的实施方式中，杂交片段包括：(a)单链RNA和miRNA识别位点之间在对应于成熟miRNA的位置9、10或11(以3’到5’方向)的miRNA识别位点的位置上的至少一个错配，或(b)单链RNA在对应于成熟miRNA的位置10或11(以3’到5’方向)的miRNA识别位点的位置上的至少一个插入。在一些优选的实施方式中，与至少一个靶基因转录物结合的单链RNA具有的核苷酸序列允许其和靶基因转录物之间形成稳定的杂交片段，但该片段抑制Argonaute蛋白或Argonaute样蛋白和杂交片段结合，如Mi等(2008)Cell,133:1-12所描述；例如，单链RNA具有在对应于天然结合至识别位点的成熟miRNA的5’端的位置上包含A、G或C(但不是U)的核苷酸序列。最优选地，miRNA切割阻断剂与靶基因转录物的结合导致至少一个靶基因的miRNA介导的抑制被抑制，从而增加靶基因的表达(相对于不存在miRNA切割阻断剂时的表达)。
本发明的另一方面包括“5’-修饰的切割阻断剂”。一个优选的实施方式包括重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或 其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中单链RNA与转录物的结合(以及杂交片段的最终形成)抑制至少一个靶基因的双链RNA介导的抑制，其中经由RNA酶III核糖核酸酶的切割由成熟miRNA的结合介导，该结合位于转录物中的miRNA识别位点(即由成熟miRNA识别)上，转录物的切割发生在miRNA识别位点，且所述杂交片段至少部分形成于miRNA识别位点内，且杂交片段在对应于天然结合至识别位点的成熟miRNA的5’端的位置上包含A、G或C(但不是U)，但在单链RNA和miRNA识别位点之间在对应于成熟miRNA的位置9、10或11(以3’到5’方向)的miRNA识别位点的位置上不包括错配，或在单链RNA在对应于成熟miRNA的位置10或11(以3’到5’方向)的miRNA识别位点的位置上不包括插入。这种5’-修饰的切割阻断剂结合至靶基因转录物上导致至少一个靶基因的miRNA介导的抑制被抑制，从而增加靶基因的表达(相对于不存在切割阻断剂时的表达)。
本领域技术人员将容易地认识到，本发明的各个方面包括类似的重组DNA构建体，加工该构建体以提供含有单链RNA的RNA，根据被抑制的RNA酶III核糖核酸酶的切割是否分别由siRNA、反式作用siRNA、定相小RNA、天然反义转录物siRNA或天然反义转录物miRNA(或一般而言，与沉默复合物如RISC有关的小RNA或Argonaute蛋白或Argonaute样蛋白)介导，所述RNA用作“siRNA切割阻断剂”、“反式作用siRNA切割阻断剂”、“定相小RNA切割阻断剂”、“天然反义转录物siRNA切割阻断剂”或“天然反义转录物miRNA切割阻断剂”(或者统称为“小RNA切割阻断剂”)。在这些情况下，对RNA酶III核糖核酸酶切割具有抗性的杂交片段的形成通常阻止各自的小RNA与靶基因转录物结合并阻止介导转录物的RNA酶III核糖核酸酶的切割。最优选地，这种小RNA切割阻断剂与靶基因转录物的结合导致至少一个靶基因的双链RNA介导的抑制被抑制，从而增加靶基因的表达(相对于不存在小RNA切割阻断剂时的表达)。例如，(1)通过选择抑制Argonaute蛋白或Argonaute样蛋白与杂交片段结合的核苷酸序列，如Mi等(2008)Cell,doi:10.1016/j.cell.2008.02.034所描述；(2)通过选择核苷酸序列，使得形成杂交片段的单链RNA部分和靶基因转录物之间 的自由能差(“ΔΔG”、参见Khvorova等(2003)Cell，115，209-216)抑制与沉默复合物如RISC或Argonaute蛋白或Argonaute样蛋白的结合；或(3)通过选择核苷酸序列，使得潜在的小RNA介导的RNA酶III核糖核酸酶切割位点上的错配或插入阻止转录物的切割，本领域技术人员能够设计这种包括单链RNA的RNA的核苷酸序列，所述RNA一旦与至少一个靶基因转录物结合，就形成在生理条件下稳定且对RNA酶III核糖核酸酶切割具有抗性的杂交片段。不需要靶基因本身的信息，仅将成熟miRNA序列的序列或加工为成熟miRNA的miRNA前体的序列—或者，miRNA结合位点序列的信息—与本申请的教导结合，以确定或设计用于抑制给定miRNA的靶基因沉默效应的切割阻断剂(或5’-修饰的切割阻断剂)。
控制miRNA调节的途径的一种方法已经作为新颖的miRNA“诱饵”公开(参见共同转让的美国专利申请11/974,469，以美国专利申请公布说明书2009-0070898 A1公开，其包括预测或设计miRNA诱饵序列的原则的公开内容特别以引用方式合并在此)，可被内源成熟miRNA识别并结合的序列导致miRNA诱饵序列和内源成熟miRNA之间碱基配对，从而由于在miRNA诱饵序列和成熟miRNA之间存在错配而形成不被切割的稳定的RNA双链体。
本申请的实施例特别确定了由特定miRNA识别的miRNA靶标。拥有该信息和申请人的教导，本领域技术人员将能设计并使用本发明各种额外的实施方式，包括可在植物细胞中转录的重组DNA构建体，其包括在植物细胞中具有功能并与至少一种多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自：(a)编码切割阻断剂以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA-无应答转基因的DNA，所述转基因具有由至少一个miRNA靶标的天然核苷酸序列衍生的核苷酸序列，其中除去或以其它方式修饰天然核苷酸序列中的miRNA识别位点以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制至少一个miRNA靶标表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制至少一个miRNA靶标表达的siRNA；以及(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成抑制至少一个miRNA靶标表达的siRNA。
翻译抑制剂
本发明的另一方面是重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中单链RNA与转录物的结合(以及杂交片段的形成)抑制转录物翻译。在本文中，术语“翻译抑制剂”一般指含有与至少一个靶基因转录物结合的单链RNA的RNA，更具体地，指和转录物形成至少部分双链的RNA的杂交片段的单链RNA部分。翻译抑制剂抑制转录物的翻译，从而减少靶基因的表达(相对于不存在所述构建体表达时的表达)。
翻译抑制剂结合至全部或至少部分位于编码序列内的mRNA位置，或结合至导致杂交片段的形成干扰翻译的位置。在一个实施方式中，单链RNA与转录物的结合(以及杂交片段的形成)至少部分发生在转录物的5'非翻译区内；当该转录物是植物靶基因的转录物时，该实施方式通常是优选的。在另一个实施方式中，单链RNA与转录物的结合(以及杂交片段的形成)至少部分发生在转录物的3'非翻译区内；当该转录物是动物靶基因的转录物时，该实施方式是优选的。在又一个实施方式中，单链RNA与转录物的结合发生在起始密码子或5'帽子之内或其附近，优选阻止翻译起始。
在优选的实施方式中，该杂交片段对RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性。在优选的实施方式中，该杂交片段的长度包括约10个碱基对到约50个碱基对，虽然它可以大于约50个碱基对。在优选的实施方式中(并认可杂交片段可包括不碱基配对的核苷酸)，杂交片段的长度包括约10个碱基对到约50个碱基对，例如约10个到约20个、或约10 个到约30个、或约10个到约40个、或约10个到约50个、或约18个到约28个、或约18个到约25个、或约18个到约23个、或约20个到约30个、或约20个到约40个、或约20个到约50个碱基对。在优选的实施方式中，杂交片段的长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、约30、约34、约40、约45、或约50个碱基对，其中所述杂交片段任选包括其他不碱基配对的且当以碱基对表示时不计算在杂交片段长度中的核苷酸。在特别优选的实施方式中，杂交片段的长度为约18到约28个碱基对，即18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碱基对，其中所述杂交片段任选包括其他不碱基配对的且当以碱基对表示时不计算在杂交片段长度中的核苷酸。本领域技术人员能够确定多少数目的非配对核苷酸对于给定的杂交片段而言是可接受的，即，其仍将允许形成在生理条件下稳定且对RNA酶III核糖核酸酶切割具有抗性的杂交片段。
例如，(1)通过选择抑制Argonaute蛋白或Argonaute样蛋白与杂交片段结合的核苷酸序列，如Mi等(2008)Cell，doi:10.1016/j.cell.2008.02.034所描述；(2)通过选择核苷酸序列，使得形成杂交片段的单链RNA部分和靶基因之间的自由能差(“ΔΔG”、参见Khvorova等(2003)Cell，115，209-216)抑制与沉默复合物如RISC或Argonaute蛋白或Argonaute样蛋白的结合；或(3)通过选择核苷酸序列，使得潜在的小RNA介导的RNA酶III核糖核酸酶切割位点上的错配或插入阻止转录物的切割，本领域技术人员能够设计这种包括单链RNA的RNA的核苷酸序列，所述RNA一旦与至少一个靶基因的转录物结合，就形成在生理条件下稳定且对RNA酶III核糖核酸酶切割具有抗性的杂交片段。在一个特别优选的实施方式中，该杂交片段的长度包括约19到约50个碱基对，该杂交片段包括9个或更少个连续的完全互补的碱基对组成的较小片段，以及在较小片段的各碱基对之间具有至少一个错配或插入。
调控靶基因表达的方法
在另一方面，本发明提供一种调控靶基因表达的方法，包括在细胞 中表达本发明的重组DNA构建体，即，一种重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性。在体内在细胞中表达本发明重组DNA构建体提供作为“切割阻断剂”或“翻译抑制剂”的RNA。
“调控靶基因表达”也指：(a)增加靶基因的表达，例如，当在细胞中表达的重组DNA构建体提供切割阻断剂时，或(b)减少靶基因的表达，例如，当在细胞中表达的重组DNA构建体提供翻译抑制剂时。“在细胞中表达”指在体内进行转录过程，以及提供包含与至少一个靶基因的转录物结合的单链RNA的RNA所必需的其他天然加工步骤。
重组DNA构建体在其中表达的细胞在许多实施方式中为真核细胞(例如植物、动物、真菌或原生生物细胞)，在其他实施方式中是原核细胞(例如细菌细胞)。由本发明方法调控表达的靶基因不一定是表达重组DNA构建体的细胞的内源基因。例如，本发明包括一种方法，包括使重组DNA构建体在植物细胞中表达，所述重组DNA构建体含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和植物的害虫或病原体的至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，从而(a)增加害虫或病原体靶基因的表达(当重组DNA构建体提供切割阻断剂时)，或(b)减少害虫或病原体靶基因的表达(当重组DNA构建体提供翻译抑制剂时)。当靶基因不是重组DNA构建体在其中转录的细胞(例如植物细胞)的内源基因时，其他加工步骤也可以在发生转录的细胞中发生，或在其他细胞(例如在植物的害虫或病原体的细胞)中进行。
在本发明的一个实施方式中，重组DNA构建体在细胞中表达以提供切割阻断剂RNA。在该实施方式中，单链RNA与转录物的结合(以及杂交片段的形成)抑制至少一个靶基因的双链RNA介导的抑制，从而相对于不存在构建体表达时的表达增加靶基因的表达。
在本发明的一个实施方式中，重组DNA构建体在细胞中表达以提 供翻译阻断剂RNA。在该实施方式中，单链RNA与转录物的结合(以及杂交片段的形成)抑制转录物的翻译，从而相对于不存在构建体表达时的表达减少靶基因的表达。
微RNA(miRNA)通常被认为通过引导信使RNA(“mRNA”)的序列特异性切割从而在转录后调控植物中的基因表达。本发明的一个方面是控制转录为含有miRNA识别位点的mRNA的植物基因的转录后抑制率的方法，所述miRNA识别位点通常由与Argonaute(Ago)复合的特异miRNA识别并结合，然后所生成的miRNA/mRNA杂交片段被RNA酶III核糖核酸酶例如Dicer样核糖核酸酶切割。该方法使用“切割阻断剂”构建体以使含有与靶基因mRNA转录物结合的单链RNA的RNA在植物中转基因表达，以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中单链RNA和转录物的结合(以及杂交片段的最后形成)抑制双链RNA介导的至少一个靶基因的抑制。所述“切割阻断剂”RNA通常与内源成熟miRNA竞争结合通常由该miRNA调节的mRNA；通过与mRNA上的miRNA靶位点结合以形成不可切割的杂交片段，切割阻断剂保护mRNA不被miRNA-Ago复合物切割。因此，切割阻断剂保护靶mRNA的切割位点(miRNA识别位点)不被miRNA切割，并阻止该特定靶基因的下调(down-regulation)。优选地，切割阻断剂增加靶基因的表达(相对于其在不存在切割阻断剂时的表达)。该方法允许以特定方式调节基因表达，并且是通过基因过表达来上调基因转录物或其编码的蛋白质水平的有用的替代方法。
本发明的一方面是通过由基于重组miRNA前体样序列的“切割阻断剂构建体”在植物中生成切割阻断剂单链RNA来提供切割阻断剂的方法。通过将切割阻断剂序列放置在miRNA初级转录物主链中，并保持转录物折回中的预测次级结构，从而使获得的转录物被Dicer样核糖核酸酶加工成单链RNA来生成miRNA前体样序列，然后该单链RNA能够与靶mRNA上的miRNA识别位点结合并阻止mRNA被成熟miRNA切割。如此选择切割阻断剂序列，使得一旦该切割阻断剂和靶mRNA杂交，就能形成杂交片段，该片段包括：(a)单链RNA和miRNA 识别位点之间在miRNA识别位点对应于成熟miRNA位置9、10或11的位置上的至少一个错配，或(b)单链RNA在对应于成熟miRNA的位置10-11的miRNA识别位点位置上的至少一个插入。在特别优选的实施方式中，与至少一个靶基因的转录物结合的单链RNA具有这样的核苷酸序列，其允许在它和靶基因转录物之间形成稳定的杂交片段，但抑制Argonaute或Argonaute样蛋白与该杂交片段结合，如Mi等(2008)Cell，doi:10.1016/j.cell.2008.02.034所描述；例如，单链RNA具有在对应于天然结合至识别位点的成熟miRNA的5’端的位置上包含A、G或C(但不是U)的核苷酸序列。对于在转基因植物中表达的切割阻断剂，许多实施方式优选在单链RNA和对应于成熟miRNA位置1的miRNA识别位点位置上的miRNA识别位点之间也有错配，以阻止抑制效果的转移。
在体内或在植物内生成切割阻断剂的一种替代方法是从强启动子例如Pol II或Pol III启动子表达短的单链RNA。该单链RNA优选包括仅在miRNA识别位点处与mRNA互补的序列。因为使用本方法产生切割阻断剂不需要RNA与Argonaute蛋白或Ago蛋白结合，因此不需要位置10和11上的错配。
靶基因
本发明重组DNA构建体可设计为调控任何一种或多种靶基因的表达。靶基因可以是可翻译(编码)序列，或者可以是非编码序列(例如非编码的调节序列)，或者这两者，并且可以包含至少一个选自以下的基因：真核靶基因、非真核靶基因、微RNA前体DNA序列和微RNA启动子。靶基因对于重组DNA构建体在其中转录的细胞(例如植物细胞或动物细胞)而言可以是天然(内源)的，或者对于重组DNA构建体在其中转录的植物或动物的害虫或病原体(或害虫或病原体的共生体)而言可以是天然的。靶基因可以是外源基因，例如植物中的转基因。靶基因可以是为了抑制而靶向的天然基因，有或没有同时表达外源转基因，例如通过在重组DNA构建体或在分离的重组DNA构建体中包含基因表达元件。例如，理想的是用外源转基因同源物取代天然基因。
靶基因可包含为了抑制而靶向的单个基因或单个基因的一部分、或者可包含例如靶基因的多个连续片段、靶基因的多个非连续片段、靶基因的多个等位基因或者来自一种或多种物种的多个靶基因。靶基因可包含来自任何物种(包括但不限于诸如细菌和病毒等非真核生物；真菌；植物，包括单子叶植物和双子叶植物，例如作物、观赏植物和非栽培植物即野生植物；无脊椎动物，例如节肢动物、环节动物、线虫和软体动物；和脊椎动物，例如两栖类、鱼类、鸟类、驯化或野生哺乳动物，甚至人)的任何序列。
在一个实施方式中，靶基因对于重组DNA构建体将在其中转录的植物而言是外源的，但对于植物的害虫或病原体(例如病毒、细菌、真菌、卵菌和无脊椎动物，例如昆虫、线虫和软体动物)、或对植物害虫或病原体的共生体而言是内源的。靶基因可包含多个靶基因、或者一个或多个基因的多个片段。在一个实施方式中，靶基因是植物的无脊椎害虫或病原体的基因。因此，本发明重组DNA构建体可以在植物中转录并用于调控可侵害植物的病原体或害虫的基因的表达。这些实施方式尤其可用于提供对一种或多种植物害虫或病原体具有抗性的非天然转基因植物，例如，对线虫(例如大豆胞囊线虫或根结线虫)的抗性或对害虫的抗性。
当靶基因是无脊椎害虫的靶基因时，该无脊椎害虫是选自下组的至少一种或多种无脊椎动物：昆虫、蛛形纲动物(例如螨)、线虫、软体动物(例如鼻涕虫和蜗牛)、和环节动物，且可包含与无脊椎害虫存在共生关系(例如，在一些蚂蚁和蚜虫物种之间的互惠共生关系)的无脊椎动物。本文使用的术语“共生”关系包括兼性(非专性)和专性的共生现象，其中两种或更多种伴生物种的至少一种受益，并进一步包括互惠共生、共栖和寄生关系。共生体也包括非无脊椎动物共生体，例如原核生物和真核原生生物。可以通过靶向内在或外在地与无脊椎害虫结合的共生体而间接控制无脊椎害虫。例如，已知原核的共生体存在于许多无脊椎动物(包括目标无脊椎害虫)的内脏或其他组织。与无脊椎害虫有关的靶向共生体的例子包括蚜虫内共生细菌巴克纳氏菌(Buchnera)；影响许多昆虫的沃尔巴克氏体属(Wolbachia)细菌；Baumannia cicadellinicola和Sulcia muelleri，即玻翅叶蝉(Homalodisca coagulata)的共共生细菌，其传播Pierce病的病原体苛养木杆菌(Xylellafastidiosa)；以及白蚁中的真核原生生物(鞭毛虫)内共生体。在一个替代方案中，无脊椎害虫的内源靶基因的表达可以这样改变：控制无脊椎动物共生体，随后影响宿主无脊椎动物。
靶基因可以是可翻译(编码)序列，或者可以是非编码序列(例如非编码调节序列)，或者两者。靶基因的例子包括非翻译(非编码)序列，例如但不限于5'非翻译区、启动子、增强子或其他非编码转录区、3'非翻译区、终止子和内含子。靶基因包括编码以下RNA的基因：微RNA、小干扰RNA、和其他与沉默复合物(RISC)或Argonaute蛋白有关的小RNA；核糖体或核酶的RNA成分；核仁小RNA；及其他非编码RNA。靶基因也可包括编码转录因子的基因和编码参与目标分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其他脂质、糖类和其他碳水化合物、生物聚合物和次级代谢物，包括生物碱类、萜类、聚酮类、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物)的生物合成或分解代谢的酶的基因。
在多个实施方式中，靶基因是植物害虫或病原体(或害虫或病原体的共生体)的必需基因。必需基因包括害虫或病原体发育为能育的生殖成体所需要的基因。必需基因包括当被沉默化或受到抑制时能导致生物体(作为成体或处于任何发育期，包括配子)死亡或者导致生物体无法成功繁殖(例如雄性或雌性亲本不育或者合子、胚或幼虫致死)的基因。有关线虫必需基因的描述可参见例如Kemphues,K.“Essential Genes”(2005年12月24日),WormBook,ed.The C.elegans Research Community, WormBook,doi/10.1895/wormbook.1.57.1，可在线得自以下网址：www.wormbook.org。有关昆虫基因的描述，公众可从果蝇基因组数据库(Drosophila genome database，可在线得自以下网址：flybase.bio.indiana.edu/)中得到，并且已经鉴定出作为典型昆虫的果蝇的438个必需基因；参见Boutros等(2004)Science,303:832-835，支持性材料可在线得自以下网址：www.sciencemag.org/cgi/content/full/303/5659/832/DC1。有关细菌和真菌必需基因的描述在必需基因数据库(“DEG”，可在线得自tubic.tju.edu.cn/deg/)中提供。必需基因包括影响其他基因的那些，其总体效果是导致无脊椎害虫死亡或者导致无脊椎害虫无法成功繁殖。在一个例子中，抑制果蝇间源框基因Caudal最终因昆虫共生的内脏细菌种群失调而导致宿主死亡(Ryu等(2008)Science,319:777-782)，因此Caudal以及由Caudal直接控制的抗微生物肽基因都被认为是必需基因。
