CN106701814A - 调节薯类叶片中淀粉含量的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种调节薯类叶片中淀粉含量的方法及应用。首次揭示通过改变SRD基因在薯类植物中的表达，可以显著调节薯类植物的淀粉性状，在植物品质的遗传改良上具有良好的应用前景。

Description

调节薯类叶片中淀粉含量的方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术及植物学领域，更具体地，本发明涉及调节薯类叶片中淀粉含量的方法及应用。

背景技术

薯类植物指具有可供食用块根或地下茎的一类的陆生作物。有块根、块茎类，如番薯(红薯、甘薯)、木薯、马铃薯、薯蓣(山药)、脚板薯等，多行无性繁殖，只留薯块作种，并可以用藤本进行繁殖。这类植物一般耐寒力较弱，多在无霜季节栽培，低温会抑制薯类作物的生长，造成块根或块茎的减产，因此种植薯类作物尽量避免长时间的低温期；此外，疏松、肥沃、深厚的土壤和多量钾肥有利于提高薯类作物产量及品质。

绝大多数薯类植物的叶片和储藏根中都会大量富集淀粉，目前薯类植物的储藏根是生产淀粉的主要原料，但叶片作为进行光合作用固定二氧化碳的主要器官，也具有生产新型淀粉的潜能。通过调控叶片中淀粉的积累以及改良叶片中淀粉的性质，充分发挥薯类叶片的优势生产新型淀粉，一直是本领域研究的重点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调节薯类叶片中淀粉含量的方法及应用。

在本发明的第一方面，提供一种调节薯类植物的叶片的淀粉性状的方法，所述方法包括：调节薯类植物中SRD多肽的表达。

在一个优选例中，所述的薯类植物包括：木薯，甘薯、马铃薯、山药、芋头、葛根、魔芋、洋姜、雪莲果等。

在另一优选例中，所述的SRD多肽选自下组：

(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)限定的多肽序列有70％以上(较佳地80％以上，85％以上，更佳地90％以上，如95％以上，98％以上，99％以上)同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述方法包括：降低植物中SRD多肽的表达，从而：

提高薯类植物叶片中的淀粉含量；

提高薯类植物叶片中淀粉颗粒的直径；

降低薯类植物叶片中淀粉的磷酸化程度；

增加薯类植物叶片中直链淀粉的含量；和/或

增加淀粉中短链(较佳地为DP6-14)的含量，降低淀粉中长链部分(较佳地为DP20-37)的含量。

在另一优选例中，所述降低植物中SRD多肽的表达包括：将干扰所述SRD多肽表达的干扰分子转入植物(如植物的细胞、组织、器官或种子)，从而下调植物中SRD多肽的表达。

在另一优选例中，干扰所述SRD多肽表达的干扰分子靶向SRD多肽的编码基因或其转录本；较佳地，靶向该编码基因的第741-1193位或其转录本。

在另一优选例中，所述的干扰分子含有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向 式(I)，

式(I)中，

Seq_正向为SRD多肽的编码基因的片段，Seq_反向为与Seq_正向互补的多核苷酸；较佳地，Seq_正向为SRD多肽的编码基因的第741-1193位；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

在另一优选例中，式(I)所示的结构在转入植物后，形成式(II)所示的二级结构：

式(II)中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间的基本上互补的关系。

在另一优选例中，所述方法还包括后续步骤：从调节SRD多肽的表达后的植物中选择出相较调节前植物而言性状获得变化的植物。

在本发明的另一方面，提供一种下调(如干扰)SRD多肽表达的物质的用途，用于调节薯类植物的叶片的淀粉性状。

在一个优选例中，所述的下调SRD多肽表达的物质用于：

提高薯类植物叶片中的淀粉含量；

提高薯类植物叶片中淀粉颗粒的直径；

降低薯类植物叶片中淀粉的磷酸化程度；

增加薯类植物叶片临时性淀粉中直链淀粉的含量；和/或

增加淀粉中短链的含量，降低淀粉中长链部分的含量。

在另一优选例中，所述的薯类植物包括：木薯，甘薯、马铃薯、山药、芋头、葛根、魔芋、洋姜、雪莲果等。

在本发明的另一方面，提供一种下调SRD多肽表达从而调节薯类植物的叶片的淀粉性状的干扰分子，其含有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向 式(I)，

式(I)中，

Seq_正向为SRD多肽的编码基因片段，Seq_反向为与Seq_正向互补的多核苷酸；较佳地，Seq_正向为SRD多肽的编码基因的第741-1193位；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的干扰分子。

在本发明的另一方面，提供一种SRD多肽或其编码基因的用途，用于作为鉴定薯类植物的叶片的淀粉性状的分子标记；所述的薯类植物的叶片的淀粉性状包括：

薯类植物叶片中的淀粉含量；

薯类植物叶片中淀粉颗粒的直径；

薯类植物叶片中淀粉的磷酸化程度；

薯类植物叶片临时性淀粉中直链淀粉的含量；和/或

增加淀粉中短链的含量，降低淀粉中长链部分的含量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、含有发卡结构的RNAi双元表达载体示意图。

