CN106939050A

CN106939050A - 抗pd1和cd19双特异性抗体及其应用

Info

Publication number: CN106939050A
Application number: CN201710189120.4A
Authority: CN
Inventors: 王继明; 张云; 赵青; 朱泽; 李镜; 李向臣; 李相国; 钟殿胜; 陈镭; 王立祥; 王华庆; 李忠廉; 刘卫平
Original assignee: Shunho Cell Biotechnology Tianjin Co ltd
Current assignee: Shunho Cell Biotechnology Tianjin Co ltd
Priority date: 2017-03-27
Filing date: 2017-03-27
Publication date: 2017-07-11
Anticipated expiration: 2037-03-27
Also published as: CN106939050B

Abstract

本发明涉及抗PD1和CD19双特异性抗体及其应用，所述抗PD‑1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段包括：特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD‑1的结构域，其包括抗PD‑1特异性抗体的重链可变区(抗PD‑1 VH)；以及特异性识别和结合CD19的结构域，其包括抗CD19特异性抗体的重链可变区(抗CD19 VH)。该双特异性抗体具有全人源序列，有效地避免了临床治疗应用中HAMA的发生，能够更有效地减少耐药现象的发生，提高药物的利用效率和治疗效果。本发明提供的抗PD‑1和CD19双特异性抗体能够获得比已有抗PD‑1、抗CD19特异性抗体更好的介导T细胞高效特异性杀伤B淋巴细胞来源的肿瘤细胞的效果。

Description

抗PD1和CD19双特异性抗体及其应用

技术领域

本发明属于抗体药物开发和生产领域，涉及抗PD-1和CD19的双特异性抗体及其应用。本发明提供了特异性识别和结合PD-1和CD19的双特异性抗体或其功能性片段，还提供了编码所述的双特异性抗体或其功能性片段的核酸分子、用于表达所述双特异性抗体或其功能性片段的表达载体和宿主细胞，和它们在制备治疗癌症的药物中的应用，以及所述双特异性抗体或其功能性片段的制备方法。

背景技术

PD-1基因是一种55kDa的跨膜蛋白，其分子由4个亚基组成：δ、ε、γ、ζ，各自的分子质量分别为18.9kDa、23.1kDa、20.5kDa、18.7kDa，其为Ig基因超家族的一员。PD-1是在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达的CD28家族的抑制性成员。

CD19是95kDa的膜受体，它在B细胞分化早期表达，并且继续表达直到B细胞被触发最终分化。CD19的胞外域含有两个被较小的潜在二硫键连接的结构域分隔开的C2型免疫球蛋白(IG)样结构域。CD19胞质域在结构上是独特的，但是在人、小鼠和豚鼠之间高度保守(Fujimoto等人，Semin Immunol.(1998)10:267)。CD19是在B淋巴细胞表面上发现的蛋白质复合物的一部分。

CD19在正常及恶性B淋巴细胞中均有表达，被视为B细胞发育过程中的一个涵盖阶段较长的最为可靠的表面标记物。在正常淋巴组织中，CD19表达于生发中心的B细胞和滤泡树突状细胞、套细胞、滤泡间T细胞区的树突状大细胞，与CD19和CD22染色模式基本相同。但同CD22相比，CD19在前B细胞中也表达。此外，通过流式细胞学检测方法，CD19在人体组织分离得到的浆细胞中可以检测到。通常来说，CD19在B淋巴细胞瘤中表达，其中包括B淋巴细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、边缘区淋巴瘤。

B淋巴细胞白血病和恶性淋巴瘤是原发于骨髓造血系统和淋巴结并弥漫全身的恶性肿瘤。传统的放化疗虽然有一定疗效，但没有选择性，对正常组织的损伤很大。近年来，生物治疗方法广泛应用于肿瘤治疗，尤其是单克隆抗体，并因其特异靶向性、高亲和性而收到了良好效果。单抗通过Fc段与效应细胞表面活性受体PD-L1结合，从而介导杀伤作用，但具有免疫杀伤作用的T细胞因为表面缺乏上述受体而不能被有效介导，从而削弱了机体对肿瘤的免疫效应。

慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种淋巴细胞克隆性增殖的肿瘤性疾病，淋巴细胞在骨髓、淋巴结、血液、脾脏、肝脏及其他器官聚集。95％以上的CLL为B细胞的克隆性增殖(即B-CLL)，仅有不到5％的病例为T细胞表型(即T-CLL)。随着对PD-1/PD-L通路的深入研究，其在树突状细胞(DC)、T淋巴细胞、B淋巴细胞等中的作用逐渐被揭示，而CD19是B淋巴细胞表面特异标志，是分子量为95×10³的穿膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，与B细胞活化和信号的转导有关，在前B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)中对肿瘤杀伤，被认为是传统的手术治疗、放化疗方法之外最有希望清除残余肿瘤细胞和微小转移病灶从而根治肿瘤的辅助治疗措施，许多动物实验和临床试验已经证实了该生物治疗措施的疗效。患者体内B细胞表面的PD-1表达量明显高于健康组；B细胞淋巴瘤患者、恶性肿瘤细胞表面PD-L1的表达量也异常增高，慢性淋巴细胞白血病体内B淋巴细胞常出现急性消耗，应用PD-1阻滞剂后这种现象有所减少。另外阻断PD-1后，B细胞的反应性也有所增强。

抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的生物大分子药物，其具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。单克隆抗体在临床上主要应用于以下三个方面：肿瘤治疗、免疫性疾病治疗以及抗感染治疗。其中，肿瘤的治疗是目前单抗应用最为广泛的领域，目前已经进入临床试验和单抗产品上市的阶段，用于肿瘤治疗的产品数量占比大概为50％。单克隆抗体治疗肿瘤是一种针对病变细胞特异靶点刺激免疫系统来杀伤靶细胞的免疫疗法，为了增强抗体的效应功能，特别是杀伤肿瘤细胞的效果，人们尝试多种方法改造抗体分子，双特异性抗体是改善抗体治疗效果的发展方向之一，现已成为抗体工程研究领域的热点。

双特异性抗体(bispecific antibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，即一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原表位的抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。双特异性抗体的一条臂结合肿瘤标志物，另一条臂结合T-细胞特异表面抗原，例如PD-1，可以克服上述问题并且连接肿瘤细胞和T-细胞。BiAb在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导的细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。

用于免疫治疗的双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。双特异性抗体是通过鼠源性单克隆抗体的化学偶联、双杂交瘤和基因工程3个发展阶段所制备的一种非天然抗体或抗体杂合分子，随着生物技术的日益进步，国内外双特异性抗体的相关研究日趋深入，其在临床治疗中作为一种新的二次导向系统具有潜在的应用价值。

随着计算机科学的迅猛发展，近年来计算机辅助药物设计成为研究与开发新药的崭新技术，明显加快了新药设计的速度和效率。蛋白质结构的不断解析，PDB数据不断增长，使计算机辅助设计蛋白质药物成为可能。基于蛋白质空间结构的蛋白质药物研究倍受重视。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新型抗PD-1和CD19双特异性抗体及其应用。该双特异性抗体具有全人源序列，有效地避免了临床治疗应用中HAMA的发生，能够更有效地减少耐药现象的发生，提高药物的利用效率和治疗效果。本发明提供新的抗PD-1和CD19双特异性抗体融合蛋白具有针对第一目的抗原的第一特异性和针对第二目的抗原的第二特异性，具有对两种不同受体的结合特异性，同时本发明还涉及该双特异性抗体融合蛋白的生产方法、该融合蛋白的药物用途和使用该融合蛋白的治疗方法。因此，本发明提供的抗PD-1和CD19双特异性抗体能够获得比已有抗PD-1、抗CD19特异性抗体更好的介导T细胞高效特异性杀伤B淋巴细胞来源的肿瘤细胞的效果。

本发明用于解决上述技术问题的技术方案如下：

一种抗PD-1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段，其包括：

a.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域，其包括抗PD-1特异性抗体的重链可变区(抗PD-1VH)；以及

b.特异性识别和结合CD19的结构域，其包括抗CD19特异性抗体的重链可变区(抗CD19VH)。

优选地，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域由依次连接的抗PD-1特异性抗体的轻链可变区(抗PD-1VL)、重链可变区(抗PD-1VH)、铰链区和Fc片段(抗PD-1CH2-CH3)组成，或由一组抗PD-1特异性抗体的轻链(抗PD-1VL-CL)和重链(抗PD-1VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)组成，或由两组抗PD-1特异性抗体的轻链(抗PD-1VL-CL)和重链(抗PD-1VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)组成，或由抗PD-1特异性抗体的轻链可变区(抗PD-1VL)和重链可变区(抗PD-1VH)组成。

