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CN106573964B - 新型特异性结合多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种针对靶标Swiss Prot Q16552的新型、特异性结合治疗性和/或诊断性多肽，和针对靶标Swiss Prot Q9NPF7的新型、特异性结合治疗性和/或诊断性多肽。此外，本发明涉及针对Swiss Prot Q16552和Swiss Prot Q9NPF7之一或两者的新型、特异性结合治疗性和/或诊断性多肽。本发明还涉及编码这种多肽的核酸分子及用于产生这种多肽和核酸分子的方法。此外，本发明涉及包含该多肽的组合物及这些多肽的治疗性和/或诊断性用途。

Description

新型特异性结合多肽及其用途
背景技术
各种脂质运载蛋白的突变蛋白是一类快速扩张的治疗剂。事实上，可将脂质运载蛋白突变蛋白构建为对与野生型脂质运载蛋白的天然配体(例如白细胞介素-17A或白细胞介素-23)不同的靶标显示出高亲和力和特异性(如，WO 99/16873、WO 00/75308、WO 03/029463、WO 03/029471和WO 05/19256)。
A.白细胞介素-17A
白细胞介素-17A(IL-17A，与IL-17同义)是一种从T细胞的Th17系产生的细胞因子。IL-17最初命名为“CTL-相关抗原8”(CTLA-8)(Rouvier等，J.Immunol,150 5445-5556(1993)；Yao等Immunity,3:811-821(1995))。随后克隆CTLA-8的人等价物并命名为“IL-17”(Yao等，J.Immunol,155(12):5483-5486(1995)；Fossiez等，J.Exp.Med.,183(6):2593-2603(1996))。
人IL-17A(CTLA-8，还命名为IL-17，Swiss Prot Q16552)是具有17,000道尔顿Mr的糖蛋白(Spriggs等，J.Clin.Immunol,17:366-369(1997))。IL-17A既可以作为同二聚体IL-17A/A存在也可以作为与同源IL-17F复合以形成异二聚体的IL-17A/F的异二聚体存在。IL-17F(IL-24,ML-1)与IL-17A具有55％的氨基酸同一性。IL-17A和IL-17F还具有相同的受体(IL-17RA)，该受体在包括血管内皮细胞、外周T细胞、B细胞、成纤细胞、肺细胞、骨髓单核细胞和骨基质细胞的多种细胞上表达(Kolls等，Immunity,21:467-476(2004)；Kawaguchi等，J.Allergy Clin.Immunol,114(6):1267-1273(2004)；Moseley等，Cytokine GrowthFactor Rev.,14(2):155-174(2003))。已经鉴定了IL-17的其它同源物(IL-17B、IL-17C、IL-17D和IL-17E)。这些其它家族成员与IL-17A具有小于30％的氨基酸同一性(Kolls等，2004)。
IL-17A主要由Th17细胞表达并在类风湿性关节炎(RA)患者的滑液中以升高的水平存在，并且已经显示其参与早期RA发展。IL-17A也在多发性硬化(MS)患者的脑脊液中过表达。此外，IL-17是TNF-α和IL-1的诱导剂，后者主要对骨质侵蚀和对受影响的患者的非常疼痛的后果负责(Lubberts E.(2008)Cytokine,41,84-91页)。此外，IL-17A的不恰当或过量产生与各种其它疾病和障碍的病理学相关，例如骨关节炎、骨植入物松动、急性移植排斥(Antonysamy等，(1999)J.Immunol,162,577-584页；van Kooten等(1998)J.Am.Soc.Nephrol.,9，1526-1534页)、败血病、败血症性或内毒素性休克、过敏、哮喘(Molet等，(2001)J.Allergy Clin.Immunol.,108，430-438页)、骨质疏松、银屑病(Teunissen等(1998)J.Invest.Dermatol,111，645-649页)、缺血、系统性硬化症(Kurasawa等，(2000)Arthritis Rheum.,43，2455-2463页)、中风和其它炎症性障碍。
尽管已经描述了多种IL-17A抑制剂，但由于发现了这种关键的促炎细胞因子，目前的方法不是最佳的，例如复杂哺乳动物细胞生产系统的必要性、对二硫键稳定性的依赖性、一些抗体片段聚集的趋势、有限的溶解度和最后但并非最不重要，即使当人源化时，这些IL-17A抑制剂也可能引起不期望的免疫响应。因此，仍然需要开发具有IL-17A结合亲和力的蛋白质，例如脂质运载蛋白突变蛋白。
B.白细胞介素-23
白细胞介素-23(也称为IL-23)是由两个亚单位即p19和p40组成的异二聚体细胞因子(B.Oppmann等，Immunity 13,715(2000))。p19(Swiss Prot Q9NPF7，在本文中可互换地称为“IL-23p19”)亚单位在结构上与IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和IL-12的p35亚单位相关。IL-23通过结合由IL-23R和IL-12β1组成的异二聚体受体来介导信号传导。由IL-12β1和IL-12β2组成的IL-12受体共享IL-12β1亚单位。最近已经描述了转基因p19小鼠展现了深度的系统性炎症和嗜中性粒细胞增多症(M.T.Wiekowski等，J Immunol166,7563(2001))。
已经报道人IL-23促进T细胞，特别是记忆T细胞的增殖，并且可以有助于Th17细胞的分化和/或维持(D.M.Frucht,Sci STKE 2002Jan8；2002(114):PE1)。
尽管已经描述了多种IL-23的选择性抑制剂(通过结合p19亚单位)，但由于发现了这种关键的异二聚体细胞因子，这些现有的方法仍然具有许多严重的缺点，例如复杂哺乳动物细胞生产系统的必要性、对二硫键稳定性的依赖性、一些抗体片段聚集的趋势、有限的溶解度和最后但并非最不重要，即使当人源化时，这些IL-23的选择性抑制剂也可能引起不期望的免疫响应。因此，仍然需要开发具有IL-23结合亲和力的蛋白质，例如脂质运载蛋白突变蛋白。
定义
以下所列定义了在本说明书中使用的术语、短语和缩写。本文列出和定义的所有术语旨在涵盖所有语法形式。
如本文所使用，“IL-17A”(包含IL-17A/A以及与IL-17F复合的IL-17A，也称为IL-17A/F)是指由Swiss Prot Q16552定义的全长蛋白、其片段或其变体。
如本文所使用，“IL-23p19”是指由Swiss Prot Q9NPF7定义的全长蛋白、其片段或其变体。
如本文所使用，“可检测的亲和力”是指以通常至少约10-5M的亲和力常数结合至选定靶标的能力。较低的亲和力通常不再能通过常规方法，例如ELISA测量，因此是次要的。例如，根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的结合亲和力在一些实施方案中可以是800nM以下的KD，在一些实施方案中是30nM以下的KD，和在一些实施方案中为约50皮摩尔(pM)或更低。
如本文所使用，可以通过本领域技术人员已知的多种方法测量(并由此可以测定突变蛋白-配体复合物的KD值)本发明的蛋白(如，脂质运载蛋白的突变蛋白)或其融合蛋白与选定靶标(在本发明中为IL-17A或IL-23p19)的“结合亲和力”。这种方法包括、但不限于，荧光滴定、竞争ELISA、如等温滴定量热法(ITC)的量热法和表面等离子体共振(BIAcore)。这样的方法在本领域中是公知的，并且其实施例也在下面详述。
还注意到，相应结合剂与其配体之间的复合物的形成受多个不同因子的影响，如各自结合配偶体的浓度、竞争者的存在、pH和所采用的缓冲系统的离子强度，以及用于测定解离常数KD的实验方法(例如荧光滴定、竞争ELISA或表面等离子体共振，仅举几个例子)，或甚至用于评估实验数据的数学算法。
因此，本领域技术人员也清楚KD值(各自结合剂与其靶标/配体之间形成的复合物的解离常数)可以在某个实验范围内变化，这取决于用于测定特定脂质运载蛋白突变蛋白对给定配体的亲和力的方法和实验设置。这意味着，所测得的KD值可能会有轻微的偏差或耐量范围，例如，取决于该KD值是通过表面等离子体共振(Biacore)、竞争ELISA、还是“直接ELISA”测定的。
如本文所用，“突变蛋白”、“突变的”实体(蛋白或核酸)或“突变体”是指与天然存在(野生型)的核酸或蛋白的“参照”骨架相比，一个或多个核苷酸或氨基酸的交换、缺失或插入。
本文中关于本发明的突变蛋白使用的术语“片段”涉及源自N端和/或C端缩短的(即缺少N-末端和/或C-末端氨基酸的至少一个)全长成熟人泪液脂质运载蛋白的蛋白质或肽。这种片段可包括成熟脂质运载蛋白一级序列的至少10个、更多如20或30个或者更多个连续氨基酸，并且通常在成熟脂质运载蛋白的免疫实验中可检测到。所述术语还包括本文所述的突变蛋白和变体的片段。本发明的脂质运载蛋白突变蛋白、其片段或变体优选地保留本文所述的结合IL-17A和/或IL23p19的功能。
一般而言，本文中关于本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或根据本发明的组合物或本文所述的融合蛋白的相应蛋白配体IL-17A(包括IL-17A/A和IL-17A/F)或IL-23p19所使用的术语“片段”涉及N-末端和/或C-末端缩短的蛋白或肽配体，其保留了全长配体被根据本发明的突变蛋白识别和/或结合的能力。
本文所用术语“诱变”是指，选择实验条件，以使得天然存在于成熟脂质运载蛋白给定序列位置处的氨基酸可被至少一个不存在于各天然多肽序列中的此特定位置处的氨基酸替换。术语“诱变”还包括通过缺失或插入一个或多个氨基酸而(额外的)改变序列区段的长度。因此，以下情况在本发明的范围内：例如，一个在选定序列位置处的氨基酸被三个随机突变的延伸段(stretch)替代，从而相比于野生型蛋白各区段的长度，导致两个氨基酸残基的插入。这样的缺失或插入可以彼此独立地引入到在本发明中可以进行诱变的任何肽区段中。在本发明的一个示例性实施方式中，几个突变的插入可以引入到选定的脂质运载蛋白骨架的AB环中(参见以全文引用并入本文的国际专利申请WO 2005/019256)。
术语“随机诱变”指无预定的单个氨基酸(突变)存在于某个序列位置处，而是至少两个氨基酸可以在诱变期间以某概率掺入在预限定的序列位置处。
“同一性”指的是衡量它们的相似性或关系的序列特性。本发明所用的术语“序列同一性”或“同一性”是指在本发明多肽序列与所讨论的序列(同源性)比对之后，相对于这两个序列中较长一个的残基数量的配对相同残基的百分比。通过将相同残基的数量除以残基总数再使结果乘以100来量度同一性。
本文所用术语“同源性”是其一般含义，并包括相同氨基酸以及认为是在本发明(如本发明的任何脂质运载蛋白突变蛋白)的多肽线性氨基酸序列中的等价位置的保守置换氨基酸(例如天冬氨酸残基交换谷氨酸残基)。
可以采用例如程序BLASTP，blastp 2.2.5版(2002年11月16日；参见Altschul，S.F.等(1997)Nucl.Acids Res.25，3389-3402)测定序列同源性或序列同一性百分比。在本实施方案中，同源性百分比基于包括前肽序列的完整多肽序列比对(矩阵：BLOSUM 62；空位权重：11.1；截止值设置为10-3)，优选地在配对比较中使用野生型蛋白骨架作为参考。BLASTP程序输出的结果表示为以“阳性”(同源氨基酸)数除以程序选定的用于比对的氨基酸总数来计算的百分比。
具体而言，为了确定与野生型脂质运载蛋白不同的脂质运载蛋白(突变蛋白)氨基酸序列的氨基酸残基是否对应于野生型脂质运载蛋白氨基酸序列中的某一位置，技术人员可利用本领域熟知的手段和方法，如手动地或通过使用计算机程序例如使用BLAST2.0(其代表基本局部比对搜索工具)或ClustalW或任何适用于产生序列比对的其它合适程序进行比对。因此，野生型脂质运载蛋白可作为“受试序列”或“参考序列”，而本文所述的与野生型脂质运载蛋白不同的脂质运载蛋白的氨基酸序列作为“查询序列”。本文中术语“参考序列”和“野生型序列”可互换使用。
“间隙”是添加或缺失氨基酸所导致的比对中的空间。因此，两份完全相同的序列具有100％的同一性，但较不高度保守且具有添加、缺失或替换的序列可能具有较低程度的同一性。本领域的技术人员将会认识到，可以得到数个计算机程序，以用来使用标准参数测定序列同一性，例如Blast(Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25,3389-3402)、Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215,403-410)和Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol.147,195-197)。
本发明中使用的术语“变体”涉及包含氨基酸序列修饰的蛋白质或肽的衍生物，所述氨基酸序列修饰例如通过置换、缺失、插入或化学修饰进行。在一些实施方式中，这种修饰确实不会降低蛋白质或肽的功能。这种变体包括蛋白质，其中一个或多个氨基酸被它们各自的D-立体异构体或除天然存在的20个氨基酸外的氨基酸(比如，例如，鸟氨酸、羟脯氨酸、瓜氨酸，高丝氨酸，羟赖氨酸、戊氨酸)替代。然而，这样的置换也可以是保守的，即氨基酸残基被替代为化学性质相似的氨基酸残基。保守替换的实例为以下组成员之间的替代：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。本文中关于本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或根据本发明的组合物或本文所述的融合蛋白的相应蛋白配体IL-17A(包括IL-17A/A和IL-17A/F)或IL-23p19所使用的术语“变体”分别涉及分别与野生型IL-17A或IL-23p19蛋白(例如本文所述的SwissProt保存的IL-17A或IL-23p19参考蛋白)相比具有一个或多个(比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、60、70、80或更多)氨基酸置换、缺失和/或插入的IL-17蛋白或其片段或者IL-23蛋白或其片段。IL-17A或IL-23p19变体与野生型IL-17A或IL-23p19蛋白(例如本文所述的SwissProt保存的IL-17A或IL-23p19参考蛋白)分别具有优选地至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的氨基酸同一性。
“天然序列”脂质运载蛋白是指与源自自然界的相应多肽具有相同氨基酸序列的脂质运载蛋白。因此，天然序列脂质运载蛋白可以具有源自任何生物体，特别是哺乳动物的相应天然存在的脂质运载蛋白的氨基酸序列。这种天然序列多肽可以从自然界中分离或者可以通过重组或合成手段产生。术语“天然序列”多肽具体涵盖脂质运载蛋白的天然存在的截短的或分泌的形式、天然存在的变体形式(例如脂质运载蛋白的剪接形式和天然存在的等位基因变体)。多肽“变体”是指与天然序列多肽具有至少约50％、60％、70％或至少约85％的氨基酸序列同一性的生物活性多肽。这种变体包括，例如，在多肽的N-或C-末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，变体与天然序列多肽具有至少约70％，包括至少约80％，比如至少约85％的氨基酸序列同一性；包括至少约90％的氨基酸序列同一性或至少约95％的氨基序列同一性。作为示例性实例，可以例如在本发明的泪液脂质运载蛋白(Tlc)突变蛋白中使前4个N-末端氨基酸残基(HHLA)和最后2个C-末端氨基酸残基(Ser、Asp)缺失而不影响该蛋白的生物功能，如SEQ ID NO:1。
当根据本发明使用时，术语“位置”是指本文描述的氨基酸序列中的氨基酸的位置或本文描述的核酸序列中的核苷酸的位置。为了理解本文中在一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白氨基酸序列位置的上下文中使用的术语“对应”或“相应”，相应位置不仅由前述核苷酸/氨基酸的数量决定。因此，由于在(突变体或野生型)脂质运载蛋白的任何位置处的氨基酸缺失或添加，则可被置换的本发明给定氨基酸的位置可能改变。类似地，由于在突变蛋白或野生型脂质运载蛋白5’-非翻译区(UTR)(包括启动子和/或任何其它调节序列或基因(包括外显子和内含子))的其它位置处的核苷酸缺失或添加，则可被置换的本发明给定核苷酸的位置可能改变。
因此，对于本发明的相应位置，优选地理解，核苷酸/氨基酸的位置在指定数字方面可以不同，但仍有类似的相邻核苷酸/氨基酸，但是所述一个或多个相应位置仍包含所述相邻核苷酸/氨基酸，其可被交换、缺失或添加。
此外，对于基于本发明参考骨架的脂质运载蛋白突变蛋白的相应位置，优选地理解，核苷酸/氨基酸的位置在结构上对应于(突变体或野生型)脂质运载蛋白的其它位置，尽管这些位置与所指定数字可能不同，但是技术人员将理解这是由于脂质运载蛋白中的高度保守的整体折叠形式。
术语“白蛋白”包括所有的哺乳动物白蛋白，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠血清白蛋白。
本文针对非天然靶标使用的术语“有机分子”或“小有机分子”表示包含至少两个碳原子的有机分子，但是优选地，包含具有不超过7或12个可旋转碳键；这种有机分子的分子量范围为100到2000道尔顿，优选地100到1000道尔顿，且它可以任选地包含一个或两个金属原子。
本文使用的词“检测/可检测的”理解为在定量和定性水平上以及它们的组合。从而其包括目标分子的定量、半定量和定性测定。
术语“受试者”是指脊椎动物，优选是哺乳动物，更优选是人。本文所用术语“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括、但不限于人、家畜和农场动物以及动物园、运动或宠物动物，例如绵羊、狗、马、猫、牛、大鼠、猪、如食蟹猕猴(cynomolgous monkey)的猿等等，仅举几个示例性实例。优选地，本文所述哺乳动物是人。
“有效量”是足够实现有益或者所希望的结果的量。在一次或多次施用中可以施用有效量。
将“样品”定义为从任何受试者中采集的生物样品。生物样品包括、但不限于血液、血清、尿液、粪便、精液或组织。
本文所述“融合多肽”包含至少两个亚单位，其中一个亚单位具有IL-17A结合特异性或具有IL-23p19结合特异性。在该融合多肽中，这些亚单位可通过共价或非共价结合(linkage)连接。优选地，该融合多肽是两个或更多个亚单位之间的翻译融合物。可通过在框架内用一个亚单位的编码序列来遗传工程化另一亚单位的编码序列来产生翻译融合物。两个亚单位可被编码连接子的核苷酸序列穿插(interspersed)。然而，本发明融合多肽的亚单位还可通过化学连接子连接。
可包含在本发明融合多肽中的“连接子”将本文所述的融合多肽的两个或更多个亚单位连接。这种结合可以是共价的或非共价的。优选的共价结合是通过肽键，例如氨基酸之间的肽键。因此，在优选的实施方案中，所述连接子包含一个或多个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多氨基酸。本文描述了优选的连接子。其它优选的连接子是化学连接子。
附图说明