图2、转基因植株Southern blot鉴定。

图3、SRDRNAi转基因植株中木薯SRD表达水平的变化。

图4、转基因植株中MeSRD蛋白表达的Western blot分析结果。

抗体：MeSRD兔源多克隆抗体；

内参：以Rubisco为蛋白上样量内参；

对照：野生型木薯TMS60444；

蛋白提取材料为温室木薯植株的成熟叶片。

图5、野生型木薯TMS60444及转基因木薯叶片中临时性淀粉的含量。叶片取自上海五厍中试试验田自然条件下生长的木薯植株，图中所示数据为3次实验重复。

图6、暗周期末野生型木薯TMS60444及转基因不同发育时期木薯叶片碘染结果。

图7、野生型木薯TMS60444及转基因木薯叶片中淀粉的扫描电镜结果。

叶片中的淀粉粒经提取后通过扫描电镜观察，A-D分别为WT、转基因株系G1i-12、转基因株系G1i-17、转基因株系G1i-31叶片中的淀粉。

图8、野生型木薯TMS60444及转基因木薯叶片中淀粉的磷酸化水平图谱。

A：葡萄糖-6-磷酸标准样品；

B：葡萄糖-3-磷酸标准样品；

C：野生型木薯TMS60444叶片中葡萄糖-6-磷酸及葡萄糖-3-磷酸含量；

D：SRDRNAi转基因木薯叶片中葡萄糖-6-磷酸及葡萄糖-3-磷酸含量。

图9、野生型木薯TMS60444及转基因木薯叶片中淀粉的磷酸化程度。

纵坐标为每毫克淀粉中含有的葡萄糖-6-磷酸的量，淀粉提取材料用大田木薯植株的叶片。**代表t-test检验差异极显著(p<0.01)。

图10、野生型木薯TMS60444及转基因木薯叶片中淀粉的直链淀粉含量。

图中所示数据为三次重复结果。*代表t-test检验差异显著(p<0.05)，**代表t-test检验差异极显著(p<0.01)。

图11、野生型木薯TMS60444及转基因木薯叶片中淀粉的XRD衍射图谱。

叶片临时性淀粉的衍射图谱；淀粉分别从大田木薯的叶片及块根中提取。

图12、野生型木薯TMS60444及转基因木薯叶片中淀粉的链长分布。

A：野生型木薯TMS60444叶片支链淀粉的链长分布；

B-F：分别为野生型木薯TMS60444块根储存性淀粉、转基因植株G1i-12、17、28、31叶片临时性淀粉与野生型木薯TMS60444叶片临时性淀粉链长分布之差。以上数据为三次实验重复。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现通过改变SRD在薯类植物中的表达，可以显著调节薯类植物的淀粉性状，在植物品质的遗传改良上具有良好的应用前景。

如本文所用，本发明的“薯类植物”也称为“薯类作物”，主要指具有可供食用块根或地下茎的一类的陆生作物。包括但不限于：大戟科的块根植物如木薯、旋花科的块根植物如甘薯，茄科的块茎植物如马铃薯，薯蓣科的块根植物如山药，天南星科的块茎植物如芋头、魔芋，豆科块根植物如葛根，菊科块茎植物如洋姜，雪莲果等。

本发明还包括SRD多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的SRD多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种SRD多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，SRD多肽的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的SRD多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长SRD多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长SRD多肽的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“SRD多肽”指具有SRD多肽活性的SEQ ID NO:2序列的多肽。该术语还包括具有与SRD多肽相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括SRD多肽的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与SRD多肽DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含SRD多肽或其片段的融合蛋白。

任何与所述的SRD多肽同源性高(比如与SEQ ID NO:2所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有SRD多肽相同功能的蛋白也包括在本发明内。

发明还提供SRD多肽或多肽的类似物。这些类似物与天然SRD多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

应理解，虽然本发明的SRD多肽优选获自木薯，但是获自其它植物的与木薯SRD多肽高度同源(如具有70％以上，如80％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它多肽也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明还涉及编码本发明SRD多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。

本发明的SRD基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或SRD基因序列经基因工程产生的宿主细胞。

基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种改良薯类植物的方法，该方法包括调节所述薯类植物中SRD多肽的表达。

更优选地，所述的方法包括：降低所述植物中SRD多肽的表达(包括使SRD多肽不表达或低表达)，从而：提高薯类植物叶片中的淀粉含量；提高薯类植物叶片中淀粉颗粒的直径；降低薯类植物叶片中淀粉的磷酸化程度；和/或增加薯类植物叶片临时性淀粉中直链淀粉的含量；增加淀粉中短链的含量，降低淀粉中长链部分的含量。

可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低SRD多肽的表达或使之缺失表达，比如将携带反义SRD基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达SRD多肽。

作为本发明的一种实施方式，提供了一种降低植物中SRD多肽的表达的方法，所述的方法包括：

(1)将干扰SRD基因表达的干扰分子转入植物组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物组织、器官或种子再生成植物。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：