优选地，所述特异性识别和结合CD19的结构域由依次连接的抗CD19特异性抗体的轻链可变区(抗CD19VL)、重链可变区(抗CD19VH)、铰链区和Fc片段(抗CD19CH2-CH3)组成，或由一组抗CD19特异性抗体的轻链(抗CD19VL-CL)和重链(抗CD19VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)组成，或由两组抗CD19特异性抗体的轻链(抗CD19VL-CL)和重链(抗CD19VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)组成，或由抗CD19特异性抗体的轻链可变区(抗CD19VL)和重链可变区(抗CD19VH)组成。

根据本发明的一个优选的实施方案，所述抗PD-1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段包括：

a’.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域，其由一组抗PD-1特异性抗体的轻链(抗PD-1VL-CL)和重链(抗PD-1VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)组成；以及

b’.特异性识别和结合CD19的结构域，其由一组抗CD19特异性抗体的轻链(抗CD19VL-CL)和重链(抗CD19VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)组成。

优选地，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域与所述特异性识别和结合CD19的结构域通过一个或多个二硫键，例如一个或多个位于铰链区的二硫键连接。

a”.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域，其由一组抗PD-1特异性抗体的轻链(抗PD-1VL-CL)和重链(抗PD-1VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)组成；以及

b”.特异性识别和结合CD19的结构域，其由依次连接的抗CD19特异性抗体的轻链可变区(抗CD19VL)、重链可变区(抗CD19VH)、铰链区和Fc片段(抗CD19CH2-CH3)组成。

a”’.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域，其由依次连接的抗PD-1特异性抗体的轻链可变区(抗PD-1VL)、重链可变区(抗PD-1VH)、铰链区和Fc片段(抗PD-1CH2-CH3)组成；以及

b”’.特异性识别和结合CD19的结构域，其由一组抗CD19特异性抗体的轻链(抗CD19VL-CL)和重链(抗CD19VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)组成。

a””.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域，其由两组抗PD-1特异性抗体的轻链(抗PD-1VL-CL)和重链(抗PD-1VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)组成；以及

b””.特异性识别和结合CD19的结构域，其由两组抗CD19特异性抗体的轻链可变区(抗CD19VL)和重链可变区(抗CD19VH)组成。

优选地，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域中的每个抗PD-1特异性抗体的重链(抗PD-1VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)的CH3分别与所述特异性识别和结合CD19的结构域中的每个抗CD19特异性抗体的重链可变区(抗CD19VH)通过化学键连接。

优选地，所述的抗PD-1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。

优选地，所述特异性识别和结合PD-1的结构域中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ No:1、5、9或21所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、7、11或23所示。

优选地，所述特异性识别和结合CD19的结构域中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13、17或25所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15、19或27所示。

优选地，所述抗PD-1特异性抗体的重链(抗PD-1VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)的氨基酸序列为SEQ ID No:29，核苷酸编码序列为SEQ ID No:30；所述抗PD-1特异性抗体的轻链(抗PD-1VL-CL)的氨基酸序列为SEQ ID No:31，核苷酸编码序列为SEQ ID No:32；由依次连接的抗PD-1特异性抗体的轻链可变区(抗PD-1VL)、重链可变区(抗PD-1VH)、铰链区和Fc片段(抗PD-1CH2-CH3)组成的所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域的氨基酸编码序列为SEQ ID No:33，核苷酸编码序列为SEQ ID No:34。

优选地，所述抗CD19特异性抗体的重链(抗CD19VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)的氨基酸序列为SEQ ID No:35，核苷酸编码序列为SEQ ID No:36；所述抗CD19特异性抗体的轻链(抗CD19VL-CL)的氨基酸序列为SEQ ID No:37，核苷酸编码序列为SEQ ID No:38；由依次连接的抗CD19特异性抗体的轻链可变区(抗CD19VL)、重链可变区(抗CD19VH)、铰链区和Fc片段(抗CD19CH2-CH3)组成的所述特异性识别和结合CD19的结构域的氨基酸序列为SEQ IDNo:39，核苷酸编码序列为SEQ ID No:40；由依次连接的抗CD19特异性抗体的轻链可变区(抗CD19VL)和重链可变区(抗CD19VH)组成的所述特异性识别和结合CD19的结构域的氨基酸序列为SEQ ID No:41，核苷酸编码序列为SEQ ID No:42。

另一方面，本发明还提供了一种编码所述的抗PD-1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段的核酸分子，或者一种包含所述核酸分子的表达载体，或者一种包含所述表达载体的宿主细胞。

优选地，所述特异性识别和结合PD-1的结构域中的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、6、10或22所示；轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:4、8、12或24所示。

优选地，所述特异性识别和结合CD19的结构域中的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:14、18、26所示；轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:16、20、28所示。

再一方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包括所述的抗PD-1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段，或所述的核酸分子，或所述的表达载体或所述的宿主细胞。优选地，所述药物组合物还包括一种或多种其他抗肿瘤药物；优选地，所述药物组合物还与一种或多种其他抗肿瘤治疗方法，例如化学疗法、放射疗法和/或生物疗法一起使用。

进一步地，本发明还提供了所述的抗PD-1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段、或所述的核酸分子、或所述的表达载体或所述的宿主细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。具体地，所述肿瘤为非霍奇金淋巴瘤。

本发明提供了能够同时特异结合程序性死亡因子1(PD-1)和CD19的双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段。本发明的双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段具有以下特性的至少一种：

a.能够与PD-1以高特异性结合，并阻断PD-1和PD-L1的相互作用；

b.与其它CD28家族成员(如ICOS、CTLA-4和CD28)不发生结合；

c.能够与CD19以高特异性结合；

d.与其他B细胞分化抗原(如CD20，CD22)不发生结合；

e.激活免疫细胞(如肿瘤特异性T细胞)，并特异识别CD19阳性肿瘤细胞，促进CD8⁺T细胞进入肿瘤组织，使IFN-γ等免疫效应物的水平大大增加，从而实现靶向杀伤肿瘤细胞。

本发明还提供了人源化PD-1/CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段。所述人源化抗体由免疫小鼠产生的鼠源抗体经由计算机模拟设计并结合噬菌体展示技术而得到，并且根据其与不同物种的PD-1和CD19蛋白胞外结构域的结合特性，鉴定其相应的结合表位。本发明所述的人源化抗PD-1/CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段具备上述PD-1/CD19双特异性抗体或其功能性片段的有利特性。

本发明所述变体和功能片段包括通过化学修饰或通过掺入脂质体中能够增加半寿期的任何片段，修饰后的片段保留与其来源抗体相同的结合特异性和亲和力，这样获得的新的具有双特异结合特性的蛋白分子也在本发明保护的范围内。

在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。

本发明所述双特异抗体、突变体及功能性片段可以是全长抗体、可仅包含两抗原结合部分，如Fab、F(ab’)2、Fv或单链(scFv)或全长抗体与抗原结合部分组成的融合蛋白(如图2)，如上所述，任何形式组合所形成的双特异性结合蛋白分子均在本发明保护的范围内。

本领域技术人员可以将编码本发明所述PD-1/CD19双特异性抗体的DNA分子克隆到载体中，进而转化宿主细胞。因此，本发明还提供了以图1(A)所示双特异抗体为例的重组DNA载体，编码图1(B-C)以及图2所示PD-1/CD19双特异抗体的突变体及功能片段的载体及宿主细胞也在本发明保护的范围内。

本发明所述的宿主细胞可以为原核宿主细胞、真核宿主细胞或噬菌体。所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核宿主细胞可以为如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，如草地粘虫等昆虫细胞，如烟草等植物细胞，如BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施方案中，本发明所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞。

本发明提供的包含PD-1抗体和CD19抗体的人源双特异性抗体蛋白在体内外都具有良好的生物活性和稳定性，能够同时结合PD-1和CD19阳性的细胞，并且能够激活人T淋巴细胞，靶向杀伤非霍奇金淋巴瘤细胞，杀伤率达30％以上。

本发明的有益效果在于提供了一种人源化的PD-1/CD19双特异性抗体，其可以结合PD-1和CD19阳性的细胞，并且能够增强T淋巴细胞的功能，从而达到靶向抗非霍奇金淋巴瘤细胞的作用，较目前临床应用的PD-1抗体和CD19单克隆抗体相比，具有更加强大的杀伤能力，在临床应用中具有很好的应用前景。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明所述PD-1/CD19双特异性抗体的结构示意图。