植物无脊椎害虫包括但不限于有害线虫、有害软体动物(鼻涕虫和蜗牛)、有害环节动物和有害昆虫。感兴趣的植物病原体包括真菌、卵菌、细菌(例如引起叶斑病、枯萎病、冠瘿病和细菌性萎蔫病的细菌)、柔膜体和病毒(例如引起花叶病、脉结病、斑驳(flecking)、斑点或异常生长的病毒)。关于真菌、细菌、柔膜体(包括支原体和螺原体)、病毒、线虫、寄生性高等植物和有鞭毛的原生动物的描述，另见G.N.Agrios,“PlantPathology”(第四版),Academic Press,San Diego,1997,635页，所有这些都是感兴趣的植物害虫或病原体。另见美国植物病理学会(American Phytopathological Society)的“Common Names of Plant Diseases”上的植物害虫和病原体以及由其引起的病害更新名录，可在线得自以下网址：www.apsnet.org/online/common/top.asp。
特别感兴趣的真菌性植物病原体的例子包括，例如引起以下病害的真菌：白粉病、锈病、叶斑病和枯萎病、猝倒病、根腐病、颈腐病、棉铃红腐病、茎溃疡病、树枝溃疡病、脉管萎蔫病、黑穗病或霉病，包括但不限于镰孢(Fusarium spp)、层绣菌(Phakospora spp)、丝核菌(Rhizoctonia spp)、曲霉(Aspergillus spp)、赤霉(Gibberella spp)、梨孢(Pyricularia spp)和交链孢(Alternaria spp)、以及美国专利6,194,636的表4和5提供的多种真菌种类，该专利以引用方式全部合并于此。植物病原体的例子包括先前分类为真菌类但是最近分类为卵菌类的病原体。特别感兴趣的卵菌性植物病原体的具体例子包括腐霉属(Pythium)(例如瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum))和疫霉属(Phytophthora)(例如致病疫霉(Phytophthora infestans)、大豆疫霉(Phytophthora sojae))的成员和引起霜霉病的生物体(例如粉霜霉(Peronospora farinosa))。
无脊椎害虫的例子包括囊线虫异皮线虫(Heterodera spp)。尤其是大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)、根结线虫(Meloidogyne spp)、玉米根虫(Diabrotica spp)、盲蝽(Lygus spp)、蚜虫和类似的吸食树汁的昆虫例如葡萄根瘤蚜(Daktulosphairavitifoliae)、玉米螟、切根虫、粘虫、叶蝉、日本金龟子、蝗虫和其他鞘翅目、双翅目和鳞翅目害虫。
合适的靶基因的具体例子还包括参与氨基酸或脂肪酸合成、贮存或分解代谢的基因、参与多步骤生物合成途径的基因，其中可能有兴趣调节一种或多种中间产物的水平；以及编码细胞周期控制蛋白的基因。靶基因可包括编码不想要的蛋白质(例如过敏原或毒素)的基因，或编码不想要的化合物(例如不想要的味道或气味成分)的生物合成的酶的基因。
重组DNA构建体可设计成对靶基因表达的调控更具特异性，例如，通过将重组DNA构建体设计成包括将加工成RNA的DNA，所述RNA包含与靶基因转录物结合的单链RNA，其中该单链RNA包含与非靶基因序列基本上不同(或不互补)的核苷酸序列(并因此更不可能与非靶基因转录物结合)。在一个实例中，该重组DNA构建体设计成抑制靶基因而不抑制非靶基因，该靶基因对单一物种(例如西方玉米根虫Diabrotica virgifera virgiferaLeConte)而言是内源基因，而该非靶基因是例如来自相关、甚至密切相关物种(例如北方玉米根虫Diabrotica barberi Smith and Lawrence或南方玉米根虫Diabroticaundecimpunctata)的基因。在其他实施方式中，重组DNA构建体设计成调控多个物种(其中靶基因将被沉默化的)共同的靶基因序列的表达。例如，可以选择用于调控玉米根虫中的靶基因的重组DNA构建体，其对玉米根虫属所有成员都具有特异性。在该实施方式的另一个实例中，可以选择这样的针对玉米根虫的重组DNA构建体以不针对来自益虫物种的任何基因序列。
启动子
通常，本发明重组DNA构建体包含启动子，该启动子在其中构建体将要转录的细胞中具有功能、并可与加工成包含与至少一个靶 基因转录物结合的单链RNA的RNA的DNA操作性连接。在多个实施方式中，启动子选自组成型启动子、空间特异性启动子、时间特异性启动子、发育特异性启动子和诱导型启动子。
适用于本发明重组DNA构建体的非组成型启动子包括空间特异性启动子、时间特异性启动子和诱寻型启动子。空间特异性启动子可包括细胞器特异性启动子、细胞特异性启动子、组织特异性启动子或器官特异性启动子(例如质体特异性启动子、根特异性启动子、花粉特异性启动子或种子特异性启动子，分别用于抑制第一靶RNA在质体、根部、花粉或种子中的表达)。在许多情况下，种子特异性启动子、胚特异性启动子、糊粉特异性启动子或胚乳特异性启动子尤为有用。时间特异性启动子可包括在植物生长周期的某些发育阶段期间、或在不同昼夜时间中、或在一年的不同季节中能启动表达的启动子。诱导型启动子包括由例如但不限于生物应激或非生物应激的化学物质或环境条件(例如缺水或干旱、热、冷、高或低营养或盐水平、高或低光照水平、或害虫或病原体感染)诱导的启动子。特别感兴趣的是微RNA启动子，尤其是具有时间特异性、空间特异性或诱导型表达模式的那些；美国专利申请公布说明书2006/0200878、2007/0199095和2007/0300329提供了miRNA启动子的例子，以及用于识别具有特异性表达模式的miRNA启动子的方法，这些专利申请以引用方式特别合并于此。表达特异性启动子也包括通常为组成型表达、但以不同程度或“强度”表达的启动子，包括通常认为是“强启动子”或“弱启动子”的启动子。
特别感兴趣的启动子包括以下例子：从土壤杆菌(Agrobacterium)的T-DNA分离的章鱼碱(opaline)合酶启动子；花椰菜花叶病毒35S启动子；增强型启动子元件或嵌合型启动子元件，例如与增强子元件(来自玉米热休克蛋白70的内含子)连接的增强型花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子；根特异性启动子，例如美国专利5,837,848；6,437,217和6,426,446公开的那些；美国专利申请公布说明书2004/0216189公开的编码质体局限性醛缩酶的植物核基因的启动子；美国专利 6,084,089公开的低温诱导型启动子；美国专利6,140,078公开的盐诱导型启动子；美国专利6,294,714公开的光诱导型启动子；美国专利6,252,138公开的病原体诱导型启动子；和美国专利申请公布说明书2004/0123347A1公开的缺水诱导型启动子。公开启动子及其应用(尤其是在植物中具有功能的重组DNA构建体中)的所有上述专利和专利公布说明书，均以引用方式合并于此。
感兴趣的植物脉管或韧皮部特异性启动子包括毛根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的rolC或rolA启动子、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA基因5的启动子、水稻蔗糖合酶RSs1基因启动子、鸭跖草黄斑驳病毒(Commelina yellowmottle badnavirus)启动子、椰子叶状腐烂病毒启动子、水稻东格鲁杆状病毒(ricetungro bacilliform virus)启动子、豌豆谷氨酰胺合酶GS3A基因启动子、马铃薯转化酶基因的invCD111和invCD141启动子、从拟南芥分离的、在烟草中有韧皮部特异性表达的启动子(Kertbundit等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.、88:5212-5216)、VAHOX1启动子区、豌豆细胞壁转化酶基因启动子、来自胡萝卜的酸性转化酶基因启动子、硫酸盐转运基因Sultr1；3的启动子、植物蔗糖合酶基因的启动子和植物蔗糖转运基因的启动子。
适用于本发明重组DNA构建体的启动子包括聚合酶II(“pol II”)启动子和聚合酶III(“pol III”)启动子。RNA聚合酶II转录长度通常小于400个核苷酸的结构或催化性RNA，并将一段简单的T残基作为终止信号识别；其曾经用于转录siRNA双链体(例如参见Lu等(2004)Nucleic Acids Res.，32:e171)。因此Pol II启动子在由本发明重组DNA构建体生成短的RNA转录物的某些实施方式中是优选的。在一个实施方式中，该重组DNA构建体包括polII启动子来表达侧翼为自切割核酶序列(例如自切割锤头状核酶)的RNA转录物，生成加工的RNA，其包含与至少一个靶基因的转录物结合的单链RNA，具有限定的5'和3'端，不含潜在干扰性的旁侧序列。一个替代方法使用pol III启动子来产生带有相对限定的5'和3'端的转录物，即，转录具有最小5'和3'旁侧序列的RNA。在一些实施方式中，pol III启动子(例如U6或H1启动子)对于添加短的富含AT的转录终止位 点而言是优选的，其在转录的RNA中生成2个碱基对的悬垂(UU)；这可用于例如表达siRNA型构建体。pol III启动子在驱动siRNA构建体的表达中的应用已有报道；参见van de Wetering等(2003)EMBO Rep.,4:609-615和Tuschl(2002)Nature Biotechnol.,20:446-448。
启动子元件可包括并非天然存在的启动子或启动子元件或其同源物、但可调节基因表达的核酸序列。这种“基因独立性”调节序列的例子包括天然存在的RNA序列或人工设计的RNA序列，其可包含配体结合区或适配子(参见下文“适配子”部分)和调节区(其可以是顺式作用的)。例如参见Isaacs等(2004)Nat.Biotechnol.,22:841-847；Bayer和Smolke(2005)Nature Biotechnol.,23:337-343；Mandal和Breaker(2004)Nature Rev.Mol.CellBiol.,5:451-463；Davidson和Ellington(2005)Trends Biotechnol.,23:109-112；Winkler等(2002)Nature,419:952-956；Sudarsan等(2003)RNA,9:644-647以及Mandal和Breaker(2004)Nature Struct.Mol.Biol.,11:29-35。可以为具体的空间或时间特异性选择或设计这样的“核糖核酸调节物”，例如仅在给定浓度的合适配体存在(或不存在)时才调节DNA的翻译，所述DNA加工成含有与至少一个靶基因的转录物结合的单链RNA的RNA。一个实例是对植物在应激(例如非生物应激例如水、温度或营养应激，或者生物应激例如附有害虫或病原体)下生成的内源配体(例如茉莉酸或水杨酸)有应答的核糖核酸调节物；在应激下，内源配体的水平增加到足以使核糖核酸调节物开始转录DNA的水平，所述DNA加工成包含与至少一个靶基因的转录物结合的单链RNA的RNA。
适配子
在一些实施方式中，本发明重组DNA构建体包括将加工成RNA适配子的DNA，所述适配子是通过并非主要基于Watson-Crick碱基配对的结合机制结合到配体上的RNA(例如，与互补的、反平行核酸链之间发生碱基配对从而形成双链核酸结构相反)。例如参见Ellington和Szostak(1990)Nature,346:818-822。适配子的例子例如 可在公共适配子数据库中找到，可在线得自以下网址：aptamer.icmb.utexas.edu(Lee等(2004)NucleicAcids Res.,32(1):D95-100)。然而，用于本发明的适配子可以是单价(结合单个配体)或多价的(结合一个以上的配体，例如，结合两个或更多个不同配体的一个单元)。
用于本发明的配体包括可被核酸次级结构通过并非主要基于Watson-Crick碱基配对的机制识别并结合的任何分子(或分子部分)。这样，配体和适配子的识别和结合类似于抗原和抗体的识别和结合，或类似于生物效应物和受体的识别和结合。配体可包括单个分子(或分子部分)，或两个或更多个分子(或分子部分)的组合，并可包括一个或多个大分子复合物(例如，聚合物、脂双层、脂质体、细胞膜或其他细胞结构或细胞表面)。特异性配体的例子包括维生素，例如辅酶B12和焦磷酸硫胺素、黄素单核苷酸、鸟嘌呤、腺苷、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷高半胱氨酸、辅酶A、赖氨酸、酪氨酸、多巴胺、葡糖胺-6-磷酸、咖啡因、茶碱；抗生素，例如氯霉素和新霉素；除草剂，例如草甘磷和麦草畏；蛋白质，包括病毒或者噬菌体外壳蛋白和无脊椎动物表皮或消化道表面蛋白质；和RNA，包括病毒RNA、转运RNA(t-RNA)、核糖体RNA(rRNA)和RNA聚合酶例如RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)。用于本发明的一类RNA适配子是不与配体结合但对热有应答的“热开关”，也就是说，该适配子的构象由温度决定；例如参见Mandal and Breaker(2004)Nature Rev.Mol.Cell Biol.,5:451-463中的盒 3。
转基因转录单位
在一些实施方式中，本发明重组DNA构建体包括转基因转录单位。转基因转录单位包括编码目标基因(例如天然蛋白质或异源蛋白质)的DNA序列。目标基因可以是来自任何物种(包括但不限于：非真核生物，例如细菌和病毒；真菌、原生生物、植物、无脊椎动物和脊椎动物)的任何编码或非编码序列。目标基因包括以上在标题为“靶基因”的部分作为靶基因描述的那些基因。该转基因转录单位还可根据转基因转录的需要包括5'或3'序列或两者。
内含子
在一些实施方式中，本发明重组DNA构建体包括编码可剪接内含子的DNA。“内含子”一般指位于外显子(DNA或相应转录RNA的蛋白质编码片段)之间的DNA片段(或由此片段转录得到的RNA)，其中，在信使RNA成熟期间，所存在的内含子通过发生在真核生物细胞核中的切割/连接过程由酶“剪接掉”或从RNA链中除去。术语“内含子”还用于表示转录为可从成熟RNA转录物中剪接掉的RNA片段的非编码DNA序列，但不是编码蛋白质的外显子之间发现的内含子。这些内含子的一个例子是能够增强下游编码序列在植物(有时，尤其是单子叶植物)中表达的可剪接序列；这些可剪接序列天然位于一些植物基因的5'非翻译区，以及位于一些病毒基因中(例如，Gallie和Walbot(1992)Nucleic Acids Res.,20:4631-4638描写为增强在植物基因中表达的烟草花叶病毒5'前导序列或“omega”前导序列)。这些可剪接序列或“增强表达的内含子”可以被人工插入启动子之间但在任何蛋白质编码外显子之前的植物基因的5'非翻译区中。这种增强表达的内含子的实例包括但不限于，玉米醇脱氢酶(Zm-Adh1)、玉米Bronze-1表达增强内含子、水稻肌动蛋白1(Os-Act1)内含子、Shrunken-1(Sh-1)内含子、玉米蔗糖合酶内含子、热休克蛋白18(hsp18)内含子和82千道尔顿热休克蛋白(hsp82)内含子。特别以引用方式合并于此的美国专利5,593,874和5,859,347描述了改善用于植物中的重组DNA构建体的方法，该方法是通过在位于基因启动子3'和位于第一蛋白质编码外显子5'的非翻译前导区包含来自70千道尔顿玉米热休克蛋白(hsp70)的表达增强内含子。
核酶
在一些实施方式中，本发明重组DNA构建体包括编码一种或多种核酶的DNA。特别感兴趣的核酶包括自切割核酶、锤头状核酶或发卡核酶。在一个实施方式中，该重组DNA构建体包括编码一种或多种核酶的DNA，所述核酶用来切割转录的RNA，从而提供所定义的RNA片段，例如与靶基因转录物结合的单链RNA。
重组酶
在一些实施方式中，本发明重组DNA构建体包括编码一种或多种位点特异性重组酶识别位点的DNA。在一个实施方式中，该重组DNA构建体包括至少一对loxP位点，其中loxP位点之间的DNA的位点特异性重组由Cre重组酶介导。选择loxP位点的位置和相对方向以实现所希望的重组；例如，当loxP位点处于相同方向时，loxP位点之间的DNA以环形切除。在另一个实施方式中，重组DNA构建体包括编码一个loxP位点的DNA；在Cre重组酶和带有loxP位点的另一个DNA的存在下，这两个DNA被重组。
基因抑制元件
在一些实施方式中，本发明重组DNA构建体还包括编码基因抑制元件的DNA。基因抑制元件包括用来特异性抑制一个或多个目标基因的任何DNA序列(或其中编码的RNA序列)，这些基因对重组DNA构建体在其中转录的细胞而言是内源基因，或对那些细胞而言是外源基因。被抑制的基因可以是如标题为“靶基因”的部分作为靶基因描述的任何基因。
适当的基因抑制元件在美国专利申请公布说明书2006/0200878中有详细描述(该申请以引用方式特别合并于此)，包括以下一个或多个：
(a)包含至少一个反义DNA片段的DNA，该反义DNA片段对要抑制的基因的至少一个片段而言是反义的；
(b)包含多拷贝的至少一个反义DNA片段的DNA，该反义DNA片段对要抑制的基因的至少一个片段而言是反义的；
(c)包含至少一个有义DNA片段的DNA，该有义DNA片段是要抑制的基因的至少一个片段；
(d)包含多拷贝的至少一个有义DNA片段的DNA，该有义DNA片段是要抑制的基因的至少一个片段；
(e)可转录为RNA以通过形成双链RNA而抑制要抑制的基因的DNA，并且该DNA包含至少一个反义DNA片段和至少一个有义DNA 片段，该反义DNA片段对要抑制的基因的至少一个片段而言是反义的，该有义DNA片段是要抑制的基因的至少一个片段；
(f)可转录为RNA以通过形成单个双链RNA而抑制要抑制的基因的DNA，并且该DNA包含多个连续反义DNA片段和多个连续有义DNA片段，这些反义DNA片段对要抑制的基因的至少一个片段而言是反义的，这些有义DNA片段是要抑制的基因的至少一个片段；
(g)可转录为RNA以通过形成多个RNA双链而抑制要抑制的基因的DNA，并且该DNA包含多个反义DNA片段和多个有义DNA片段，这些反义DNA片段对要抑制的基因的至少一个片段而言是反义的，这些有义DNA片段是要抑制的基因的至少一个片段，并且其中多个反义DNA片段和多个有义DNA片段以一系列反向重复方式排列；
(h)包含来源于植物miRNA的核苷酸的DNA；
(i)包含siRNA核苷酸的DNA；
(j)可转录为能结合配体的RNA适配子的DNA；和
(k)可转录为能结合配体的RNA适配子的DNA，和可转录为能调节要抑制的基因的表达的调节RNA的DNA，其中所述调节依赖于调节RNA的构象，而调节RNA的构象受RNA适配子结合状态的变构影响。
在一些实施方式中，内含子用于在不存在任何蛋白质编码外显子(编码序列)的情况下递送基因抑制元件。在一个实施方式中，通过将基因抑制元件嵌入在内含子中而中断内含子，例如增强表达的内含子(在某些实施方式中是优选的)，其中，一旦转录，基因抑制元件从内含子切除。因此，不需要蛋白质编码外显子来提供本文公开的重组DNA构建体的基因抑制功能。
转录调节元件
在一些实施方式中，本发明重组DNA构建体包含编码转录调节元件的DNA。转录调节元件包含调节本发明重组DNA构建体的表达水平(相对于不存在这样的调控元件下的表达)的元件。合适的转录调控元件的实例包括美国专利申请公布说明书2006/0200878所述的核糖开关(顺式或反式作用)、转录物稳定化序列和miRNA识别位点，该专利申请以 引用方式特别合并于此。
制备和使用重组DNA构建体
可通过适合预定用途的任何方法来制备本发明重组DNA构建体，考虑例如所需表达类型和在转录构建体的植物中使用的方便性。制备和使用DNA构建体和载体的通用方法是本领域众所周知的，详细描述于例如包括以下在内的手册和实验室指南：Sambrook和Russell,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”(第三版)、Cold Spring HarborLaboratory Press,NY,2001。构建DNA构建体和载体用于转化的有用技术的实例公开于美国专利申请公布说明书2004/0115642A1中，该申请以引用方式合并于此。也可使用GATEWAYTM克隆技术(可得自Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)来构建DNA构建体，该技术使用来自噬菌体λ载体构建的整合酶/att系统的位点特异性重组酶LR克隆反应，代替限制性核酸内切酶和连接酶。LR克隆反应公开于美国专利5,888,732和6,277,608和美国专利申请公布说明书2001/283529、2001/282319和2002/0007051中，所有这些文献都以引用方式特别合并于此。另一种载体构建的替代方法使用不依赖连接的克隆，如以下文献所公开：Aslandis等(1990)Nucleic Acids Res.,18:6069-6074和Rashtchian等(1992)Biochem.,206:91-97，其中将具有单链5'端和3'端的DNA片段连接到所需载体中，然后可以在体内扩增。