图1：提供通过表面等离子体共振对SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白与人IL-17A的相互作用的结合-速率和解离-速率的典型测量。使用标准胺化学将IL-17A固定在传感器芯片上，并且使用SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白作为流经芯片表面的可溶性分析物。所得解离常数(KD)为0.8nM。
图2：提供通过表面等离子体共振对SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白与人IL-17A/F的相互作用的结合-速率和解离-速率的典型测量。采用专用实验试剂盒将生物素化的SEQ ID NO:1捕获在传感器芯片上，并使用人IL-17A/F作为流经芯片表面的可溶性分析物。所得解离常数(KD)为100pM。
图3：证明SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白能够以75pM的IC50阻断hIL-17A与其受体hIL-17RA之间的相互作用。用可变浓度的SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白预-温育生物素化的hIL-17A，并在ELISA板上用固定的可溶性hIL-17RA定量未中和的hIL-17A。阴性对照SEQ ID NO:41没有竞争效应。用单位点结合模型拟合数据。
图4：示出在竞争ELISA形式中测量的SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白的交叉反应性概况。与hIL-17A相比，从几乎相同的IC50可以明显看出与食蟹猕猴(cynomolgusmonkey)IL-17A和狨猴IL-17A完全交叉反应。用单位点结合模型拟合数据。
图5：证明在基于细胞的分析中，SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白高效阻断hIL-17A与其受体hIL-17RA的结合。该分析基于U87-MG细胞中hIL-17A诱导的G-CSF的分泌。将细胞用固定浓度的hIL-17A温育并用SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白滴定，或作为比较，用基准抗体1(重链SEQ ID NO:53，轻链SEQ ID NO:54)、用基准抗体2(重链SEQ IDNO:55，轻链SEQ ID NO:56)滴定，并将SEQ ID NO:2作为阴性对照。将由MSD(Meso Scale
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以下称为“MSD”)测量的任意单位的G-CSF浓度针对脂质运载蛋白突变蛋白或抗体分子的浓度绘图。所得SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白的平均IC50值是0.13nM(第一个实验为0.17nM，重复实验中为0.10nM)，其比显示平均IC50＝2.33(2.65/2.01)nM的基准1显著更有效，并和具有平均IC50＝0.12(0.14/0.10)nM的基准2相比在相似的范围中。阴性对照SEQ ID NO:2对IL-17A诱导的细胞G-CSF产生无影响。SEQ ID NO:1或基准抗体分子与IL-17A的结合阻断了IL-17A与细胞表面IL-17RA的结合，并因此阻止了G-CSF分泌的诱导。用单位点结合模型拟合数据，假设全部分子的相等G-CSF浓度平稳。
图6：提供通过表面等离子体共振对SEQ ID NO:2的脂质运载蛋白突变蛋白与人IL-23的相互作用的结合-速率和解离-速率的典型测量。在三个重复实验中测定的平均解离常数为KD＝0.35±0.20nM。
图7：提供通过表面等离子体共振对SEQ ID NO:2的脂质运载蛋白突变蛋白与人IL-23的相互作用的结合-速率和解离-速率的典型测量。采用专用实验试剂盒将生物素化的SEQ ID NO:2捕获在传感器芯片上，并使用IL-23作为流经芯片表面的可溶性分析物。所得解离常数(KD)为2.9nM。注意，必须使用高的非生理浓度的NaCl以便进行该分析。因此，该结果并不代表生理条件下SEQ ID NO:2对IL-23的亲和力。该分析的效用在于其能够允许比较SEQ ID NO:2与包含该突变蛋白的融合蛋白之间的亲和力(参见实施例11和表1)。
图8：证明SEQ ID NO:2的脂质运载蛋白突变蛋白能够以0.54nM的IC50阻断hIL-23与其受体hIL-23R之间的相互作用。用可变浓度的SEQ ID NO:2的脂质运载蛋白突变蛋白预-温育生物素化的hIL-23，并在ELISA板上用固定的可溶性hIL-23R定量未中和的hIL-23。阴性对照SEQ ID NO:43没有竞争效应。用单位点结合模型拟合数据。
图9：示出在竞争ELISA形式中测量的SEQ ID NO:2的脂质运载蛋白突变蛋白的交叉反应性概况和特异性。SEQ ID NO:2的脂质运载蛋白突变蛋白与人和小鼠IL-23完全交叉反应，并对食蟹猕猴和狨猴IL-23显示稍微降低的亲和力。用单位点结合模型拟合数据。
图10：证明在基于细胞的增殖分析中，SEQ ID NO:2的脂质运载蛋白突变蛋白能够阻断hIL-23的生物活性。在该分析中，用hIL-23预温育SEQ ID NO:2、IgG同种型阴性对照及两个基准抗体(基准3：重链SEQ ID NO:57和轻链SEQ ID NO:58；基准4：重链SEQ ID NO:59和轻链SEQ ID NO:60)，并随后加入用hIL-23R和hIL-12Rβ1转染的Ba/F3细胞。转染的Ba/F3细胞响应于人IL-23而增殖。实验显示，所述生物活性被SEQ ID NO:2和基准抗体3和4以分别为1.2nM(1.7/0.7)、3.0nM(3.1/2.9)、1.2nM(0.8/1.5)的EC50值阻断。阴性对照对细胞增殖无影响。数据用S形剂量效应模型(sigmoidal dose-response model)拟合。
图11：提供表1中表征的构建体SEQ ID NO:1-13的图形概述。SEQ ID NO:1(图11中缩写为“1”)对应于IL-17A-结合脂质运载蛋白突变蛋白。SEQ ID NO:2(缩写为“2”)对应于IL-23-结合脂质运载蛋白突变蛋白。SEQ ID NO:14(缩写为“14”)对应于链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域。SEQ ID NO:15(缩写为“15”)是SEQ ID NO:14的工程化、去免疫化版本。SEQ ID NO:16(缩写为“16”)对应于人IgG1抗体的Fc-部分。
图12：证明在示例性实验中，基于本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白的多特异性融合蛋白能够同时结合IL-17A、IL-23和人血清白蛋白(HSA)，而不受结合的相应其它靶标的干扰。SEQ ID NO:9是IL-17A结合脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:1、IL-23结合脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:2和源自链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域的人血清白蛋白结合肽的异二聚体融合蛋白。在图12所示的表面等离子体共振实验中，将生物素化的SEQIDNO:9捕获在传感器芯片上。为了证明同时结合，将在缓冲液中的hIL-17AF、hIL-23和HAS的稀释液连续应用至所制备的芯片表面。还采用单个靶标来实施对固定的SEQ ID NO:9应用hIL-17AF、hIL-23和HAS，以通过结合单个靶标来获得可获得的最大结合水平用于比较。图12示出了测量的结合曲线和反映对所有三种靶标的完全结合预期的响应的理论结合曲线。后者通过汇集SEQ ID NO:9对各个靶标的实验响应获得。测量的和理论的曲线几乎相同，所显示出的差异是由于实验曲线中靶标的解离。数据表明，与仅结合单个靶标相比，SEQID NO:9能够同时结合全部靶标而没有信号强度的损失或动力学改变。
图13：提供通过表面等离子体共振对脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:45(图13A)和SEQ ID NO:46(图13B)与人IL-23结合的结合-速率和解离-速率的典型测量。所得解离常数(KD)分别为0.1nM(SEQ ID NO:45)和0.6nM(SEQ ID NO:46)。
图14：证明脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46能够分别以0.1nM(SEQ ID NO:45)和1.1nM(SEQ ID NO:46)的IC50阻断hIL-23与其受体hIL-23R之间的相互作用。用可变浓度的所述脂质运载蛋白突变蛋白预-温育生物素化的hIL-23，并在ELISA板上用固定的可溶性hIL-23R定量未中和的hIL-23。用单位点结合模型拟合数据。
图15：证明在基于细胞的增殖分析中，SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的脂质运载蛋白突变蛋白能够阻断hIL-23的生物活性。在该分析中，用hIL-23预温育SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和阴性对照SEQ ID NO:43，并随后加入用hIL-23R和hIL-12Rβ1转染的Ba/F3细胞。转染的Ba/F3细胞响应于人IL-23而增殖。实验显示，所述生物活性被SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46以分别为3.7nM和5.4nM的IC50值阻断。阴性对照SEQ ID NO:43对细胞增殖无影响。数据用S形剂量效应模型(sigmoidal dose-response model)拟合。
图16：提供测定SEQ ID NO:63和62以及SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白对靶标IL-17A的特异性的代表性实验。将生物素化的IL-17A捕获在微量滴定板上，并滴定测试分子。如实施例16所述，通过HRP-标记的抗-人TLc-特异性抗体检测结合的测试分子。将数据用1:1结合模型拟合，所述模型具有EC50值和最大信号作为自由参数(freeparameter)和固定为一(unity)的斜率。
图17：提供测定SEQ ID NO:64和62以及SEQ ID NO:2的脂质运载蛋白突变蛋白对靶标IL-23的特异性的代表性实验。将生物素化的IL-23捕获在微量滴定板上，并滴定测试分子。如实施例17所述，通过HRP-标记的抗-人NGAL-特异性抗体检测结合的测试分子。将数据用1:1结合模型拟合，所述模型具有EC50值和最大信号作为自由参数(free parameter)和固定为一(unity)的斜率。
图18：提供测定SEQ ID NO:63和62的多肽融合物和SEQ ID NO:64和62的多肽融合物以及SEQ ID NO:61和62的抗体的多肽融合物对靶标TNF-α的特异性的代表性实验。将TNF-α涂布在微量滴定板上，并滴定测试分子。如实施例18所述，通过HRP-标记的抗-人IgGFc-特异性抗体检测结合的测试分子。将数据用1:1结合模型拟合，所述模型具有EC50值和最大信号作为自由参数(free parameter)和固定为一(unity)的斜率。
图19：提供了测定SEQ ID NO:63和62的多肽融合物和SEQ ID NO:64和62的多肽融合物分别同时结合靶标TNF-α和IL-17A、TNF-α和IL-23的能力的代表性实验。将重组的TNF-α涂布在微量滴定板上，随后滴定多肽融合物。之后，加入恒定浓度的生物素化的IL-17A或IL-23，并如实施例19所述通过HRP-标记的extravidin检测。将数据用1:1结合模型拟合，所述模型具有EC50值和最大信号作为自由参数(free parameter)和固定为一(unity)的斜率。
具体实施方式
本发明给现有技术贡献了具有IL-17A和/或IL-23p19结合特异性的多肽或蛋白，其中所述多肽包含以至少可检测的亲和力结合IL-17A或IL-23p19的脂质运载蛋白突变蛋白。
在一些实施方案中，所述多肽是能够以至少可检测的亲和力结合IL-17A的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，所述多肽是能够以至少可检测的亲和力结合IL-23p19的脂质运载蛋白突变蛋白。本发明还涉及两种多肽在用于结合受试者中IL-17A和IL-23p19中的用途。
在一些方面，所述多肽是包含至少两个亚单位的融合蛋白，其中一个亚单位具有IL-17A结合特异性，和另一个亚单位具有IL-23p19结合特异性。在一些进一步的实施方案中，所述融合蛋白可进一步包含亚单位，其中该亚单位具有IL-23p19或IL-17A结合特异性。在一些又进一步的实施方案中，所述融合蛋白可包含一个IL-17A特异性亚单位，一个IL-23p19特异性亚单位，和一个含有细菌白蛋白结合结构域(ABD)的亚单位。
在一些其它方面，本发明的多肽还可以是包含至少两个IL-17A特异性亚单位的融合蛋白，或包含至少两个IL-23p19特异性亚单位的融合蛋白。
在一些实施方案中，所述对IL-17A具有结合特异性的融合蛋白的亚单位包含本发明的IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，所述具有IL-23p19结合特异性的融合蛋白的亚单位包含结合IL-23p19的抗体。在一些其它实施方案中，所述具有IL-23p19结合特异性的融合蛋白的亚单位包含本发明的IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，所述具有IL-17A结合特异性的融合蛋白的亚单位包含结合IL-17A的抗体。
本发明的多肽或蛋白可以是脂质运载蛋白的突变蛋白，优选地是选自以下的脂质运载蛋白：视黄醇-结合蛋白(RBP)、后胆色素结合蛋白(BBP)、载脂蛋白D(APO D)、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、泪液脂质运载蛋白(TLPC或Tlc)、α2-微球蛋白-相关蛋白(A2m)、24p3/uterocalin(24p3)、von Ebners腺蛋白1(VEGP 1)、von Ebners腺蛋白2(VEGP 2)和主要变应原Can f1前体(ALL-1)。
如本文所用，将“脂质运载蛋白”定义为重量为约18-20kDA的单体蛋白，其具有圆柱形β折叠片超二级结构区，所述结构区包含通过在一端的多个(优选为4个)环逐对连接的多个(优选为8个)β链，以由此限定结合口袋。在脂质运载蛋白家族成员中，正是所述环在本应刚性的脂质运载蛋白骨架中的这种多样性产生多种不同的结合模式，每一种模式能容纳不同大小、形状和化学特征的靶标(例如上文的Flower,D.R.(1996)；上文的Flower,D.R.等(2000)，或Skerra,A.(2000)Biochim.Biophys.Acta1482,337-350中的综述)。事实上，蛋白的脂质运载蛋白家族已经天然进化到结合范围广泛的配体，具有非常低水平的整体序列保守性(通常具有少于20％的序列同一性)，但保留高保守性的整个折叠模式。不同脂质运载蛋白位置间的对应关系为本领域技术人员所熟知。例如，见，美国专利No.7,25,0297。
如上所述，脂质运载蛋白是由其超二级结构定义的多肽，即包含通过在一端的4个环逐对连接的8个β链，以由此限定结合口袋的圆柱形β折叠片超二级结构区。本发明不局限于本文具体公开的脂质运载蛋白突变蛋白。在这一方面，本发明涉及具有圆柱形β折叠片超二级结构区的脂质运载蛋白突变蛋白，该结构区包含通过在一端的4个环逐对连接的8个β链，以由此限定结合口袋；其中所述4个环中的至少3个的每一个的至少一个氨基酸已经突变，并且其中所述脂质运载蛋白以可检测的亲和力有效结合IL-17A或IL-23p19。
在一个特别的实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白是人泪液脂质运载蛋白(TLPC或Tlc)(也称为脂质运载蛋白-1、泪液前-白蛋白或von Ebner腺蛋白)的突变蛋白。如本文所用术语“人泪液脂质运载蛋白”或“Tlc”或“脂质运载蛋白-1”指具有SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P31025(同种型1)的成熟的人泪液脂质运载蛋白。可将示于SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P31025的氨基酸序列用作优选的“参考序列”，更优选地，将示于SEQ ID NO:41的氨基酸序列用作参考序列。
本发明还涵盖如上所定义的Tlc突变蛋白，其中成熟人泪液脂质运载蛋白序列的前4个N-末端氨基酸残基(His-His-Leu-Leu；位置1-4)和/或成熟人泪液脂质运载蛋白(SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P31025)线性多肽序列的最后2个C-末端氨基酸残基(Ser-Asp；位置157-158)缺失(SEQ ID NO:2-5)。此外，本发明涵盖如上所定义的Tlc突变蛋白，其中对应于成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置108的一个GH环氨基酸残基(Lys)缺失(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:43)。成熟人泪液脂质运载蛋白的野生型多肽序列的另一个可能突变是将以全文引用并入本文的PCT申请WO 2005/019256所述的在序列位置5至7(Ala Ser Asp)的氨基酸序列改变为Gly Gly Asp。
本发明的Tlc突变蛋白可进一步包含氨基酸置换Arg 111→Pro。本发明的Tlc突变蛋白还可包含置换Lys 114→Trp。其还可包含置换Cys 101→Ser或Cys 101→Thr。在一些优选的实施方案中，本发明的Tlc突变蛋白还可包含置换Cys 153→Ser。
氨基酸序列的修饰包括单个氨基酸位置的直接诱变，以便通过引入某些限制性酶的切割位点来简化突变的脂质运载蛋白基因或其部分的亚克隆。此外，还可引入这些突变以进一步改善Tlc突变蛋白对IL-17A或IL-23p19的亲和力。另外，如果需要，可以引入突变以便调节突变蛋白的某些特征，例如改善折叠稳定性、血清稳定性、蛋白质抗性或水溶性，或者降低聚集趋势。例如，可以将天然存在的半胱氨酸残基突变成其他氨基酸以防止二硫桥形成。这种将半胱氨酸残基引入Tlc突变蛋白的氨基酸序列的突变的示例性可能性包括以下置换：Thr 40→Cys、Glu 73→Cys、Arg 90→Cys、Asp 95→Cys和Glu 131→Cys。在氨基酸位置40、73、90、95和/或131中任意的侧面处产生的硫醇部分可以用于PEG化或HES化突变蛋白，例如，以便增加相应Tlc突变蛋白的血清半衰期。