(a)含有反方向启动的SRD多肽的编码基因或基因片段(反义分子)的载体；

(b)含有可在植物体内形成特异性干扰SRD多肽的编码基因表达(或转录)的成分的干扰分子的载体；

(ii)将植物的组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物组织或器官。

较佳地，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述载体的植物织或器官；和

(iv)将步骤(iii)中的植物组织或器官再生成植物。

基于SRD基因的核苷酸序列，可以设计出在导入植物体后可形成特异性干扰SRD基因表达的分子的多核苷酸。设计时要考虑到特异性以及干扰的效率。本发明对干扰分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了SRD基因与植物性状的相关性以后，可以以各种途径制备出所述的干扰分子，从而用于调节植物性状。所述的干扰分子可通过转基因技术被输送到植物体内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到植物体内。

作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果优异的干扰分子，所述的干扰分子可特异性的干扰SRD基因的表达；并且经验证，其具有良好的干扰SRD基因表达的效果。所述的干扰分子是含有SEQ ID NO:1中第741-1193位所示的核苷酸序列的分子，构成发夹结构。

本发明还提供了一种干扰分子，所述干扰分子含有以下结构：Seq_正向为SRD基因片段(较佳地为SEQ ID NO:1中第741-1193位所示的核苷酸序列)，Seq_反向为与Seq_正向互补的多核苷酸；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

所述的干扰分子在导入到植物体内后，可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。也即，形成如下所示的二级结构：

其中，||表示在Seq_正向和Seq_反向之间的基本上互补的关系。所述的茎环结构可被植物体内的各种物质进一步作用、加工或剪切，并且形成双链RNA(dsRNA)。

通常，所述的干扰分子位于表达载体上。

本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了SRD基因或其同源基因的转基因植物；或者SRD多肽表达量(包括低表达或不表达)降低的植物等。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

此外，本发明还涉及利用SRD多肽或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用SRD多肽或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中SRD多肽的表达情况，鉴定植物的性状。还可利用SRD基因相关的植物特性作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。

本发明的方法可以制备获得叶片中的淀粉含量提高及淀粉颗粒增大的薯类植物，从而可实现从薯类植物的叶片中大量提取淀粉的工艺。

并且，本发明的方法可以提高薯类植物叶片中淀粉颗粒的直径(3-10μm)，使得其中的淀粉颗粒与来源于豆类(如绿豆)或谷物类(如米)的淀粉颗粒较为接近，这种颗粒淀粉作为小颗粒淀粉(小于10μm)具有良好的应用价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、MeSRD的克隆及序列分析

本发明人通过Blastp及Blastn在RIKEN cassava cDNA数据库(http://www.brc.riken.jp/inf/en/index.shtml)中搜索发现两条EST序列，定义为木薯的MeSRD基因，其全长4230bp，编码1410个氨基酸。