在某些实施方式中，重组DNA构建体的DNA序列包括对于将要表达该重组DNA构建体的植物已经经过密码子优化的序列。例如，可通过本领域已知方法，使将要在植物中表达的重组DNA构建体具有为了在植物中表达而经密码子优化的所有或部分序列(例如第一基因抑制元件或基因表达元件)。例如参见美国专利5,500,365中有关植物密码子优化方法的描述，通过引用方式合并于此；另见De Amicis和Marchetti(2000)Nucleic Acid Res.,28:3339-3346。
非天然转基因植物细胞、植物和种子
另一方面，本发明提供非天然转基因植物细胞，在其基因组中包含 本发明的重组DNA构建体，该DNA构建体含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性。本发明还提供含有非天然转基因植物细胞的非天然转基因植物。在一个实施方式中，该非天然转基因植物完全由转基因组织组成。在另一个实施方式中，该非天然植物是部分转基因植物并包含非转基因组织；在一个例子中，该非天然部分转基因植物包括非转基因接穗和含有非天然转基因植物细胞的转基因砧木。本发明还提供包含非天然转基因植物细胞的非天然转基因种子。
本发明的非天然转基因植物包括任何发育阶段的植物，并包括由本文所公开的非天然转基因植物细胞制备的非天然再生植物、或再生植物的非天然后代植物(其可以是近交或杂交后代植物)、或这种非天然转基因植物的种子。也提供在其基因组中具有本发明的重组DNA构建体的非天然转基因种子。本发明的非天然转基因植物细胞、转基因植物和转基因种子通过本领域众所周知的方法制备，如标题“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”下所述。
非天然转基因植物细胞可包括分离的植物细胞(例如单独的植物细胞或在人工培养基中或人工培养基上生长的细胞)，或可包括未分化组织(例如愈伤组织或任何聚集的植物细胞)中的植物细胞。非天然转基因植物细胞可包括至少一种分化组织中的植物细胞，所述分化组织选自叶(例如叶柄和叶片)、根、茎(例如块茎、根茎、匍匐茎、鳞茎和球茎)、茎秆(例如木质部、韧皮部)、木材、种子、果实和花(例如雄蕊、花丝、花药、花粉、小孢子、心皮、雌蕊、子房、胚珠)。本发明的非天然转基因植物细胞或非天然转基因植物可被稳定转化成，例如，也包含本发明重组构建体的能育转基因植物及其非天然转基因种子。
在本发明的一些实施方式中，该非天然植物是非天然转基因植物。在这些实施方式中，非天然植物的所有细胞(单倍体细胞可能除外)和组织包含本发明的重组DNA构建体。在其他实施方式中，该非天然植物是部分转基因的，并包含天然非转基因组织(例如，非天然转基因组织 嫁接在天然的非转基因组织上)。在一个实施方式中，非天然植物包含天然的非转基因接穗和包括转基因植物细胞的非天然转基因砧木，其中非转基因接穗和转基因砧木嫁接在一起。当该植物通常作为嫁接在砧木上的接穗(其中接穗和砧木可以来自相同物种或种类，或是不同物种或种类)无性繁殖生长时，这样的实施方式尤其有用；实例包括葡萄、苹果、梨、温柏、鳄梨、柠檬、核果、奇异果、玫瑰及其他农业或重要观赏植物。特别要求保护的实施方式包括如下实施方式，其中(a)包含天然非转基因葡萄接穗和非天然转基因葡萄砧木的非天然部分转基因植物；和(b)包含天然非转基因果树(例如梨树)接穗和非天然转基因果树(例如温柏)砧木的非天然部分转基因植物。
制备和使用转基因植物细胞和转基因植物
在本发明的重组DNA构建体用于产生本发明的非天然转基因植物细胞、植物或种子时，转化可以包括任何众所周知并已证明的方法和组合物。用于植物转化的适当方法事实上包括可将DNA导入细胞的任何方法。一种植物转化方法是微粒轰击，例如由以下文件所述：美国专利5,015,580(大豆)、5,538,880(玉米)、5,550,318(玉米)、5,914,451(大豆)、6,153,812(小麦)、6,160,208(玉米)、6,288,312(水稻)、6,365,807(水稻)和6,399,861(玉米)和6,403,865(玉米)，所有这些文献都以引用方式合并，用于能够生产转基因植物。
植物转化的另一种方法是利用含二元Ti质粒系统的土壤杆菌的土壤杆菌介导的转化，其中该土壤杆菌属携带第一Ti质粒和第二嵌合质粒，该第二嵌合质粒含有野生Ti质粒的至少一个T-DNA边界、在转化的植物细胞中具有功能并与本发明基因抑制构建体操作性连接的启动子。例如参见美国专利5,159,135中所述的二元系统，该专利以引用方式合并于此。另参见De Framond(1983)Biotechnology,1:262-269；以及Hoekema等(1983)Nature,303:179。在这样的二元系统中，可在合适的替代宿主例如大肠杆菌中方便地构建和操作含有一个或多个T-DNA边界的较小质粒，然后转移至土壤杆菌中。
用于土壤杆菌介导的植物(尤其是作物)转化的具体方法包括以下文 献中公开的方法：美国专利5,004,863、5,159,135和5,518,908(棉花)；5,416,011、5,569,834、5,824,877和6,384,301(大豆)；5,591,616和5,981,840(玉米)；5,463,174(包括油菜的芸苔属植物)、7,026,528(小麦)和6,329,571(水稻)和美国专利申请公布说明书2004/0244075(玉米)和2001/0042257A1(甜菜)，所有这些文献都以引用方式特别合并于此，用于能够生产转基因植物。对于包括以下的双子叶植物和单子叶植物的许多植物种而言都已经报道了类似的方法：花生(Cheng等(1996)Plant Cell Rep.,15:653)；芦笋(Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84:5345)；大麦(Wan和Lemaux(1994)Plant Physiol.,104:37)；水稻(Toriyama等(1988)Bio/Technology,6:10；Zhang等(1988)Plant Cell Rep.,7:379；小麦(Vasil等(1992)Bio/Technology,10:667；Becker等(1994)Plant J.,5:299)；苜蓿(Masoud等(1996)Transgen.Res.,5:313)；和番茄(Sun等2006)Plant Cell Physiol.,47:426-431)。另见美国专利申请公布说明书2003/0167537A1中有关转化的拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物的载体、转化方法和生产的描述，其中转录因子由CaMV35S启动子组成型表达，该文献以引用方式合并于此。转化其他植物种的各种方法是本领域众所周知的，例如参见百科全书参考文献，由Chittaranjan Kole和Timothy C.Hall,BlackwellPublishing Ltd.,2008；ISBN 978-1-405-16924-0出版的“Compendium of TransgenicCrop Plants”，(可得自以下网址：mrw.interscience.wiley.com/emrw/9781405181099/hpt/toc)，其描述了用于谷类和饲用牧草(水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、高粱、珍珠稷、手指稷、温带牧草和百喜草(bahiagrass))、油料作物(大豆、油籽芸苔属植物、向日葵、花生、亚麻、芝麻和红花)、豆类谷物和饲料(菜豆、豇豆、豌豆、蚕豆、小扁豆、宽叶菜豆、亚洲豆、木豆、野豌豆、鹰嘴豆、羽扇豆、苜蓿和三叶草)、温带水果和坚果(苹果、梨、桃、李子、浆果作物、樱桃、葡萄、橄榄、杏和胡桃)、热带和亚热带水果和坚果(柠檬、葡萄柚、香蕉和车前草、菠萝、番木瓜、芒果、鳄梨、奇异果、西番莲和柿子)、蔬菜作物(番茄、茄子、胡椒、蔬菜芸苔属植物、萝卜、胡萝卜、葫芦、葱蒜、芦笋和叶菜)、糖、块茎和纤维作物(甘蔗、甜菜、甜 叶菊(stvia)、马铃薯、甘薯、木薯和棉花)、种植作物、观赏植物和草皮草(烟草、咖啡、可可粉、茶、橡胶树、药用植物、观赏植物和草皮草)和森林树种的转化方法。本领域技术人员有着多种用于生产稳定的转基因植物的转化方法。
优选在组织培养基和受控环境中实施能提供含稳定整合的重组DNA的转基因植物细胞和转基因植物的转化方法。“培养基”是指用于在体外(即在完整的活生物体之外)培养细胞的多种营养混合物。受体细胞靶标包括但不限于分生组织细胞、愈伤组织、未成熟胚或部分胚、以及配子细胞例如小孢子、花粉、精子和卵细胞。可再生为能育植物的任何细胞都可用作有用的受体细胞，用于本发明的实施。愈伤组织可来自各种组织来源，包括但不限于未成熟胚或部分胚、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够增殖为愈伤组织的这些细胞可作为用于遗传转化的受体细胞。用于制备本发明转基因植物的实用的转化方法和材料(例如各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚的转化、以及其后的能育转基因植物的再生)都公开于美国专利6,194,636和6,232,526和美国专利申请公布说明书2004/0216189，这些文献以引用方式特别合并于此。
在通常的转化实践中，在任何一个转化实验中，DNA仅能导入到少量靶细胞中。标记基因通常用于提供识别通过接受转基因DNA构建体并将其整合到其基因组中而稳定转化的细胞的有效系统。优选的标记基因提供赋予选择剂(例如抗生素或除草剂)抗性的选择标记。植物细胞对其具有抗性的任何抗生素或除草剂都可以是有用的选择剂。使可能转化的细胞接触选择剂。在存活细胞群体中的细胞就是通常整合了赋予抗性的基因并以允许细胞存活的足够量表达的细胞。还可进一步测试细胞，以证实重组DNA的稳定整合。常用的选择标记基因包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因，所述抗生素例如卡那霉素或巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)和庆大霉素(aac3和aacC4)，所述除草剂例如草铵膦(bar或pat)和草甘磷(EPSPS)。有用的选择标记基因和选择剂的实例可参见美国专利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047，所有这些文献以引用方式合并于此。也可使用可筛选标记或报道基因，例如提供可目测鉴定转化子的能力的标记。有用的可筛选标记的例子包括例 如表达这样的蛋白质的基因：该蛋白质通过作用于显色底物(例如β－葡萄糖醛酸酶(GUS)(uidA)或虫荧光素酶(luc)而产生可检测的颜色，或者它本身是可检测的，例如绿色荧光蛋白(GFP)(GFP)或免疫原性分子。本领域技术人员理解，许多其他有用的标记或报道基因都可以使用。
重组DNA构建体在本发明转基因植物细胞中转录的检测或测定可通过任何合适的方法完成，包括蛋白质检测方法(例如蛋白质印迹、ELISA及其他免疫化学方法)、酶活性测定或核酸检测方法(例如DNA印迹、RNA印迹、PCR、RT-PCR、荧光原位杂交)。
重组DNA构建体在本发明转基因植物细胞中转录的其他合适的检测或测定方法包括测定能直接或间接指示靶基因在可转录重组DNA构建体的转基因植物细胞中的表达水平(相对于不转录重组DNA的转基因植物中的表达水平)的任何其他性状，例如总体或显微形态学性状、生长速率、产量、生殖或补充率、对害虫或病原体的抗性、或对生物或非生物应激(例如缺水应激、盐应激、营养应激、热或寒冷应激)的抗性。这些方法可采用表型性状的直接测定或间接测定(例如在植物中，这些测定包括植物部分测定例如叶或根的测定，以测定非生物应激耐受性)。这些方法包括直接测定对无脊椎害虫或病原体(例如损害植物组织)的抗性或间接测定(例如植物产量测定，或生物测定，例如西方玉米根虫(Diabroticavirgifera virgifera LeConte)幼虫的生物测定，其描述于国际专利申请公布说明书WO2005/110068A2和美国专利申请公布说明书US2006/0021087A1中，所述文献以引用方式合并于此，或由Steeves等(2006)Funct.Plant Biol.,33:991-999描述的大豆胞囊线虫生物测定，其中测定每一植物的胞囊数、每克根的胞囊数、每一植物的卵数、每克根的卵数以及每一胞囊中的卵数。
通过例如表达或抑制其他基因，可将本发明的重组DNA构建体与赋予额外性状(例如就转化植物而言，包括除草剂抗性、抗虫性、低温发芽耐受性、缺水耐受性等性状)的其他重组DNA叠加在一起。用于调节基因表达增减的构建体公开于美国专利申请公布说明书2004/0126845A1中，其以引用方式合并于此。
可收获能育转基因植物的种子并用于培育后代，包括在其基因组中 包含重组DNA构建体的本发明转基因植物的杂种后代。因此，除了用本发明重组DNA构建体直接转化植物之外，可通过将具有重组DNA的第一植物和缺乏该构建体的第二植物杂交来制备本发明的转基因植物。例如，可将重组DNA导入适于转化的植物系中以产生转基因植物，该转基因植物可与第二植物系杂交以将重组DNA逐渐渗入所得后代中。本发明的转基因植物可与具有赋予一种或多种额外性状(例如但不限于除草剂抗性、抗虫性或抗病性、环境应激抗性、营养含量改变和产量提高)的其他重组DNA的植物系杂交，以产生具有同时赋予所需靶序列表达行为和额外性状的重组DNA的后代植物。
在这种合并性状的育种中，提供额外性状的转基因植物可以是雄性品系(授粉者)，而携带基础性状的转基因植物可以是雌性品系。这种杂交的后代发生分离，使得一些植物携带双方亲本性状的DNA，而一些只携带一方亲本性状的DNA；可通过与亲本重组DNA结合的标记来鉴定这类植物。可将携带双方亲本性状的DNA的后代植物与雌性亲本系多次回交，例如通常6到8代，以产生具有与一个原始转基因亲本系基本相同的基因型以及其他转基因亲本系的重组DNA的纯合后代植物。
本发明的再一方面是由本发明转基因种子生长而来的转基因植物。本发明预期由含有重组DNA的转基因种子直接生长而来的转基因植物以及植物后代，包括近交或杂交植物系，其通过将由转基因种子直接生长而来的转基因植物与并非由同一转基因种子生长而来的第二植物杂交而制备。杂交例如可包括以下步骤：
(a)种植第一亲本植物(例如非转基因或转基因)和本发明的转基因的第二亲本植物的种子；
(b)使第一和第二亲本植物的种子生长成开花的植物；
(c)用第二亲本的花粉给第一亲本的花授粉；和
(d)收获具有受精花的亲本植物上结出的种子。
通常希望将重组DNA逐渐渗入优良品种中，例如通过回交，将一个来源的特定所需性状转移到缺乏该性状的近交或其他植物中。这可通过例如以下步骤完成：首先将优良近交系(“A”)(回交亲本)与携带目标性状的合适基因(例如按照本发明所制备的构建体)的供体近交系(“B”)(非 回交亲本)杂交。先在该杂交的所得后代中选出具有从非回交亲本“B”转移的所需性状的后代，所选后代再与优良回交亲本“A”回交。经过选择所需性状的五代或五代以上的回交后，后代在控制所转移性状的基因座上基本上是半合子，但在大多数或几乎所有其他基因上都类似优良亲本。回交的最后一代自交，得到对所转移的基因(即一个或多个转化事件)而言是纯种繁育的后代。
经过一系列育种操作，所选DNA构建体可以从一个品系移至完全不同的另一品系，而无需进一步重组操作。因此可产生近交植物，其对于一个或多个DNA构建体而言是纯种育种。通过将不同近交植物杂交，可产生具有不同DNA构建体组合的大量不同杂种。按照这种方法，可产生具有通常与杂种有关的理想农艺学特性(“杂交优势”)以及由一种或多种DNA构建体赋予的所需特性的植物。
在本发明的某些转基因植物细胞和转基因植物中，最好同时表达目标基因，同时也调节靶基因的表达。因此，在一些实施方式中，该转基因植物包含重组DNA，所述重组DNA还含有基因表达元件，用于表达至少一个目标基因，而本发明的重组DNA构建体的转录优选通过基因表达元件的同时转录而实现。
本发明的重组DNA构建体可在任何植物细胞或组织中或者在任何发育阶段的完整植物转录。转基因植物可来自任何单子叶植物或双子叶植物植物，例如但不限于，具有商业或农业价值的植物，例如作物(尤其是作为人类食物或动物饲料的作物)、生产木材或纸浆的树木、蔬菜植物、水果植物和观赏植物。目标植物的实例包括谷类作物植物(例如小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、黑小麦、水稻、稷、高粱、藜麦、苋菜和荞麦)；饲料作物植物(例如饲用牧草和饲用双子叶植物，包括苜蓿、巢菜、三叶草等)；油料作物(例如棉花、红花、向日葵、大豆、甘兰型油菜、油菜、亚麻、花生和油棕)；树坚果(例如胡桃、腰果、榛子、山核桃、杏等)；甘蔗、椰子、枣椰、橄榄、甜菜、茶和咖啡；生产木材或纸浆的树；蔬菜作物植物例如豆类(例如菜豆、豌豆、小扁豆、苜蓿、花生)、莴苣、芦笋、朝鲜蓟、芹菜、胡萝卜、萝卜、芸苔属植物(例如甘蓝、羽衣甘蓝、芥及其他叶状芸苔属植物、椰菜、花椰菜、抱子甘蓝、 芜菁、球茎甘蓝)、食用葫芦科类(例如黄瓜、甜瓜、夏西葫芦、冬西葫芦)、食用葱蒜类(例如洋葱、大蒜、韭菜、葱、细香葱)、茄科的食用成员(例如番茄、茄子、马铃薯、胡椒、灯笼果(groundcherries))、和藜科的食用成员(例如甜菜、牛皮菜、菠菜、藜麦、苋菜)；水果作物植物例如苹果、梨、柑桔类水果(例如橙子、酸橙、柠檬、葡萄柚及其他)、核果(例如杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠萝、葡萄、奇异果、木爪、鳄梨、和浆果；用于生物资源或生物燃料的植物(例如芒草、柳枝稷、珍珠粉树、油棕、真核微藻例如葡萄藻(Botryococcus braunii)、小球藻(Chlorella spp)和杜氏盐藻(Dunaliella spp)、以及真核大藻例如江蓠(Gracilaria spp)和马尾藻(Sargassum spp)；和观赏植物，包括观赏用花卉植物、观赏用树木和灌木、观赏用地被植物和观赏用禾草。
本发明也提供由本发明非天然转基因植物细胞、植物或种子制备得到的商品，包括但不限于收获的叶、根、苗、块茎、茎、果实、种子、或植物的其他部分、粗粉、油类、提取物、发酵或消化产物、碾碎或完整的谷物或植物种子、或任何食品或非食品(包括由本发明转基因植物细胞、植物或种子制备得到的商品)。本发明所预期的对一种或多种商品中本发明重组DNA构建体的一个或多个核酸序列的检测，是该商品含有或源自本发明非天然转基因植物细胞、植物或种子的实际证据。
在多个实施方式中，相对于缺乏重组DNA构建体的植物而言，在其基因组中含有本发明重组DNA构建体的非天然转基因植物具有至少一个额外的改变的性状，其选自以下性状：
(a)提高的非生物应激耐受性；
(b)提高的生物应激耐受性；
(c)改变的初级代谢产物的组成；
(d)改变的次级代谢产物的组成；
(e)改变的微量元素、类胡萝卜素或维生素的组成；
(f)提高的产量；
(g)提高的氮、磷酸盐或其他营养物的利用能力；
(h)改变的农艺学特性；
(i)改变的生长或生殖特性；和
(j)提高的收获、贮存或加工品质。
在一些实施方式中，非天然转基因植物的特征在于：提高对非生物应激的耐受性(例如对缺水或干旱、热、冷、非最佳营养或盐水平、非最佳光照水平的耐受性)或对生物应激(例如拥挤、异株克生作用或创伤)的耐受性；改变初级代谢产物(例如脂肪酸、油、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成；改变次级代谢产物(例如生物碱类、萜类、聚酮化合物、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢产物)组成；改变微量元素(例如铁、锌)、类胡萝卜素(例如β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、玉米黄质或其他类胡萝卜素和叶黄素)、或维生素(例如生育酚)组成；提高产量(例如在非应激状态下提高产量或在生物或非生物应激下提高产量)；提高氮、磷酸盐或其他营养物的利用能力；改变农艺学特性(例如延迟成熟；延迟衰老；更早熟或更晚熟；改善耐阴性；提高根或茎倒伏的抗性；提高对茎“green snap”的抗性；改变生长或生殖特性(例如有意矮化；有意雄性不育，用于例如改进杂交步骤；改善营养生长率；改善发芽率；改善雄性或雌性生育力)；改善收获、贮存或加工品质(例如提高贮存期间对害虫的抗性，提高对破损的抗性、提高对消费者的吸引力)；或这些性状的组合。
在另一个实施方式中，非天然转基因种子或由非天然转基因植物产生的种子具有改变的初级代谢产物(例如脂肪酸、油、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成，改变的次级代谢产物组成，改变的微量元素、类胡萝卜素或维生素组成，提高的收获、贮存或加工品质，或这些性状的组合。在另一个实施方式中，理想的是改变转基因植物或转基因植物的种子的天然成分的含量，例如以降低变应原性蛋白质或糖蛋白或毒性代谢物的含量。