图2为本发明所述PD-1/CD19双特异性抗体的功能性片段或变体的结构示意图。

图3为纯化人源化PD-1、CD19胞外结构域的SDS-PAGE检测结果。

图4为抗PD-1单克隆抗体的ELISA检测结果。

图5为抗CD19单克隆抗体的ELISA检测结果。

图6分别显示抗PD-1单克隆3、21、45与77与CD28家族蛋白的结合。

图7分别显示抗PD-1单克隆3、21、45与77对PD-L1蛋白与人T细胞的PD-1结合的封闭作用。

图8分别显示抗CD19单克隆16、75与CD19蛋白的特异性结合。

图9显示编码本发明的双特异抗体的重组质粒图谱。

图10显示本发明的PD-1/CD19双特异性抗体对PD-1和CD19的特异结合。

图11显示双特异性抗体抑制小鼠体内移植瘤的生长的实验结果。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1PD-1/CD19双特异性抗体的结构设计

本发明提供了一些可同时特异性结合PD-1与CD19胞外结构域的双特异性抗体的结构模型，此类抗体4种主要实施例的结构如图1所示，图1(A-C)中3种异源二聚体的形成均基于本领域技术员所熟知的CH3结构域突变技术(“knob and hole mutation”)(VonKreudenstein et al.，MAbs.2013 5(5):646-54)。(其中，(A)抗PD-1特异性抗体的轻链(抗PD-1VL-CL)-重链(抗PD-1VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)对与抗CD19特异性抗体的轻链(抗PD-1VL-CL)-重链(抗PD-1VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)对组成的双特异性结合蛋白；(B)抗PD-1特异性抗体的轻链-重链对与CD19轻链可变区(抗CD19VL)、重链可变区(抗CD19VH)、铰链区和Fc片段(抗CD19CH2-CH3)融合蛋白组成的双特异性结合蛋白；(C)抗PD-1轻链可变区、重链可变区、铰链区和Fc片段融合蛋白与抗CD19特异性抗体的轻链-重链对组成的双特异性结合蛋白；(D)抗PD-1特异性抗体的轻链与抗PD-1特异性抗体的重链、抗CD19轻链可变区(抗CD19VL)和重链可变区(抗CD19VH)融合蛋白组成的双特异性结合蛋白。

PD-1/CD19双特异性抗体的变体及功能性片段的实施例如图2所示，图2E-H中的双特异抗体变体及功能性片段的形成基于本领域技术员所熟知的融合肽技术(以多肽链或蛋白质将不同结构域连接，进而实现融合表达)，图2I中的异源二聚体的形成基于本领域技术员所熟知的CH3结构域突变技术(同图1A-C)(E)抗PD-1的重链可变区(抗PD-1VH)与抗CD19重链可变区(抗CD19VH)的融合蛋白；(F)抗PD-1的单链可变片段(scFv)与抗CD19的scFv组成的融合蛋白；(G)抗PD-1的单链可变片段(scFv)与抗CD19的scFv组成的非免疫球蛋白融合蛋白；(H)抗PD-1轻链可变区、重链可变区、铰链区、Fc片段与抗CD19轻链可变区、重链可变区组成的四价融合蛋白；(I)抗PD-1轻链可变区、重链可变区、铰链区和Fc片段融合蛋白与抗CD19轻链可变区、重链可变区、铰链区和Fc片段融合蛋白组成的双特异性结合蛋白(注：图中特异识别PD-1与CD19的功能片段位置可互换)。

实施例2PD-1/CD19双特异性抗体抗原(人PD-1和CD19胞外可溶结构域)的制备

在UniProt数据库获得人源PD-1和CD19胞外结构域的编码基因序列，通过全基因合成的方式获得编码基因PD-1ED-CDS和CD19ED-CDS，合成产物在经BamH I、EcoR I(PD-1ED-CDS)和BamH I、Xba I(CD19ED-CDS)双酶切后，克隆到pcDNA3.1载体，利用CHO-S细胞作为宿主细胞进行蛋白质表达，利用亲和层析、离子交换层析等纯化技术对目的蛋白进行纯化。

图3为人源PD-1与CD19胞外结构域蛋白纯化并进行去糖基化处理后的SDS-PAGE检测结果图。

实施例3抗人PD-1与CD19抗体的获得

1.免疫动物

将1mg/ml已纯化的人PD-1或CD19胞外结构域蛋白100μl分别与等体积弗氏完全佐剂在室温下均匀混合后，腹部皮下多点注射入6-8周BALB/C小鼠体内。7天后，将1mg/ml蛋白100μl与等体积弗氏不完全佐剂在室温下均匀混合后，腹部皮下多点注射入小鼠体内。七天后，重复上面步骤。七天后，重复上面步骤。第四次注射后三天，断鼠尾尖取血15μl，室温静置2h，25℃，6000-8000rpm，离心10-15min，取上清，通过ELISA实验检测效价。若效价检测可用即眼部取全血，室温静置2h，25℃，6000-8000rpm，离心10min，取上清，-80℃保存。若效价不可用，继续免疫一次。

2.细胞融合

无菌取小鼠脾细胞并制成细胞悬液，将1×10⁸个脾细胞与2-5×10⁷个骨髓瘤(SP2/0-Ag14)细胞融合，50％PEG作融合剂，以HAT选择培养基培养3-10天后，以HT培养基进行培养，培养条件为5％CO₂，37℃。

3.阳性克隆筛选

利用ELISA反应筛选单克隆杂交瘤细胞中可分泌结合PD-1或CD19胞外结构域蛋白抗体的克隆，分别是筛选出结合PD-1(克隆3、21、45、77)和CD19(克隆16、75)的优选克隆，检测结果如图4和5所示，克隆均可特异识别相应的抗原蛋白。

实施例4抗PD-1抗体与其他CD28家族蛋白结合的鉴定

为鉴定筛选出的抗PD-1抗体的特异性，将CD28家族的成员蛋白PD-1、CD28、CTLA-4和ICOS(R&D Systerm)于酶标板中在37℃温箱中静置包被2h；4℃封闭过夜；洗涤后加入100μl侯选抗体(1μg/ml)，37℃孵育1h；洗涤5次后加入稀释的HRP标记山羊抗小鼠抗体(Abcam)，室温孵育1h；洗涤5次后加入OPD底物溶液100μl/孔，显色5min后加入50μl/孔的2MH₂SO₄终止反应。用酶标仪测定490nm处各孔的吸光值。实验结果如图6，候选克隆分泌的抗体不结合除PD-1外的CD28家族成员蛋白。

实施例5抗PD-1抗体对人T细胞的PD-1受体与PD-L1结合的封闭实验

1.人外周血T细胞的分离

抽取健康志愿者外周血10mL，缓慢加入装有5ml淋巴细胞分离液的离心管中，2500rpm，20min，取出白膜层，以PBS洗涤3次，获得人外周血单核细胞PBMC。分离得到的PBMC，加入100μl/ml CD3抗体(Invitrogen)，轻吹混匀，室温孵育15min；加入5μl/ml免疫磁珠(Invitrogen)，4℃孵育60min，每10分钟震荡一次；以PBS冲洗并稀释，将细胞悬液注入填有不锈钢毛的特制试管中，放入分离器进行分离纯化，强磁场下T细胞不能通过分离器，得以纯化。

2.人PD-L1胞外结构域与绿色荧光蛋白融合蛋白的制备

在UniProt数据库获得人PD-L1胞外结构域的编码基因序列，通过全基因合成的方式获得编码基因，合成产物在经EcoR I、Xho I双酶切后，克隆到pEGFP-N1载体，利用CHO-S细胞作为宿主细胞进行蛋白质表达，利用亲和层析、离子交换层析等纯化技术对目的蛋白进行纯化，获得绿色荧光蛋白融合表达的人源PD-L1胞外结构域蛋白rh-PD-L1-GFP，图7(A)为融合蛋白的表达与纯化并进行区糖基化处理后的SDS-PAGE结果。

3.抗PD-1抗体对人T细胞的PD-1受体与PD-L1结合的封闭实验

将优选克隆产生的4种抗体(1μg/ml)与rh-PD-L1-GFP(1μg/ml)室温下轻柔混合30min，然后将混合蛋白溶液加入分离纯化出的人外周血T细胞，室温孵育15分钟后以PBS清洗3次，以流式细胞仪进行分析。