在另一特别的实施方案中，本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白是人脂质运载蛋白2的突变蛋白。本文所用术语“人脂质运载蛋白2”或“人Lcn2”或“人NGAL”指具有SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P80188的成熟的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)。本发明的人脂质运载蛋白2突变蛋白此处还可命名为“hNGAL突变蛋白”。可将示于SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P80188的氨基酸序列用作优选的“参考序列”，更优选地，将示于SEQ ID NO:43的氨基酸序列用作参考序列。
在一些实施方案中，以可检测的亲和力结合IL-17A或IL-23p19的脂质运载蛋白突变蛋白可包含至少一个用另一个氨基酸(例如丝氨酸残基)置换天然半胱氨酸残基的氨基酸置换。在一些其它实施方案中，以可检测的亲和力结合IL-17A或IL-23p19的脂质运载蛋白突变蛋白可包含一个或多个非天然半胱氨酸残基置换野生型脂质运载蛋白的一个或多个氨基酸。在进一步特别的实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白包含至少两个用半胱氨酸残基置换天然氨基酸的氨基酸残基置换，从而形成一个或多个半胱氨酸桥。在一些实施方案中，所述半胱氨酸桥可以连接至少两个环区。根据Flower(Flower，1996,上文；Flower等，2000，上文)和Breustedt等(2005，上文)在本文中使用这些区的定义。
本发明的针对或特异性于IL-17A或IL-23p19的蛋白包含任何数目的基于所定义的蛋白骨架的特异性结合蛋白突变蛋白。优选地，交换、缺失或插入的核苷酸或氨基酸的数目分别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多(比如25、30、35、40、45或50)，其中优选的是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11和甚至更优选的是9、10或11。然而，优选的是本发明的脂质运载蛋白突变蛋白仍然能够结合IL-17A或IL-23p19，特别是人IL-17A或人IL-23p19。
一方面，本发明包含以至少可检测的亲和力结合IL-17A或IL-23p19的各种脂质运载蛋白突变蛋白。在此意义上，可认为IL-17A或IL-23p19是参考野生型脂质运载蛋白的非天然配体，其中“非天然配体”是指在生理条件下不能结合野生型脂质运载蛋白的化合物。通过在某些序列位置处用一个或多个突变工程化野生型脂质运载蛋白，本发明的发明人已经证明对非天然配体，如IL-17A或IL-23p19的高亲和力和高特异性是可能的。在一些实施方案中，在编码野生型脂质运载蛋白上某些序列位置处的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或甚至更多个核苷酸三联体上，可以通过用核苷酸三联体的亚集(subset)在这些位置上的置换来实施随机诱变。
此外，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可在对应于参考脂质运载蛋白线性多肽序列某些序列位置的任一个或多个(包括至少在任1个、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)序列位置处具有突变的氨基酸残基。
本发明的蛋白可包含在突变的氨基酸序列位置之外的“亲本”蛋白骨架(例如脂质运载蛋白)的野生型(天然)氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白还可在序列位置上携带一个或多个氨基酸突变，只要这种突变不妨碍或干扰、至少基本上不妨碍或干扰突变蛋白的结合活性和折叠。可以采用已建立的标准方法(Sambrook,J.等(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)在DNA水平上非常简单地完成这种突变。氨基酸序列改变的示例性实例是插入或缺失以及氨基酸置换。这种置换可以是保守的，即氨基酸残基被替代为化学性质(特别是关于极性以及尺寸)相似的氨基酸残基。保守置换的实例是以下组的成员之间的替代：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，也可以将非-保守性改变引入氨基酸序列。此外，代替替换单一氨基酸残基，还可以使人泪液脂质运载蛋白的一级结构插入或缺失一个或多个连续氨基酸，只要这些缺失或插入导致稳定的折叠/功能的突变蛋白(例如，具有截短的N-和C-末端的Tlc突变蛋白)。在这种突变蛋白中，例如，在多肽的N-或C-末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基。一般而言，这种突变蛋白与成熟人泪液脂质运载蛋白的氨基酸序列具有约至少70％(包括至少约80％，比如至少约85％)的氨基酸序列同一性。作为示例性实例，本发明还涵盖如上定义的Tlc突变蛋白，其中成熟人泪液脂质运载蛋白序列的前4个N-末端氨基酸残基(His-His-Leu-Leu；位置1-4)和/或成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列的最后2个C-末端氨基酸残基(Ser-Asp；位置157-158)缺失(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:43)。
当与其它脂质运载蛋白比较序列同一性时，本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与参考脂质运载蛋白具有高序列同一性。在该一般情况下，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列至少基本上类似于参考脂质运载蛋白的氨基酸序列，前提是在比对中可能存在由氨基酸的添加或缺失导致的间隙(如下所定义)。在一些实施方案中，本发明的基本上类似于参考脂质运载蛋白的序列的脂质运载蛋白突变蛋白的相应序列与参考脂质运载蛋白突变蛋白的序列具有至少70％同一性或序列同源性、至少75％同一性或序列同源性、至少80％同一性或序列同源性、至少82％同一性或序列同源性、至少85％同一性或序列同源性、至少87％同一性或序列同源性或者至少90％同一性或序列同源性(包括至少95％同一性或序列同源性)，前提是保留改变的位置或序列并且一个或多个间隙是可能的。
如本文所使用，由于结合特异性不是绝对的，而是一种相对性质，因此，若本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能够区分靶标和一个或多个参考靶标，则其能“特异性结合”这种靶标(例如，IL-17A或IL-23p19)。根据蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-试验、FACS、IHC和肽扫描来测定“特异性结合”。
在一个实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白在其N-末端和/或其C-末端与融合配偶体融合，该融合配偶体是延长所述突变蛋白血清半衰期的蛋白结构域。在进一步特别的实施方案中，该蛋白结构域是免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合结构域、白蛋白结合肽和白蛋白结合蛋白。
在另一个实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白与延长所述突变蛋白血清半衰期的化合物缀合。更优选地，所述突变蛋白与选自以下的化合物缀合：聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合结构域、白蛋白结合肽和白蛋白结合蛋白。
在又一实施方案中，本发明涉及包含编码本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本发明涵盖包含所述核酸分子的宿主细胞。
可通过诱变人泪液脂质运载蛋白的天然存在形式的方式获得本发明的Tlc突变蛋白。可通过诱变人脂质运载蛋白2的天然存在形式的方式获得本发明的hNGAL突变蛋白。在一些所述诱变的实施方案中，置换(或替代)是保守置换。然而，可以设想任何置换(包括非-保守置换或一个或多个源自下文的示例性置换)，只要所述脂质运载蛋白突变蛋白保留其结合IL-17A或IL-23p19的能力，和/或所述脂质运载蛋白突变蛋白与然后被置换的序列具有同一性，即所述脂质运载蛋白突变蛋白分别与成熟人泪液脂质运载蛋白或成熟人脂质运载蛋白2的氨基酸序列具有至少60％，比如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或更高的同一性。
A.具有白细胞介素-17A(IL-17A，与IL-17同义)结合亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白
一方面，本发明提供结合人IL-17A(与“IL-17”相同)的人脂质运载蛋白突变蛋白及其有益用途。本文所述结合蛋白可结合人IL-17A同二聚体(与“IL-17A/A”相同)和/或人IL-17A与人IL-17F同源物的异二聚体(与“IL-17A/F”相同)。本发明还提供制备本文所述的IL-17A结合蛋白以及包含这种蛋白的组合物的方法。本发明的IL-17A结合蛋白及其组合物可用于检测样品中IL-17A(包括IL-17A/A和IL-17A/F)的方法中或用于结合受试者中IL-17A(包括IL-17A/A和IL-17A/F)的方法中。之前未描述过这种具有伴随本发明提供用途的这些特征的人脂质运载蛋白突变蛋白。
本发明的一个实施方案涉及一种脂质运载蛋白突变蛋白，当在基本上如实施例1所述的分析中测量时，其能以通过约1nM或更低(例如0.8nM)的KD量度的亲和力结合白细胞介素-17A(IL-17A)。
在一些其它实施方案中，在基本上如实施例3所述的竞争ELISA形式中，所述脂质运载蛋白突变蛋白能够以约100pM或更低(例如75pM)的IC50值抑制IL-17A与其受体IL-17RA的结合。
在一些特别的实施方案中，所述IL-17A-结合脂质运载蛋白突变蛋白与人IL-17A、食蟹猕猴IL-17A和绒猴IL-17A交叉反应。
在一些又进一步的实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能够阻断IL-17A与其受体IL-17RA的结合。在一些进一步的实施方案中，当在基本上如实施例5所述的分析中测量所述脂质运载蛋白突变蛋白和基准抗体时，所述脂质运载蛋白突变蛋白具有的平均EC50值至少与基准抗体的EC50值一样好(即差异小于0.1nM)或更优。在一些实施方案中，所述基准抗体是包含(i)SEQ ID NO:53或55作为第一亚单位和(ii)SEQ ID NO:54或56作为第二亚单位的多肽。脂质运载蛋白突变蛋白在分析中可具有约0.13nM或甚至更低的平均IC50值，同时基准抗体在分析中具有约2.33nM或更低(例如约0.12nM)的EC50值。
在一些其它实施方案中，例如，当在基本上如实施例1所述的分析中，通过比SEQID NO:42的脂质运载蛋白突变蛋白的KD更低的第一所述脂质运载蛋白突变蛋白的KD测量地，本发明的IL-17A-结合脂质运载蛋白突变蛋白能够以比SEQ ID NO:42的脂质运载蛋白突变蛋白更高的亲和力结合IL-17A。在一些进一步的实施方案中，例如，当在基本上如实施例5所述的分析中测量时，本发明的IL-17A-结合脂质运载蛋白突变蛋白能够以比SEQ IDNO:42的脂质运载蛋白突变蛋白更低的EC50值抑制IL-17A与其受体IL-17RA的结合。
1.具有白细胞介素-17A(IL-17A)结合-亲和力的示例性脂质运载蛋白突变蛋白
一方面，本发明涉及新的针对或特异于白细胞介素-17A(IL-17A)的特异性-结合人泪液脂质运载蛋白突变蛋白。本文公开的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白可用于治疗和/或诊断目的。本发明的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白在本文中还可命名为“Tlc突变蛋白”。如本文所使用，由于结合特异性不是绝对的，而是一种相对性质，因此，若本发明的Tlc突变蛋白能够区分一种靶标和一个或多个参考靶标，则其能“特异性结合”这种靶标(例如，此处为IL-17A)。根据蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-试验、FACS、IHC和肽扫描来测定“特异性结合”。
因此，本发明提供一种或多种Tlc突变蛋白，其能够以通过约10nM、约1nM、约0.1nM或更低的KD量度的亲和力结合白细胞介素-17A(IL-17A)。更优选地，所述Tlc突变蛋白可具有通过约1nM、0.8nM、0.6nM、100pM或更低的KD量度的亲和力。
在一些特别的实施方案中，这种Tlc突变蛋白在对应于成熟人泪液脂质运载蛋白(SWISS-PROT数据库登录号P31025；SEQ ID NO:41)线性多肽序列的位置26-33、56、58、60-61、64、92、101、104-106、108、111、114和153的一个或多个位置处具有突变的氨基酸残基。
在进一步特别的实施方案中，这种Tlc突变蛋白可进一步在对应于成熟人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:41)线性多肽序列的位置101、111、114和153的一个或多个位置处具有突变的氨基酸残基。
在一些进一步的实施方案中，所述Tlc突变蛋白在对应于成熟人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:41)线性多肽序列的序列位置26、27、28、29、30、31、32、33、56、58、60、61、64、92、101、104、105、106、108、111、114和153的一个或多个序列位置处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多个突变的氨基酸残基。
在一些又进一步的实施方案中，本发明涉及一种多肽，其中所述多肽为Tlc突变蛋白，与成熟人泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列相比，所述Tlc突变蛋白在序列位置26-33、56、58、60-61、64、92、101、104-106、108、111、114和153处包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或甚至更多个突变的氨基酸残基，并且其中所述多肽结合IL-17A，特别是结合人IL-17A。
在一些实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可包含至少一个用如丝氨酸残基置换天然半胱氨酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，本发明的Tlc突变蛋包含用丝氨酸残基置换在位置61和/或153处的天然半胱氨酸残基的氨基酸置换。在本上下文中应注意已经发现(在相应的天然(naive)核酸文库的水平上)移除由半胱氨酸61和153形成的野生型泪液脂质运载蛋白的结构二硫键(参见Breustedt，等，2005，上文)可以提供泪液脂质运载蛋白突变蛋白，其不仅稳定折叠，还能以高亲和力结合给定非-天然配体。不希望受理论束缚，还认为结构二硫键的消除提供了允许(自发)产生非-天然人工二硫键或将其特意引入本发明的突变蛋白中的其它优点，由此增加所述突变蛋白的稳定性。例如，在一些实施方案中，本发明的Tlc突变蛋白包含用丝氨酸残基置换在位置101处的天然半胱氨酸残基的氨基酸置换。进一步地，在一些实施方案中，本发明的突变蛋白包含用脯氨酸残基置换在位置111处的天然精氨酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，本发明的突变蛋包含用色氨酸残基置换在位置114处的天然赖氨酸残基的氨基酸置换。
相对于成熟人泪液脂质运载蛋白(WISS-PROT数据库登录号P31025)的氨基酸序列，本发明的Tlc突变蛋白在成熟人泪液脂质运载蛋白的位置26-33、56、58、60-61、64、92、101、104-106、108、111、114和153的任意处可进一步包含一个或多个(包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或至少14个)用半胱氨酸残基置换天然氨基酸残基的氨基酸置换。
在一些实施方案中，本发明的突变蛋白在关于成熟人泪液脂质运载蛋白氨基酸序列的位置28或105处包含用半胱氨酸残基置换天然氨基酸的氨基酸置换。在一些实施方案中，本发明的突变蛋白在关于成熟人泪液脂质运载蛋白氨基酸序列的位置28或105处包含用半胱氨酸残基置换天然氨基酸的氨基酸置换。在进一步特别的实施方案中，本发明的突变蛋白在关于成熟人泪液脂质运载蛋白氨基酸序列的位置28和105处包含用两个半胱氨酸残基置换天然氨基酸的氨基酸置换。
在一些实施方案中，本发明的Tlc突变蛋白包含出现在序列位置61和153的每一处的半胱氨酸残基中的至少一个或两个被另一氨基酸置换的氨基酸，且包含在成熟人泪液脂质运载蛋白(SWISS-PROT数据库登录号P31025)线性多肽序列的序列位置26-33、56、58、60-61、64、92、101、104-106、108、111、114和153的任意处的至少三个氨基酸残基的突变。位置26-34包含在AB环中，位置55位于β-折叠的最末端，并且随后的位置56-58以及60-61和64包含在CD环中。位置104-108包含在成熟人泪液脂质运载蛋白的β-桶结构的开放端的结合位点中的GH环中。根据Flower(Flower,1996，上文；Flower等，2000，上文)和Breustedt等(2005，上文)将这些区域的定义用于本文。在一些实施方案中，本发明的Tlc突变蛋白包含氨基酸置换Cys 61→Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Gly、Gln、Asp、Asn、Leu、Tyr、Met、Ser、Pro或Trp和Cys 153→Ser或Ala。已证明这种置换可用于阻止形成天然存在的连接Cys61和Cys153的二硫桥，并从而有助于处理所述突变蛋白。然而，结合IL-17A并具有在Cys61和Cys153之间形成的二硫桥的泪液脂质运载蛋白突变蛋白也是本发明的一部分。
在一些实施方案中，本发明的IL-17A结合Tlc突变蛋白在成熟人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:41)的序列位置26-33、56、58、60-61、64、92、101、104-106、108、111、114和153中的任意一个或多个处包含一个或多个以下突变的氨基酸残基：Arg 26→Phe；Glu 27→Trpl；Phe 28→Cys；Pro 29→Ser；Glu 30→Gly；Met 31→Ile；Asn 32→His；Leu 33→Glu；Leu 56→Asp；Ser 58→Glu；Arg 60→Phe；Cys 61→Leu；Val 64→Phe；His 92→Arg；Cys101→Ser；Glu 104→Asp；Leu 105→Cys；His 106→Pro；Lys 108缺失；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser。在一些实施方案中，本发明的Tlc突变蛋白在成熟人泪液脂质运载蛋白的这些序列位置处包括两个或更多个，比如3、4、5、6、7、8或全部突变的氨基酸残基。