通常，进行各自由转基因植物细胞再生的转基因植物种群的筛选，以鉴定生长成为具有所需性状的转基因植物的转基因植物细胞。测定该转基因植物以检测提高的性状例如，提高的水利用效率、提高的冷耐受性、提高的产量、提高的氮利用效率、提高的种子蛋白质以及提高的种子油。筛选方法包括在温室或试验田间直接筛选性状或筛选替代性状。这种分析涉及检测植物的化学组成、生物质、生理特性或形态的改变。 化学组成例如谷物营养成分的改变通过分析种子中蛋白质、游离氨基酸、油、游离脂肪酸、淀粉、生育酚或其他营养物的组成和含量来检测。生长或生物质特性的改变通过测定植物高度、茎径、节间长、根和苗干重、以及(对于产生谷粒的植物例如玉米、水稻或小麦)穗或种子头长和直径来检测。生理特性的改变通过评价对应激条件的反应来鉴定，例如在施加的应激条件例如缺水、缺氮或磷酸盐、冷或热生长条件、病原体或昆虫攻击、光照不足或增加植物密度下测定。其他选择特性包括花粉脱落天数、玉米抽丝天数、叶伸长率、叶绿素含量、叶温、直立、秧苗活力、节间长、植物高度、叶数目、叶面积、分蘖、支持根、绿色保持、茎倒伏、根倒伏、植物健康、生育力、green snap和抗虫性。另外，可以评估收获的种子的表型特性：例如在玉米中，这可以包括每排穗的谷粒数目、穗上谷粒的行数、谷粒发育不全、谷粒重、谷粒大小、谷粒密度和物理谷粒品质。下文说明了用于鉴定玉米植物所需性状的筛选试验的例子。可容易地改变这些例子，用于筛选其他植物例如作为杂种或近交种的甘兰型油菜、棉花和大豆。
通过在田间施用三个水平的氮肥筛选来鉴定具有氮利用效率的转基因玉米植物，所述氮肥例如以低水平(0磅/英亩)、中间水平(80磅/英亩)和高水平(180磅/英亩)施用。具有提高的氮利用效率的植物和对照植物相比提供更高的产量。
通过在多个地点用在最适生产管理实践和最大杂草和害虫控制的情况下生长的植物筛选转基因植物来鉴定具有提高产量的转基因玉米植物。提高产量的有用目标是5％到10％的产量增加(和对照植物种子生长成的植物的产量相比)。可以在多个和不同的地理位置以及一个或多个种植季节使用选择方法，来在统计上区分产量提高与自然环境影响。
通过在试验(拒绝给水一段时期以诱导应激，随后浇水以使植物复活)中筛选植物来鉴定水利用效率提高的转基因玉米植物。例如，一个有用的选择方法是在15天的总周期内，在11天的初始无应激生长期后，对植物施加3个干旱/重新给水循环。各周期由5天组成，前四天不浇水，在周期的第五天进行水淬。由该选择方法分析得到的主要表型是植物生长率的变化，由植物干旱生长处理期间的高度和生物量确定。
通过在冷发芽试验和/或耐冷性田间试验中筛选植物来鉴定具有提高的耐冷性的转基因玉米植物。在冷发芽试验中，将转基因和对照种子盘置于9.7摄氏度的黑暗生长室中24天。和对照种子相比具有提高的发芽率的种子被鉴定为具有提高的耐冷性。在耐冷性田间试验中，通过在田间位置比传统的春种提早的田间种植来鉴定具有提高的耐冷性的植物。例如，在当地农民开始种植玉米前约两个星期将种子种入土地，以便对作物施加明显的冷应激。作为对照，在局部最适种植条件下种植种子，以使该作物几乎不接触或者不接触冷环境。在各个位置，在冷和正常条件下种植种子，优选每次处理多次重复。
前述说明和公开的实例描述了本发明的主题，其包括以下：(I)重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性；(II)重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中所述DNA加工成含有单链RNA的RNA过程包括所述DNA转录为含有一个或多个双链RNA茎的中间体；(III)重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中所述单链RNA的长度为约10到100个核苷酸；(IV)重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其还含有至少一种选自以下的元件：(A)在真核细胞中具有功能的启动子；(B)与所述将加工成含有单链RNA的RNA的DNA操作性连接的Pol III启动子；(C)加工成RNA适配子的DNA；(D)转基因转录单元；(E)编码可剪接内含子的DNA；(F)编码自剪接核酶的DNA；(G)编码位点特异性重组酶识别位点的DNA；(H)编码基因抑制元件的DNA；和(I)编码转录调控元件的DNA；(V)重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中所述至少一个靶基因包含：(A)编码序列、非编码序列、或编码序列非编码序列两者；或(B)单个靶基因或多个靶基因；或(C)下组的一个或多个：(1)真核细胞的内源基因，(2)转基因植物的转基因，(3)植物的害虫或病原体的内源基因，和(4)与植物的害虫或病原体有关的共生体的内源基因；(VI)重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中所述单链RNA与所述转录物的结合：(A)抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制；或(B)抑制所述转录物的翻译；(VII)重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中所述单链RNA与所述转录物的结合：(A)抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制；或(B)抑制所述转录物的翻译；并且其中(1)所述单链RNA与所述转录物的结合抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制，且所述杂交片段的长度包含约10到约100个碱基对；(2)所述单链RNA与所述转录物的结合抑制所述转录物的翻译，且所述杂交片段的长度包含约10到约100个碱基对；或(3)所述单链RNA与所述转录物的结合抑制所述转录物的翻译，且所述杂交片段的长度包含约19到约50个碱基对；所述杂交片段含有9个或更少个连续的完全互补的碱基对的较小片段，以及在所述较小片段的各对之间具有至少一个错配或插入；(VIII)重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和 至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中所述单链RNA与所述转录物的结合：(A)抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制；或(B)抑制所述转录物的翻译；且其中所述单链RNA与所述转录物的结合抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制，且所述杂交片段的长度包含约10到约100个碱基对，且所述双链RNA介导的抑制包括所述转录物被所述RNA酶III核糖核酸酶的切割，且所述切割由小RNA与所述转录物的结合介导；(IX)重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中所述单链RNA与所述转录物的结合：(A)抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制；或(B)抑制所述转录物的翻译；且其中所述小RNA是：(1)内源小RNA或转基因小RNA；或(2)选自miRNA、siRNA、反式作用siRNA、定相小RNA、天然反义转录物siRNA和天然反义转录物miRNA；(X)重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中所述单链RNA与所述转录物的结合：(A)抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制；或(B)抑制所述转录物的翻译；且其中所述单链RNA与所述转录物的结合抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制，且所述杂交片段的长度包含约10到约100个碱基对，且所述双链RNA介导的抑制包括所述转录物被所述RNA酶III核糖核酸酶的切割，且所述切割由小RNA与所述转录物的结合介导；且其中所述杂交片段在所述杂交片段的一个位置包含至少一个错配或至少一个插入，导致抑制所述转录物被所述RNA酶III核糖核酸酶切割；(XI)重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片 段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中所述单链RNA与所述转录物的结合：(A)抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制；或(B)抑制所述转录物的翻译；且其中所述单链RNA与所述转录物的结合抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制，且所述杂交片段的长度包含约10到约100个碱基对，且所述双链RNA介导的抑制包括所述转录物被所述RNA酶III核糖核酸酶的切割，且所述切割由小RNA与所述转录物的结合介导；且其中所述小RNA是成熟miRNA，所述结合位于所述转录物中的miRNA识别位点，所述转录物的所述切割发生在所述miRNA识别位点，以及所述杂交片段至少部分形成于所述miRNA识别位点内；(XII)重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中所述单链RNA与所述转录物的结合：(A)抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制；或(B)抑制所述转录物的翻译；且其中所述单链RNA与所述转录物的结合抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制，且所述杂交片段的长度包含约10到约100个碱基对，且所述双链RNA介导的抑制包括所述转录物被所述RNA酶III核糖核酸酶的切割，且所述切割由小RNA与所述转录物的结合介导；且其中所述小RNA是成熟miRNA，所述结合位于所述转录物中的miRNA识别位点，所述转录物的所述切割发生在所述miRNA识别位点，以及所述杂交片段至少部分形成于所述miRNA识别位点内；且其中所述杂交片段包含：(1)在所述单链RNA和所述miRNA识别位点之间在对应于所述成熟miRNA的位置9、10或11的位置处的至少一个错配，或(2)在所述单链RNA上对应于所述成熟miRNA的位置10-11的位置处的至少一个插入，或(3)在对应于所述成熟miRNA的5’端的位置处的A、G或C(而不是U)，但不包含(a)在所述单链RNA和所述miRNA识别位点之间在对应于所述成熟miRNA的位置9、10或11(以3'到5'方向)的所述miRNA识别位点位置处的错配，或(b)在所述单链RNA上对应于所述成熟miRNA的位置10或11(以3'到5'方向)的所述miRNA识别位点的位置处的插入；(XIII)重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中所述单链RNA与所述转录物的结合：(A)抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制；或(B)抑制所述转录物的翻译；且其中所述单链RNA与所述转录物的结合抑制所述转录物的翻译，且所述单链RNA与所述转录物的结合：(i)至少部分发生在所述转录物的5'非翻译区或3'非翻译区内；或(ii)发生在起始密码子或5'帽子内或其附近；(XIV)重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中所述单链RNA与所述转录物的结合：(A)抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制；或(B)抑制所述转录物的翻译；且其中所述单链RNA与所述转录物的结合抑制所述转录物的翻译，且所述杂交片段对所述RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性；(XV)调控靶基因表达的方法，包括在细胞内表达重组DNA构建体，所述构建体含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性；(XVI)调控靶基因表达的方法，包括在细胞内表达重组DNA构建体，所述构建体含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性；且其中所述单链RNA与所述转录物的结合：(A)抑制双链RNA介导的所述至少一个靶基因的抑制，从而增加所述靶基因的表达；或(B)抑制所述转录物的翻译，从而减少所述靶基因的表达；(XVII)含有重组DNA构建体的非天然植物染色体或质体，所述构建体含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含 有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性；(XVIII)在其基因组中含有重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞，所述构建体含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，或含有所述非天然转基因植物细胞的非天然转基因植物或非天然转基因植物种子或非天然转基因花粉粒；(XIX)非天然部分转基因植物，包含：(A)在其基因组中含有重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞，所述构建体含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，且所述非天然转基因植物还含有非转基因组织；或(B)含有在其基因组中包含重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞的转基因砧木，所述构建体含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，且所述转基因植物还含有非转基因接穗；(XX)可在植物细胞内转录的重组DNA构建体，含有在所述植物细胞中具有功能且和至少一个多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(A)编码切割阻断剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(B)编码5'修饰的切割阻断剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(C)编码翻译抑制剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(D)编码诱饵以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(E)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列， 其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(F)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的miRNA；(G)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的siRNA；和(H)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的siRNA；(XXI)可在植物细胞内转录的重组DNA构建体，含有在所述植物细胞中具有功能且和至少一个多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(A)编码切割阻断剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(B)编码5'修饰的切割阻断剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(C)编码翻译抑制剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(D)编码诱饵以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(E)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(F)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的miRNA；(G)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的siRNA；和(H)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的siRNA；且其中所述表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标是选自下组的至少一个：miR156靶标、miR160靶标、miR164靶标、miR166靶标、miR167靶标、miR169靶标、miR171靶标、miR172靶标、miR319靶标、miR395靶标、miR396靶标、miR398靶标、miR399靶标、miR408靶标、miR444靶标、miR528靶标、miR167g靶标、miR169g靶标、COP1(组成型光形态发生1)、GA2ox(赤霉酸2氧化酶)、GA20ox(赤霉酸20氧化酶)、HB2(同源盒2)、HB2-4(同源盒2和同源盒4)、HB4(同源盒4)、LG1(无叶舌1)、SPX(SYG1、PHO81和XPR1结构域；PFAM条目PF03105，在www.sanger.ac.uk)、VIM1a(甲基化变体1a)、DHS1(脱氧辅蛋白合酶)、DHS2(脱氧辅蛋白合酶)、DHS3(脱氧辅蛋白合酶)、DHS4(脱氧辅蛋白合酶)、DHS5(脱氧辅蛋白合酶)、DHS6(脱氧辅蛋白合酶)、DHS7(脱氧辅蛋白合酶)、DHS8(脱氧辅蛋白合酶)、CRF(玉米RING指；RNF169)、G1543a(拟南芥同源盒17的玉米直向同源物)、G1543b(拟南芥同源盒17的玉米直向同源物)、GS3(粒径3)和GW2(粒重2)；(XXII)可在植物细胞内转录的重组DNA构建体，含有在所述植物细胞中具有功能且和至少一个多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(A)编码切割阻断剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(B)编码5'修饰的切割阻断剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(C)编码翻译抑制剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(D)编码诱饵以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(E)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(F)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的miRNA；(G)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的siRNA；和(H)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的siRNA；且其中所述表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标是选自下组的至少一个：miR156靶标、miR160靶标、miR164靶标、miR166靶标、miR167靶标、miR169靶标、miR171靶标、miR172靶标、miR319靶标、miR395靶标、miR396靶标、miR398靶标、miR399靶标、miR408靶标、miR444靶标、miR528靶标、miR167g靶标、miR169g靶标、COP1(组成型光形态发生1)、GA2ox(赤霉酸2氧化酶)、GA20ox(赤霉酸20氧化酶)、HB2(同源盒2)、HB2-4(同源盒2和同源盒4)、HB4(同源盒4)、LG1(无叶舌1)、SPX(SYG1、PHO81和XPR1结构域；PFAM条目PF03105，在www.sanger.ac.uk)、VIM1a(甲基化变体1a)、DHS1(脱氧辅蛋白合酶)、DHS2(脱氧辅蛋白合酶)、DHS3(脱氧辅蛋白合酶)、DHS4(脱氧辅蛋白合酶)、DHS5(脱氧辅蛋白合酶)、DHS6(脱氧辅蛋白合酶)、DHS7(脱氧辅蛋白合酶)、DHS8(脱氧辅蛋白合酶)、CRF(玉米RING指；RNF169)、G1543a(拟南芥同源盒17的玉米直向同源物)、G1543b(拟南芥同源盒17的玉米直向同源物)、GS3(粒径3)和GW2(粒重2)；且其中所述至少一个多核苷酸是选自编码以下核苷酸序列的DNA中的至少一个：SEQ ID NO：1120、1121、1122、1248、1257、1313、1314、1364、1387、1478、1489、1490、1491、1492、1493、1585、1597、1598、1599、1713、1752、1753、1801、1802、1820、1927、1929、1931、1971、2006、2007、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2022、2023、2025、2027、2029、2031、2033、2035、2037、2039、2041、2043、2045、2047、2049、2051、2053、2055、2056、2057、2059、2060、2061、和2063；(XXIII)可在植物细胞内转录的重组DNA构建体，含有在所述植物细胞中具有功能且和至少一个多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(A)编码切割阻断剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(B)编码5'修饰的切割阻断剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(C)编码翻译抑制剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(D)编码诱饵以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(E)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(F)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的miRNA；(G)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的siRNA；和(H)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的siRNA；且其中所述重组DNA构建体稳定整合入所述植物细胞的质体或染色体中。