由图7(B-F)可见，克隆3、21和77可阻碍PD-L1与人T细胞上的PD-1受体的结合，克隆45的阻断效果较差。

实施例6抗CD19抗体与CD20、CD33和CD138的结合鉴定

将CD19、CD20、CD33和CD138(R&D Systerm)于酶标板中在37℃温箱中静置包被2h；4℃封闭过夜；洗涤后加入100μl侯选抗体(1μg/ml)，37℃孵育1h；洗涤5次后加入稀释的HRP标记山羊抗小鼠抗体(Abcam)，室温孵育1h；洗涤5次后加入OPD底物溶液100μl/孔，显色5min后加入50μl/孔的2M H₂SO₄终止反应。用酶标仪测定490nm处各孔的吸光值。实验结果如图8，候选克隆分泌的抗体不结合CD20、CD33和CD138蛋白。

实施例7抗PD-1和CD19候选抗体可变区序列的获得

分别扩大培养抗PD-1克隆3、21、45、77和抗CD19克隆16、75，培养至细胞量为10⁹个，离心收集细胞，去除细胞培养液，以预冷的PBS缓冲液(6-8mL)轻轻洗涤细胞两次；以Trizol试剂盒(TAKARA)提取总RNA，以紫外分光光度计检测RNA的纯度与浓度；以总RNA为模板，逆转录获得cDNA，逆转录体系20μl，其中5×逆转录Buffer(4μl)，dNTP(1μl)，MgCl₂(2.4μl)，PD(N6)随机引物(1.5μl)，RNA模板(2μg)，逆转录酶(1μl)，DEPC水(至20μl)。

以cDNA为模板，扩增杂交瘤中可变区的DNA序列，扩增引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补(Orlandi R，et al.Cloning immunoglobulin variable domainsfor expression by polymerase chain reaction.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：3833)，扩增体系50μl，其中5×PCR Buffer(10μl)，dNTP(4μl)，引物(2μl)，cDNA模板(1μl)，PCR酶(0.5μl)，PCR水(至50μl)。

扩增产物克隆至pMD19载体，经蓝白斑筛选后，重组子测序，获得的抗PD-1克隆3、21、77重链和轻链可变区氨基酸序列见SEQ No.1和3，5和7，9和11；编码相应氨基酸的核苷酸序列见SEQ No.2和4，6和8，10和12。获得的抗CD19克隆8、65重链和轻链可变区氨基酸序列见SEQ No.13和15，17和19；编码相应氨基酸的核苷酸序列见SEQ No.14和16，18和20。

实施例8抗PD-1与CD19抗体的人源化改造

利用获得的抗PD-1与CD19抗体的可变区氨基酸序列利用IMGT/V-Quest在线服务器分析抗体亚型，综合Kabat、Chothia及IMGT三种抗体的CDR区的Numbering方案确定抗体轻链与重链的六个CDR区序列；利用DS软件进行小鼠亲本抗体Fab及其嵌合人源化抗体Fab的空间结构，获得嵌合抗体的分子模型后，对亲本Fab和嵌合抗体Fab初始模型采用分子动力学模拟进行全面的优化，提取稳定的平均构象；利用表位扫描检验设计的人源化抗体可能存在的线性表位与构象表位，确定必须保留的框架区氨基酸位点后，设计不同的氨基酸突变位点获得人源化抗体。

在此基础上，我们得到了多个人源化抗体，其中评分最高的抗PD-1和抗CD19抗体序列分别为克隆81和克隆22。

在此基础上，我们得到了多个人源化抗体，其中评分最高的抗PD-1和抗CD20抗体序列分别为克隆81和克隆22，克隆81的重链和轻链氨基酸序列分别SEQ ID No.21和23，编码相应氨基酸的核苷酸序列分别SEQ ID No.22和24；克隆22的重链和轻链氨基酸序列分别SEQ ID No.25和27，编码相应氨基酸的核苷酸序列分别为SEQ ID No.26和28。

实施例9抗PD-1/CD19双特异性抗体表达载体的构建

本发明抗PD-1/CD19双特异性抗体中抗PD-1(克隆81，制备方法见实施例8)的可变区编码核苷酸PD-1-VH和PD-1-VL，抗CD19(克隆22，制备方法见实施例8)的可变区编码核苷酸CD19-VH和CD19-VL，IgG1重链恒定区CH1、铰链区、Fc和Fc-knob和Fc-hole编码核苷酸，以及轻链恒定区CL的kappa链编码核苷酸，以及链接scFv的多肽(GGGGS)3编码基因得自于Life Technologies Inc.(Carlsbad，CA)。

图1中所示的4种结构的双特异性抗体中各个不同链，VL和CL、VH和CH1、CH1和Fc(Fc-knob、Fc-hole)、ScFv和Fc(Fc-knob、Fc-hole)、Fc和ScFv通过重叠PCR的方式获得。pcDNA3.1和pIRES作为表达载体以制备双特异性抗体，图1中所示的4种双特异抗体的重组质粒图谱见图9。

实施例10抗PD-1/CD19双特异性抗体的制备

1.利用293F宿主细胞表达双特异性抗体

在转染之前24小时，将1×10⁶个293F细胞接种于烧瓶中的293freestyle培养基中于37℃，8％CO₂，130rpm条件下培养。将100μl 293fectin加入至1ml的OPtiMEM中，搅拌条件下，室温孵育5分钟。同时，将重组质粒(实施例9制备的)，溶解于1ml OPtiMEM中，DNA总量为30μg。将上述DNA与293fectin完全混合，并且总体积为2ml，在室温下孵育20分钟。然后将该混合物加入至细胞培养物中。在37℃下培养细胞，且培养箱中有5％CO₂，以130rpm培养5天。

2.抗体纯化

将细胞培养基于2000×g离心，收集上清并用0.22μm过滤器过滤。将收集的液体用10倍(以体积算)结合缓冲液(9.5mM NaH₂PO₄+40.5mM Na₂HPO₄，pH 7.0)稀释，然后通过Sepharose Fast Flow protein A亲和色谱柱(购自GE公司，5ml体积)、FabAffinityKBPAgarose亲和填料(购自ACROBiosystems公司，5ml体积)，和SP阳离子交换色谱柱(购自GE公司，10ml)进行纯化，依使用手册操作。

实施例11抗PD-1/CD19双特异性抗体的特异性结合鉴定

将PD-1、CTLA-4、CD19和CD19(R&D Systerm)于酶标板中在37℃温箱中静置包被2h；4℃封闭过夜；洗涤后加入纯化后4种按照实施例10制备的抗体(100μg/ml)的梯度稀释液(PBS连续稀释(1：10²，1：10³，1：10⁴，1：10⁵，1：10⁶，1：10⁷，1：10⁸，1：10⁹)，100μl/孔，37℃孵育1h；洗涤5次后加入稀释的HRP标记山羊抗小鼠抗体(Abcam)，室温孵育1h；洗涤5次后加入OPD底物溶液100μl/孔，显色5min后加入50μl/孔的2MH₂SO₄终止反应。用酶标仪测定490nm处各孔的吸光值。实验结果如图10，图1的4种双特异性抗体可同时特异性识别PD-1和CD19。

实施例12PD-1/CD19双特异抗体的体内杀伤实验

1.异植瘤模型建立

将处于对数生长期的非霍奇金淋巴瘤Raji细胞重悬于无血清的RPMI1640培养液，使得细胞浓度为1×10⁷个细胞/ml。小鼠腋下接种Raji细胞l×10⁷个/ml，0.2ml/只，建立淋巴瘤裸鼠模型。每两天测一次荷瘤的最长直径和最短直径，荷瘤的体积用公式：体积(mm³)＝长×宽²/2。实验第30天，肿瘤的体积达到了500mm³，处死小鼠，分离肿瘤。

2.抗PD-1/CD19双特异性抗体杀伤实验

将种植瘤小鼠分为4组，每组4只，以纯化的按照实施例10制备的PD-1/CD19双特异性抗体(图1D)尾静脉注射至成瘤小鼠体内，用量分别为A组：0mg/kg，B组：5mg/kg，C组：30mg/kg和D组：100mg/kg。每隔一周注射1次，连续注射4次，记录小鼠体内肿瘤大小变化。抗PD-1/CD19双特异性抗体不仅抑制小鼠体内肿瘤的生长，同时具有缩小肿瘤的作用，以30mg/kg和100mg/kg剂量注射6周后，肿瘤体积分别缩小至初始体积的49.7％和37.8％(见图11A)。

表1双抗对肿瘤的抑制作用结果

组别	肿瘤大小	肿瘤体积增率
			对照组	1255±43mg	1255.8％
5mg/kg组	427±37mg**	432.6％
			30mg/kg组	75±19mg**	49.7％
100mg/kg组	49±16mg**	37.8％