在进一步特别的实施方案中，本发明的Tlc突变蛋白包含如SEQ ID NO:1或其片段或变体中任一个所示的氨基酸序列。
在进一步特别的实施方案中，本发明的Tlc突变蛋白与选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％或更高的同一性。
本发明还包含具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Tlc突变蛋白的结构同源物，所述结构同源物与所述的Tlc突变蛋白具有大于约60％，优选地大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于92％和最优选地大于95％的序列同源性或序列同一性。
在一些特别的实施方案中，本发明提供以通过约1nM或更低的KD量度的亲和力结合IL-17A的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％或更高，比如95％的同一性。
2.具有白细胞介素-17A(IL-17A)结合亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白的应用
IL-17A是由记忆T细胞(称为Th17)的亚集产生的促炎细胞因子，其涉及许多障碍的发病机理，例如多发性硬化症(MS)(Hellings,P.W.等，Am.J.Resp.Cell Mol.Biol.28(2003)42-50；Matusevicius,D.等，Multiple Sclerosis5(1999)101-104)、类风湿性关节炎(RA)(Ziolkovvska,M.等，J.Immunol.164(2000)2832-38；Kotake,S.等，J.Clin.Invest.103(1999)1345-52；Hellings,P.W.等，Am.J.Resp.Cell Mol.Biol.28(2003)42-50)。IL-17A在诱导其它炎性细胞因子、趋化因子和粘附分子(Komiyama,Y.等，J.Immunol.177(2006)566-573)、银屑病、克罗恩氏(crohn)病、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘和移植排斥中起作用。
IL-17参与诱导促炎症响应并诱导或介导多种其它细胞因子、因子和介质的表达，包括组织坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-8、IL-1β、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、前列腺素E2(PGE2)、IL-10、IL-12、IL-IR拮抗剂、白血病抑制因子、和溶基质素(stromelysin)(Yao等，J.Immunol,155(12):5483-5486(1995)；Fossiez等，J.Exp.Med.,183(6):2593-2603(1996)；Jovanovic等，J.Immunol,160:3513-3521(1998)；Teunissen等，J.Investig.Dermatol,111:645-649(1998)；Chabaud等，J.Immunol,161:409-414(1998))。IL-17A还诱导软骨细胞和人骨关节炎外植体中的一氧化氮(Shalom-Barak等，J.BiolChem.,273:27467-27473(1998)；Attur等，Arthritis Rheum.,40:1050-1053(1997))。通过IL-17A在T细胞介导的自身免疫中的作用，IL-17A诱导细胞因子、趋化因子和生长因子的释放(如上所述)，其是嗜中性粒细胞积聚的重要局部调节剂，并在软骨和骨破坏中起作用。越来越多的证据表明靶向IL-17A信号传导可能在包括类风湿性关节炎(RA)、银屑病、克罗恩氏(crohn)病、多发性硬化症(MS)、银屑病性疾病(psoriatric disease)、哮喘和系统性红斑狼疮(SLE)的多种自身免疫疾病中有益(参见如Aggarwal等，J.Leukoc.Biol,71(1):1-8(2002)；Lubberts等，"Treatment with a neutralizing anti-murine interleukin-17antibody after the onset of collagen-induced arthritisreduces joint inflammation,cartilage destruction,and bone erosion,"ArthritisRheum.,50:650-659(2004))。
此外，本领域已知炎症和免疫调节过程涉及各种形式的心血管疾病的发病机理(Biasucci,L.,等，Circulation 1999,99:855-860；Albert,C,等，Circulation 2002,105:2595-9；Buffon,A.,等，NEJM 2002,347:55-7；Nakajima,T.,等，Circulation 2002,105:570-5)。目前的研究已经通过降低疾病的炎性和免疫调节响应建立了治疗心血管疾病的基础(Blankenberg,S.,等，Circulation 2002,106:24-30；Mallat,Z.,等，Circulation2001,104:1598-603；Mallat,Z.,等，Circ Res.2001,89:E41-5)。心血管疾病涵盖多种影响心脏的肌肉和/或血管、外周血管、肌肉和各种器官的障碍。
因此，本发明的Tlc突变蛋白的许多可能应用存在于医药中。在另一方面，本发明涉及所公开的Tlc突变蛋白在用于检测样品中IL-17A(包括IL-17A/A和IL-17A/F)以及相应的诊断方法中的用途。
本发明还涉及如所述的一种或多种Tlc突变蛋白在用于与IL-17A形成复合物中的用途。
因此，本发明的另一方面，所公开的突变蛋白用于检测IL-17A。这种用途可包括以下步骤：使一种或多种所述突变蛋白与怀疑含有IL-17A的样品在合适条件下接触，由此允许在所述突变蛋白与IL-17A之间形成复合物，并通过合适信号检测所述复合物。
可检测信号可以通过如上文所述的标记产生，或通过由于结合(即复合物形成)本身而导致的物理特性的变化而产生。一个实例是等离子体表面共振，其数值在结合配偶体结合期间发生改变，所述配偶体中的一者固定在表面上，例如金箔上。
本文公开的突变蛋白还可用于分离IL-17A。这种用途可包括以下步骤：使一种或多种所述突变蛋白与猜测含有IL-17A的样品在合适条件下接触，由此允许在所述突变蛋白与IL-17A之间形成复合物，并从所述样品中分离所述复合物。
在所公开的突变蛋白用于检测IL-17A以及分离IL-17A中的用途中，可以将所述突变蛋白和/或IL-17A或其结构域或片段固定在合适的固相上。
又一方面，本发明的特征在于包含本发明的Tlc突变蛋白的诊断或分析试剂盒。
除了其在诊断中的用途，再一方面，本发明涵盖本发明的突变蛋白或包含这种突变蛋白的组合物在结合受试者中IL-17A和/或抑制受试者中IL-17A与其受体结合中的用途。
再又一方面，本发明的特征在于一种结合受试者中IL-17A的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的一种或多种本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或者一种或多种包含这种突变蛋白的组合物。
再又一方面，本发明涉及一种抑制受试者中IL-17与其受体结合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的一种或多种本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或者一种或多种包含这种突变蛋白的组合物。
在本发明的上下文中，所公开的具有IL-17A结合亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白可结合作为同二聚体存在的IL-17A，但是这种突变蛋白还可结合作为与同源IL-17F复合从而形成异二聚体IL-17A/F的异二聚体存在的IL-17A。在一个优选的实施方案中，本发明的一种脂质运载蛋白突变蛋白可以可检测的亲和力结合与IL-17F复合的IL-17A。
B.具有白细胞介素-23p19(IL-23p19)结合亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白
此外，本发明通过提供结合人IL-23p19的人脂质运载蛋白突变蛋白及其有益应用来满足对IL-23p19的可选抑制剂的需求。因此，本发明还提供制备和应用本文所述的IL-23p19-结合蛋白的方法以及可被用于检测样品中IL-23p19的方法或用于结合受试者中IL-23p19的方法中的组合物。之前未描述过这种具有伴随本发明提供用途的这些特征的脂质运载蛋白突变蛋白。
本发明的一个实施方案涉及一种脂质运载蛋白突变蛋白，当在基本上如实施例6或实施例13所述的分析中测量时，所述脂质运载蛋白突变蛋白能够以通过约1nM或更低(例如约0.6nM)的KD量度的亲和力结合白细胞介素-23p19(IL-23p19)。
在一些其它实施方案中，在基本上如实施例8或实施例14所述的竞争ELISA形式中，所述脂质运载蛋白突变蛋白能够以约0.55nM或更低的IC50值抑制IL-23与其受体IL-23R的结合。
在一些特别的实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白与人IL-23和小鼠IL-23二者交叉反应。
在一些又进一步的实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能够抑制IL-23与其受体IL-23R的结合。在一些进一步的实施方案中，当在基本上如实施例10或实施例15所述的分析中测量所述脂质运载蛋白突变蛋白和基准抗体时，所述脂质运载蛋白突变蛋白具有的平均EC50值至少与基准抗体的平均EC50值一样好(即差异小于1.0nM)或更优。在一些实施方案中，所述基准抗体是包含(i)SEQ ID NO:57或59作为第一亚单位和(ii)SEQ IDNO:58或60作为第二亚单位的多肽。脂质运载蛋白突变蛋白在分析中可具有约1.2nM或甚至更低的平均EC50值，同时基准抗体在分析中具有约3nM或更低(比如约1.2nM)的EC50值。
在一些其它实施方案中，本发明的IL-23p19-结合脂质运载蛋白突变蛋白比SEQID NO:44的脂质运载蛋白突变蛋白更加生物物理稳定。
1.具有白细胞介素-23p19(IL-23p19)结合亲和力的示例性脂质运载蛋白突变蛋白
一方面，本发明涉及新的针对或特异于白细胞介素-23p19(IL-23p19)的特异性-结合人脂质运载蛋白2(Lcn2或NGAL)。本文公开的人脂质运载蛋白2突变蛋白可用于治疗和/或诊断目的。本发明的人脂质运载蛋白2突变蛋白在本文中还可命名为“NGAL突变蛋白”。如本文所使用，由于结合特异性不是绝对的，而是一种相对性质，因此，若本发明的Tlc突变蛋白能够区分靶标和一个或多个参考靶标，则其能“特异性结合”该靶标(此处为IL-23p19)。根据蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-试验、FACS、IHC和肽扫描来测定“特异性结合”。
对此，本发明提供一种或多种NGAL突变蛋白，其能够以通过约10nM或更低的KD量度的亲和力结合白细胞介素-23p19(IL-23p19)。更优选地，所述NGAL突变蛋白可具有通过约1nM更低的KD测量的亲和力。
在一些实施方案中，本发明的hNGAL突变蛋白在对应于成熟hNGAL(SEQ ID NO:43)线性多肽序列的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、75-77、79、81、87、96、98、100、103、106、114、120、125、127、134和175的一个或多个位置处包含置换。
在特别的实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白在对应于成熟hNGAL(SWISS-PROT数据库登录号P80188；SEQ ID NO:43)线性多肽序列的序列位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、75-77、79、81、87、96、98、100、103、106、114、120、125、127、134和175的序列位置处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多个置换。优选地，设想本发明涉及一种脂质运载蛋白突变蛋白，其除了在对应于成熟人NGAL线性多肽序列的位置36、87和/或96的位置处包含一个或多个置换外，还在对应于成熟hNGAL线性多肽序列的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、75-77、79、81、87、96、98、100、103、106、114、120、125、127、134和175的一个或多个位置处包含置换。
在一些又进一步的实施方案中，本发明涉及一种多肽，其中所述多肽是hNGAL突变蛋白，与成熟hNGAL的线性多肽序列相比，所述hNGAL突变蛋白在序列位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、75-77、79、81、87、96、98、100、103、106、114、120、125、127、134和175处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多个突变的氨基酸残基，并且其中所述多肽结合IL-23p19，特别是结合人IL-23p19。
在一些实施方案中，本发明的IL-23p19-结合hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL(SEQ IDNO:43)线性多肽序列的序列位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、75-77、79、81、87、96、98、100、103、106、114、120、125、127、134和175的任一个或多个处包含一个或多个以下突变的氨基酸残基：Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Leu；Gln 49→Arg；Tyr 52→Thr；Asn 65→Asp；Ser 68→Arg；Leu 70→Glu；Arg 72→Gly；Lys 73→Ala或Vla；Lys 75→Thr；Asp 77→Lys；Trp 79→Gln或Arg；Arg 81→Gly；Asn 96→Gly；Lys 98→Glu；Tyr 100→Met；Leu 103→Met；Tyr 106→Phe；Asn 114→Asp；Met 120→Ile；Lys 125→Tyr；Ser 127→Tyr；和Lys 134→Glu。在一些实施方案中，本发明的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL的这些序列位置处包括两个或更多个，比如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、甚至更多个或全部突变的氨基酸残基。
此外，本发明的IL-23p19-结合hNGAL突变蛋白还可包含以下置换：Cys 87→Ser。另外，本发明的IL-23p19-结合hNGAL突变蛋白还可包含以下置换：Cys 76→Tyr或Arg。另外，本发明的IL-23p19-结合hNGAL突变蛋白还可包含以下置换：Cys 175→Ala。
在一些另外的实施方案中，与成熟hNGAL的线性多肽序列相比，本发明的结合IL-23p19的hNGAL突变蛋白包括下列氨基酸替代组之一：
(a)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Leu；Gln 49→Arg；Tyr 52→Thr；Asn 65→Asp；Ser 68→Arg；Leu 70→Glu；Arg 72→Gly；Lys 73→Ala；Lys 75→Thr；Cys 76→Tyr；Asp 77→Lys；Trp 79→Gln；Arg 81→Gly；Asn 96→Gly；Lys 98→Glu；Tyr 100→Met；Leu103→Met；Tyr 106→Phe；Met 120→Ile；Lys 125→Tyr；Ser 127→Tyr；和Lys 134→Glu；
(b)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Gln 49→Arg；Tyr 52→Thr；Asn 65→Asp；Ser 68→Arg；Leu 70→Glu；Arg 72→Gly；Lys 73→Vla；Lys 75→Thr；Cys 76→Arg；Asp 77→Lys；Trp 79→Arg；Arg 81→Gly；Asn 96→Gly；Tyr 100→Met；Leu 103→Met；Tyr 106→Phe；Lys 125→Tyr；Ser 127→Tyr；和Lys 134→Glu；或
(c)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Leu；Gln 49→Arg；Tyr 52→Thr；Asn 65→Asp；Ser 68→Arg；Leu 70→Glu；Arg 72→Gly；Lys 73→Val；Lys 75→Thr；Cys 76→Tyr；Asp 77→Lys；Trp 79→Gln；Arg 81→Gly；Asn 96→Gly；Tyr 100→Met；Leu 103→Met；Tyr 106→Phe；Asn 114→Asp；Lys 125→Tyr；Ser 127→Tyr；和Lys 134→Glu。
在剩余区域，即不同于序列位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、75-77、79、81、87、96、98、100、103、106、114、120、125、127、134和175的区域中，在突变的氨基酸序列位置外，本发明的hNGAL突变蛋白可以包含野生型(天然的)氨基酸序列。
在进一步特别的实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白包含选自SEQ IDNO:2和45-46或其片段或变体的氨基酸序列。
本发明的IL-23p19-结合hNGAL突变蛋白的氨基酸序列可与选自SEQ ID NO:2和45-46的序列具有高序列同一性，如至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少90％的同一性，包括至少95％的同一性。
本发明还包含具有选自SEQ ID NO:2和45-46的氨基酸序列的hNGAL突变蛋白的结构同源物，所述结构同源物与所述hNGAL突变蛋白具有大于约60％，优选地大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于92％和最优选地大于95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。
在一些特别的实施方案中，本发明提供以通过约1nM或更低的KD量度的亲和力结合IL-23p19的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％或更高，比如95％的同一性。