实施例
实施例1
该实施例说明了制备和使用“切割阻断剂”重组DNA构建体，所述构建体含有加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性；其中单链RNA与转录物的结合(以及杂交片段的最终形成)抑制双链RNA介导的靶基因的抑制。更具体地，该实施例描述了用于在植物中产生人工或基因工程miRNA或切割阻断剂的构建体，以及所述切割阻断剂抑制转化的植物细胞中拟南芥GL1基因的miRNA介导的抑制的用途。
靶基因：拟南芥GLABROUS1(GL1)基因是毛状体合成所需的；GL1突变体缺乏叶毛状体。GL1由以下DNA序列编码：ATGAGAATAAGGAGAAGAGATGAAAAAGAGAATCAAGAATACAAGAAAGGTTTATGGACAGTTGAAGAAGACAACATCCTTATGGACTATGTTCTTAATCATGGCACTGGCCAATGGAACCGCATCGTCAGAAAAACTGGGCTAAAGAGATGTGGGAAAAGTTGTAGACTGAGATGGATGAATTATTTGAGCCCTAATGTGAACAAAGGCAATTTCACTGAACAAGAAGAAGACCTCATTATTCGTCTCCACAAGCTCCTCGGCAATAGATGGTCTTTGATAGCTAAAAGAGTACCGGGAAGAACAGATAACCAAGTCAAGAACTACTGGAACACTCATCTCAGCAAAAAACTCGTCGGAGATTACTCCTCCGCCGTCAAAACCACCGGAGAAGACGACGACTCTCCACCGTCATTGTTCATCACTGCCGCCACACCTTCTTCTTGTCATCATCAACAAGAAAATATCTACGAGAATATAGCCAAGAGCTTTAACGGCGTCGTATCAGCTTCGTACGAGGATAAACCAAAACAAGAACTGGCTCAAAAAGATGTCCTAATGGCAACTACTAATGATCCAAGTCACTATTATGGCAATAACGCTTTAT GGGTTCATGACGACGATTTTGAGCTTAGTTCACTCGTAATGATGAATTTTGCTTCTGGTGATGTTGAGTACTGCCTTTAG(SEQ ID NO:1)，包含miRNA识别位点，其序列为CTCCACCGTCATTGTTCATCA(SEQ ID NO:2)，且其也由SEQ ID NO:1的核苷酸位置404到424的下划线部分表示。
微RNA：选择作为用于设计人工miRNA的支架(scaffold)或初始序列的是源自具有以下序列的大豆“miRMON1”前体的DNA：AATTCATTACATTGATAAAACACAATTCAAAAGATCAATGTTCCACTTCATGCAAAGACATTTCCAAAATATGTGTAGGTAGAGGGGTTTTACAGGATCGTCCTGAGACCAAATGAGCA GCTGACCACATGATGCAGCTATGTTTGCTATTCAGCTGCTCATCTGTTCTCAGGTCGCCCTTGTTGGACTGTCCAACTCCTACTGATTGCGGATGCACTTGCCACAAATGAAAATCAAAGCGAGGGGAAAAGAATGTAGAGTGTGACTACGATTGCATGCATGTGATTTAGGTAATTAAGTTACATGATTGTCTAATTGTGTTTATGGAATTGTATA(SEQ ID NO:3)，其中成熟miRNA(“miRMON1”)的核苷酸由SEQ ID NO:3的核苷酸位置104到124的下划线部分表示。预测编码的转录物具有图1A所示的折回结构，且其是具有以下序列的较长miRMON1前体的片段：AAAATTCATTACATTGATAAAACACAATTCAAAAGATCAATGTTCCACTTCATGCAAAGACATTTCCAAAATATGTGTAGGTAGAGGGGTTTTACAGGATCGTCCTGAGACCAAATGAGCAGCTGACCACATGATGCAGCTATGTTTGCTATTCAGCTGCTCATCTGTTCTCAGGTCGCCCTTGTTGGACTGTCCAACTCCTACTGATTGCGGATGCACTTGCCACAAATGAAAATCAAAGCGAGGGGAAAAGAATGTAGAGTGTGACTACGATTGCATGCATGTGATTTAGGTAATTAAGTTACATGATTGTCTAATTGTGTTTATGGAATTGTATATTTTCAGACCAGGCACCTGTAACTAATTATAGGTACCATACCTTAAAATAAGTCCAACTAAGTCCATGTCTGTGATTTTTTAGTGTCACAAATCACAATCCATTGCCATTGGTTTTTTAATTTTTCATTGTCTGTTGTTTAACTAACTCTAGCTTTTTAGCTGCTTCAAGTACAGATTCCTCAAAGTG GAAAATGTTCTTTGAAGTCAATAAAAAGAGCTTTGATGATCATCTGCATTGTCTAAGTTGGATAAACTAATTAGAGAGAACTTTTGAACTTTGTCTACCAAATATCTGTCAGTGTCATCTGTCAGTTCTGCAAGCTGAAGTGTTGAATCCACGAGGTGCTTGTTGCAAAGTTGTGATATTAAAAGACATCTACGAAGAAGTTCAAGCAAAACTCTTTTTGGC(SEQ ID NO:4)，其中成熟miRMON1的核苷酸由SEQ ID NO:4的核苷酸位置106到126的下划线部分表示；该较长miRMON1前体早先由以美国专利申请公布说明书2006/200878公布的美国专利申请11/303,745作为SEQ ID NO:38公开，该专利以引用方式特别合并于此。该较长前体(SEQ ID NO:4)也适于用作支架。
编码源自SEQ ID NO:3的基因工程“miRGL1”miRNA前体的DNA被设计用来制备基因工程miRGL1前体转录物，该转录物被加工成用于抑制拟南芥内源基因的人工“miRGL1”成熟miRNA，所述miRGL1前体具有以下序列：AATTCATTACATTGATAAAACACAATTCAAAAGATCAATGTTCCACTTCATGCAAAGACATTTCCAAAATATGTGTAGGTAGAGGGGTTTTACAGGATCGTCCTGATGAACAATGACGG TGGAGCCACATGATGCAGCTATGTTTGCTAT
Figure BDA0001164683680000531
GGTCGCCCTTGTTGGACTGTCCAACTCCTACTGATTGCGGATGCACTTGCCACAAATGAAAATCAAAGCGAGGGGAAAAGAATGTAGAGTGTGACTACGATTGCATGCATGTGATTTAGGTAATTAAGTTACATGATTGTCTAATTGTGTTTATGGAATTGTATA(SEQ ID NO:5)，其中成熟miRNA(“miRGL1”)的核苷酸由SEQ ID NO:5的核苷酸位置104到124的下划线部分表示，且名为miRNA*(“miRGL1*”)的对应相对链的核苷酸由SEQ ID NO:5的核苷酸位置151到171的斜体字部分表示。预测该miRGL1前体具有图1B所示的折回结构，并在植物中被加工成成熟miRGL1，其序列为(以5'到3'方向)TGATGAACAATGACGGTGGAG(SEQID NO:6，或者以3'到5'方向写为GAGGTGGCAGTAACAAGTAGT)。
切割阻断剂：编码源于SEQ ID NO:3的切割阻断剂(“miRGL1-CB”) 前体的DNA用于转录为基因工程化“切割阻断剂"型miRNA前体，该前体被加工成含有单链RNA的RNA，该单链RNA和靶基因GL1的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述GL1转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中单链RNA与转录物的结合(以及杂交片段的最终形成)抑制双链RNA介导的至少一个靶基因的抑制，其中该抑制由miRGL1介导。所述miRGL1-CB前体具有以下序列：AATTCATTACATTGATAAAACACAATTCAAAAGATCAATGTTCCACTTCATGCAAAGACATTTCCAAAATATGTGTAGGTAGAGGGGTTTTACAGGATCGTCCTGATGAACA
Figure BDA0001164683680000541
GACGGTGGAGCCACATGATGCAGCTATGTTTGCTATC
Figure BDA0001164683680000542
GGTCGCCCTTGTTGGACTGTCCAACTCCTACTGATTGCGGATGCACTTGCCACAAATGAAAATCAAAGCGAGGGGAAAAGAATGTAGAGTGTGACTACGATTGCATGCATGTGATTTAGGTAATTAAGTTACATGATTGTCTAATTGTGTTTATGGAATTGTATA(SEQ ID NO:7)，其中成熟切割阻断剂(“miRGL1-CB”)的核苷酸由SEQ ID NO:7的核苷酸位置104到124的下划线部分表示，对应的相对链miRNA*(“miRGL1-CB*”)的核苷酸由SEQ ID NO:7的核苷酸位置151到171的斜体字部分表示。SEQ ID NO:7的位置113和114的核苷酸由粗体下划线部分表示并对应于成熟miRGL1-CBl的位置10和11(以3'到5'方向)；选择这两个核苷酸，有意使其和GL1(SEQ IDNO:1)的miRNA识别位点(SEQ ID NO:2)的核苷酸错配，以阻止被RNA酶III核糖核酸酶切割。预测编码的miRGL1-CB RNA前体具有图1所示的折回结构并在植物中被加工成成熟miRGL1-CB，其具有序列(以5'到3'方向)TGATGAACATAGACGGTGGAG(SEQ ID NO:8，或者以3'到5'方向写成GAGGTGGCAGATACAAGTAGT)。图1E显示了GL1miRNA识别位点(SEQ ID NO:2)、以3'到5'方向的成熟miRGL1(SEQ ID NO:6)和以3'到5'方向的成熟miRGL1-CB(SEQ ID NO:8)的对比。
miRGL1感受器：编码具有序列TccagctgctcatttggtctcaTGATCACTGCGGCCGCAATACAgccatagatcacttgatg tcaC
Figure BDA0001164683680000552
ccaccgtcattgttcatcagatttctctctgcaagcg(SEQ ID NO:9)的“miRGL1-感受器”的DNA用于包括具有序列
Figure BDA0001164683680000553
CCACCGTCATTGTTCATCA(SEQ ID NO:10)的人工miRGL1识别位点，其也以SEQ ID NO:9的核苷酸位置67到87的下划线部分表示。SEQID NO:9的位置67和68的核苷酸(或SEQ ID NO:10的位置1和2的核苷酸)由粗体下划线部分表示并对应于成熟miRGL1的位置1和2(以3'到5'方向)；选择这两个核苷酸，有意使其和成熟miRGL(SEQ ID NO:6)的3'端的至少两个核苷酸错配，以阻止传递性。
构建用于土壤杆菌介导的转化的三种质粒：
(1)“35S/miRGL1/Term”—该质粒包括在5'到3'方向包含驱动(b)miRGL1前体(SEQID NO:5)表达的(a)35S启动子和(c)nos终止子的构建体；
(2)“35S/GFP/miRGL1-sensor/Term”—该质粒包括在5'到3'方向包含与(b)绿色荧光蛋白(GFP)编码序列操作性相连的(a)35S启动子、(c)miRGL1-感受器序列(SEQ ID NO:9)和(d)nos终止子的构建体；
(3)“35S/miRGL1-CB”—该质粒包括在5'到3'方向包含驱动(b)miRGL1-CB前体(SEQ ID NO:7)表达的(a)35S启动子的构建体。
本发明的一个方面使用描述于
Figure BDA0001164683680000551
等(2005)Plant Mol.Biol.,59:647-661)的方法证明。使用含有这些质粒的不同组合的土壤杆菌，以及必要时使用“填充剂”(无效质粒)土壤杆菌瞬时转化本氏烟草(Nicotiana benthamiana)植物，来确保土壤杆菌的等量渗透。
用质粒(2)转化的本氏烟草植物当在紫外线下观察时显现GFP(绿色)荧光。在用质粒(1)和(2)转化的植物中，在紫外线下观察时，GFP荧光仅被叶绿素(红色)荧光消除，说明成熟miRGL1微RNA抑制GFP的表达。在用质粒(1)、(2)和(3)转化的植物中，GFP荧光恢复，说明miRGL1-CB切割阻断剂通过阻止miRGL1识别位点被成熟miRGL1切割来抑制双链RNA介导(即mRGL1介导)的靶基因GFP的抑制，从而相对于不存在切割阻断剂时的表达增加靶基因GFP的表达(荧光)。
在本发明的另一个证明中，稳定转化的拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物通过用表达miRGL1前体(SEQ ID NO:5)的质粒进行土壤杆菌介导 的转化而产生，所述前体在植物中加工成用于抑制拟南芥内源基因GL1的“miRGL1”成熟miRNA。所得的转化的拟南芥植物显示没有毛状体的叶，说明抑制了靶基因GLABROUS1。用表达miRGL1-CB前体(SEQ IDNO:7)的质粒进一步转化并使用卡那霉素抗性选择miRGL1DNA纯合的拟南芥植物。在这些双转化体植物中，成熟切割阻断剂miRGL1-CB(以3'到5'方向，SEQ ID NO:8)在植物中的表达通过阻止miRGL1识别位点被成熟miRGL1切割来抑制双链RNA介导(即mRGL1-介导)的靶基因GLABROUS1(GL1)的抑制，从而恢复毛状体产生(说明相对于不存在切割阻断剂时的表达，增加了靶基因GL1的表达)。
实施例2
该实施例说明替代的“切割阻断剂”重组DNA构建体，其在对应于天然结合至靶基因识别位点的成熟miRNA的5'端的位置具有修饰，即在植物中通过转基因法生成的“5'-修饰的切割阻断剂”，以及使用该切割阻断剂来抑制miRNA介导的靶基因在转化的植物细胞中的抑制的方法。
在一个例子中，编码人工miRNA(miRGL1)前体(SEQ ID NO:6)的DNA通过单一核苷酸变化来修饰(将成熟miRGL1的5'端从U变到C)，从而产生5'-修饰的切割阻断剂前体序列AATTCATTACATTGATAAAACACAATTCAAAAGATCAATGTTCCACTTCATGCAAAGACATTTCCAAAATATGTGTAGGTAGAGGGGTTTTACAGGATCGTCCCGATGAACAATGACGGTGGAGCCACATGATGCAGCTATGTTTGCTAT
Figure BDA0001164683680000561
GGTCGCCCTTGTTGGACTGTCCAACTCCTACTGATTGCGGATGCACTTGCCACAAATGAAAATCAAAGCGAGGGGAAAAGAATGTAGAGTGTGACTACGATTGCATGCATGTGATTTAGGTAATTAAGTTACATGATTGTCTAATTGTGTTTATGGAATTGTATA(SEQ ID NO:11)，其中成熟的5'-修饰的切割阻断剂的核苷酸由SEQ ID NO:11的核苷酸位置104到124的下划线部分表示(作为对比，对应于SEQ ID NO:6的miRGL1*核苷酸的SEQ ID NO:11的核苷酸由SEQ ID NO:11的核苷酸 位置151到171的斜体字部分表示)。预测该5'-修饰的切割阻断剂RNA前体具有如图1D所示的折回结构并在植物中加工成成熟5'-修饰的切割阻断剂，其(在5'到3'方向)的序列为CGATGAACAATGACGGTGGAG(SEQ ID NO:12，或者以3'到5'方向写成GAGGTGGCAGTAACAAGTAGC)。使用类似于实施例2描述的方法瞬时转染本氏烟草。出乎意料地，观察到由该5'-修饰的切割阻断剂RNA前体加工所得的成熟小RNA作为切割阻断剂，抑制miRGL1-介导的靶基因GFP的抑制。
制备miRGL1-CB前体(SEQ ID NO:7)的两个5'-修饰的变体，其中对应于成熟miRGL1-CB的5'端的位置分别从T变化为A或从T变化为C，但保持对应于成熟miRGL1的位置10或11(以3'到5'方向)的错配。预测这两个变体都具有类似于图1A到1D所示的折回结构(未显示)。“5'-A变体”具有以下核苷酸序列AATTCATTACATTGATAAAACACAATTCAAAAGATCAATGTTCCACTTCATGCAAAGACATTTCCAAAATATGTGTAGGTAGAGGGGTTTTACAGGATCGTCCAGATGAACATAG ACGGTGGAGCCACATGATGCAGCTATGTTTGCTAT
Figure BDA0001164683680000571
GGTCGCCCTTGTTGGACTGTCCAACTCCTACTGATTGCGGATGCACTTGCCACAAATGAAAATCAAAGCGAGGGGAAAAGAATGTAGAGTGTGACTACGATTGCATGCATGTGATTTAGGTAATTAAGTTACATGATTGTCTAATTGTGTTTATGGAATTGTATA(SEQ ID NO:13)，且“5'-C变体”具有以下核苷酸序列AATTCATTACATTGATAAAACACAATTCAAAAGATCAATGTTCCACTTCATGCAAAGACATTTCCAAAATATGTGTAGGTAGAGGGGTTTTACAGGATCGTCCCGATGAACATAGACGGTGGAGCCACATGATGCAGCTATGTTTGCTAT
Figure BDA0001164683680000572
GGTCGCCCTTGTTGGACTGTCCAACTCCTACTGATTGCGGATGCACTTGCCACAAATGAAAATCAAAGCGAGGGGAAAAGAATGTAGAGTGTGACTACGATTGCATGCATGTGATTTAGGTAATTAAGTTACATGATTGTCTAATTGTGTTTATGGAATTGTATA(SEQ ID NO:14)，其 中成熟切割阻断剂的核苷酸由SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的核苷酸位置104到124的下划线部分表示(作为对比，对应于SEQ ID NO:6的miRGL1*核苷酸的SEQ ID NO:13或者SEQ ID NO:14的核苷酸由SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的核苷酸位置151到171的斜体字部分表示)。