注：与对照组比较**P<0.01。

3.抗PD-1单克隆抗体、抗CD19单克隆抗体与抗PD-1/CD19双特异性抗体肿瘤杀伤效率比较实验

将种植瘤小鼠分为5组，每组4只，以纯化的抗PD-1单克隆抗体(克隆81)、抗CD19单克隆抗体(克隆22)与抗PD-1/CD19双特异性抗体(序列参见克隆81和克隆22，图1D)尾静脉注射至成瘤小鼠体内，用量分别为A组：PBS，B组：30mg/kg抗PD-1单抗(克隆81)，C组：30mg/kg抗CD19单抗(克隆75)，C组：30mg/kg抗PD-1/CD19双特异性抗体(图1中的双抗D)。每隔一周注射1次，连续注射4次，记录小鼠体内肿瘤大小变化。抗PD-1/CD19双特异性抗体缩小肿瘤的作用明显优于抗PD-1单抗和抗CD19单抗，在抗PD-1单抗、抗CD19单抗和抗PD-1/CD19双抗作用下肿瘤体积分别缩小至初始体积的71.5％，62.8％和85.3％(见图11B)。

表2不同抗体对肿瘤的抑制作用结果

组别	肿瘤大小	肿瘤体积增率
			对照组	1412±38mg	1321.8％
抗PD-1单抗组	537±17mg*	71.5％
			抗CD19单抗组	130±16mg**	62.8％
抗PD-1/CD19双抗组	49±15mg**##&	85.3％

注：与对照组比较**P<0.01；与PD-1组比较^##P<0.01；与CD19组比较^&P<0.05。

实施例13抗PD-1/CD19双特异抗体的变体(图2所示5种变体)体内肿瘤杀伤实验

将种植瘤小鼠分为6组，每组4只，以纯化的5种抗PD-1/CD19双特异抗体的变体(图2E-I所示的双抗变体，序列参见克隆81和克隆22)尾静脉注射至成瘤小鼠体内，用量分别为A组：PBS，B组：20mg/kg变体1(图2E)，C组：20mg/kg变体2(图2F)，D组：20mg/kg变体3(图2G)，E组：20mg/kg变体4(图2H)，和F组：20mg/kg变体5(图2I)。每隔一周注射1次，连续注射4次，记录小鼠体内肿瘤大小变化。5种抗PD-1/CD19双特异性抗体的变体同样具备抑制肿瘤生长的功效。(p＜0.01)。

表3不同抗体的变体对肿瘤的抑制作用结果

注：与对照组比较**P<0.01。

<110> 顺昊细胞生物技术（天津）股份有限公司

<120> 抗PD1和CD19双特异性抗体及其应用

<130> SHUNHOBiMab-PD-1XCD19

<160> 42

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆3重链的氨基酸序列

<400> 1

Gln Gly Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Phe Phe Asp Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆3重链可变区的核苷酸序列

<400> 2

cagggccagc tggtgcagag cggcggcgag gtgaagaagc ccggcgccag cctgaggctg 60

gactgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactactaca tgcactgggt gaggcaggcc 120

cccggccagg gcctggagtg gatgggcggc atctggtacg acggcagcaa gaggtactac 180

aacgagaagt tcaagaacag ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240

atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc caggagggac 300

tacttcttcg actggtactt cgactactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgagcagc 360

<210> 3

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆3轻链可变区的氨基酸序列

<400> 3

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Ser

85 90 95

Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 4

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆3轻链可变区的核苷酸序列

<400> 4

gagatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctga gccccggcga gagggccagc 60

atcagctgca gggccagcca gagcgtgagc accagcggct acagctacct ggcctggtac 120

cagcagaagc ccggccaggc ccccaggctg ctgatctacg acgccagcta cctggagagc 180

ggcatccccg ccaggttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaagatcagc 240

agcctggagc ccgaggacgt gggcgtgtac tactgccagc acagcagcaa ctggcccctg 300

accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aag 333

<210> 5

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆21重链可变区的氨基酸序列

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Thr Phe Ser Asp

20 25 30

Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys

50 55 60

Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

65 70 75 80

Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 6

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆21重链可变区的核苷酸序列

<400> 6

caggtgcagc tggtggagag cggcgccgag gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctg 60

gactgcaagg ccagcggcta catcaccttc agcgactact acatgtactg ggtgaggcag 120

gcccccggcc acggcctgga gtggatcggc tacatcaacc ccagcaacgg cggcaccaac 180

ttcaacgaga agttcaaggg caggttcacc atcagcaggg acaacagcaa gaacaccctg 240

ttcctgcaga tgaacagcct gcagttcgac gacaccgccg tgtactactg cgccaccaac 300

gacgactact ggggccaggg caccctggtg accgtgagca gc 342

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆21轻链可变区的氨基酸序列

<400> 7

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Asp Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆21轻链可变区的核苷酸序列

<400> 8

gacatcgtga tgacccagag ccccgccacc ctgagcctga gccccggcga gagggccagc 60

atcagctgca gggccagcaa gggcgtgagc agctacctgc actggtacca gcagaagccc 120

ggccagagcc ccaggctgct gatctacctg gccagctacc tggagagcgg cgtgcccgac 180

aggttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga agatcagcag ggtggaggcc 240

gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag agcagggacc tgccctacac cttcggccag 300

ggcaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 9

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆77重链可变区的氨基酸序列

<400> 9

Gln Gly Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ser Trp Asn

20 25 30

Trp Ile Arg Gln Ala Pro Ile His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

35 40 45

Asn Tyr Ala Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ala Val Thr

50 55 60

Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser

65 70 75 80

Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Phe Gly

85 90 95

Ser Thr Ala Trp Tyr Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆77重链可变区的核苷酸序列

<400> 10

cagggccagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccac ctgcaccgtg 60

accggctaca gcatcaccag cgactacagc tggaactgga tcaggcaggc ccccatccac 120

ggcctggagt ggatcggcta catcaactac gccggcagca ccagctacaa ccccagcctg 180

gaggccgtga ccatcaccgc cgacaagagc accagcaccg cctacatgga gctgagcagc 240

ctgaggagcg aggacaccgc cgtgtactac tgcgccaggt ggttcggcag caccgcctgg 300

tacatcgacg tgtggggcca gggcaccacc gtgaccgtga gcagc 345

<210> 11

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆77轻链可变区的氨基酸序列

<400> 11

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gln

1 5 10 15

Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ala Leu Leu His Ser Asp

20 25 30

Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Leu Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Ile Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val

65 70 75 80

Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly Val His Ile

85 90 95

Pro Tyr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆77轻链可变区的核苷酸序列

<400> 12

gacgtggtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga ccctgcagcc cgccagcatc 60

agctgcaaga gcagccaggc cctgctgcac agcgacggca agacctacct gtactggtac 120

ctgcagaagc ccggccagag ccccaagctg ctgatctacg agctgagcag caggttcagc 180

ggcatccccg acaggatcac cggcagcggc accgacttca ccctgaagat cagcagggtg 240

gaggccgagg acctgggcgt gtacttctgc ttccagggcg tgcacatccc ctacagcttc 300

ggccagggca ccaagctgga gatcaag 327

<210> 13

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆16重链可变区的氨基酸序列

<400> 13

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

115 120

<210> 14

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆16重链可变区的核苷酸序列

<400> 14

caagttcagt tattggaatc tggtgctgag cttgtccgtc ctggctcctc agtaaaaatt 60

tcgtgtaagg ccagtggata tgcatttagc tcttactgga tgaattgggt gaaacaacgc 120

cccgggcagg gtctcgaatg gatcggccaa atatggccag gagatgggga cactaactat 180

aatggtaagt tcaaaggcaa ggcgacccta acagctgatg agtcctcatc gacggcctac 240

atgcagctga gtagcttacg atctgaagac tccgcagttt attcatgcgc gcggagagag 300

actaccacag tcggaaggta ctattacgct atggattatt gggggcaagg tacgactgta 360

acc 363

<210> 15

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆16轻链可变区的氨基酸序列

<400> 15

Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Arg Ser

<210> 16

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆16轻链可变区的核苷酸序列

<400> 16

gaattagttt tgactcaatc tcctgcttcc cttgccgtct cactcggtca gcgtgcaacc 60

atttcgtgta aagcgagtca aagcgtagat tatgacggcg attcttacct aaattggtat 120

cagcaaatcc ccggacagcc accgaagctg ttaatatacg acgcttccaa cttggtgtca 180

gggattcctc cccgcttttc gggtagtggc agcggaacag atttcacgct taatatccat 240

ccagttgaga aagtcgacgc cgcaacttat cactgccaac agtctaccga agatccgtgg 300

acatttgggg gtggcacgaa gctcgagata aaacgacggt cc 342

<210> 17

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆75重链可变区的氨基酸序列

<400> 17

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ser Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Thr Val Thr