2.具有白细胞介素-23p19(IL-23p19)结合亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白的应用
白细胞介素-23(IL-23)是由独特亚单位p19(本文中可互换地称为“IL-23p19”)和与白细胞介素-12(IL-12)共享的p40亚单位组成的异二聚体细胞因子(Oppmann,Immunity13:115(2000))。已发现IL-23刺激源自活化的CD4T细胞的IL-17A和IL-17F的产生和/或维持，所述CD4T细胞现在被称为“新的”T-辅助细胞(Th)亚集，命名为Th17。关于IL-23细胞因子和受体生物学的论述综述于Holscher,Curr.Opin.Invest.Drugs 6:489(2005)和Langrish等，Immunol Rev.202:96(2004)中。与Th1和Th2系类似，Th17细胞最可能进化从而为特定类型的病原体(例如细胞外细菌)提供适应性免疫。然而，不适当的Th17响应已经强烈地牵涉不断增加的自身免疫障碍，包括多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎性肠病和银屑病。
在这一方面，IL-23促进以白细胞介素-17的产生为特征的不同CD4T细胞活化状态(J.Biol.Chem.278:1910-191(2003)；还参见Langrish等)。IL-23驱动诱导自身免疫炎症的致病性T细胞群(J.Exp.Med.201:233-240(2005)；Starnes等"Cutting edge:IL-17F,anovel cytokine selectively expressed in activated T cells and monocytes,regulates angiogenesis and endothelial cell cytokine production"J.Immunol.167:4137-4140(2001))。
因此，本发明的具有IL-23p19结合亲和力的突变蛋白的许多可能应用存在于医药中。另一方面，本发明涉及所公开的这种突变蛋白在用于检测样品中IL-23p19以及相应的诊断方法中的用途。
本发明还涉及如所述的一种或多种具有IL-23p19结合亲和力的突变蛋白在用于与IL-23p19形成复合物中的用途。
因此，本发明的又一方面，所公开的突变蛋白用于检测IL-23p19。这种用途可包括以下步骤：使一种或多种所述突变蛋白与怀疑含有IL-23p19的样品在合适条件下接触，从而允许在所述突变蛋白与IL-23p19之间形成复合物，并通过合适信号检测所述复合物。
可检测信号可以通过如上文所述的标记产生，或通过由于结合(即复合物形成)本身而导致的物理特性的变化而产生。一个实例是等离子体表面共振，其数值在结合配偶体结合期间发生改变，所述配偶体中的一者固定在表面上，例如金箔上。
本文公开的突变蛋白还可用于分离IL-23p19。这种用途可包括以下步骤：使一种或多种所述突变蛋白与猜测含有IL-23p19的样品在合适条件下接触，由此允许在所述突变蛋白与IL-23p19之间形成复合物，并从所述样品中分离所述复合物。
在所公开的突变蛋白用于检测IL-23p19以及分离IL-23p19中的用途中，可以将所述突变蛋白和/或IL-23p19或者其结构域或片段固定在合适的固相上。
因此，可测定分子(例如IL-23p19)如在样品中的存在或缺失，以及其浓度或水平。
又一方面，本发明的特征在于包含本发明的具有IL-23p19结合亲和力的突变蛋白的诊断或分析试剂盒。
除了其在诊断中的用途，再一方面，本发明涵盖本发明的这种突变蛋白或包含这种突变蛋白的组合物在结合受试者中IL-23p19和/或抑制受试者中IL-23p19与其受体结合中的用途。
再又一方面，本发明的特征在于一种结合受试者中IL-23p19的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的一种或多种本发明的具有IL-23p19结合亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白或者一种或多种包含这种突变蛋白的组合物。
再又一方面，本发明涉及一种用于抑制受试者中IL-23与其受体结合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的一种或多种本发明的具有IL-23p19结合亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白或者一种或多种包含这种突变蛋白的组合物。
C.包含IL-17A结合脂质运载蛋白突变蛋白和/或IL-23p19结合脂质运载蛋白突变蛋白的组合物和所述脂质运载蛋白突变蛋白的用途
IL-17A和IL-23是涉及炎症的细胞因子。人白细胞介素17A(也称为“IL-17”，包括IL-17A/A和IL-17A/F)是刺激白细胞介素-6(IL-6)、细胞内粘附分子1(ICAM-I)、白细胞介素-8(IL-8)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的表达和前列腺素E2表达的细胞因子，并在CD34+造血前体细胞优先成熟为嗜中性粒细胞中起作用(Yao等，J.Immunol 755:5483(1995)；Fossiez等,J.Exp.Med.183:2593(1996))。人白细胞介素-23(也称为IL-23)是已报道的促进T细胞、特别是记忆T细胞增殖的细胞因子。
已报道IL-17A(包括与IL-17F复合的IL-17A，也被称为“IL-17A/F”)和IL-23均在许多自身免疫疾病，例如多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩氏病和银屑病中起重要作用。在患有多发性硬化症的人的中枢神经系统中和在经受多发性硬化症、实验性自身免疫性脑炎髓炎(EAE)的动物模型的小鼠中，IL-23和IL-17A均过表达。当EAE被髓鞘性少突胶质细胞糖蛋白(MOG)35-55肽-或蛋白脂质肽(PLP)诱导时，在小鼠中观察到了上述过表达。此外，IL-23p19或IL-17A的中和导致了小鼠中EAE症状的改善(Park等，Immunol 6:1133(2005)；Chen等，J Clin Invest.116:1317(2006))。
还已证明IL-17A和Th17细胞可从IL-23-非依赖性来源产生，并且IL-17效应响应的体内发育已显示出IL-23-非依赖性(Mangan等，Nature 441:231(2006))。IL-23的中和理论上将消除现有的IL-17A产生细胞，但是不能完全阻止新的Th17细胞的发育。
因此，本发明涉及这些促炎细胞因子IL-17A和IL-23p19二者的结合，因为IL-23(通过p19)和IL-17A二者的结合比单独的IL-23p19或单独IL-17A的中和更在治疗上有效，因此其对炎性疾病的有效治疗是有益的。
尽管已经描述了针对IL-17A和/或IL-23p19的抗体，但是基于这些抗体的方法仍然具有许多严重的缺陷，例如复杂哺乳动物细胞生产系统的必要性、对二硫键稳定性的依赖性、一些抗体片段聚集的趋势、有限的溶解度和最后但并非最不重要，即使当人源化时，这些抗体也可能引起不期望的免疫应答。因此，仍然需要开发小的球状蛋白(例如脂质运载蛋白)作为骨架以产生新型IL-17A或IL-23p19结合蛋白，例如具有IL-17A或IL-23p19结合亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白。
因此，本发明的一个目标是提供结合IL-17A(包括IL17-A/A和IL17-A/F)和/或IL-23p19的和可用于药物应用中的人脂质运载蛋白突变蛋白。本发明还提供一种或多种包含这种脂质运载蛋白突变蛋白和可选的一种或多种药学上或诊断中可接受的赋形剂(如佐剂、稀释剂或载体)的组合物。本发明的脂质运载蛋白突变蛋白及其组合物可用于检测样品中IL-17A(包括IL17-A/A和IL17-A/F)和/或IL-23p19的方法中或用于结合受试者中IL-17A(包括IL17-A/A和IL17-A/F)和/或IL-23p19的方法中。
如上所讨论的，分别用IL-17A(包括IL17-A/A和IL17-A/F)或IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白同时结合IL-17A(包括IL17-A/A和IL17-A/F)和IL-23p19能够克服分别单独结合IL-17A(包括IL17-A/A和IL17-A/F)或单独结合IL-23p19可能诱导的一些缺氧-介导的效应。因此，本发明涵盖(i)IL-17A特异性的第一脂质运载蛋白突变蛋白和(ii)IL-23p19特异性的第二脂质运载蛋白突变蛋白在用于结合受试者中IL-17A和IL-23p19中的用途。这种用途包括向受试者施用有效量的(i)IL-17A特异性的第一脂质运载蛋白突变蛋白和(ii)IL-23p19特异性的第二脂质运载蛋白突变蛋白的步骤。
在本发明的上下文中，IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白可结合作为同二聚体存在的IL-17A(即IL-17A/A)，但是这种突变蛋白还可结合作为与同源IL-17F复合以形成异二聚体IL-17A/F的异二聚体存在的IL-17A。在一个优选的实施方案中，所述脂质运载蛋白突变蛋白结合IL-17A和IL-17F的复合物。
可将所述第一脂质运载蛋白突变蛋白和所述第二脂质运载蛋白突变蛋白组合施用，所述组合施用包括同时、伴随或按顺序施用。在一些实施方案中，所述第一脂质运载蛋白突变蛋白和所述第二脂质运载蛋白突变蛋白可包含在可被施用的组合物中。所述组合物可包含有效量的第一和第二脂质运载蛋白突变蛋白作为活性成分，以及至少一种药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体。所述第一脂质运载蛋白突变蛋白和所述第二脂质运载蛋白突变蛋白还可彼此独立施用，所述彼此独立施用包括在独立的时间点以单独间隔施用。
在一些实施方案中，本发明还涉及包含IL-17A特异性的第一脂质运载蛋白突变蛋白和(ii)IL-23p19特异性的第二脂质运载蛋白突变蛋白的组合物，所述组合物可用于结合如受试者中IL-17A和IL-23p19的方法中。此外，这种组合物还可用于检测如样品中IL-17A(包括IL17-A/A和IL17-A/F)和IL-23p19的方法中。
在一些其它实施方案中，本发明涉及第一脂质运载蛋白突变蛋白和第二脂质运载蛋白突变蛋白的组合。这些脂质运载蛋白突变蛋白中的一个可以可检测的亲和力结合作为给定非-天然靶标的IL-17A。另一个脂质运载蛋白突变蛋白可以可检测的亲和力结合作为给定非-天然靶标的IL-23p19。从而，相应的脂质运载蛋白突变蛋白分别结合作为给定非-天然靶标的IL-17A或IL-23p19。术语“非-天然靶标”是指在生理条件下不结合相应脂质运载蛋白的化合物。例如，第一脂质运载蛋白突变蛋白可结合IL-17A和第二脂质运载蛋白突变蛋白可结合IL-23p19，或反之亦然。第一脂质运载蛋白突变蛋白和第二脂质运载蛋白突变蛋白的组合可以以各种形式提供。
在一些实施方案中，如本发明所用的IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白能够以可检测的亲和力，即以至少200nM，包括约100nM、约50nM、约25nM或约15nM的解离常数结合IL-17A。在一些实施方案中，如本发明所用的IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白能够以可检测的亲和力，即以至少200nM，包括约100nM、约50nM、约25nM或约15nM的解离常数结合IL-23p19。在一些进一步优选的实施方案中，本发明的组合的脂质运载蛋白突变蛋白以对IL-17A或IL-23p19至少约10nM、约1nM、约0.1nM、约10pM或甚至更低的解离常数分别结合IL-17A或IL-23p19。因此，本发明提供(i)对IL-17A具有特别高亲和力的脂质运载蛋白的突变蛋白和(ii)对IL-23p19具有特别高亲和力的脂质运载蛋白的突变蛋白的组合。
在一些实施方案中，所述对IL-17A具有可检测的亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白是人泪液脂质运载蛋白的突变蛋白。关于对IL-17A具有可检测的亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白的这些和进一步的细节可以在本发明的部分A中找到。
在特别优选的实施方案中，IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施方案中，所述对IL-23p19具有可检测的亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白是人泪液脂质运载蛋白的突变蛋白或人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的突变蛋白。关于对IL-23p19具有可检测的亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白的这些和进一步的细节可以在本发明的部分B中找到。
在特别优选的实施方案中，IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白如SEQ IDNO:2、45和46中任一个所示。
再又一方面，本发明的特征在于一种结合受试者中IL-17A和IL-23的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的(i)IL-17A特异性的第一脂质运载蛋白突变蛋白和(ii)IL-23p19特异性的第二脂质运载蛋白突变蛋白。
再又一方面，本发明涉及一种用于抑制受试者中IL-17A和IL-23分别与其受体结合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的(i)IL-17A特异性的第一脂质运载蛋白突变蛋白和(ii)IL-23p19特异性的第二脂质运载蛋白突变蛋白。
本发明还涉及(i)IL-17A特异性的第一脂质运载蛋白突变蛋白和(ii)IL-23p19特异性的第二脂质运载蛋白突变蛋白在用于与IL-17A和IL-23p19形成复合物中的用途。
因此，本发明的又一方面，所公开的突变蛋白可用于检测IL-17A和IL-23p19。这种用途可包括以下步骤：使两种或更多种所述突变蛋白与怀疑含有IL-17A和IL-23p19的样品在合适条件下接触，由此允许分别在所述突变蛋白与IL-17A之间或所述突变蛋白与IL-23p19之间形成复合物，并通过合适信号检测所述复合物。
可检测信号可以通过如上文所述的标记产生，或通过由于结合(即复合物形成)本身而导致的物理特性的变化而产生。一个实例是等离子体表面共振，其数值在结合配偶体结合期间发生改变，所述配偶体中的一者固定在表面上，例如金箔上。
本文公开的突变蛋白还可用于分离IL-17A和IL-23p19。这种用途可包括以下步骤：使一种或多种所述突变蛋白与猜测含有IL-17A和IL-23p19的样品在合适条件下接触，由此允许分别在所述突变蛋白与IL-17A之间或所述突变蛋白与IL-23之间形成复合物，并从所述样品中分离所述复合物。
在所公开的突变蛋白用于检测IL-17A和IL-23p19以及分离IL-17A和IL-23p19中的用途中，可以将所述突变蛋白和/或IL-17A和IL-23p19或其结构域或片段固定在合适的固相上。
因此，可测定IL-17A和/或IL-23p19如在样品中的存在或缺失，以及其浓度或水平。
另一方面，本发明提供部件的试剂盒(kit of parts)。所述试剂盒包括第一和第二容器。所述第一容器包含第一脂质运载蛋白突变蛋白和所述第二容器包含第二脂质运载蛋白突变蛋白。一方面，本发明涉及一种试剂盒，其在一个或多个容器中单独或以混合物的形式包含IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。又一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其在一个或多个容器中单独或以混合物的形式包含IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其在一个或多个容器中单独或以混合物的形式包含IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白和IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些进一步的优选实施方案中，所述试剂盒包括包含IL-17A特异性的第一脂质运载蛋白突变蛋白的第一容器和包含IL-23p19特异性的第二脂质运载蛋白突变蛋白的第二容器。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括与其一体的或作为一个或多个单独文件的关于内容或该试剂盒和所述脂质运载蛋白突变蛋白的使用的信息。在一些实施方案中，该试剂盒可包括一种或多种组合物，其配制为用于在稀释剂中重构。这样的稀释剂，例如无菌稀释剂，也可包括在该试剂盒中，例如在容器内。
D.具有IL-17A和/或IL-23p19结合亲和力的融合蛋白及其用途
一方面，本发明涉及一种包含至少两个任何顺序的亚单位的融合蛋白：一个亚单位具有IL-17A结合特异性和另一个亚单位具有IL-23p19结合特异性。
例如本发明提供一种融合蛋白，其含有分别具有IL-17A(包括IL-17A/A和IL-17A/F)和IL-23p19结合特异性的蛋白部分。在这一方面，所述融合蛋白的一个亚单位可包含本发明的IL-17A(包括IL-17A/A和IL-17A/F)特异性的脂质运载蛋白突变蛋白，而所述融合蛋白的另一个亚单位可包含本发明的IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。
另一方面，本发明涉及包含至少两个亚单位的融合蛋白，其中每个亚单位具有IL-17A(包括IL-17A/A和IL-17A/F)结合特异性。在一些实施方案中，至少一个亚单位包含IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，在基本上如实施例2所述的分析中，所述融合蛋白具有约1nM或更低的KD的IL-17A结合亲和力。在另一些实施方案中，在基本上如实施例3所述的竞争ELISA形式中或基本上如实施例5所述的分析中，所述融合蛋白能够抑制IL-17A与其受体的结合。