MeSRD核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：

ATGAGTAATAGCATAGGGCATAATTTATTCCAACAGAGTTTGATTCGTCCCGCGAGTTTTAAACATGGAAGCAATCTCAATTCTTCTGGCATTCCTGCAAGCTATTTATTCCAATCTGCCTCTGTGAGTCGAGGACTGCAGATAAGCAGGTCGCCAATATCCTCTAGTTTTTATGGAAAAAATTTGAGGGTGCGGAAATCAAAATTAGCCGTTGTAAATCCTCGTCCAGCTATAACAATTCCACGGGCTATATTGGCGATGGATCCGGCATCCCAGCTCCTAGGAAAATTCAACCTTGATGGAAATGTTGAATTGCAGGTGTTTGTTAGCAGTCACACTTCTGCTTCTACTGTGCAAGTACACATTCAGATAACATGCACTAGTGATTCTTTGCTCCTACACTGGGGTGGGAAACATGATAGAAAGGAAAACTGGGTACTTCCTAGTCGTTATCCAGATGGAACCAAAAATTATAAGAGCAGAGCCCTTAGAAGTCCTTTTGTCAAGTCTGGTTCAAGTTCTTACCTGAAAATAGAGATTGATGATCCTGCAATACAAGCCTTAGAATTTCTTATACTTGATGAAGCGCATAATAAATGGTTTAAAAATAATGGTGACAACTTTCATGTTAAATTACCTGCACGAGAGAAGCTGATAATTCCAAATATCTCAGTTCCTGAAGAGCTTGTACAAGTTCAAGCATATCTGAGGTGGGAAAGAAATGGTAAACAAATGTATACCCCAGAACAAGAAAAGAAAGAATATGAAGCCGCTCGTATTGAACTATT GGAGGAAGTAGCTAAGGGTACTTCCATTGAGGGCCTCCGAGCAAGGCTGACAAACAAAAA TGAAATTAAGGAGTCATCTGTCTCTAAAACACAAAGCAAGATACACGCTCAAGCTCATAG AAGATGGGAAAAATCTACTACTAGTAATGAAAGGTTTCAGCGCAATCAGAGGGACTTAGC ACAGCTTGTTACCAAATCTGCTACTAAAAAATCTGCAGAGGAAGCTGTTTCAGTAGAACCA AAACCAAAAGCATTGAAGGCAGTTGAACTTTTTGCTAAAGAAAAGGAAGAACGGGTTGGG GGTGCTGTTCTGAACAAGAAGATCTTTAAGCTCCAAGATGCGGAACTTCTGGTGCTTGTGA CCAAGCCTGCTGATAAGATGAAGGTTTATGTTGCCACTGATTTCAAAGAACCAGTCACTCTTCACTGGGCATTATCTAGGAAGGGTAAAGAGTGGTTGGCGCCACCACCAAGTGTGTTGCCTCCTGGTTCAGTTTCTTTGAACGAGGCTGCTGAAACACAACTTAAAAGCATTTCTTCAACTGAACTTTCTTATCAGGTCCAATACTTTGAAACGGAGATCGAAGAGAATTTTGTAGGGATGCCCTTTGTGCTTTTTTCTAATGAAAAATGGATAAAGAATAAGGGCTCTGACTTTTATGTTGAACTTAGTGGCGGACCTAGGCCAGTCCAAAAGGATGCTGGTGATGGAAGAGGTACAGCAAAAGTTTTATTGGACACAATTGCAGAGCTGGAGAGTGAAGCACAGAAATCCTTCATGCACCGATTTAATATTGCAGCTGATTTGATGGAGGATGCAAAGGATGCTGGTGAGTTGGGTTTTGCAGGGATCTTGGTGTGGATGAGATTTATGGCCACGAGGCAACTTATTTGGAACAAAAACTACAATGTGAAACCACGTGAGATCAGCAAGGCACAGGATAGGCTCACAGACTTGCTCCAGAATACTTATACAAGTCATCCTCAATATCGGGAGCTTTTGCGGATGATTATGTCTACTGTCGGTCGAGGTGGTGAAGGTGATGTGGGGCAGCGAATTCGGGATGAAATTTTAGTTATCCAGAGAAACAATGATTGCAAAGGTGGTATGATGGAGGAATGGCATCAGAAGCTGCATAATAACACAAGCCCTGATGATGTTGTTATCTGCCAGGCATTAATGGATTACATTAAAAGTGACCTTGACATCAGTGTGTACTGGAAAACTTTGAATGAAAATGGAATAACAAAAGAACGACTTTTAAGCTATGATCGTGCAATCCATTCTGAACCAAGCTTCAGGAGAGATCAAAAGGACGGTCTTTTGCGTGATCTCGGCAACTATATGAGAAGTTTGAAGGCAGTTCATTCTGGTGCAGATCTTGAGTCTGCTATTGCAAATTGTATGGGCTATAAAGATGAGGGTCAAGGTTTCATGGTTGGAGTGCAAATAAATCCCATTTCAGGCTTGCCATCTGGATTTCCAGAGTTGCTTCGATTTGTTCTCAAACATGTTGAAGATAGAAATGTAGAAGCACTTCTTGAGGGTTTGCTGGAGGCTCGTCAGGAGCTGAGGCCATTGCTGTTTAAGTCTAATAATCGTCTGAAAGATCTTCTATTTTTGGATATTGCCCTTGATTCTACTGTTAGGACAGCCATTGAGAGAGGATATGAGGAATTAAATGATGCTGGACCAGAGAAAATTATGTATTTCATCACCCTGGTTCTTGAAAATCTTGCGCTTTCATCAGATGATAATGAAGAGTTTGTCTATTGCTTGAAGGGATGGAATTATGCCCTAAGCATGTCCAAAAGTAAAAGCAATCACTGGGCATTATATGCAAAATCAGTCCTTGACAGAACTCGCCTTGCCCTGGCCAGCAAGGCTGAATGGTATCAGCAAGTTTTGCAACCATCAGCAGAGTATCTTGGATCACTGCTTGGAGTGGATCAGTGGGCTGTGAACATATTCACTGAAGAAATAGTTCGTGCTGGATCAGCTGCAGCTGTATCCTTGCTTCTTAATCGACTTGATCCAGTTCTTCGGAAGACTGCTCATCTTGGAAGTTGGCAGGTTATTAGCCCAGTTGAAGCTGCTGGGTATGTTGTTGTTGTGGATGAGTTGCTCACAGTACAGAATTTATCTTACGACCGCCCTACAATTTTAGTGGCAAGAAGAGTAAGTGGAGAAGAAGAAATTCCTGATGGTACAGTTGCTGTGCTGACATCTGACATGCCAGATGTCCTATCCCATGTTTCTGTACGAGCAAGAAATAGCAAGGTTTGCTTTGCCACATGTTTTGATCACAACATTCTGGACAATCTCCGAGCAAATGAAGGGAAATTATTGAATTTGAAACCTACATCAGCAGATATAGTCTATAGCGTGATCGAGGGTGAATTAGCAGATTTAAGTTCAAATAAGCTGAAAGAAGTTGGTCCTTCACCTATAAAGTTGATAAGAAAGCAGTTCAGTGGTAGATATGCCATATCATCGGAGGAGTTCACCGGTGAAATGGTTGGTGCCAAATCACGCAATATCGCGCATCTAAAAGGAAAAGTACCATCCTGGATTGGGATTCCTACATCGGTTGCCTTACCATTTGGAGTTTTTGAGAAGGTTCTTTCAGATGGTTCAAATCAAGAAGTGGCTAAGAAGTTGGAAGTTTTGAAGAAACAGTTGGAAGGAGGAGAGTCTAGTGTCCTCAGGAGAATTCGTGAGACAGTTTTACAGCTGGCAGCACCACCACAGCTGGTGCAAGAGCTGAAGACAAAGATGAAAAGTTCTGGGATGCCTTGGCCTGGCGATGAAGGTGAACAGCGATGGGAGCAAGCATGGATGGCTATAAAGAAGGTCTGGGCTTCAAAATGGAATGAGAGAGCATACTTCAGCACAAGGAAAGTGAAGTTGGACCATGATTACCTCTGCATGGCTGTCCTGGTTCAGGAGATAATAAATGCCGATTATGCATTTGTTATCCACACGACCAATCCATCTTCTGGGGATTCATCAGAGATATATGCTGAGGTAGTGAAGGGACTTGGAGAAACTCTTGTTGGAGCCTATCCCGGCCGTGCTTTGAGTTTTATCTGCAAGAAAAAAGATCTGAATTCTCCTCAGGTGTTGGGTTACCCAAGCAAACCCATTGGCCTTTTTATAAGACGTTCTATAATCTTCAGATCTGACTCCAATGGTGAAGATCTGGAAGGTTATGCTGGTGCTGGTCTTTATGATAGTGTTCCAATGGATGAGGAAGAGAAAGTTGTGCTTGATTACTCATATGATCCATTGATCACCGATGAAAGCTTCCGAAAATCAATTCTCTCTAACATAGCTCGTGCTGGAAGTGCCATTGAAGAGCTCTATGGATCTCCACAAGACATTGAAGGAGTAATAAGGGACGGTAAACTCTATGTGGTTCAGACAAGGCCTCAGATGTAA