115 120

<210> 18

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆75重链可变区的核苷酸序列

<400> 18

gaattagttt tgactcaatc tcctgcttcc cttgccgtct cactcggtca gcgtgcaacc 60

atttcgtgta aagcgagtca aagcgtagat tatgacggcg attcttacct aaattggtat 120

cagcaaatcc ccggacagcc accgaagctg ttaatatacg acgcttccaa cttggtgtca 180

gggattcctc cccgcttttc gggtagtggc agcggaacag atttcacgct taatatccat 240

ccagttgaga aagtcgacgc cgcaacttat cactgccaac agtctaccga agatccgtgg 300

acatttgggg gtggcacgaa gctcgagata aaacgacggt cc 342

<210> 19

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆75轻链可变区的氨基酸序列

<400> 19

Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ala Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Leu Leu Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Arg Ser

<210> 20

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆75轻链可变区的核苷酸序列

<400> 20

gaattagttt tgactcaatc tcctgctgcc cttgcagtct ccctcggtca gcgtgcgacc 60

atttcatgtg ctgcctcgca aagtgtagat tatgacggcg atagctacct aaattggtat 120

cagcaaatcc ccggacagcc accgaaactg ttaatatacg acgcatctaa cttggtgtcc 180

gggattcctc cccgcttttc aggttcgggc agtggaacag atttcacgct taatatccat 240

ccagttgaga aggtcgacgc gctcctatat cactgccaac agagcactga agatccgtgg 300

acctttgggg gtggcacaaa actggagata aagcgacggt ct 342

<210> 21

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆81重链可变区的氨基酸序列

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ser Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Thr Ala Tyr Asn Pro Ala Leu Lys

50 55 60

Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr Met Glu

65 70 75 80

Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Asp Leu Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆81重链可变区的核苷酸序列

<400> 22

caggtgcagc tggtgcagag cggcgtggag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agcgactaca gctactgggt gaggcaggcc 120

cccggccagg gcctggagtg gatgggcggc atcaacccca gcaacggcac cgcctacaac 180

cccgccctga agagggtgac cctgaccacc gacagcagca ccaccaccgc ctacatggag 240

ctgaagagcc tgcagttcga cgacaccgcc gtgtactact gcgccaggag ggactacagg 300

ttcgacatgg gcgacctggg ccagggcacc accgtgaccg tgagcagc 348

<210> 23

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆81轻链可变区的氨基酸序列

<400> 23

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Asp Gly

20 25 30

Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Asp Leu Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 24

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆81轻链可变区的核苷酸序列

<400> 24

gagatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctga gccccggcga gagggccacc 60

ctgagctgca gggccagcaa gggcgtgagc gacggcaaga cctacctgta ctggtaccag 120

cagaagcccg gccaggcccc caggctgctg atctacgagg ccagctacct ggagagcggc 180

gtgcccgcca ggttcagcgg cagcggcacc gacttcaccc tgaccatcag cagcctggag 240

cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cacagcaggg acctgcccta caccttcggc 300

ggcggcacca aggtggagat caag 324

<210> 25

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆22重链可变区的氨基酸序列

<400> 25

Gln Gly Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp

20 25 30

Val Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Lys Phe Lys Gly Lys

35 40 45

Ala Thr Leu Thr Ala Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Tyr

50 55 60

Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Thr Val Thr Trp Gly

65 70 75 80

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Lys

85 90

<210> 26

<211> 282

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆22重链可变区的核苷酸序列

<400> 26

caaggtcagt tagttcaatc tggcgctgaa gtcaaaaagc ctggagccac ttgtaccgta 60

acagggtatg cattttcctc atactggatg aattgggtgt ggcccggtga tggcgacacg 120

aactataata aattcaaggg aaaagcgact ttgaccgctg ttgggcgtta ctattacgcc 180

atggattatt actattacgc aatggactat tggggtcttg gcacaacggt cacttaatgg 240

ggacagggga ccacagtaac ggtgtcgagt ctcaagtagt ga 282

<210> 27

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆22轻链可变区的氨基酸序列

<400> 27

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gln

1 5 10 15

Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp

20 25 30

Tyr Gln Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly

35 40 45

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Leu Gly Val Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ser Tyr

85 90 95

Met Gln Leu Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 28

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆22轻链可变区的核苷酸序列

<400> 28

gatgttgtca tgactcaatc tcctttatcc ttgcccgtaa cccttcagcc agcttcaatt 60

tcgtgtaaat atgacggtga tagttacctc aattggtatc aagccagcaa cctagtgtct 120

ggcatcccgc ctcgtttttc cggatcaggg tcgggtacag acgcaagtaa tctggttagc 180

ggcatacccc gcttctctgg atccgggacg gattttactt taaagatttc acgagtcgaa 240

gcggaggact tgggtgtaac cgctgatgaa tcgagtagca catcttacat gcagcttggc 300

acgaaactcg agatcaagcg g 321

<210> 29

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-1特异性抗体的重链的氨基酸序列

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ser Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Thr Ala Tyr Asn Pro Ala Leu Lys

50 55 60

Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr Met Glu

65 70 75 80

Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Asp Leu Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 30

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-1特异性抗体的重链的核苷酸编码序列

<400> 30

caggtgcagc tggtgcagag cggcgtggag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agcgactaca gctactgggt gaggcaggcc 120

cccggccagg gcctggagtg gatgggcggc atcaacccca gcaacggcac cgcctacaac 180

cccgccctga agagggtgac cctgaccacc gacagcagca ccaccaccgc ctacatggag 240

ctgaagagcc tgcagttcga cgacaccgcc gtgtactact gcgccaggag ggactacagg 300

ttcgacatgg gcgacctggg ccagggcacc accgtgaccg tgagcagcgc cagcaccaag 360

ggccccagcg tgttccccct ggccccctgc agcaggagca ccagcgagag caccgccgcc 420

ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgagctg gaacagcggc 480

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagcagcgg cctgtacagc 540

ctgagcagcg tggtgaccgt gcccagcagc agcctgggca ccaagaccta cacctgcaac 600

gtggaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaggg tggagagcaa gtacggcccc 660

ccctgccccc cctgccccgc ccccgagttc ctgggcggcc ccagcgtgtt cctgttcccc 720

cccaagccca aggacaccct gatgatcagc aggacccccg aggtgacctg cgtggtggtg 780

gacgtgagcc aggaggaccc cgaggtgcag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 840

cacaacgcca agaccaagcc cagggaggag cagttcaaca gcacctacag ggtggtgagc 900

gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc 960

aacaagggcc tgcccagcag catcgagaag accatcagca aggccaaggg ccagcccagg 1020

gagccccagg tgtacaccct gccccccagc caggaggaga tgaccaagaa ccaggtgagc 1080

ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac 1140

ggccagcccg agaacaacta caagaccacc ccccccgtgc tggacagcga cggcagcttc 1200

ttcctgtaca gcaggctgac cgtggacaag agcaggtggc aggagggcaa cgtgttcagc 1260

tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagagcct gagcctgagc 1320

ctgggcaagt gataa 1335

<210> 31

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-1特异性抗体的轻链的氨基酸序列

<400> 31

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Asp Gly

20 25 30

Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Asp Leu Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 32

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-1特异性抗体的轻链的核苷酸编码序列

<400> 32

gagatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctga gccccggcga gcgcgccacc 60

ctgagctgcc gcgccagcaa gggcgtgagc gacggcaaga cctacctgta ctggtaccag 120

cagaagcccg gccaggcccc ccgcctgctg atctacgagg ccagctacct ggagagcggc 180

gtgcccgccc gcttcagcgg cagcggcacc gacttcaccc tgaccatcag cagcctggag 240

cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cacagccgcg acctgcccta caccttcggc 300

ggcggcacca aggtggagat caagcgcacc gtggccgccc ccagcgtgtt catcttcccc 360

cccagcgacg agcagctgaa gagcggcacc gccagcgtgg tgtgcctgct gaacaacttc 420

tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagag cggcaacagc 480

caggagagcg tgaccgagca ggacagcaag gacagcacct acagcctgag cagcaccctg 540

accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag 600

ggcctgagca gccccgtgac caagagcttc aaccgcggcg agtgctgata a 651

<210> 33

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗-PD-1 scFv-Fc 融合蛋白氨基酸序列

<400> 33

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Asp Gly

20 25 30

Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Asp Leu Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val

115 120 125

Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser

130 135 140

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Tyr Trp Val

145 150 155 160

Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro

165 170 175

Ser Asn Gly Thr Ala Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Arg Val Thr Leu Thr