在一些进一步的实施方案中，两个亚单位的每一个均包含IL-17A/A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些进一步的实施方案中，两个亚单位的每一个均包含IL-17A/F特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。这两个脂质运载蛋白突变蛋白可具有不同的氨基酸序列。因此，在一些实施方案中，这两个脂质运载蛋白突变蛋白结合IL-17A上的不同表位。然而，在一些其它实施方案中，这两个脂质运载蛋白突变蛋白可以是彼此相同的。例如，这种融合蛋白可包含两个SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在这一方面，所述融合蛋白可具有如SEQ IDNO:10、SEQ NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的含有两个具有IL-17A(包括IL-17A/A和IL-17A/F)结合特异性的亚单位的融合蛋白可以比单个亚单位显示出更高的效力，这是由于由靶标(如IL17A/A)的二聚体性质引起的两个亚单位的亲合力效应。在这一方面，所述融合蛋白可以是二价融合蛋白。再又一方面，本发明还涵盖包含至少两个具有IL-23p19结合特异性的亚单位的融合蛋白。在一些实施方案中，至少一个亚单位包含IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，在基本上如实施例7所述的分析中，所述融合蛋白具有10nM或更低的KD的IL-23p19结合亲和力。在一些另外的实施方案中，在基本上如实施例8或实施例14所述的竞争ELISA形式中或者基本上如实施例10或实施例15所述的分析中，所述融合蛋白能够抑制IL-23与其受体的结合。
在一些进一步的实施方案中，两个亚单位的每一个均包含IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。这两个脂质运载蛋白突变蛋白可具有不同的氨基酸序列。因此，在一些实施方案中，这两个脂质运载蛋白突变蛋白结合IL-23p19上的不同表位。然而，在一些其它实施方案中，这两个脂质运载蛋白突变蛋白可以是彼此相同的。
又一方面，本申请公开了一种融合蛋白，其包含(i)免疫球蛋白的Fc部分，包括全长人抗体，例如IgG抗体，和(ii)IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。
另一方面，本发明公开了一种融合蛋白，其包含(i)免疫球蛋白的Fc部分，包括全长人抗体，例如IgG抗体，和(ii)IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。
示例性IL-17A(包括IL-17A/A和IL-17A/F)特异性的脂质运载蛋白突变蛋白包括本发明A部分公开的那些。在特别优选的实施方案中，该脂质运载蛋白突变蛋白如SEQ IDNO:1所示。
示例性IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白包括本发明B部分公开的那些。在特别优选的实施方案中，该脂质运载蛋白突变蛋白如SEQ ID NO:2、45和46中任一个所示。
在一些特别的实施方案中，可将脂质运载蛋白突变蛋白，例如通过肽键，连接至人抗体Fc部分的C-末端和/或N-末端(参见图11)。在特别的实施方案中，本发明的融合蛋白可包含与IgG抗体Fc部分连接的脂质运载蛋白突变蛋白。在这一方面，这些融合蛋白中的一个包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在又一优选的实施方案中，本发明的融合蛋白包含如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸。
在相关的实施方案中，本发明的一个或多个融合蛋白能够抑制IL-17A和IL-23分别与它们的受体的结合。在一些进一步的实施方案中，本发明的一个或多个融合蛋白能够同时结合(engage)IL-17A和IL-23p19，并且由此能够同时抑制IL-17A和IL-23分别与它们的受体的结合。
在这方面，本发明涉及一种包含至少两个任何顺序的亚单位的融合蛋白，包括一个亚单位包含IL-17A(包括IL-17A/A和IL-17A/F)特异性的脂质运载蛋白突变蛋白和一个亚单位包含IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些进一步的实施方案中，该融合蛋白可包含另外的亚单位，该亚单位包含IL-17A(包括IL-17A/A和IL-17A/F)或IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，包含在融合蛋白的两个不同亚单位中的两个IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白可结合IL-17A靶标上的不同表位；可选地，包含在融合蛋白的两个不同亚单位中的两个IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白可具有相同的氨基酸序列，并因此对IL-17A靶标上的相同表位具有特异性。本发明的具有两个结合IL-17A的亚单位的融合蛋白可以比具有仅一个结合IL-17A的亚单位的融合蛋白显示出对IL-17A更强的结合，这是由于靶标的二聚体性质所带来的亲合力效应。同样，包含在融合蛋白的两个不同亚单位中的两个IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白可结合IL-23p19靶标上的不同表位；可选地，包含在融合蛋白的两个不同亚单位中的两个IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白可具有相同的氨基酸序列，并因此对IL-23p19靶标上的相同表位具有特异性。融合蛋白还包括将一个亚单位连接至另一个亚单位的连接子。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白的一个亚单位包含本发明A部分公开的脂质运载蛋白突变蛋白。在特别优选的实施方案中，所述亚单位包含如SEQ ID NO:1所示的脂质运载蛋白突变蛋白。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白的一个亚单位包含本发明B部分公开的脂质运载蛋白突变蛋白。在特别优选的实施方案中，所述亚单位包含如SEQ ID NO:2、45和46中任一个所示的脂质运载蛋白突变蛋白。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含A部分公开的脂质运载蛋白突变蛋白和B部分公开的脂质运载蛋白突变蛋白。
在特别的实施方案中，本发明的融合蛋白包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在特别的实施方案中，本发明的融合蛋白包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在又一优选的实施方案中，本发明的融合蛋白包含如SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸。
另一方面，本发明公开了包含至少两个亚单位的融合蛋白，其中一个亚单位具有IL-17A或IL-23p19结合特异性，和另一个亚单位包含白蛋白结合结构域(ABD)或白蛋白结合肽。在一些实施方案中，所述具有IL-17A或IL-23p19结合特异性的亚单位包含本发明的IL-17A或IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。此外，所述融合蛋白可以任何顺序包含(i)一个IL-17A特异性亚单位，(ii)一个IL-23p19特异性亚单位和(iii)一个包含细菌白蛋白结合结构域的亚单位。在一些实施方案中，所述具有IL-17A结合特异性的亚单位包含本发明的IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些其它实施方案中，所述具有IL-23p19结合特异性的亚单位包含本发明的IL-23p19特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。
在一些实施方案中，所述白蛋白结合结构域(ABD)可以是链球菌蛋白G(
Figure BDA0001216391380000411
T.,&Skerra,A.(1998)J.Immunol.Methods218,73-83)或其片段，例如如SEQ ID NO:14所示。在一些其它实施方案中，例如以全文引用并入本文的PCT申请WO 2012/004384所述，所述白蛋白结合肽是源自链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域的人血清白蛋白结合肽。在一些进一步优选的实施方案中，所述白蛋白结合肽包含如SEQ DI NO:15所示的氨基酸序列。
特别地，本发明提供一种能够同时结合人血清白蛋白(HSA)和IL-23p19的融合蛋白，所述融合蛋白包含例如，如SEQ DI NO:7所示的氨基酸序列。
本发明提供一种能够同时结合HSA和IL-17A二者的融合蛋白，所述融合蛋白包含例如，如SEQ DI NO:8或SEQ DI NO:10所示的氨基酸序列。在一些进一步优选的实施方案中，这种融合蛋白可包含两个IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白，所述IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白包含例如，如SEQ DI NO:10所示的氨基酸序列。
此外，本申请的特征在于一种融合蛋白，例如，当在基本上如实施例12所述的分析中测量该融合蛋白时，其能够同时结合所有HAS、IL-17A和IL-23p19。在一些进一步的实施方案中，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在一些又进一步优选的实施方案中，这种融合蛋白可包含两个IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白，所述IL-17A特异性的脂质运载蛋白突变蛋白包含例如，如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
又一方面，本发明涉及包含至少两个任何顺序的亚单位的融合蛋白：一个亚单位具有IL-17A结合特异性或具有IL-23p19结合特异性，和另一个亚单位具有TNF结合特异性，例如，包含TNF-抑制蛋白。肿瘤坏死因子(或TNF家族)是指一群能够引起细胞死亡(凋亡)的细胞因子(如TNF-α和淋巴毒素-α)。示例性TNF抑制剂包括阿达木单抗(adalimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、依那西普(etanercept)、塞妥珠单抗(certolizumabpegol)和戈利木单抗(golimumab)。在一些进一步的实施方案中，TNF-特异性亚单位包含抗-TNF-α抗体，例如如SEQ ID NO:61和62所示的抗体。在另一些实施方案中，所述具有IL-17A结合特异性或具有IL-23p19结合特异性的亚单位包含本发明的脂质运载蛋白突变蛋白，例如SEQ IDNO:1的脂质运载蛋白或SEQ ID NO:2的脂质运载蛋白。在一些又进一步的实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:63和62的氨基酸序列或SEQ ID NO:64和62的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白能够结合17A，且在一些优选的实施方案中，例如当在基本上如实施例16所述的分析中测量所述融合蛋白和所述脂质运载蛋白突变蛋白时，该融合蛋白可具有的平均EC50值至少与包含在该融合蛋白中的脂质运载蛋白突变蛋白的平均EC50值一样好或更优。在一些实施方案中，所述融合蛋白能够结合IL-23，且在一些优选的实施方案中，例如当在基本上如实施例17所述的分析中测量所述融合蛋白和所述脂质运载蛋白突变蛋白时，该融合蛋白可具有的平均EC50值至少与包含在该融合蛋白中的脂质运载蛋白突变蛋白的平均EC50值一样好或更优。在一些实施方案中，所述融合蛋白能够结合TNF-α，且在一些优选的实施方案中，当在基本上如实施例18所述的分析中测量所述抗体和所述融合蛋白时，该融合蛋白可具有的平均EC50值至少与包含在该融合蛋白中的抗体的平均EC50值一样好或更优。在一些进一步的实施方案中，例如当在基本上如实施例19所述的分析中测量融合蛋白时，所述融合蛋白可以能够同时结合所有TNF-α、IL-17A和IL-23p19。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白具有通过约1nM或更低的KD量度的IL-17A(包括IL-17A/A和IL-17A/F)结合亲和力。更优选地，所述融合蛋白可具有通过0.1nM或更低的KD量度的亲和力。在一些进一步的实施方案中，本发明的融合蛋白的一个或多个IL-17A结合部分可具有与这种部分作为独立多肽时一样好的IL-17A(包括IL-17A/A和IL-17A/F)结合亲和力或抑制能力(参见表1)。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白具有通过约10nM或更低的KD量度的IL-23p19结合亲和力。更优选地，所述融合蛋白可具有通过约1nM或更低的KD量度的亲和力。在一些进一步的实施方案中，本发明的融合蛋白的一个或多个IL-23p19结合部分可具有与这种部分作为独立多肽时一样好的IL-23p19结合亲和力或抑制能力(参见下表1)。
表1：提供在竞争ELISA、表面等离子体共振(SPR)和基于功能细胞的分析中，单个脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相比于它们的融合蛋白SEQ ID NO:3-13的活性概述。根据各自的构建体是否含有IL-17A结合脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:1、IL-23结合脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:2、或者两者兼具，测定与IL-17和/或IL-23相互作用的值。为了分别测定对IL-17和IL-23的活性，按照实施例3和/或实施例8所述实施竞争ELISA实验，按照实施例2和/或实施例6所述以反向形式实施SPR实验(即采用固定在传感器芯片上的蛋白质构建体)，并且细胞分析基于IL-17A诱导的G-CSF分泌(实施例5)和/或IL-23诱导的Ba/F3细胞增殖(实施例10)。应注意，为测定IL-23亲和力而实施的反向形式的SPR实验是在非生理高浓度NaCl存在下进行的，并且因此得到的值不能反映在生理条件下对IL-23的亲和力，但是该实验用于测定，将SEQ ID NO:3-13的包含SEQ ID NO:2的融合蛋白与单个突变蛋白SEQ ID NO:2相比，对IL-23的相对亲和力是否不同。表1证明在全部分析形式中，含有SEQ ID NO:1的全部融合蛋白的IL-17A结合活性至少与SEQ ID NO:1本身的活性一样好。因此，SEQ ID NO:1可灵活地用于任何融合蛋白而没有活性损失。在全部分析形式中，含有SEQ ID NO:2的全部融合蛋白的IL-23结合活性与SEQ ID NO:2本身的活性非常接近。因此，SEQ ID NO:2可灵活地用于任何融合蛋白而没有显著的活性损失。
Figure BDA0001216391380000441
在相关的实施方案中，本发明的一种或多种融合蛋白能够抑制IL-17A与其受体的结合。
在相关的实施方案中，本发明的融合蛋白能够抑制IL-23与其受体的结合。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白还可包含连接子(如肽键)，该连接子将本发明的脂质运载蛋白突变蛋白和本发明的另一脂质运载蛋白突变蛋白彼此共价连接。这可以通过，例如将连接的脂质运载蛋白突变蛋白表达为由肽连接子相连的单个多肽来实现。合适的肽连接子可以由含有任何氨基酸(例如如本文所述)的任意长度的氨基酸延伸段组成。优选的连接子设计利用了按照式(GxSy)n的甘氨酸和丝氨酸的氨基酸重复延伸段，其中在重复n次的构建块(building block)中，x是甘氨酸重复次数和y是丝氨酸重复次数。每一个变量x、y和n的值均可在0至100的范围内，优选地为0至10。此处提供非限制性实例SEQ IDNO:18-20。
在一些其它实施方案中，可将共价连接的化学方法应用于将本发明的脂质运载蛋白突变蛋白和本发明的另一脂质运载蛋白突变蛋白连接。一个实例是双功能连接子的使用，其允许连接子和氨基酸侧链之间，例如，脂质运载蛋白突变蛋白中的马来酰亚胺与游离半胱氨酸之间或脂质运载蛋白突变蛋白中活化的羧酸酯和伯胺之间的反应化学。这包括与可包含在蛋白质表达期间的非-天然氨基酸侧链的反应，并且其提供可选择地衍生的功能性。在一些又进一步的实施方案中，“点击”化学，例如叠氮化物和炔烃的环化加成，可用于连接本发明融合蛋白的一个或多个亚单位。
在一些进一步优选的实施方案中，本发明的融合蛋白进一步包含如SEQ ID NO:18-20中任一个所示的氨基酸序列。
在一些进一步的实施方案中，在本文公开的融合蛋白中，包含本发明脂质运载蛋白突变蛋白的一个亚单位可以直接地或通过化学连接子与包含本发明脂质运载蛋白突变蛋白的另一个亚单位连接。
在一些又进一步的实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可与另一脂质运载蛋白突变蛋白的N-或C-末端或者N-和C-末端二者融合。
在一些实施方案中，包含在本发明融合蛋白中的每一亚单位均保持热稳定(如可以耐受至少40℃Tm的熔融(melting)温度)。在一些实施方案中，关于一个或多个其它亚单位，包含在本发明融合蛋白中的所述三个亚单位的每一个均具有高协同性解折叠(unfolding)(如消除部分解折叠，从而显着降低它们的降解速率)。部分解折叠的消除称为“协同”，因为解折叠是一个全或无的过程。在一些进一步的实施方案中，包含在融合蛋白中的一个或多个脂质运载蛋白突变蛋白可以耐受至少50℃、至少55℃、至少60℃或甚至更高Tm的熔融(melting)温度。在一些又进一步的实施方案中，包含在融合蛋白中的一个或多个HSA组分可以耐受至少30℃、至少35℃、至少40℃或甚至更高Tm的熔融(melting)温度。
在一些实施方案中，本发明的一个或多个融合蛋白包含多聚体：如本发明脂质运载蛋白突变蛋白的四聚体、三聚体或二聚体，其中至少一个脂质运载蛋白突变蛋白与另一脂质运载蛋白突变蛋白的至少一侧(如N-末端)融合。在一些进一步的实施方案中，多聚体融合蛋白可优选地对应于单体融合蛋白。例如，由于靶标的二聚体性质所带来的亲合力效应，本发明的结合IL-17A的二聚体融合蛋白可对IL-17A显示更强的结合。
在一些进一步的实施方案中，本发明的一个或多个融合蛋白导致形成了如Schlehuber,S.,和Skerra,A.(2001),Duocalins,engineered ligand-binding proteinswith dual specificity derived from the lipocalin fold.Biol.Chem.382,1335-1342中描述的“Duocalins”，其公开内容通过引用全文并入本文。
再又一方面，本发明涵盖本发明的一种或多种融合蛋白或者一种或多种包含这种蛋白的组合物在用于结合受试者中IL-17A和/或IL-23p19和/或抑制受试者中IL-17A和/或IL-23与它们相应受体结合中的用途。
再又一方面，本发明的特征在于一种结合受试者中IL-17A和/或IL-23p19的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的一种或多种本发明的融合蛋白或者一种或多种包含这种蛋白的组合物。