“5'-C变体”(SEQ ID NO:14)瞬时转染入本氏烟草(使用类似于实施例2的方法)；“5'-C”变体和35S/miRGL1-sensor/Term(无miRGL1)的共同接种引起GFP荧光，说明“5'-C变体”不能切割miRGL1识别位点且不具有miRNA样活性。
利用本氏烟草的瞬时转染(类似于实施例2描述的实验)检测“5'-A变体”(SEQ IDNO:13)(质粒pMON115363)和“5'-C变体”(SEQ ID NO:14)(质粒pMON115349)两者，也发现它们抑制miRGL1-介导的靶基因GFP的抑制，虽然程度不如原始切割阻断剂miRGL1-CB(SEQ IDNO:7)那么大。
以上实施例作为制备和使用用于抑制miRNA介导的靶基因抑制的切割阻断剂(或5'-修饰的切割阻断剂)的指导。本领域技术人员了解，不需要靶基因本身的信息，仅需要成熟miRNA序列或者加工成成熟miRNA的miRNA前体序列(或者，miRNA识别位点序列信息)，与本申请的教导结合，就可以设计抑制给定miRNA的靶基因沉默效应的切割阻断剂(或5'-修饰的切割阻断剂)。
因此，本申请还提供并要求保护用于已经向公众公开的所有miRNA序列的新颖的切割阻断剂和5'-修饰的切割阻断剂，所述miRNA序列包括但不限于：可得自miRBase(microrna.sanger.ac.uk)的miRNA，以及公开于美国专利申请11/303,745(以美国专利申请公布说明书2006/0200878公开)、11/974,469(以美国专利申请公布说明书2009-0070898A1公开)、11/868,081(以美国专利申请公布说明书2008/0115240公开)、10/884,374(以美国专利申请公布说明书2005/0144669公开)和10/490,955(美国专利7,232,806)的成熟miRNA和miRNA前体，这些包括各自序列表的专利申请公开以引用方式特别合并于此。
实施例3
本实施例提供鉴定为“已证实的miRNA靶标”(即含有已证实的miRNA识别位点)的靶基因的实施方式。本发明的重组DNA构建体可用于调控这种靶基因的表达并可用于制备具有提高的产量或其他需要性状的非天然转基因植物细胞、植物组织和植物(特别是非天然转基因作物)。
使用本领域已知的方法，例如Zhang(2005)Nucleic Acids Res.,33:W701-704和Rhoades等(2002)Cell,110:513-520描述的序列互补性法则来完成识别位点的预测。经实验证实预测的miRNA识别位点的一种方法是被称为RNA连接酶介导的cDNA 5'端快速扩增(“5'RLM-RACE”或者“5'RACE”)的技术，其鉴定miRNA切割模式；参见例如Kasschau等(2003)Dev.Cell,4:205-217和Llave等(2002)Science,297:2053-2056。该方法依赖于RNA衔接分子与切割位点5'端的连接并依赖于包括Ago1的RNA酶III酶留下的5'磷酸。对所得的PCR产物进行测序，与预测的在相对于miRNA 5'端的核苷酸10和11之间的miRNA切割位点比对的克隆的相对数量提供对miRNA活性的估计值。
尽管用于证实预测的miRNA靶标的标准是对预测切割的试验证实，但是计算证实对于提供一组可操作或应用尺寸的潜在靶基因而言也非常有用。至少能使用两种基于miRNA和预测的miRNA靶标的同源性的计算证实方法。一种方法将预测的靶标与实验证实的靶标进行比较；如果该预测靶标和实验证实的靶标同源，则经计算证实该预测靶标。预期该方法能鉴定高置信度地miRNA靶标并由于可使用更多实验证实靶标而变得越来越重要。第二种方法比较来自两种物种的序列(当没有已知的miRNA靶标信息可以获得时)。如果miRNA和预测的miRNA靶标都保存在两种物种中，则两种物种中预测的靶标视为被证实。
在该实施例中，使用第一种方法，其中对预测的miRNA靶标的计算证实基于预测的靶标和已知靶标的同源性。通过挖掘关于以下植物的miRNA靶标的文献来创建经实验证实的植物miRNA靶基因的列表：水稻(Sunkar等(2005)Plant Cell,17:1397-1411；Luo等(2006)FEBS Lett.,580:5111-5116)；苔藓(Physcomitrella patens)(Axtell等(2007)Plant Cell, 19:1750-1769；Fattash等(2007)BMC Plant Biol.,7:13)；杨树(Lu等(2005)Plant Cell,17:2186-2203)；绿藻(Molnár等(2007)Nature,447:1126-1130)；以及玉米(Lauter等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,102:9412-9417)。在该列表中加入来自公众可得到的拟南芥小RNA计划(Arabidopsis Small RNA Project)(可在线得自以下网址：asrp.cgrb.oregonstate.edu/db/microRNAfamily.html)的203拟南芥基因座。由该列表编辑了来自可用的功能注释的基因功能关键词“字典”，包括已知的关键词变体(表1)。
检索给定的预测miRNA靶标的任何功能注释以和字典的关键词匹配。发展计算算法以首先和最长关键词匹配，然后和第二长关键词匹配，诸如此类，以减少关键词匹配的假阳性。当找到一个匹配时，预测的靶标视为被证实。该方法应用于已经从各种植物种的特性序列资料库中预测的miRNA靶标；由此鉴定的经计算证实的miRNA靶标列于表2。
证实的miRNA靶标的鉴定允许给定miRNA和其靶基因(含有证实的miRNA识别位点的天然基因或者转基因)之间的相互作用的操作。例如，预计含有证实的miRNA靶标(证实的miRNA识别位点)的靶基因的过量表达会降低生化网络或包括miRNA的网络中的特定miRNA的效果。
或者，包含相同miRNA靶标序列(或经修饰以防止被RNA酶II核糖核酸酶切割的序列)的人工转录物可被用作miRNA“诱饵”(如以美国专利申请公布说明书2009-0070898A1公开的共同转让的美国专利申请11/974,469所描写，该公开以引用方式特别合并于此)，所述“诱饵”与内源靶基因竞争结合到特定miRNA，因此降低生化网络或包括miRNA的网络中的miRNA的效果(例如，靶基因的抑制和miRNA对在靶基因下游的其他基因的效果的降低)。此处公开的经证实的miRNA靶标的信息允许本领域技术人员将miRNA靶标序列用作支架，所述支架用于设计用作转基因miRNA诱饵以降低miRNA对其靶基因的效果的人工序列，或允许本领域技术人员鉴定与miRNA诱饵同样有用的内源序列。因此，本申请还提供并要求用于本文公开的已证实的miRNA靶标的miRNA诱饵，以及已经向公众公开的所有miRNA序列的miRNA诱饵，所述miRNA包括但不限于：可得自miRBase(microrna.sanger.ac.uk)的miRNA；以及美国专利申请11/303,745(以美国专利申请公布说明书2006/0200878公开)、11/974,469(以美国专利申请公布说明2009-0070898 A1公开)、11/868,081(以美国专利申请公布说明书2008/0115240公开)、10/884,374(以美国专利申请公布说明书2005/0144669公开)以及10/490,955(美国专利7,232,806)公开的成熟miRNA和miRNA前体，这些说明书以引用方式特别全部合并于此。
在又一个实施方式中，本发明还通过修饰转基因中已证实的miRNA识别位点的序列从而阻止被这些特定miRNA结合和/或切割而提供miRNA无应答的转基因。在一个例子中，由内源miRNA正常调节的基因表达的增加可通过表达编码miRNA-无应答转基因的重组DNA构建体而实现，所述miRNA-无应答转基因具有由基因的天然核苷酸序列衍生的核苷酸序列，但其中天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割。在另一个实施方式中，本发明提供通过增加已证实的miRNA识别位点以将转基因置于特定miRNA的控制下而修饰的转基因序列；该实施方式的变化中，通过在其基因组中引入转基因和调节该转基因的特定miRNA的外源前体来制备转基因植物。
表1：miRNA靶标关键词字典
Figure BDA0001164683680000611
Figure BDA0001164683680000621
Figure BDA0001164683680000631
Figure BDA0001164683680000641
Figure BDA0001164683680000651
表2：经计算证实的miRNA靶标
Figure BDA0001164683680000652
Figure BDA0001164683680000661
Figure BDA0001164683680000671
Figure BDA0001164683680000681
Figure BDA0001164683680000691
Figure BDA0001164683680000701
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Figure BDA0001164683680000771
Figure BDA0001164683680000781
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Figure BDA0001164683680000851
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Figure BDA0001164683680000871
Figure BDA0001164683680000881
实施例4
该实施例提供鉴定为“已证实的miRNA靶标”(即含有已证实的miRNA识别位点)的靶基因的其他实施方式以及已证实的miRNA识别位点的代表性用途，例如，用于设计用于制备重组DNA构建体的人工序列，包括但不限于，本申请人教导并要求保护的添加有外源miRNA识别位点的转基因、修饰或去除天然miRNA识别位点的转基因、诱饵、切割阻断剂或翻译抑制剂。本发明的重组DNA构建体可用于调控这种靶基因的表达，并用于制备含有提高的产量或其他所需性状的非天然转基因植物细胞、植物组织和植物(特别是非天然转基因作物)。
表3提供含有miRNA识别位点的miRNA和miRNA靶标列表，其中使用类似于实施例2描述的技术在多种植物中鉴定该miRNA识别位点。该miRNA靶标用基因名称、蛋白结构域、功能、位置确认，或者简单地确认为含有miRNA识别位点的基因；该信息足以设计含有miRNA-无应答转基因、切割阻断剂、5'-修饰的切割阻断剂、翻译抑制剂和miRNA诱饵的人工序列。表3还提供miRNA前体(用于加工成天 然成熟miRNA)以及含有用于加工成合成的成熟miRNA、miRNA诱饵、miRNA-无应答转基因和miRNA切割阻断剂的miRNA前体的人工序列列表，所有这些尤其用于制备本发明的重组DNA构建体。在本申请的教导并提供靶基因中miRNA或miRNA识别位点的核苷酸序列的情况下，本领域技术人员能够容易地设计这样的人工序列。本领域技术人员也将认识到，不需要靶基因本身的信息，仅将成熟miRNA序列的序列或加工为成熟miRNA的miRNA前体序列(或者，miRNA识别位点序列的信息)与本申请的教导结合，就可以设计用于抑制给定miRNA的靶基因沉默效应的切割阻断剂(5’-修饰的切割阻断剂)。表3还提供重组DNA构建体的实例，当所述构建体在作物(优选但不限于玉米或玉蜀黍、大豆、油菜、棉花、苜蓿、甘蔗、甜菜、高粱和水稻)中转基因表达时，与不表达所述构建体的作物相比，作物的产量得到提高。用于制备转基因植物的技术在标题为“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”部分下描述。“提高的产量”可以是原有产量增加；在其他实施方式中，提高的产量是与缺乏本发明重组DNA构建体表达的作物相比，在特定生长条件例如非生物或生物应激条件(例如热或冷应激、干旱应激或营养物应激)下的产量增加。
在拥有以上有关miRNA靶标的信息的情况下，本领域技术人员能够制备和使用本发明各方面的多个额外的实施方式，包括可在植物细胞中转录的重组DNA构建体，其包含在植物细胞中具有功能并与至少一种多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自：(a)编码切割阻断剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'修饰的切割阻断剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修 饰，以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的siRNA；和(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的siRNA。特别要求保护的是重组DNA构建体稳定整合到植物细胞的质体或染色体中的实施方式。还特别要求保护的是提高植物产量的方法，其中所述重组DNA构建体在作物(优选但不限于玉米或玉蜀黍、大豆、油菜、棉花、苜蓿、甘蔗、甜菜、高粱和水稻)中转基因表达，与所述构建体不在其中表达的作物相比，作物的产量得到提高。
本发明范围内的实施方式包括可在植物细胞中转录的重组DNA构建体，其包含在植物细胞中具有功能并与至少一种多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自：(a)编码切割阻断剂以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA-无应答转基因的DNA，所述转基因具有由至少一个miRNA靶标的天然核苷酸序列衍生的核苷酸序列，其中除去或修饰天然核苷酸序列中的miRNA识别位点以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制至少一个miRNA靶标表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制至少一个miRNA靶标表达的siRNA；以及(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成抑制至少一个miRNA靶标表达的siRNA—其中所述至少一个miRNA靶标是选自下组的至少一个：miR156靶标、miR160靶标、miR164靶标、miR166靶标、miR167靶标、miR169靶标、miR171靶标、miR172靶标、miR319靶标、miR395靶标、miR396靶标、miR398靶标、miR399靶标、miR408靶标、miR444靶标、miR528靶标、miR167g靶标、miR169g靶标、COP1(组成型光形态发生1)、GA2ox(赤霉酸2氧化酶)、GA20ox(赤霉酸20氧化酶)、HB2(同源盒2)、HB2-4(同源盒2和同源盒4)、HB4(同源盒4)、LG1(无叶舌1)、SPX(SYG1、PHO81和XPR1结构域；PFAM条目PF03105，在www.sanger.ac.uk)、VIM1a(甲基化变体1a)、DHS1(脱氧辅蛋白合酶)、DHS2(脱氧辅蛋白合酶)、DHS3(脱氧辅蛋白合酶)、DHS4(脱氧辅蛋白合酶)、DHS5(脱氧辅蛋白合酶)、DHS6(脱氧辅蛋白合酶)、DHS7(脱氧辅蛋白合酶)、DHS8(脱氧辅蛋白合酶)、CRF(玉米RING指；RNF169)、G1543a(拟南芥同源盒17的玉米直向同源物)、G1543b(拟南芥同源盒17的玉米直向同源物)、GS3(粒径3)和GW2(粒重2)。本发明特别要求保护的具体实施方式包括可在植物细胞中转录的重组DNA构建体，其包含在植物细胞中具有功能并与至少一种多核苷酸操作性连接的启动子，其中所述至少一个多核苷酸选自编码以下核苷酸序列的DNA：SEQ ID NO：1120、1121、1122、1248、1257、1313、1314、1364、1387、1478、1489、1490、1491、1492、1493、1585、1597、1598、1599、1713、1752、1753、1801、1802、1820、1927、1929、1931、1971、2006、2007、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2022、2023、2025、2027、2029、2031、2033、2035、2037、2039、2041、2043、2045、2047、2049、2051、2053、2055、2056、2057、2059、2060、2061、和2063；特别要求保护的是重组DNA构建体稳定整合到植物细胞的质体或染色体中的实施方式。
其他实施方式是提高植物产量的方法，其中可在植物细胞中转录的重组DNA构建体在作物(优选但不限于玉米或玉蜀黍、大豆、油菜、棉花、苜蓿、甘蔗、甜菜、高粱和水稻)中转基因表达，与所述构建体不在其中表达的作物相比，作物的产量得到提高，所述重组DNA构建体包含在植物细胞中具有功能并与至少一种多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自：(a)编码切割阻断剂以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA-无应 答转基因的DNA，所述转基因具有由至少一个miRNA靶标的天然核苷酸序列衍生的核苷酸序列，其中除去或修饰天然核苷酸序列中的miRNA识别位点以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制至少一个miRNA靶标表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制至少一个miRNA靶标表达的siRNA；以及(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成抑制至少一个miRNA靶标表达的siRNA—其中所述至少一个miRNA靶标是选自下组的至少一个：miR156靶标、miR160靶标、miR164靶标、miR166靶标、miR167靶标、miR169靶标、miR171靶标、miR172靶标、miR319靶标、miR395靶标、miR396靶标、miR398靶标、miR399靶标、miR408靶标、miR444靶标、miR528靶标、miR167g靶标、miR169g靶标、COP1(组成型光形态发生1)、GA2ox(赤霉酸2氧化酶)、GA20ox(赤霉酸20氧化酶)、HB2(同源盒2)、HB2-4(同源盒2和同源盒4)、HB4(同源盒4)、LG1(叶舌1)、SPX(SYG1、PHO81和XPR1结构域；PFAM条目PF03105，在www.sanger.ac.uk)、VIM1a(甲基化变体1a)、DHS1(脱氧辅蛋白合酶)、DHS2(脱氧辅蛋白合酶)、DHS3(脱氧辅蛋白合酶)、DHS4(脱氧辅蛋白合酶)、DHS5(脱氧辅蛋白合酶)、DHS6(脱氧辅蛋白合酶)、DHS7(脱氧辅蛋白合酶)、DHS8(脱氧辅蛋白合酶)、CRF(玉米RING指；RNF169)、G1543a(拟南芥同源盒17的玉米直向同源物)、G1543b(拟南芥同源盒17的玉米直向同源物)、GS3(粒径3)和GW2(粒重2)。特别要求保护的是提高植物产量的方法，其中可在植物细胞中转录的重组DNA构建体包含在植物细胞中具有功能并与至少一种多核苷酸操作性连接的启动子，其中所述至少一个多核苷酸选自编码以下核苷酸序列的DNA：SEQ ID NO：1120、1121、1122、1248、1257、1313、1314、1364、1387、1478、1489、1490、1491、1492、1493、1585、1597、1598、1599、1713、1752、1753、1801、1802、1820、1927、1929、1931、1971、2006、2007、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2022、2023、2025、2027、2029、2031、2033、2035、2037、2039、2041、2043、2045、2047、2049、2051、2053、2055、2056、2057、2059、2060、2061、和2063，所述重组DNA构建体在作物(优选但不限于玉米或玉蜀黍、大豆、 油菜、棉花、苜蓿、甘蔗、甜菜、高粱和水稻)中转基因表达，与所述构建体不在其中表达的作物相比，作物的产量得到提高。
本发明的其他方面包括含有稳定整合的可在非天然转基因植物细胞中转录的重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞，其中所述重组DNA构建体包含在非天然转基因植物细胞中具有功能并与至少一种多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自编码表2或3鉴定的至少一种miRNA靶标的DNA；该重组DNA构建体可稳定整合到植物细胞的质体、染色体或基因组。实施方式包括含有稳定整合的可在非天然转基因植物细胞中转录的重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞，其中所述重组DNA构建体包含在非天然转基因植物细胞中具有功能并与至少一种多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸包括选自SEQIDNO:15–2064的DNA序列。