180 185 190

Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln

195 200 205

Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe

210 215 220

Asp Met Gly Asp Leu Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Glu

225 230 235 240

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Gly Lys

465

<210> 34

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗-PD-1 scFv-Fc 融合蛋白核酸序列

<400> 34

gagatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctga gccccggcga gagggccacc 60

ctgagctgca gggccagcaa gggcgtgagc gacggcaaga cctacctgta ctggtaccag 120

cagaagcccg gccaggcccc caggctgctg atctacgagg ccagctacct ggagagcggc 180

gtgcccgcca ggttcagcgg cagcggcacc gacttcaccc tgaccatcag cagcctggag 240

cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cacagcaggg acctgcccta caccttcggc 300

ggcggcacca aggtggagat caagggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc 360

ggcggcagcc aggtgcagct ggtgcagagc ggcgtggagg tgaagaagcc cggcgccagc 420

gtgaaggtga gctgcaaggc cagcggctac accttcacca gcgactacag ctactgggtg 480

aggcaggccc ccggccaggg cctggagtgg atgggcggca tcaaccccag caacggcacc 540

gcctacaacc ccgccctgaa gagggtgacc ctgaccaccg acagcagcac caccaccgcc 600

tacatggagc tgaagagcct gcagttcgac gacaccgccg tgtactactg cgccaggagg 660

gactacaggt tcgacatggg cgacctgggc cagggcacca ccgtgaccgt gagcagcgag 720

agcaagtacg gccccccctg ccccccctgc cccgcccccg agttcctggg cggccccagc 780

gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tcagcaggac ccccgaggtg 840

acctgcgtgg tggtggacgt gagccaggag gaccccgagg tgcagttcaa ctggtacgtg 900

gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagcccaggg aggagcagtt caacagcacc 960

tacagggtgg tgagcgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 1020

aagtgcaagg tgagcaacaa gggcctgccc agcagcatcg agaagaccat cagcaaggcc 1080

aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtac accctgcccc ccagccagga ggagatgacc 1140

aagaaccagg tgagcctgac ctgcctggtg aagggcttct accccagcga catcgccgtg 1200

gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac 1260

agcgacggca gcttcttcct gtacagcagg ctgaccgtgg acaagagcag gtggcaggag 1320

ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1380

agcctgagcc tgagcctggg caagtgataa 1410

<210> 35

<211> 418

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD19特异性抗体的重链的氨基酸序列

<400> 35

Gln Gly Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp

20 25 30

Val Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Lys Phe Lys Gly Lys

35 40 45

Ala Thr Leu Thr Ala Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Tyr

50 55 60

Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Thr Val Thr Trp Gly

65 70 75 80

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Lys Ala Ser Thr Lys Gly

85 90 95

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

100 105 110

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

115 120 125

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

130 135 140

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

145 150 155 160

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val

165 170 175

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

180 185 190

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly

195 200 205

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

210 215 220

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

225 230 235 240

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

245 250 255

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

260 265 270

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

275 280 285

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

290 295 300

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

305 310 315 320

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

325 330 335

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

340 345 350

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

355 360 365

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

370 375 380

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

385 390 395 400

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

405 410 415

Gly Lys

<210> 36

<211> 1257

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD19特异性抗体的重链的核苷酸编码序列

<400> 36

cagggccagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccac ctgcaccgtg 60

accggctacg ccttcagcag ctactggatg aactgggtgt ggcccggcga cggcgacacc 120

aactacaaca agttcaaggg caaggccacc ctgaccgccg tgggccgcta ctactacgcc 180

atggactact actactacgc catggactac tggggcctgg gcaccaccgt gacctggggc 240

cagggcacca ccgtgaccgt gagcagcctg aagagcacca agggccccag cgtgttcccc 300

ctggccccct gcagcaggag caccagcgag agcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag 360

gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgagc tggaacagcg gcgccctgac cagcggcgtg 420

cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc 480

gtgcccagca gcagcctggg caccaagacc tacacctgca acgtggacca caagcccagc 540

aacaccaagg tggacaagag ggtggagagc aagtacggcc ccccctgccc cccctgcccc 600

gcccccgagt tcctgggcgg ccccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 660

ctgatgatca gcaggacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaggac 720

cccgaggtgc agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag 780

cccagggagg agcagttcaa cagcacctac agggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac 840

caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtga gcaacaaggg cctgcccagc 900

agcatcgaga agaccatcag caaggccaag ggccagccca gggagcccca ggtgtacacc 960

ctgcccccca gccaggagga gatgaccaag aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag 1020

ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca acggccagcc cgagaacaac 1080

tacaagacca ccccccccgt gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagcaggctg 1140

accgtggaca agagcaggtg gcaggagggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag 1200

gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgagcctga gcctgggcaa gtgataa 1257

<210> 37

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD19特异性抗体的轻链的氨基酸序列

<400> 37

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gln

1 5 10 15

Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp

20 25 30

Tyr Gln Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly

35 40 45

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Leu Gly Val Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ser Tyr

85 90 95

Met Gln Leu Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 38

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19特异性抗体的轻链的核苷酸编码序列

<400> 38

gacgtggtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga ccctgcagcc cgccagcatc 60

agctgcaagt acgacggcga cagctacctg aactggtacc aggccagcaa cctggtgagc 120

ggcatccccc cccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acgccagcaa cctggtgagc 180

ggcatccccc gcttcagcgg cagcggcacc gacttcaccc tgaagatcag ccgcgtggag 240

gccgaggacc tgggcgtgac cgccgacgag agcagcagca ccagctacat gcagctgggc 300

accaagctgg agatcaagcg caccgtggcc gcccccagcg tgttcatctt cccccccagc 360

gacgagcagc tgaagagcgg caccgccagc gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420

cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agagcggcaa cagccaggag 480

agcgtgaccg agcaggacag caaggacagc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 540

agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca ccagggcctg 600

agcagccccg tgaccaagag cttcaaccgc ggcgagtgct gataa 645

<210> 39

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗-CD19 scFv-Fc 融合蛋白氨基酸序列

<400> 39

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gln

1 5 10 15

Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp

20 25 30

Tyr Gln Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly

35 40 45

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Leu Gly Val Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ser Tyr

85 90 95

Met Gln Leu Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Gly Gln Leu Val Gln

115 120 125

Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Thr Cys Thr Val Thr Gly

130 135 140

Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Trp Pro Gly Asp Gly

145 150 155 160

Asp Thr Asn Tyr Asn Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Val

165 170 175

Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

180 185 190

Trp Gly Leu Gly Thr Thr Val Thr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

195 200 205

Val Ser Ser Leu Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

325 330 335

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

340 345 350

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

355 360 365

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

385 390 395 400

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

405 410 415

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

420 425 430

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 40

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗-CD19 scFv-Fc 融合蛋白核苷酸序列

<400> 40

gacgtggtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga ccctgcagcc cgccagcatc 60

agctgcaagt acgacggcga cagctacctg aactggtacc aggccagcaa cctggtgagc 120

ggcatccccc cccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acgccagcaa cctggtgagc 180

ggcatccccc gcttcagcgg cagcggcacc gacttcaccc tgaagatcag ccgcgtggag 240

gccgaggacc tgggcgtgac cgccgacgag agcagcagca ccagctacat gcagctgggc 300

accaagctgg agatcaagcg cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 360

ggcagccagg gccagctggt gcagagcggc gccgaggtga agaagcccgg cgccacctgc 420

accgtgaccg gctacgcctt cagcagctac tggatgaact gggtgtggcc cggcgacggc 480

gacaccaact acaacaagtt caagggcaag gccaccctga ccgccgtggg ccgctactac 540

tacgccatgg actactacta ctacgccatg gactactggg gcctgggcac caccgtgacc 600

tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgagc agcctgaagg agagcaagta cggccccccc 660

tgccccccct gccccgcccc cgagttcctg ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc 720

aagcccaagg acaccctgat gatcagcagg acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac 780

gtgagccagg aggaccccga ggtgcagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 840

aacgccaaga ccaagcccag ggaggagcag ttcaacagca cctacagggt ggtgagcgtg 900

ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac 960

aagggcctgc ccagcagcat cgagaagacc atcagcaagg ccaagggcca gcccagggag 1020

ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccag gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg 1080

acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc 1140

cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc 1200

ctgtacagca ggctgaccgt ggacaagagc aggtggcagg agggcaacgt gttcagctgc 1260

agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agagcctgag cctgagcctg 1320

ggcaagtgat aa 1332

<210> 41

<211> 666

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗-PD-1重链-CD19 scFv氨基酸序列

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ser Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Thr Ala Tyr Asn Pro Ala Leu Lys

50 55 60

Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr Met Glu

65 70 75 80

Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Asp Leu Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu

450 455 460

Pro Val Thr Leu Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Tyr Asp Gly Asp

465 470 475 480

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro

485 490 495

Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ala Ser Asn Leu Val

500 505 510

Ser Gly Ile Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

515 520 525

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Thr Ala Asp Glu Ser

530 535 540

Ser Ser Thr Ser Tyr Met Gln Leu Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

545 550 555 560

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

565 570 575

Gly Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Thr

580 585 590

Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val

595 600 605

Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Lys Phe Lys Gly Lys Ala

610 615 620

Thr Leu Thr Ala Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Tyr Tyr

625 630 635 640

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Thr Val Thr Trp Gly Gln

645 650 655

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Lys

660 665

<210> 42

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗-PD-1重链-CD19 scFv核苷酸序列

<400> 42

caggtgcagc tggtgcagag cggcgtggag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agcgactaca gctactgggt gaggcaggcc 120

cccggccagg gcctggagtg gatgggcggc atcaacccca gcaacggcac cgcctacaac 180

cccgccctga agagggtgac cctgaccacc gacagcagca ccaccaccgc ctacatggag 240

ctgaagagcc tgcagttcga cgacaccgcc gtgtactact gcgccaggag ggactacagg 300

ttcgacatgg gcgacctggg ccagggcacc accgtgaccg tgagcagcgc cagcaccaag 360

ggccccagcg tgttccccct ggccccctgc agcaggagca ccagcgagag caccgccgcc 420

ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgagctg gaacagcggc 480

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagcagcgg cctgtacagc 540

ctgagcagcg tggtgaccgt gcccagcagc agcctgggca ccaagaccta cacctgcaac 600

gtggaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaggg tggagagcaa gtacggcccc 660

ccctgccccc cctgccccgc ccccgagttc ctgggcggcc ccagcgtgtt cctgttcccc 720

cccaagccca aggacaccct gatgatcagc aggacccccg aggtgacctg cgtggtggtg 780

gacgtgagcc aggaggaccc cgaggtgcag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 840

cacaacgcca agaccaagcc cagggaggag cagttcaaca gcacctacag ggtggtgagc 900

gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc 960

aacaagggcc tgcccagcag catcgagaag accatcagca aggccaaggg ccagcccagg 1020

gagccccagg tgtacaccct gccccccagc caggaggaga tgaccaagaa ccaggtgagc 1080

ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac 1140

ggccagcccg agaacaacta caagaccacc ccccccgtgc tggacagcga cggcagcttc 1200

ttcctgtaca gcaggctgac cgtggacaag agcaggtggc aggagggcaa cgtgttcagc 1260

tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagagcct gagcctgagc 1320

ctgggcaagg acgtggtgat gacccagagc cccctgagcc tgcccgtgac cctgcagccc 1380

gccagcatca gctgcaagta cgacggcgac agctacctga actggtacca ggccagcaac 1440

ctggtgagcg gcatcccccc ccgcttcagc ggcagcggca gcggcaccga cgccagcaac 1500

ctggtgagcg gcatcccccg cttcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaagatcagc 1560

cgcgtggagg ccgaggacct gggcgtgacc gccgacgaga gcagcagcac cagctacatg 1620

cagctgggca ccaagctgga gatcaagcgc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 1680

ggcggcggcg gcagccaggg ccagctggtg cagagcggcg ccgaggtgaa gaagcccggc 1740

gccacctgca ccgtgaccgg ctacgccttc agcagctact ggatgaactg ggtgtggccc 1800

ggcgacggcg acaccaacta caacaagttc aagggcaagg ccaccctgac cgccgtgggc 1860

cgctactact acgccatgga ctactactac tacgccatgg actactgggg cctgggcacc 1920

accgtgacct ggggccaggg caccaccgtg accgtgagca gcctgaagtg ataa 1974

Claims

1.一种抗PD-1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段，其包括：

2.根据权利要求1所述的抗PD-1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段，其中所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域由依次连接的抗PD-1特异性抗体的轻链可变区(抗PD-1VL)、重链可变区(抗PD-1VH)、铰链区和Fc片段(抗PD-1CH2-CH3)组成，或由一组抗PD-1特异性抗体的轻链(抗PD-1VL-CL)和重链(抗PD-1VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)组成，或由两组抗PD-1特异性抗体的轻链(抗PD-1VL-CL)和重链(抗PD-1VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)组成，或由抗PD-1特异性抗体的轻链可变区(抗PD-1VL)和重链可变区(抗PD-1VH)组成；

3.根据权利要求1或2所述的抗PD-1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段，

其包括：

b’.特异性识别和结合CD19的结构域，其由一组抗CD19特异性抗体的轻链(抗CD19VL-CL)和重链(抗CD19VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)组成；

优选地，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域与所述特异性识别和结合CD19的结构域通过一个或多个二硫键，例如一个或多个位于铰链区的二硫键连接；或者

其包括：

b”.特异性识别和结合CD19的结构域，其由依次连接的抗CD19特异性抗体的轻链可变区(抗CD19VL)、重链可变区(抗CD19VH)、铰链区和Fc片段(抗CD19CH2-CH3)组成；

其包括：

b”’.特异性识别和结合CD19的结构域，其由一组抗CD19特异性抗体的轻链(抗CD19VL-CL)和重链(抗CD19VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)组成；

其包括：

b””.特异性识别和结合CD19的结构域，其由两组抗CD19特异性抗体的轻链可变区(抗CD19VL)和重链可变区(抗CD19VH)组成；

4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗PD-1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段，其是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗PD-1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段，其中所述特异性识别和结合PD-1的结构域中的重链可变区的氨基酸序列如SEQNo:1、5、9或21所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、7、11或23所示；

优选地，所述特异性识别和结合CD19的结构域中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:13、17或25所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15、19或27所示；

优选地，所述抗PD-1特异性抗体的重链(抗PD-1VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)的氨基酸序列为SEQ ID No:29，核苷酸编码序列为SEQ ID No:30；所述抗PD-1特异性抗体的轻链(抗PD-1VL-CL)的氨基酸序列为SEQ ID No:31，核苷酸编码序列为SEQ ID No:32；由依次连接的抗PD-1特异性抗体的轻链可变区(抗PD-1VL)、重链可变区(抗PD-1VH)、铰链区和Fc片段(抗PD-1CH2-CH3)组成的所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域的氨基酸编码序列为SEQ ID No:33，核苷酸编码序列为SEQ ID No:34；

优选地，所述抗CD19特异性抗体的重链(抗CD19VH-CH1-铰链区-CH2-CH3)的氨基酸序列为SEQ ID No:35，核苷酸编码序列为SEQ ID No:36；所述抗CD19特异性抗体的轻链(抗CD19VL-CL)的氨基酸序列为SEQ ID No:37，核苷酸编码序列为SEQ ID No:38；由依次连接的抗CD19特异性抗体的轻链可变区(抗CD19VL)、重链可变区(抗CD19VH)、铰链区和Fc片段(抗CD19CH2-CH3)组成的所述特异性识别和结合CD19的结构域的氨基酸序列为SEQ ID No:39，核苷酸编码序列为SEQ ID No:40；由抗CD19特异性抗体的轻链可变区(抗CD19VL)和重链可变区(抗CD19VH)组成的所述特异性识别和结合CD19的结构域的氨基酸序列为SEQ IDNo:41，核苷酸编码序列为SEQ ID No:42；

优选地，所述特异性识别和结合PD-1的结构域中的重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:2、6、10或22所示；轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:4、8、12或24所示；

优选地，所述特异性识别和结合CD19的结构域中的重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:14、18、26所示；轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:16、20、28所示。

6.一种编码根据权利要求1至5中任一项所述的抗PD-1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段的核酸分子。

7.一种包含根据权利要求6所述的核酸分子的表达载体。

8.一种包含根据权利要求7所述的表达载体的宿主细胞。

9.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至5中任一项所述的抗PD-1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段，或根据权利要求6所述的核酸分子，或根据权利要求7所述的表达载体或根据权利要求8所述的宿主细胞。

优选地，所述药物组合物还包括一种或多种其他抗肿瘤药物；优选地，所述药物组合物还与一种或多种其他抗肿瘤治疗方法，例如化学疗法、放射疗法和/或生物疗法一起使用。

10.根据权利要求1至5中任一项所述的抗PD-1和CD19双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段、或根据权利要求6所述的核酸分子、或根据权利要求7所述的表达载体或根据权利要求8所述的宿主细胞以及通过抑制PD-1，PD-L1或PD-L2等免疫抑制信号通路而使免疫增强联合靶向CD19在治疗肿瘤(例如非霍奇金淋巴瘤)的药物中的应用。