再又一方面，本发明涉及一种用于抑制受试者中IL-17A和/或IL-23与它们相应受体结合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的一种或多种本发明的融合蛋白或者一种或多种包含这种蛋白的组合物。
本发明的融合蛋白还可包含信号序列。多肽N-末端的信号序列引导该多肽进入特定细胞区室，例如大肠杆菌的周质或真核细胞的内质网。本领域已知大量信号序列。将多肽分泌到大肠杆菌周质中的示例性信号序列是OmpA-信号序列。
本发明还涉及本发明的一种或多种融合蛋白用于与IL-17A和/或IL-23p19形成复合物中的用途。
因此，本发明的另一方面，本发明的一种或多种融合蛋白可用于检测IL-17A和/或IL-23p19。这种用途可包括以下步骤：使一种或多种本发明的融合蛋白与怀疑含有IL-17A和/或IL-23p19的样品在合适条件下接触，由此允许分别在所述蛋白与IL-17A之间和/或所述蛋白与IL-23p19之间形成复合物，并通过合适信号检测所述复合物。
可检测信号可以通过如上文所述的标记产生，或通过由于结合(即复合物形成)本身而导致的物理特性的变化而产生。一个实例是等离子体表面共振，其数值在结合配偶体结合期间发生改变，所述配偶体中的一者固定在表面上，例如金箔上。
本文公开的一种或多种融合蛋白还可用于从含有其它物质的样品中分离IL-17A和/或IL-23p19。这种用途可包括以下步骤：使一种或多种所述融合蛋白与猜测含有IL-17A和/或IL-23p19的样品在合适条件下接触，由此允许分别在所述蛋白与IL-17A之间和/或所述蛋白与IL-23p19之间形成复合物，并从所述样品中分离所述复合物。
在所公开的融合蛋白用于检测IL-17A和/或IL-23p19以及分离IL-17A和/或IL-23p19中的用途中，可以将所述融合蛋白、IL-17A、IL-23p19和/或其结构域或片段固定在合适的固相上。
因此，可检测分子(例如IL-17A和/或IL-23p19)如在样品中的存在或缺失，以及其浓度或水平。
另一方面，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包含至少一种本发明的融合蛋白和使用该试剂盒的一个或多个说明。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括与其一体的或作为一个或多个单独文件的关于内容或该试剂盒和所述融合蛋白的使用的信息。在一些实施方案中，该试剂盒可包括一种或多种本发明的融合蛋白，其配制为用于在稀释剂重构。这样的稀释剂，例如无菌稀释剂，也可包括在该试剂盒中，例如在容器内。
在一些实施方案中，本发明的一种或多种融合蛋白可用于治疗需要抑制免疫响应的若干病症，例如类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、斑块状银屑病和幼年特发性关节炎。
E.本发明的脂质运载蛋白突变蛋白和融合蛋白
脂质运载蛋白是天然进化从而结合配体的蛋白质性结合分子。脂质运载蛋白存在于许多生物体中，包括脊椎动物、昆虫、植物和细菌。脂质运载蛋白家族的成员(Pervaiz,S.,&Brew,K.(1987)FASEB J.1,209-214)通常是小的分泌的蛋白并具有单个多肽链。它们的特征在于一系列不同的分子识别特性：它们结合多种分子(主要是疏水性分子，例如类视黄醇、脂肪酸、胆固醇、前列腺素、胆绿素、信息素、甜味剂(tastant)和着嗅剂(odorant))的能力；它们与特异细胞表面受体结合并形成大分子复合物。尽管过去将它们主要分类为转运蛋白，但现在明确了脂质运载蛋白完成多种生理功能。这些功能包括在视黄醇转运、嗅觉、信息素信号传导和前列腺素合成中的作用。脂质运载蛋白还涉及免疫响应的调节和细胞内环境稳态的介导(例如，Flower,D.R.(1996)Biochem.J.318,1-14和Flower,D.R.等(2000)Biochim.Biophys.Acta 1482,9-24综述)。
脂质运载蛋白之间的全序列保守性非常低，通常具有低于20％的序列同一性。形成强烈对比的是，其整体折叠模式高度保守。脂质运载蛋白结构的中心部分由单个八股反平行β折叠组成，所述β折叠自身闭合形成连续的氢键β桶。该β桶形成中央腔体。桶的一个末端被穿过其底部的N端肽段以及连接β折叠股的三个肽环立体封闭。β桶的另一个末端对溶剂开放并包含由四个柔性肽环形成的靶标结合位点。正是所述环在本应刚性的脂质运载蛋白骨架中的这种多样性产生多种不同的结合模式，每一种模式能够容纳不同大小、形状和化学特征的靶标(例如上文的Flower,D.R.(1996)；上文的Flower,D.R.等(2000)，或Skerra,A.(2000)Biochim.Biophys.Acta 1482,337-350中的综述)。
本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可以是任何可选脂质运载蛋白的突变蛋白。可使用突变蛋白的合适脂质运载蛋白(有时也命名为“蛋白质‘参考’骨架”或简称为“骨架”)的实例包括、但不限于泪液脂质运载蛋白(脂质运载蛋白-1，von Ebner腺蛋白)、视黄醇结合蛋白、嗜中性粒细胞、脂质运载蛋白型前列腺素D-合酶、β-乳球蛋白、后胆色素结合蛋白(BBP)、载脂蛋白D(APO D)、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、泪液脂质运载蛋白(Tlc)、α2-微球蛋白-相关蛋白(A2m)、24p3/uterocalin(24p3)、von Ebners腺蛋白1(VEGP 1)、von Ebners腺蛋白2(VEGP 2)和主要变应原Can f1前体(ALL-1)。在相关的实施方案中，该脂质运载蛋白突变蛋白选自人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、人泪液脂质运载蛋白(Tlc)、人载脂蛋白D(APO D)和大菜粉蝶(Pieris brassicae)后胆色素结合蛋白。
当在本文的结合IL-17A或IL-23p19的本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的上下文中使用时，术语“特异的(specific for)”包括该脂质运载蛋白突变蛋白分别指向、结合至IL-17A或IL-23p19或者与IL-17A或IL-23p19发生反应。因此，指向、结合至或与其反应包括所述脂质运载蛋白突变蛋白分别特异性结合至IL-17A或IL-23p19。如本文所述，在上下文中术语“特异性地”是指脂质运载蛋白突变蛋白与IL-17A蛋白或IL-23p19蛋白反应，但至少基本上不与另一种蛋白反应。术语“另一种蛋白”分别包括任何非-IL-17A蛋白或非-IL-23p19蛋白，包括与IL-17A或IL-23p19密切相关或同源的蛋白，本文公开的脂质运载蛋白指向这些蛋白。然而，来自除人以外的物种的IL-17A或IL-23p19蛋白、片段和/或变体(如在定义“受试者”的上下文中描述的那些)未被术语“另一种蛋白”排除。术语“基本上不结合”指本发明的脂质运载蛋白突变蛋白不结合另一种蛋白，即显示出小于约30％、优选地20％、更优选地10％、特别优选地小于9％、8％、7％、6％或5％的交叉反应。如上定义的所述脂质运载蛋白是否特异性反应可以很容易地进行测试，特别是通过比较本发明的脂质运载蛋白突变蛋白与IL-17A或IL-23p19的反应和所述脂质运载蛋白与其它(另一种)蛋白的反应。“特异性结合”，也可以例如，根据蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA测试、FACS、IHC和肽扫描来测定。
当和与另一种脂质运载蛋白序列同一性进行比较时，本发明脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与相应脂质运载蛋白具有高序列同一性(也见上文)。在这一普遍的背景下，本发明组合的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与相应脂质运载蛋白的氨基酸序列(野生型或参考脂质运载蛋白)至少基本上相似。与相应脂质运载蛋白的序列至少基本上相似的本发明组合的脂质运载蛋白突变蛋白的相应序列，在一定程度上与野生型(或参考)脂质运载蛋白类似，具有一个或多个氨基酸实施方案，与相应脂质运载蛋白的序列具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少90％的同一性，包括至少95％的同一性。在这一方面，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白当然可包含本文所述的比较置换，其使该脂质运载蛋白突变蛋白能够分别结合IL-17A或IL-23p19。脂质运载蛋白的典型突变蛋白相对于天然序列脂质运载蛋白在脂质运载蛋白配体结合位点开放端的四个环中包含一个或多个氨基酸突变(参见上文)。如上文所述，这些区域在决定脂质运载蛋白突变蛋白对所需靶标的结合特异性中至关重要。作为示例性实例，源自泪液脂质运载蛋白、NGAL脂质运载蛋白或其同源物的多肽的突变蛋白在N-末端区域和/或β-桶结构端排列的三个肽环BC、DE、和FG的任何序列位置处可具有一个、两个、三个、四个或更多个突变的氨基酸残基，所述β-桶结构位于天然脂质运载蛋白结合袋的对面。作为另一示例性实例，与野生型泪液脂质运载蛋白的序列相比，源自泪液脂质运载蛋白或其同源物的多肽的突变蛋白可在β-桶结构端排列的肽环DE中具有突变的氨基酸残基。
与相应的天然脂质运载蛋白相比，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白包含一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或甚至20个)置换，条件是这种脂质运载蛋白突变蛋白应该能够分别结合IL-17A或IL-23p19。例如，脂质运载蛋白突变蛋白可在对应于具有例如泪液脂质运载蛋白、NGAL脂质运载蛋白或本文公开的任何其它脂质运载蛋白的野生型序列的野生型脂质运载蛋白的不同位置(即在对应位置)的位置处具有置换。在一些实施方案中，本发明的组合的脂质运载蛋白突变蛋白包含至少两个氨基酸置换，包括用精氨酸残基置换天然氨基酸的2、3、4或5，有时甚至更多个的至少两个氨基酸置换。因此，以产生能够分别结合IL-17A或IL-23p19为目标，本文所述的蛋白质‘参考’骨架的核酸经受诱变。
并且，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可在其N-或C-末端，优选地C-末端包含异源氨基酸序列(例如Strep-标签，如Strep II标签)而不影响该脂质运载蛋白突变蛋白的生物活性(结合其靶标，如IL-17A或IL-23p19)。标签的一个优选的实例如SEQ ID NO:17所示。
同样，与相应的野生型脂质运载蛋白相比，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可在其N-末端缺失1、2、3、4或更多个氨基酸和/或在其C-末端缺失1、2或更多个氨基酸；例如SEQID NO:2-7和12-14。
具体而言，为了确定与野生型脂质运载蛋白不同的脂质运载蛋白突变蛋白氨基酸序列的氨基酸残基是否对应于野生型脂质运载蛋白氨基酸序列中的某一位置，技术人员可利用本领域熟知的手段和方法，如手动地或通过使用计算机程序例如BLAST2.0(其代表基本局部比对搜索工具)或ClustalW或任何适用于产生序列比对的其它合适程序进行比对。因此，野生型脂质运载蛋白可作为“受试序列”或“参考序列”，而本文所述的与野生型脂质运载蛋白不同的脂质运载蛋白的氨基酸序列作为“查询序列”。本文中术语“参考序列”和“野生型序列”可互换使用。
在一些实施方案中，置换(或替代)是保守置换。然而，可以设想任何置换(包括非-保守置换或者源自下文列出的示例性置换的一个或多个)，只要所述脂质运载蛋白突变蛋白保留了其分别结合IL-17A或IL-23p19的能力，和/或所述脂质运载蛋白突变蛋白与然后被置换的序列具有同一性，即所述脂质运载蛋白突变蛋白与“原始”序列具有至少60％，比如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或更高的同一性。
保守置换通常为以下置换，根据待突变的氨基酸列举，每一个待突变的氨基酸后面为一个或多个可作为保守性的替代：Ala→Gly、Ser、Val；Arg→Lys；Asn→Gln、His；Asp→Glu；Cys→Ser；Gln→Asn；Glu→Asp；Gly→Ala；His→Arg、Asn、Gln；Ile→Leu、Val；Leu→Ile、Val；Lys→Arg、Gln、Glu；Met→Leu、Tyr、Ile；Phe→Met、Leu、Tyr；Ser→Thr；Thr→Ser；Trp→Tyr；Tyr→Trp、Phe；Val→Ile、Leu。其它置换也是可能的并可根据其它已知的保守或非-保守置换凭经验确定。作为另一取向(orientation)，以下八组的每一组包含氨基酸，该氨基酸通常可用于定义另一氨基酸的保守置换：
a.丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)；
b.天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；
c.天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)；
d.精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)；
e.异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)；
f.苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)；
g.丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)；和
h.半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)。
如果这种置换导致了生物活性的改变，则可引入更多实质性改变(如以下或如下文关于氨基酸分类进一步描述)并就所需特征筛选产品。这种更实质性改变的实例是：Ala→Leu、Ile；Arg→Gln；Asn→Asp、Lys、Arg、His；Asp→Asn；Cys→Ala；Gln→Glu；Glu→Gln；His→Lys；Ile→Met、Ala、Phe；Leu→Ala、Met、正亮氨酸；Lys→Asn；Met→Phe；Phe→Val、Ile、Ala；Trp→Phe；Tyr→Thr、Ser；Val→Met、Phe、Ala。
脂质运载蛋白的生物性质中的实质性修饰通过选择它们在维持以下的效果上显著不同的置换完成：(a)置换区域中多肽骨架的结构，例如片(sheet)或螺旋构象；(b)靶点处分子的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积(bulk)。基于一般侧链性质，将天然存在的残基分为以下组：(1)疏水性：正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；(2)中性亲水性：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；(3)酸性：天冬氨酸、谷氨酸(4)碱性：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；(5)影响链取向的残基：甘氨酸、脯氨酸；和(6)芳香族：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非-保守置换需要将这些类别中一类的成员置换成另一类。通常还可用丝氨酸置换不参与维持相应脂质运载蛋白正确构象的任何半胱氨酸残基，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可将半胱氨酸键添加至脂质运载蛋白以提高其稳定性。
采用已经建立的标准方法，可在核酸(如DNA水平)上非常简单地完成任何突变(包括以上所讨论的插入)。氨基酸序列改变的示例性实例是插入或缺失以及氨基酸置换。这种置换可以是保守的，即氨基酸残基被替代为化学性质(特别是关于极性以及尺寸)相似的氨基酸残基。保守置换的实例为以下组的成员之间的替代：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，也可以将非-保守性改变引入氨基酸序列。此外，代替替换单一氨基酸残基，还可以使泪液脂质运载蛋白的一级结构插入或缺失一个或多个连续氨基酸，只要这些缺失或插入导致稳定的折叠/功能的突变蛋白。
氨基酸序列的修饰包括单个氨基酸位置的直接诱变，以便通过引入某些限制性酶的切割位点来简化突变的脂质运载蛋白基因或其部分的亚克隆。此外，还可引入这些突变以进一步改善针对给定靶标的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白的亲和力。另外，如果需要，可以引入突变以便调节突变蛋白或融合蛋白的某些特征，例如改善折叠稳定性、血清稳定性、蛋白质抗性或水溶性或者降低聚集趋势。例如，可以将天然存在的半胱氨酸残基突变成其他氨基酸以防止二硫桥形成。还可以有意将其它氨基酸序列位置突变成半胱氨酸以便引入新的反应基团，例如用于与其它化合物如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、生物素、肽或蛋白质缀合，或用于形成非天然存在的二硫结合(linkage)。所产生的硫醇部分可以用于PEG化或HES化突变蛋白或融合蛋白，例如，以便增加相应脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白的血清半衰期。
在一些实施方案中，若上述部分中的一个与本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白缀合，则与氨基酸侧链的缀合可能是有益的。合适的氨基酸侧链可以天然存在于人脂质运载蛋白的氨基酸序列中，或者可以通过诱变引入。若通过诱变引入了合适的结合位点，则一种可能性是用半胱氨酸残基替代在适当位置处的氨基酸。
例如，这种突变包括人泪液脂质运载蛋白的野生型序列中Thr 40→Cys、Glu 73→Cys、Arg 90→Cys、Asp 95→Cys或Glu 131→Cys置换中的至少一个。在这些位置任意处新产生的半胱氨酸残基随后可用于将该突变蛋白或融合蛋白与延长该突变蛋白或其融合蛋白血清半衰期的部分(例如PEG或其活化衍生物)缀合。
对于人脂质运载蛋白2的突变蛋白，这种将半胱氨酸残基引入脂质运载蛋白(包括人脂质运载蛋白2突变蛋白)的氨基酸序列中的突变的示例性可能性包含在对应于人NGAL野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的序列位置中至少一个处引入半胱氨酸(Cys)残基。在一些实施方案中，其中本发明的人脂质运载蛋白2突变蛋白具有这样一种序列，与SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P80188的序列相比，在该序列中用另一氨基酸残基替代半胱氨酸，相应的半胱氨酸可重新引入该序列。作为示例性实例，在这种情况下，可以通过还原为在SWISS-PROT登录号P80188的序列中原始存在的半胱氨酸来在氨基酸位置87处引入半胱氨酸残基。在氨基酸位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146和/或158中任意的侧面处产生的硫醇部分可以用于PEG化或HES化突变蛋白，例如，以便增加相应人脂质运载蛋白2突变蛋白或其融合蛋白的血清半衰期。