MeSRD氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

MSNSIGHNLFQQSLIRPASFKHGSNLNSSGIPASYLFQSASVSRGLQISRSPISSSFYGKNLRVRKSKLAVVNPRPAITIPRAILAMDPASQLLGKFNLDGNVELQVFVSSHTSASTVQVHIQITCTSDSLLLHWGGKHDRKENWVLPSRYPDGTKNYKSRALRSPFVKSGSSSYLKIEIDDPAIQALEFLILDEAHNKWFKNNGDNFHVKLPAREKLIIPNISVPEELVQVQAYLRWERNGKQMYTPEQEKKEYEAARIELLEEVAKGTSIEGLRARLTNKNEIKESSVSKTQSKIHAQAHRRWEKSTTSNERFQRNQRDLAQLVTKSATKKSAEEAVSVEPKPKALKAVELFAKEKEERVGGAVLNKKIFKLQDAELLVLVTKPADKMKVYVATDFKEPVTLHWALSRKGKEWLAPPPSVLPPGSVSLNEAAETQLKSISSTELSYQVQYFETEIEENFVGMPFVLFSNEKWIKNKGSDFYVELSGGPRPVQKDAGDGRGTAKVLLDTIAELESEAQKSFMHRFNIAADLMEDAKDAGELGFAGILVWMRFMATRQLIWNKNYNVKPREISKAQDRLTDLLQNTYTSHPQYRELLRMIMSTVGRGGEGDVGQRIRDEILVIQRNNDCKGGMMEEWHQKLHNNTSPDDVVICQALMDYIKSDLDISVYWKTLNENGITKERLLSYDRAIHSEPSFRRDQKDGLLRDLGNYMRSLKAVHSGADLESAIANCMGYKDEGQGFMVGVQINPISGLPSGFPELLRFVLKHVEDRNVEALLEGLLEARQELRPLLFKSNNRLKDLLFLDIALDSTVRTAIERGYEELNDAGPEKIMYFITLVLENLALSSDDNEEFVYCLKGWNYALSMSKSKSNHWALYAKSVLDRTRLALASKAEWYQQVLQPSAEYLGSLLGVDQWAVNIFTEEIVRAGSAAAVSLLLNRLDPVLRKTAHLGSWQVISPVEAAGYVVVVDELLTVQNLSYDRPTILVARRVSGEEEIPDGTVAVLTSDMPDVLSHVSVRARNSKVCFATCFDHNILDNLRANEGKLLNLKPTSADIVYSVIEGELADLSSNKLKEVGPSPIKLIRKQFSGRYAISSEEFTGEMVGAKSRNIAHLKGKVPSWIGIPTSVALPFGVFEKVLSDGSNQEVAKKLEVLKKQLEGGESSVLRRIRETVLQLAAPPQLVQELKTKMKSSGMPWPGDEGEQRWEQAWMAIKKVWASKWNERAYFSTRKVKLDHDYLCMAVLVQEIINADYAFVIHTTNPSSGDSSEIYAEVVKGLGETLVGAYPGRALSFICKKKDLNSPQVLGYPSKPIGLFIRRSIIFRSDSNGEDLEGYAGAGLYDSVPMDEEEKVVLDYSYDPLITDESFRKSILSNIARAGSAIEELYGSPQDIEGVIRDGKLYVVQTRPQM*

实施例2、MeSRDRNAi载体的构建及转基因木薯的获得

本发明人首先通过选择MeSRD(pdm02348)基因特异性片段(741-1193bp)，构建了特异性抑制MeSRD表达的RNA interference(RNAi)双元载体：pPCaMV35S::SRDRNAi。

本发明人首先通过选择MeSRD(pdm02348)基因特异性片段(741-1193bp)，构建了特异性抑制MeSRD表达的RNA interference(RNAi)双元载体：pPCaMV35S::SRDRNAi。