表3
Figure BDA0001164683680000931
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*特别优选的作物是玉米、大豆、油菜、棉花、苜蓿、甘蔗、甜菜、高粱和水稻。
实施例5
该实施例说明与转基因植物细胞和转基因植物有关的本发明的各种方面。更具体地，该实施例说明用于不同作物的转化载体和技术，用于提供在其基因组中含有本发明重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞、植物和种子，所述构建体可在植物细胞中转录，含有在植物细胞中具有功能并与至少一种本文公开的多核苷酸操作性连接的启动子，包括：(1)可在植物细胞中转录的重组DNA构建体，含有在植物细胞中具有功能并与至少一种本文公开的多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(a)编码切割阻断剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位 点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的siRNA；和(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的表达的siRNA；(2)可在植物细胞中转录的重组DNA构建体，含有在植物细胞中具有功能并与至少一种多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(a)编码切割阻断剂以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少至少一个miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于至少一个miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制至少一个miRNA靶标的表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制至少一个miRNA靶标的表达的siRNA；和(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制至少一个miRNA靶标的表达的siRNA—其中所述至少一个miRNA靶标是选自下组的至少一个：miR156靶标、miR160靶标、miR164靶标、miR166靶标、miR167靶标、miR169靶标、miR171靶标、miR172靶标、miR319靶标、miR395靶标、miR396靶标、miR398靶标、miR399靶标、miR408靶标、miR444靶标、miR528靶标、miR167g靶标、miR169g靶标、COP1(组成型光形态发生1)、GA2ox(赤霉酸2氧化酶)、GA20ox(赤霉酸20氧化酶)、HB2(同源盒2)、HB2-4(同源盒2和同源盒4)、HB4(同源盒4)、LG1(无叶舌1)、SPX(SYG1、PHO81和XPR1结构域；PFAM条目PF03105，在www.sanger.ac.uk)、VIM1a(甲基化变体1a)、DHS1(脱氧辅蛋白合酶)、DHS2(脱氧辅蛋白合酶)、DHS3(脱氧辅蛋白合酶)、DHS4(脱氧辅蛋白合酶)、DHS5(脱氧 辅蛋白合酶)、DHS6(脱氧辅蛋白合酶)、DHS7(脱氧辅蛋白合酶)、DHS8(脱氧辅蛋白合酶)、CRF(玉米RING指；RNF169)、G1543a(拟南芥同源盒17的玉米直向同源物)、G1543b(拟南芥同源盒17的玉米直向同源物)、GS3(粒径3)和GW2(粒重2)；(3)可在植物细胞中转录的重组DNA构建体，含有在植物细胞中具有功能并与至少一种多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自编码以下核苷酸序列的DNA：SEQ IDNO：1120、1121、1122、1248、1257、1313、1314、1364、1387、1478、1489、1490、1491、1492、1493、1585、1597、1598、1599、1713、1752、1753、1801、1802、1820、1927、1929、1931、1971、2006、2007、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2022、2023、2025、2027、2029、2031、2033、2035、2037、2039、2041、2043、2045、2047、2049、2051、2053、2055、2056、2057、2059、2060、2061、和2063；(4)可在植物细胞中转录的重组DNA构建体，含有在非天然转基因植物细胞中具有功能并与至少一种选自编码表2或3鉴定的至少一个miRNA靶标的DNA的多核苷酸操作性连接的启动子；以及(5)可在植物细胞中转录的重组DNA构建体，含有在非天然转基因植物细胞中具有功能并与至少一种含有选自SEQ ID NO:15–2064的DNA序列的多核苷酸操作性连接的启动子。很清楚，使用这些重组DNA载体在非天然转基因植物细胞、植物和种子中表达的多核苷酸可编码阻止或减少表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标(包括本段落鉴定的特定miRNA靶标)转录物的小RNA介导的切割的转录物，或者可编码抑制表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标(包括本段落鉴定的特定miRNA靶标)的表达的转录物，或者可编码编码表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标的转录物，或者编码选自SEQ ID NO:15-2064的DNA序列。
转化载体和方法
以下章节描述用于制备包含用于转化特定作物的本发明重组DNA构建体的转化载体的基础载体实例。所述重组DNA构建体可在植物细胞中转录并含有在植物细胞中具有功能并与至少一种多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸编码阻止或减少表2或3中鉴定的至少一 个miRNA靶标(包括本段落鉴定的特定miRNA靶标)转录物的小RNA介导的切割的转录物，或者编码抑制表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标(包括本段落鉴定的特定miRNA靶标)的表达的转录物，或者编码编码表2或3中鉴定的至少一个miRNA靶标的转录物，或者编码选自SEQ ID NO:15-2064的DNA序列。也提供利用包含本发明重组DNA构建体的这些载体来产生非天然转基因植物细胞、非天然转基因组织或者非天然转基因植物的作物特异性转化方法的详细实例。其他转化技术是本领域技术人员所熟知的，如“Compendium ofTransgenic Crop Plants”，由Chittaranjan Kole何Timothy C.Hall编著，BlackwellPublishing Ltd.,2008；ISBN 978-1-405-16924-0(可得自以下网址mrw.interscience.wiley.com/emrw/9781405181099/hpt/toc)所描述。这种转化方法可用于生产含有转化细胞核的非天然转基因植物细胞。随后由这种包含转化细胞核的非天然转基因植物细胞生产非天然转基因植物、种子和花粉，并筛选出加强的性状(例如，提高的产量、提高的水利用率、提高的耐寒性、提高的氮或磷酸盐利用率、提高的种子蛋白质含量或提高的种子油含量、或如标题“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”部分所公开的任何性状)。
玉米的转化
表4和图2所示的基础转化载体pMON93039(SEQ ID NO:2065)用于制备用于土壤杆菌介导的玉米细胞转化的重组DNA构建体。用于表达本发明各重组DNA构建体的转化载体通过将本发明多核苷酸在插入位点插入基础载体pMON93039(SEQ ID NO:2065)的目标基因表达盒中来构建，所述插入位点即在内含子元件(坐标1287-1766)和聚腺苷酸化元件(坐标1838-2780)之间。例如，用于表达miR399切割阻断剂的转化载体通过将SEQ ID NO:1802的DNA(见表3)在pMON93039(SEQ ID NO:2065)的内含子元件(坐标1287-1766)和聚腺苷酸化元件(坐标1838-2780)之间的插入位点处插入目标基因表达盒来构建。
对于土壤杆菌介导的玉米胚细胞转化，使可转化系的玉米植物在温室中生长，当胚的长度为1.5到2.0mm时收获穗。通过用80％乙醇喷雾 穗或将穗浸泡在80％乙醇，然后风干来消毒穗表面。将未成熟胚从经消毒的穗的单个谷粒中分离出来。在接种玉米细胞之前，使各含有用于表达本发明各重组DNA构建体的转化载体的土壤杆菌培养物在室温下生长过夜。未成熟玉米胚细胞在切除后与土壤杆菌一起接种，在室温下与土壤杆菌一起培养5到20分钟，然后在23摄氏度在黑暗中与土壤杆菌共培养1到3天。将共培养的胚转移至选择性培养基，培养大约两周，以使胚性愈伤组织发育。将胚性愈伤组织转移至含有100mg/L巴龙霉素的培养基中，间隔大约两个星期进行传代培养。开始选择后6到8周，回收转化的植物细胞的多个事件。
对于由转化和选择获得的多个转基因事件中的每一个，由转基因植物细胞愈伤组织再生出转基因玉米植物。将各事件的转基因植物细胞的愈伤组织置于培养基中，以启动芽和根发育成幼苗，将幼苗转移至盆栽土壤使其在26摄氏度的生长室中初始生长，然后在雾台上生长，然后移植到盆中，在盆中植物生长成熟。使再生的植物自体受精。收获第一代(“R1”)种子。该种子或由种子生长成的植物用于选择种子、幼苗、后代第二代(“R2”)转基因植物或杂种，例如，通过选择与对照植物(缺乏重组DNA构建体的表达的植物)相比具有改善的性状的转基因植物。
重复以上过程以生产用单独的本发明重组DNA构建体转化的转基因玉米植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在玉米植物细胞中转录的构建体，其含有在玉米植物细胞中具有功能并与各多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(a)编码切割阻断剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于表2或3鉴定的各miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体 的DNA，所述前体加工成用于抑制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的siRNA；和(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的siRNA。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因玉米植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在玉米植物细胞中转录的构建体，其含有在玉米植物细胞中具有功能并与多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(a)编码切割阻断剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制miRNA靶标的表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制miRNA靶标的表达的siRNA；和(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制miRNA靶标的表达的siRNA—其中制备分离的构建体用于表5所列的各miRNA靶标。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因玉米植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在玉米植物细胞中转录的构建体，其含有在玉米植物细胞中具有功能并与表6所提供的各多核苷酸操作性连接的启动子，其中制备分离的构建体用于各多核苷酸。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因玉米植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在玉米植物细胞中转录的构建体，其含有在植物细胞中具有功能并与选自编码表2和3鉴定的各miRNA靶标的DNA的多核苷酸操作性连接的启动子。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因玉米植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在玉米植物细胞中转录的构建体，其含有在植物细胞中具有功能并与SEQ ID NO:15–2064的各个多核苷酸操作性连接的启动子。
针对与对照植物或种子(缺乏重组DNA构建体表达的植物或种子)相比提高的性状(例如提高产量)，筛选由再生有转基因玉米植物产生的再生转基因玉米植物或后代转基因玉米植物或玉米种子。从带有本发明特定重组构建体的转基因玉米植物的各组多个事件中鉴定产生最大提高性状(例如最大的产量提高)的事件，并选择后代玉米种子用于商业性发展。
表4
Figure BDA0001164683680001351
表5：miRNA靶标
Figure BDA0001164683680001361
表6：本发明构建体表达的多核苷酸
Figure BDA0001164683680001362
大豆的转化
表7和图3所示的基础转化载体pMON82053(SEQ ID NO:2066)用于制备用于土壤杆菌介导的大豆细胞或组织转化的本发明的重组DNA构建体。为了构建用于表达任何本发明重组DNA构建体的转化载体，将编码至少一个多核苷酸的核苷酸在插入位点插入基础载体pMON82053(SEQ ID NO:2066)中的目标基因表达盒中，所述插入位点即在启动子元件(坐标1-163)和聚腺苷酸化元件(坐标688-1002)之间。例如，用于表达miR399切割阻断剂的转化载体通过将SEQ ID NO:1802的DNA(见表3)在pMON82053(SEQ ID NO:2066)的启动子元件(坐标1-163)和聚腺苷酸化元件(坐标688-1002)之间的插入位点处插入目标基因表达盒来制备。
对于土壤杆菌介导的转化，将大豆种子放置过夜，切下分生组织外植体并放入创伤容器中。各自含有用于表达本发明各重组DNA构建体的转化载体的诱导的土壤杆菌细胞的培养物和制得的外植体混合。用超 声波处理对接种的外植体造成创伤，共培养2-5天，然后转移至选择性培养基6-8周，使转基因芽选择并生长。在约6-8周收获具有抗性的芽，在选择性生根培养基中放置2-3周。将生根的芽转移至温室并盆栽在土壤中。
重复以上过程以生产用分离的本发明重组DNA构建体转化的转基因大豆植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在大豆植物细胞中转录的构建体，其含有在大豆植物细胞中具有功能并与各多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(a)编码切割阻断剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于表2和3鉴定的各miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的siRNA；和(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的siRNA。
重复以上过程以生产用以下各本发明重组DNA构建体转化的转基因大豆植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在大豆植物细胞中转录的构建体，其含有在大豆植物细胞中具有功能并与多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(a)编码切割阻断剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制miRNA靶标的表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制miRNA靶标的表达的siRNA；和(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制miRNA靶标的表达的siRNA—其中制备分离的构建体用于表5所列的各miRNA靶标。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因大豆植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在大豆植物细胞中转录的构建体，其含有在大豆植物细胞中具有功能并与表6所提供的各多核苷酸操作性连接的启动子，其中制备分离的构建体用于各多核苷酸。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因大豆植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在大豆植物细胞中转录的构建体，其含有在植物细胞中具有功能并与选自编码表2和3鉴定的各miRNA靶标的DNA的多核苷酸操作性连接的启动子。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因大豆植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在大豆植物细胞中转录的构建体，其含有在植物细胞中具有功能并与SEQ ID NO:15–2064的各个多核苷酸操作性连接的启动子。
针对与对照植物或种子(缺乏重组DNA构建体表达的植物或种子)相比提高的性状(例如提高的产量)，筛选由再生的转基因大豆植物产生的再生转基因大豆植物或后代转基因大豆植物或大豆种子。从带有本发明特定重组构建体的转基因大豆植物的各组多个事件中鉴定产生最大提高性状(例如最大的产量提高)的事件，并选择后代大豆种子用于商业性发展。
油菜的转化
表7和图3所示的基础转化载体pMON82053(SEQ ID NO:2066)用 于制备用于土壤杆菌介导的油菜细胞或组织转化的本发明的重组DNA构建体。为了构建用于表达任何本发明重组DNA构建体的转化载体，将编码至少一个多核苷酸的核苷酸在插入位点插入基础载体pMON82053(SEQ ID NO:2066)的目标基因表达盒中，所述插入位点即在启动子元件(坐标1-163)和聚腺苷酸化元件(坐标688-1002)之间。例如，用于表达miR399切割阻断剂的转化载体通过将SEQ ID NO:1802的DNA(见表3)在pMON82053(SEQ ID NO:2066)的启动子元件(坐标1-163)和聚腺苷酸化元件(坐标688-1002)之间的插入位点处插入目标基因表达盒来制备。
各自含有用于表达本发明各重组DNA构建体的转化载体的土壤杆菌细胞的过夜生长培养物用于接种来自体外生长的油菜幼苗的组织。与土壤杆菌共培养后，使受感染组织选择性生长，以促进转基因芽的生长，然后从转基因芽生长出根，将选定的幼苗盆栽在土壤，并将盆栽植物转移入温室。进行分子表征以证实本发明重组DNA构建体的存在及其在转基因植物中的表达。