以木薯(manihot utilissima)基因组为模板，以5’-ATGGTACCCCCAGAACAAGAAAAGAAAGAA-3’(SEQ ID NO:3)和5’-CTATCGATAA ATCAGTGGCAACATAAACCT-3’(SEQ ID NO:4)扩增获得MeSRD(pdm02348)基因特异性片段(741-1193bp)，将扩增的MeSRD(741-1193bp)正向片段插入到pRNAi-dsAC1双元载体(参见Biotechnology and Bioengineering,Vol.108,No.8,August,2011，1925-1935)的KpnI/ClaI酶切位点中；以5’-ATGGATCCCCCAGAACAAGAAAAGAAAGAA-3’(SEQ ID NO:5)和5’-CTCTCGAGAAATCAGTGGCAACATAAACCT-3’(SEQ ID NO:6)为引物，扩增获得MeSRD(pdm02348)基因特异性片段(741-1193bp)，将扩增的MeSRD(741-1193bp)反向重复片段插入到前述已经插入了正向片段的pRNAi-dsAC1双元载体的XhoI/BamHI酶切位点中，获得包含有发卡结构的RNAi重组载体。

将构建好的RNAi重组载体转入农杆菌LBA4404，再通过农杆菌侵染木薯脆性悬浮愈伤，侵染后的愈伤组织通过再生、筛选等过程得到阳性植株，将pPCaMV35S::SRDRNAi转基因木薯记作SRDRNAi，缩写为G1i。

实施例3、MeSRDRNAi转基因木薯的分子鉴定

通过农杆菌介导的木薯悬浮愈伤转化共获得pPCaMV35S::SRDRNAi阳性转基因木薯G1i-1、5、12、16、17等共20个株系，随后通过Southern blot筛选最后获得单拷贝转基因植株为G1i-12、17、18、22、23等共十一个株系。

(1)基因表达水平鉴定

为了验证RNA干扰的效果，本发明人以5’-ACCTCTGCATGGCTGTCCTGGTT-3’(SEQ ID NO:7)和5’-GCACGGCCGGGATAGGCTCC-3’(SEQ ID NO:8)为引物，通过Real-time RT-PCR对单拷贝植株中MeSRD的表达水平进行分析。

结果表明，在大多数pPCaMV35S::SRDRNAi单拷贝转基因木薯中，MeSRD的表达量都被明显下调，其中以G1i-2、12、18、28、31下调最为明显，相对于野生型木薯TMS60444，在G1i-12转基因株系中MeSRD的表达量减少了90％，如图3。

(2)蛋白水平表达鉴定

虽然目标基因在表达水平上受到了强烈的抑制，但在蛋白水平上是否也受到抑制，需要进一步的证明。本发明人针对MeSRD特异性的蛋白片段设计抗原多肽并成功获得了木薯MeSRD的兔源多克隆抗体。收获野生型木薯及MeSRD基因表达明显下调的三个单拷贝转基因木薯(G1i-12、G1i-17、G1i-28)大小一致的叶片，提取总蛋白后，进一步通过Western blot检测MeSRD的蛋白量。以Rubisco为蛋白上样量内参，以野生型木薯TMS60444为对照(WT)；蛋白提取材料为温室木薯植株的成熟叶片。

结果表明，在野生型中有MeSRD的目的条带，大小约在140kD，与预测的MeSRD大小一致；在转基因植株G1i-12、17、18中并没有MeSRD的目的条带，说明本发明人通过RNAi的手段不仅降低了目的基因的表达水平，同时也成功降低了目的基因的蛋白量，如图4。

上述结果表明，成功获得了MeSRD的表达被有效干扰的MeSRDRNAi转基因木薯。

实施例4、MeSRD在叶片临时性淀粉含量的调节

分别在上海五厍中试试验田自然条件下培养野生型木薯TMS60444和SRDRNAi转基因木薯。分别取光周期中6:00、12:00、18:00、0:00的成熟叶片，先用甲醇除去可溶性的多糖，烘干后通过Total Starch(K-TSTA，Megazyme)试剂盒测定叶片中的淀粉含量。结果如图5，野生型木薯的叶片在光周期开始时，淀粉含量逐渐上升，6:00到12:00之间淀粉迅速积累，12:00到18:00之间，淀粉积累速率变得相对缓慢，到光周期结束时淀粉含量达到最高，约为2％；当暗周期开始时，淀粉开始降解，淀粉含量逐渐下降，在整个暗周期中淀粉的降解速率基本保持不变，到暗周期末(6:00)时淀粉基本被完全降。而在SRDRNAi转基因木薯的叶片中，淀粉含量在光周期中一直保持在较高的水平，约为11％，其淀粉含量在光周期中的变化中的波动性也没有规律。

取暗周期结束后不同发育时期的野生型及转基因木薯叶片，经过酒精脱色后，用0.2％的碘液染色，发现野生型叶片不能着色，而转基因木薯不同时期的叶片都明显变蓝，说明野生型木薯叶片在暗周期末不再积累淀粉，而转基因木薯叶片仍然含有大量的淀粉，如图6。

实施例5、MeSRD对叶片临时性淀粉形态的影响

分别在上海五厍中试试验田自然条件下培养野生型木薯TMS60444和SRDRNAi转基因木薯，培养至收获期。分别提取野生型木薯TMS60444及SRDRNAi转基因木薯叶片中淀粉，通过扫描电镜(SEM)观察叶片及块根中的淀粉形态，结果发现叶片中的淀粉呈现圆饼状，野生型木薯叶片中淀粉直径约为2-3μm，而SRDRNAi转基因植株中淀粉粒普遍变大，大部分淀粉直径可达5μm以上，在部分MeSRD表达下调的转基因植株G1i-12、17中淀粉的直径最高可达10μm左右，如图7。

淀粉粒的增大不但可降低淀粉提取工艺的成本，同时也更接近绿豆、谷物来源的小淀粉颗粒。

实施例6、MeSRD对叶片临时性淀粉磷酸化程度的调节

分别在上海五厍中试试验田自然条件下培养野生型木薯TMS60444和SRDRNAi转基因木薯，培养至收获期。收集光周期末成熟木薯叶片，提取叶片中淀粉，酸水解后通过HPAEC-PAD分析其水解液中的葡萄糖-6-磷酸的含量。

色谱图显示，G-6-P及G-3-P的标准品分别在22.7min及24.2min分钟出现洗脱峰，在野生型木薯的叶片临时性淀粉水解液中也检测到明显的G-6-P及G-3-P的洗脱峰。与其他物种中类似，G-3-P的含量明显小于G-6-P的含量，而在RNAi转基因植株的叶片临时性淀粉中G-6-P洗脱峰变的非常微弱，约为野生型木薯的0.5％，说明木薯中MeSRD也具有催化淀粉中葡萄糖残基C-6位磷酸化的功能，如图8。MeSRDRNAi转基因木薯植株中以G1i-12、17、18中淀粉的磷酸化程度下调最为明显，约为1ng/mg淀粉，G1i-28、31其次，分别为7ng/mg淀粉和15ng/mg淀粉，而野生型叶片中淀粉磷酸化水平为20ng/mg淀粉，其磷酸化水平基本与MeSRD基因的表达水平成正相关，如图9所示。

实施例7、MeSRD对叶片临时性淀粉中直链淀粉含量的调节

随着叶片中淀粉形态的改变，其直链淀粉含量也发生了明显的变化。

分别在上海五厍中试试验田自然条件下培养野生型及SRDRNAi转基因木薯，培养至收获期。测定叶片临时性淀粉中直链淀粉含量。

测定方法：木薯淀粉中直链淀粉含量的测定参考中华人民共和国国家标准GB/T 15683-2008/ISO 6647-1：2007。主要步骤为：称取50mg±0.5mg木薯淀粉、直链淀粉标样(Sigma，St.Louis，MO，USA)和支链淀粉标样(Sigma，St.Louis，MO，USA)于试管中，加入500μL 95％乙醇将粘在试管内壁上的样品冲下，轻轻摇匀并加入4.5mL 1.0M氢氧化钠溶液混匀后沸水浴10min以上直至淀粉样完全分散，冷却至室温后转移到50mL容量瓶中定容；同时按相同步骤制备不加任何淀粉样的空白对照；利用定容的直链淀粉和支链淀粉标样配制直链淀粉含量为0、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％的系列标准含量溶液各1mL备用；8mL 2％碘液稀释后加4mL 1.0M HAC溶液并定容至200mL即为淀粉显色液，现配现用，同一批样品使用相同的显色液；空白对照、木薯淀粉样、标准含量溶液各取100μL加入1mL淀粉显色液中混匀显色，空白对照取4次，其它样品取3次，显色后在分光光度计Libra S22(Biochrom Ltd.，UK)上进行720nm波长OD值测量；利用标准含量溶液在720nm处的吸光度值进行一元线性回归并求取相关系数，建立直链淀粉含量与吸光度的方程式，将待测木薯淀粉样吸光度代入方程式求取其直链淀粉含量。

结果如图10，相对于野生型木薯叶片临时性淀粉，在转基因植株叶片中直链淀粉的含量有非常明显的上升，野生型木薯叶片中直链淀粉含量约有9％，SRDRNAi转基因植株叶片临时性淀粉中直链淀粉的含量上升到22-37％，与块根储存性淀粉种直链淀粉的含量相近。

实施例8、MeSRD对叶片临时性淀粉热力学性质的调节

差示热值扫描(Differential Scanning Calorimetry，DSC)是测定在加热过程中淀粉的吸热能力的一种热力学手段，淀粉的吸热能力主要受到淀粉直链淀粉含量、淀粉结晶度、支链淀粉链长分布等方面的影响。在上海五厍中试试验田自然条件下培养野生型及SRDRNAi转基因木薯，培养至收获期，进行热力学性质测定。

热力学性质测定方法为：使用Q2000差示扫描量热仪(TA Instruments，Norwalk，CT，USA)作淀粉样品糊化热力学分析。将样品(10mg淀粉加30μL水，以空盘作为空白对照)密封在氧化铝坩埚内，室温平衡24h后，以10℃/min的速度，由30℃升温至95℃，扫描热量变化。数据使用Universal Analysis软件进行分析。