重复以上过程以生产用分离的本发明重组DNA构建体转化的转基因油菜植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在油菜植物细胞中转录的构建体，其含有在油菜植物细胞中具有功能并与各多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(a)编码切割阻断剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于表2和3鉴定的各miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑 制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的siRNA；和(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的siRNA。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因油菜植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在油菜植物细胞中转录的构建体，其含有在油菜植物细胞中具有功能并与多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(a)编码切割阻断剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制miRNA靶标的表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制miRNA靶标的表达的siRNA；和(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制miRNA靶标的表达的siRNA—其中制备分离的构建体用于表5所列的各miRNA靶标。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因油菜植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在油菜植物细胞中转录的构建体，其含有在油菜植物细胞中具有功能并与表6所提供的各多核苷酸操作性连接的启动子，其中制备分离的构建体用于各多核苷酸。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因油菜植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在油菜植物细胞中转录的构建体，其含有在植物细胞中具有功能并与选自编码表2和3鉴定的各miRNA靶标的DNA的多核苷酸操作性连接的启动子。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因油菜植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在油菜植物 细胞中转录的构建体，其含有在植物细胞中具有功能并与SEQ ID NO:15–2064的各个多核苷酸操作性连接的启动子。
针对与对照植物或种子(缺乏重组DNA构建体表达的植物或种子)相比提高的性状(例如提高的产量)，筛选由再生的转基因油菜植物产生的再生转基因油菜植物或后代转基因油菜植物或油菜种子。从带有本发明特定重组构建体的转基因油菜植物的各组多个事件中鉴定产生最大提高性状(例如最大的产量提高)的事件，并选择后代油菜种子用于商业性发展。
棉花的转化
表8和图4所示的基础转化载体pMON99053(SEQ ID NO:2067)用于制备用于土壤杆菌介导的棉花细胞或组织转化的本发明的重组DNA构建体。为了构建用于表达任何本发明重组DNA构建体的转化载体，将编码至少一个多核苷酸的核苷酸在插入位点插入基础载体pMON99053(SEQ ID NO:2067)的目标基因表达盒中，所述插入位点即在启动子元件(坐标388-1091)和聚腺苷酸化元件(坐标1165-1791)之间。
转化棉花的方法是本领域已知的，例如参见美国专利申请公布说明书2004/0087030A1、2008/0256667A1、2008/0280361A1和2009/0138985A1所描述的技术，这些文献以引用方式合并。棉花转化方法的一个例子中，可转化棉花基因型(例如，无花蜜、DP393、OOSO4、07W610F、STN474、Delta Pearl、DP5415、SureGrow501或SureGrow747)的种子被表面除菌、冲洗并在CSM培养基(包含羧苄青霉素、头孢噻肟、BRAVO和Captan50)中在黑暗中水合14到42小时。如美国专利申请公布说明书2008/0256667A1所述由种子加工分生组织外植体。利用超声波处理，用各自含有用于表达本发明各重组DNA构建体的转化载体的土壤杆菌细胞培养物来接种该外植体。除去接种物并将接种的外植体转移至INO培养基并使用16小时光周期培养2到5天。共培养后，将外植体转移至半固体选择性培养基上(改良的Lloyd&McCown木本植物培养基，其补充有200mg/L头孢噻肟、200mg/L羧苄青霉素和100-200mg/L壮观霉素)，含有或不含植物生长调节剂或促进多芽形成和 生长的其他添加剂。外植体以16小时光周期培养。在选择性培养基上4到6周后，将那些长出绿芽的外植体转移到培养瓶并置于含有0.25mg/LIBA的液体培养基中，在塑料圆顶下生根发芽3-4周。用一种或多种分子测定法(例如PCR或DNA印迹法)测试组织的分子特征。
重复以上过程以生产用分离的本发明重组DNA构建体转化的转基因棉花植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在棉花植物细胞中转录的构建体，其含有在棉花植物细胞中具有功能并与各多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(a)编码切割阻断剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于表2和3鉴定的各miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的siRNA；和(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的siRNA。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因棉花植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在棉花植物细胞中转录的构建体，其含有在棉花植物细胞中具有功能并与多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(a)编码切割阻断剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制miRNA靶标的表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制miRNA靶标的表达的siRNA；和(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制miRNA靶标的表达的siRNA—其中制备分离的构建体用于表5所列的各miRNA靶标。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因棉花植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在棉花植物细胞中转录的构建体，其含有在棉花植物细胞中具有功能并与表6所提供的各多核苷酸操作性连接的启动子，其中制备分离的构建体用于各多核苷酸。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因棉花植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在棉花植物细胞中转录的构建体，其含有在植物细胞中具有功能并与选自编码表2和3鉴定的各miRNA靶标的DNA的多核苷酸操作性连接的启动子。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因棉花植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在棉花植物细胞中转录的构建体，其含有在植物细胞中具有功能并与SEQ ID NO:15–2064的各个多核苷酸操作性连接的启动子。
针对与对照植物或种子(缺乏重组DNA构建体表达的植物或种子)相比提高的性状(例如提高产量)，筛选由再生的转基因棉花植物产生的再生转基因棉花植物或后代转基因棉花植物或棉花种子。从带有本发明特定重组构建体的转基因棉花植物的各组多个事件中鉴定产生最大提高性状(例如最大的产量提高)的事件，并选择后代棉花种子用于商业性发展。
表7
Figure BDA0001164683680001441
表8
Figure BDA0001164683680001451
甘蔗的转化
甘蔗转化技术是本领域已知的，例如参见Brumbley等在“Sugarcane”(可得自以下网址：mrw.interscience.wiley.com/emrw/9781405181099/hpt/article/k0701/current/pdf)、以“Compendium of Transgenic Crop Plants”出版，由Chittaranjan Kole和Timothy C.Hall编著的Blackwell Publishing Ltd.,2008；ISBN 978-1-405-16924-0(可得自以下网址：mrw.interscience.wiley.com/emrw/9781405181099/hpt/toc)以及PCT国际专利申请公布说明书WO2007/003023(甘蔗)和WO2008/049183(甘蔗)中描写的方法。在甘蔗转化的一个例子中(参见PCT国际专利申请公布说明书WO2007003023A2的实施例3)，由甘蔗(Saccharum spp.hybrid)的顶端分生组织和初生叶建立胚性甘蔗愈伤组织培养物。通过如(Sanford(1990)Plant Physiol.,79:206-209)在先描述的粒子轰击，八周大的愈伤组织用UBI-1::Bar::NOSpo1yA和UBI-l::Oas::NOSpolyA或UBI-1::Bar::NOSpolyA和UBI-1::CPs::NOSpolyA表达盒的等摩尔混合物(10pg DNAI3/mg颗粒)共轰击。轰击后，愈伤组织转移至含有1mg/LPPT和1mg/L BAP的MS培养基中以促进芽再生并抑制非转基因组织生长。两周后，将愈伤组织转移至含有1mg/L PPT和1mg/L Affi的MS培养基中使芽长长并诱导根形成。两周后，将幼苗放入品红箱中适应环境，两周后，将具有良好发育的根的芽(10-15cm)转移至盆栽土壤并放入温室中。
重复以上过程以生产用分离的本发明重组DNA构建体转化的转基因甘蔗植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在甘蔗植物细胞中转录的构建体，其含有在甘蔗植物细胞中具有功能并与各多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(a)编码切割阻断剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少表2和3中鉴定的各miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于表2和3鉴定的各miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的siRNA；和(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制表2和3鉴定的各miRNA靶标的表达的siRNA。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因甘蔗植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在甘蔗植物细胞中转录的构建体，其含有在甘蔗植物细胞中具有功能并与多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自(a)编码切割阻断剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(b)编码5'-修饰的切割阻断剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(c)编码翻译抑制剂以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(d)编码诱饵以阻止或减少miRNA靶标转录物的小RNA介导的切割的DNA；(e)编码miRNA无应答转基因的DNA，所述转基因具有来源于miRNA靶标的天然核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述天然核苷酸序列中的miRNA识别位点被去除或者修饰，以阻止miRNA介导的切割；(f)编码miRNA前体的DNA，所述前体加工成用于抑制miRNA靶标的表达的miRNA；(g)编码双链RNA的DNA，所述双链RNA加工成用于抑制miRNA靶标的表达的siRNA；和(h)编码ta-siRNA的DNA，所述ta-siRNA加工成用于抑制miRNA靶标的表达的siRNA—其中制备分离的构建体用于表5所列的各miRNA靶标。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因甘蔗植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在甘蔗植物细胞中转录的构建体，其含有在甘蔗植物细胞中具有功能并与表6所提供的各多核苷酸操作性连接的启动子，其中制备分离的构建体用于各多核苷酸。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因甘蔗植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在甘蔗植物细胞中转录的构建体，其含有在植物细胞中具有功能并与选自编码表2 和3鉴定的各miRNA靶标的DNA的多核苷酸操作性连接的启动子。
重复以上过程以生产用本发明的以下各重组DNA构建体转化的转基因甘蔗植物细胞的多个事件，所述重组DNA构建体即可在甘蔗植物细胞中转录的构建体，其含有在植物细胞中具有功能并与SEQ ID NO:15–2064的各个多核苷酸操作性连接的启动子。
针对与对照植物或种子(缺乏重组DNA构建体表达的植物或种子)相比提高的性状(例如提高的产量)，筛选由再生的转基因甘蔗植物产生的再生转基因甘蔗植物或后代转基因甘蔗植物或甘蔗种子。从带有本发明特定重组构建体的转基因甘蔗植物的各组多个事件中鉴定产生最大提高性状(例如最大的产量提高)的事件，并选择后代甘蔗种子用于商业性发展。
其他实施方式
miRNA诱饵与内源靶基因竞争结合至特定miRNA，因此降低miRNA在生化网络或涉及miRNA的网络中的效果。诱饵包括内源(天然)miRNA诱饵序列、通过操纵内源序列(例如通过化学或其他诱变或位点特异性重组)而生成的诱饵、以及合成miRNA诱饵序列。重组DNA构建体可用于表达多个miRNA诱饵。miRNA诱饵法的优点包括不表达蛋白质的事实，以及因为miRNA通常属于多基因家族(其中各miRNA基因生成独特的miRNA初级转录物)，其中单个miRNA诱饵用于与由一个以上miRNA基因或者初级转录物衍生的成熟miRNA结合。
然而，有时miRNA诱饵的替代物是优选的，因为与来自一个以上miRNA基因的成熟miRNA结合的miRNA诱饵可能无意地影响非靶基因的表达。申请人在此公开了通过干扰成熟miRNA与其靶标的结合而操纵miRNA调节的途径的其他新颖的方法。这些方法通常包括本发明重组DNA构建体的体内(例如植物中)表达和加工，其能特别可用于调节单个(或者，如果需要，多个)靶基因的表达，以及操纵基因在转基因植物中的表达，导致改善的表型，例如提高的产量或生物或非生物应激耐受性。
一种方法是通过使用“切割阻断剂”或“5'-修饰的切割阻断剂”，该 阻断剂在真核细胞中转基因表达并与靶基因转录物的miRNA识别位点以不引起切割的方式结合，从而通过与miRNA竞争结合至该识别位点阻止或者减少由miRNA介导的转录物的切割。该方法通过保护miRNA靶基因不被miRNA-Ago复合物切割而控制miRNA靶基因的转录后抑制率，并减少或阻止miRNA靶基因的下调。本发明包括与其他涉及沉默化的小RNA竞争的类似的切割阻断剂，所述小RNA例如si-RNA、反式作用siRNA、定相RNA、天然反义转录物siRNA、天然反义转录物miRNA，或者甚至与沉默复合物例如RISC或Argonaute或Argonaute样蛋白有关的任何小RNA。
另一个方法是使用“翻译抑制剂”，该翻译抑制剂在真核细胞中转基因表达并与靶基因转录物结合并抑制其翻译，从而减少靶基因表达。如此设计翻译抑制剂的核苷酸序列，使得在翻译抑制剂和靶基因转录物之间形成的杂交片段赋予转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶切割的抗性。翻译抑制剂提供以下优点：减少可传递的小RNA形成的可能性(如可发生在miRNA介导的靶基因降解中)，以及因为翻译抑制剂保持与靶基因转录物结合(不同于miRNA，miRNA与切割的转录物分离，然后可与另一个转录物分子结合)而实现靶标抑制的更加受控的调节。翻译抑制剂可基于选自与沉默复合物例如RISC或Argonaute或Argonaute样蛋白有关的任何小RNA的序列。
本领域技术人员容易理解，上述方法也适用于其中介导靶基因抑制的双链RNA不是miRNA的情况。因此，本发明的各方面包括在体内或植物内加工以提供含有单链RNA的RNA的类似重组DNA构建体，根据受抑制的RNA酶III核糖核酸酶的切割是否分别由siRNA、反式作用siRNA、定相小RNA、天然反义转录物siRNA或天然反义转录物miRNA(或统称为，与沉默复合物例如RISC或Argonaute或Argonaute样蛋白有关的任何小RNA)介导，所述单链RNA用作“siRNA切割阻断剂”、“反式作用siRNA切割阻断剂”、“定相小RNA切割阻断剂”、“天然反义转录物siRNA切割阻断剂”或“天然反义转录物miRNA切割阻断剂”(或统称为“小RNA切割阻断剂”)。
按照以上所公开的内容所述，可制备和使用本发明所公开和要求保护的所有材料和方法，而无需过多实验。尽管根据优选的实施方式和说明性的实施例已经描述了本发明的材料和方法，但对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的构思、精神和范围的条件下，可以对本文所述的材料和方法进行修改。本领域技术人员显而易见的所有这些类似替换和修改都视为落入所附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和构思之内。

Claims (8)

1.增加作物植物的产量的方法，包括在作物植物中表达编码RNA分子的重组DNA构建体，所述RNA分子抑制赤霉酸20氧化酶(GA20ox)靶基因的表达，其中所述GA20ox靶基因由SEQ ID NO:2013的序列组成。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA分子包含至少一个选自下组的RNA：(a)加工成用于抑制GA20ox靶基因表达的miRNA的miRNA前体、(b)加工成用于抑制GA20ox靶基因表达的至少一个siRNA的双链RNA、(c)加工成用于抑制GA20ox靶基因表达的至少一个siRNA的ta-siRNA和(d)加工成用于抑制GA20ox靶基因表达的至少一个定相小RNA的定相小RNA定相小RNA转录物。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述作物植物选自下组：玉米、大豆、油菜、棉花、苜蓿、甘蔗、甜菜、高粱和水稻。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述miRNA前体的序列如SEQ ID NO:2012所示。
5.可在植物细胞中转录的重组DNA构建体，包含在植物细胞中具有功能且和至少一个多核苷酸操作性连接的启动子，所述多核苷酸选自下组：(a)编码加工成用于抑制GA20ox靶基因表达的miRNA的miRNA前体的DNA、(b)编码加工成用于抑制GA20ox靶基因表达的至少一个siRNA的双链RNA的DNA、(c)编码加工成用于抑制GA20ox靶基因表达的至少一个siRNA的ta-siRNA的DNA和(d)编码加工成用于抑制GA20ox靶基因表达的至少一个定相小RNA的定相小RNA定相小RNA转录物的DNA，其中所述GA20ox靶基因由SEQ ID NO:2013的序列组成。
6.如权利要求5所述的重组DNA构建体，其中所述重组DNA构建体稳定整合入植物细胞的质体或染色体中。
7.如权利要求5所述的重组DNA构建体，其中所述植物细胞是选自下组的作物植物的细胞：玉米、大豆、油菜、棉花、苜蓿、甘蔗、甜菜、高粱和水稻。
8.如权利要求5所述的重组DNA构建体，进一步包含至少一个选自下组的元件：
a.在真核细胞中具有功能的启动子；
b.与经历加工成包含单链RNA的RNA的DNA操作性连接的Pol III启动子；
c.加工成RNA适配子的DNA；
d.转基因转录单元；
e.编码可剪接内含子的DNA；
f.编码自剪接核酶的DNA；
g.编码位点特异性重组酶识别位点的DNA；
h.编码基因抑制元件的DNA；和
i.编码转录调控元件的DNA。
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