结果如表1，SRDRNAi转基因植株中，叶片临时性淀粉To(起始糊化温度)、Tp(峰值糊化温度)与野生型叶片临时性淀粉没有明显差异，但Tc(表示结束糊化温度)、ΔH(糊化焓)明显提高，其中ΔH要比野生型高四倍左右。

表1野生型及转基因木薯叶片中淀粉的热力学性质参数

注：图中所示数据均为3次实验重复的平均值±标准差。每组数据中标有相同字母(a，b，c，d，e)的值表示在此条件下各测定值之间差异不显著(p<0.05)。

实施例9、MeSRD对叶片临时性淀粉结构的调节

在上海五厍中试试验田自然条件下培养野生型及SRDRNAi转基因木薯，培养至收获期，收集木薯叶片，并从叶片中提取临时性淀粉，利用X射线衍射仪测定叶片临时性淀粉的衍射图谱。

淀粉XRD衍射图谱可以分为A、B、C、V型淀粉，一般认为淀粉的XRD衍射图谱由结晶区的衍射峰及非结晶区的背景峰组成。野生型木薯叶片中的淀粉XRD图谱显示其衍射图谱有多个结晶区特征峰，但非结晶区的背景峰比较弱，预示野生型叶片中的临时性淀粉非结晶区比较少，结晶度比较高；而SRDRNAi转基因植株叶片中的临时性淀粉与普通淀粉一样有结晶区和非结晶区组成，其衍射峰主要表现为15°，17°，23°衍射峰，为标准的C型淀粉，与储存性淀粉的衍射图谱相近，如图11。

此外，叶片临时性淀粉通过异淀粉酶(Isoamylase)水解后，利用HPAEC-PAD分析其水解液中的葡聚糖成分。

如图12，分析结果显示，野生型木薯叶片临时性淀粉中最短的葡聚糖链为DP6，在DP11-12及DP45处有两个峰，DP18-20处有一个肩峰。不同于木薯叶片淀粉的链长分布，块根储存性淀粉中短链含量增加(2.2％)、中链含量降低(-0.8％)。转基因植株叶片淀粉与野生型相比，其链长分布变化趋势与块根淀粉变化相似：其短链(DP6-14)有明显的上升，最高可提高0.4％；中链部分(DP20-37)有明显的下降，约-0.2％左右。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (14)

1.一种调节薯类植物的叶片的淀粉性状的方法，其特征在于，所述方法包括：调节薯类植物中SRD多肽的表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的薯类植物包括：木薯，甘薯、马铃薯、山药、芋头、葛根、魔芋、洋姜、雪莲果。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的SRD多肽选自下组：

(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)限定的多肽序列有70％以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：降低植物中SRD多肽的表达，从而：

提高薯类植物叶片中的淀粉含量；

提高薯类植物叶片中淀粉颗粒的直径；

降低薯类植物叶片中淀粉的磷酸化程度；

增加薯类植物叶片中直链淀粉的含量；和/或

增加淀粉中短链的含量，降低淀粉中长链部分的含量。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述降低植物中SRD多肽的表达包括：将干扰所述SRD多肽表达的干扰分子转入植物，从而下调植物中SRD多肽的表达。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，干扰所述SRD多肽表达的干扰分子靶向SRD多肽的编码基因或其转录本；较佳地，靶向该编码基因的第741-1193位或其转录本。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的干扰分子含有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向 式(I)，

式(I)中，

Seq_正向为SRD多肽的编码基因的片段，Seq_反向为与Seq_正向互补的多核苷酸；较佳地，Seq_正向为SRD多肽的编码基因的第741-1193位；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括后续步骤：从调节SRD多肽的表达后的植物中选择出相较调节前植物而言性状获得变化的植物。

9.一种下调SRD多肽表达的物质的用途，用于调节薯类植物的叶片的淀粉性状。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的下调SRD多肽表达的物质用于：

提高薯类植物叶片中的淀粉含量；

提高薯类植物叶片中淀粉颗粒的直径；

降低薯类植物叶片中淀粉的磷酸化程度；

增加薯类植物叶片临时性淀粉中直链淀粉的含量；和/或

增加淀粉中短链的含量，降低淀粉中长链部分的含量。

11.如权利要求9或10所述的用途，其特征在于，所述的薯类植物包括：木薯，甘薯、马铃薯、山药、芋头、葛根、魔芋、洋姜、雪莲果等。

12.一种下调SRD多肽表达从而调节薯类植物的叶片的淀粉性状的干扰分子，其含有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向 式(I)，

式(I)中，

Seq_正向为SRD多肽的编码基因片段，Seq_反向为与Seq_正向互补的多核苷酸；较佳地，Seq_正向为SRD多肽的编码基因的第741-1193位；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

13.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求12所述的干扰分子。

14.一种SRD多肽或其编码基因的用途，其特征在于，用于作为鉴定薯类植物的叶片的淀粉性状的分子标记；所述的薯类植物的叶片的淀粉性状包括：

薯类植物叶片中的淀粉含量；

薯类植物叶片中淀粉颗粒的直径；

薯类植物叶片中淀粉的磷酸化程度；

薯类植物叶片临时性淀粉中直链淀粉的含量；和/或

增加淀粉中短链的含量，降低淀粉中长链部分的含量。