在另一个实施方案中，为了给将上述部分中的一个缀合至本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白提供合适的氨基酸侧链，可以通过诱变引入人工氨基酸。一般而言，这些人工氨基酸设计为更具反应性，从而促进与所需化合物缀合。这种可通过人工tRNA引入的人工氨基酸的一个实例是对乙酰基-苯丙氨酸。
对于本文公开的突变蛋白或融合蛋白的若干应用，以缀合物形式(例如与为蛋白质或者蛋白质结构域或肽的部分融合)使用它们可能是有利的。在一些实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白或其融合蛋白在该脂质运载蛋白突变蛋白(包括包含在本发明的融合蛋白中的)的N-末端或C-末端融合至蛋白质、蛋白质结构域或肽，例如单个序列和/或亲和标签。
合适的融合配偶体的进一步实例是例如
Figure BDA0001216391380000541
或
Figure BDA0001216391380000542
II(Schmidt,T.G.M.等(1996)J.Mol.Biol.255,753-766)、myc-标签、FLAG-标签、His6-标签或HA-标签的亲和标签或例如谷胱甘肽-S-转移酶的也允许容易检测和/或纯化重组蛋白的蛋白质。最后，具有生色或荧光性质的蛋白质(例如绿色荧光蛋白质(GFP)或黄色荧光蛋白质(YFP))也是本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的合适融合配偶体。
一般而言，可以用包含任何合适的化学物质或酶的化合物标记本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白，所述化学物质或酶直接或间接产生可检测化合物或化学、物理、光学或酶反应信号。物理反应和同时光学反应/标记的实例是照射时的荧光发射或当使用放射活性标记时的X-射线发射。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶是催化显色反应产物形成的酶标记(同时是光学标记)的实例。一般而言，通常用于抗体(除了那些专门与免疫球蛋白的Fc部分中的糖部分一起使用的)的所有标记也可用于与本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白缀合。本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白还可与任何合适的治疗活性剂缀合，例如用于将这种试剂靶向递送至给定细胞、组织或器官或用于选择性靶向如肿瘤细胞的细胞而不影响周围正常细胞。这种治疗活性剂的实例包括放射性核素、毒素、小有机分子和治疗性肽(例如作为细胞表面受体激动剂/拮抗剂的肽或竞争给定细胞靶标上蛋白质结合位点的肽)。然而，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白还可与治疗活性核酸(例如反义核酸分子、小干扰RNA、微RNA或核酶)缀合。可以采用本领域熟知的方法产生这种缀合物。
如上所述，在一些实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白可与延长该突变蛋白或融合蛋白血清半衰期的部分(这方面还参见PCT公开文本WO 2006/56464，其中参考具有CTLA-4结合亲和力的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的突变蛋白描述了这种缀合策略)缀合。所述延长血清半衰期的部分可以是聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、例如棕榈酸(Vajo&Duckworth 2000,Pharmacol.Rev.52,1-9)的脂肪酸、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合结构域、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白、转铁蛋白，仅举几个例子。白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白、抗体、包括结构域抗体(例如，参见美国专利6,696,245)的抗体片段或具有白蛋白结合活性的脂质运载蛋白突变蛋白。因此，用于延长本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白的半衰期的合适缀合配偶体包括细菌白蛋白结合结构域，例如链球菌蛋白G(
Figure BDA0001216391380000551
T.,&Skerra,A.(1998)J.Immunol.Methods 218,73-83)的一种或如SEQ ID NO:39所示的一种。此外，可用作缀合配偶体的白蛋白结合肽的实例是，例如具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列的那些，其中如美国专利申请2003/0069395或Dennis等(Dennis,M.S.,Zhang,M.,Meng,Y.G.,Kadkhodayan,M.,Kirchhofer,D.,Combs,D.&Damico,L.A.(2002)J Biol Chem277,35035-35043)所述，Xaa1是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa2是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys；Xaa3是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；和Xaa4是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr。
在其它实施方案中，白蛋白本身(Osborn,B.L.等，2002,J.Pharmacol.Exp.Ther.303,540-548)或白蛋白的生物活性片段可用作本发明脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白的缀合配偶体。术语“白蛋白”包括所有的哺乳动物白蛋白，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白。
若白蛋白结合蛋白是抗体片段，则其可以是结构域抗体。将结构域抗体(dAb)工程化以允许精确控制生物物理性质和体内半衰期，从而产生最佳安全性和有效性产品概况。结构域抗体例如可从Domantis Ltd.(Cambridge,UK and MA,USA)商购获得。
当将转铁蛋白用作延长本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白血清半衰期的部分时，可将该突变蛋白或融合蛋白遗传地融合到非-糖基化转铁蛋白的N或C末端或者两者。非-糖基化转铁蛋白具有14-17天的半衰期，且转铁蛋白-缀合的突变蛋白或融合蛋白将类似地具有延长的半衰期。所述转铁蛋白载体还提供高生物利用度、生物分布和循环稳定性。这一技术可从BioRexis(BioRexis Pharmaceutical Corporation,PA,USA)商购获得。用于用作蛋白质稳定剂/半衰期延长配偶体的重组人转铁蛋白(DeltaFerrinTM)也可从Novozymes Delta Ltd.(Nottingham,UK)商购获得。
若将免疫球蛋白的Fc部分用于延长本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白的血清半衰期的目的，则可采用可从Syntonix Pharmaceuticals,Inc(MA,USA)商购获得的SynFusionTM技术。这种Fc-融合技术的应用允许产生更长效的生物药物，并可以例如由两个拷贝的连接至抗体Fc区的突变蛋白组成以改善药物动力学、溶解度和生产效率。
另一个延长本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白半衰期的选择是将长的、非结构化的、柔性富含甘氨酸的序列(例如具有约20至80个连续甘氨酸残基的聚甘氨酸)融合至突变蛋白(包括包含在本发明的融合蛋白中的)的N-或C-末端。WO2007/038619中公开的这种方法，例如也称为“rPEG”(重组PEG)。
若将聚亚烷基二醇用作缀合配偶体，则该聚亚烷基二醇可以是置换的、未置换的、线性的或支链的。其也可以是活化的聚亚烷基衍生物。合适的化合物的实例是如WO 99/64016、美国专利6,177,074或美国专利6,403,564中关于干扰素所述的聚乙二醇(PEG)分子，或如对于其它蛋白质所述的聚乙二醇(PEG)分子，例如PEG修饰的天冬酰胺酶、PEG-腺苷脱氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶(参见，例如，Fuertges等(1990)The ClinicalEfficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins J.Control.Release11,139-148)。这种聚合物(例如聚乙二醇)的分子量可以从大约300到大约70.000道尔顿，包括，例如，具有约10.000、约20.000、约30.000或约40.000道尔顿的分子量的聚乙二醇。此外，如例如美国专利6,500,930或6,620,413所述，为了延长血清半衰期的目的，可将例如淀粉或羟乙基淀粉(HES)的碳水化合物低聚-和聚合物与本发明的突变蛋白或融合蛋白缀合。
此外，本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白可与可赋予本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白新特征(例如酶活性或对其它分子的结合亲和力)的部分缀合。合适部分的实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶、蛋白G的白蛋白结合结构域、蛋白A、抗体片段、低聚结构域或毒素。
此外，可以将本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白与单独的酶活性位点融合，使得所得融合蛋白的两个“组分”一起作用于给定治疗靶标。例如，可将脂质运载蛋白突变蛋白(包括包含在本发明融合蛋白中的)的结合结构域附着于致病靶标，从而允许酶结构域消除该靶标的生物功能。
在一些实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白可通过连接子(如肽键)与部分缀合，该连接子将本发明的脂质运载蛋白突变蛋白和所公开的另一部分彼此共价连接。这可以通过，例如将连接的脂质运载蛋白突变蛋白表达为由肽连接子相连的单个多肽来实现。合适的肽连接子可以由含有任何氨基酸的任意长度的氨基酸延伸段组成。优选的连接子设计利用了按照式(GxSy)n的甘氨酸和丝氨酸的氨基酸重复延伸段，其中在重复n次的构建块中，x是甘氨酸重复次数和y是丝氨酸重复次数。每一个变量x、y和n的值均可在0至100的范围内，优选地为0至10。此处提供非限制性实例SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:36-38。
在一些其它实施方案中，可将共价连接的化学方法应用于将本发明的脂质运载蛋白突变蛋白和所公开的另一部分连接。一个实例是双功能连接子的使用，其允许连接子和氨基酸侧链之间，例如脂质运载蛋白突变蛋白中的马来酰亚胺与游离半胱氨酸之间或脂质运载蛋白突变蛋白中活化的羧酸酯和伯胺之间的反应化学。这包括与可包含在蛋白质表达期间的非-天然氨基酸侧链的反应，并且其提供可选择地衍生的功能性。在一些又进一步的实施方案中，“点击”化学，例如叠氮化物和炔烃的环化加成，可用于连接本发明融合蛋白的一个或多个亚单位。
本发明还涉及核酸分子(DNA和RNA)，该核酸分子包含编码本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白的核苷酸序列。由于遗传密码子的简并性允许其它指定相同氨基酸的其它密码子置换某些密码子，因此本发明不局限于编码本文所述脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白的特定核酸分子，而是涵盖包含编码功能性突变蛋白或功能性融合蛋白的核苷酸序列的全部核酸分子。在这一方面，本发明提供核苷酸序列，该核苷酸序列编码一般如SEQID NO:23-35、45-49和54所示的一些示例性脂质运载蛋白突变蛋白、一些示例性融合蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述方法包括使核酸分子在核苷酸三联体处经受诱变，该核苷酸三联体编码对应于人NGAL(SEQ ID NO:8)线性多肽序列的序列位置的28、36、40-41、49、52、68、70、72-73、75、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134的序列位置中至少一个，有时甚至更多个。
在本发明的方法的另一实施方案中，首先使编码人泪液脂质运载蛋白的核酸分子经受在人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)线性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、55-58、60-61、64、104-108中一个或多个处的诱变。第二，使该编码人泪液脂质运载蛋白的核酸分子还经受在成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列的氨基酸序列位置101、111、114和153中一个或多个处的诱变。
本发明还包含编码本发明脂质运载蛋白突变蛋白和融合蛋白的核酸分子，其包含在实验诱变指定序列位置之外的其它突变。这种突变通常是耐受的或甚至可证明是有益的，例如若这些突变有利于所述突变蛋白和融合蛋白的改善的折叠效率、血清稳定性、热稳定性或配体结合亲和力。
本申请公开的核酸分子可以“可操作地连接”至一个或多个调节序列以允许该核酸分子的表达。
核酸分子，如DNA，如果它包括包含关于转录和/或翻译调节的信息的序列元件，并且这样的序列“可操作地连接”至编码多肽的核苷酸序列的话，其被称为“能够表达核酸分子”或能够“允许核苷酸序列的表达”。可操作的连接是这样的连接：在所述连接中，调节序列元件和待表达的序列以使基因能够表达的方式相连接。基因表达需要的调控区域的确切性质可能在种类间变化，但一般来说这些区域包括启动子，在原核生物中，所述启动子既包含启动子本身(即指导转录启动的DNA元件)，又包括当转录成RNA时发出翻译启动信号的DNA元件。这种启动子区域通常包括参与转录和翻译启动的5'非编码序列，如-35/-10盒以及原核生物中的Shine-Dalgarno元件或者真核生物中的TATA盒、CAAT序列和5'-加帽元件。这些区域还可以包括增强子或阻遏元件以及翻译信号和用于将天然多肽靶向宿主细胞特定隔室的前导序列。
此外，3'非编码序列可以包含参与转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定的宿主细胞内没有令人满意的功能，那么它们可能被该细胞中有功能的信号置换。
因此，本发明的核酸分子可以包括调节序列，如启动子序列。在一些实施方案中，本发明的核酸分子包括启动子序列和转录终止序列。合适的原核启动子是，例如，tet启动子，lacUV5启动子或T7启动子。可用于在真核细胞中表达的启动子的实例有SV40启动子或CMV启动子。
本发明的核酸分子也可以是载体的一部分或任何其它类型的克隆载体，如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人工染色体。
在一个实施方案中，核酸分子包含在质粒中。质粒载体指编码融合至目的cDNA的温和噬菌体(如M13或f1)基因间区域或其功能部分的载体。用这样的噬菌粒载体和合适的辅助噬菌体(如M13K07、VCS-M13或R408)超感染细菌宿主细胞后，产生完整的噬菌体颗粒，由此使得可以将编码的异源cDNA物理偶联至在噬菌体表面上展示的其相应多肽(参见例如Lowman,H.B.(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26,401–424，或Rodi,D.J.和Makowski,L.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10,87–93)。
除了上文描述的调节序列和编码本文所述脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白的核酸序列以外，这种克隆载体可以包括源自与用于表达的宿主细胞相容的物种的复制和控制序列，以及赋予转化或转染细胞可选择表型的选择标记物。大量合适的克隆载体是本领域已知的，并可商购获得。
编码本文所述脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白的DNA分子，特别是含有这种突变蛋白的编码序列的克隆载体，可以转化至能够表达该基因的宿主细胞中。可以使用标准技术进行转化。因此，本发明还涉及含有本文公开的核酸分子的宿主细胞。
在适于表达编码本发明脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白的核苷酸序列的条件下培养转化的宿主细胞。合适的宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，或者是真核细胞，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、SF9或High5昆虫细胞、永生化哺乳动物细胞系(例如HeLa细胞或CHO细胞)或原代哺乳动物细胞。
本发明还涉及用于产生本文所述的多肽的方法，其中通过遗传工程方法，从编码该脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白的核酸开始产生该脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白。该方法可以在体内进行，脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白可以例如在细菌或真核宿主生物体中产生，然后从该宿主生物体或其培养物中分离。还可以在体外产生蛋白质，例如使用体外翻译系统。
在体内产生脂质运载蛋白突变蛋白、融合蛋白或片段时，通过重组DNA技术(上文已概述)将编码该突变蛋白的核酸引入合适的细菌或真核宿主生物体中。为此，首先使用已建立的标准方法用克隆载体转化该宿主细胞，所述克隆载体包含编码本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白的核酸分子。然后在允许表达该异源DNA并因而允许合成相应多肽的条件下培养该宿主细胞。之后，从细胞或培养基中回收该多肽。
在一些实施方案中，本申请公开的核酸分子，如DNA，可以“可操作地连接”至本发明的另一核酸分子以允许本发明融合蛋白的表达。在这一方面，可操作的连接是这样的连接：在所述连接中，第一核酸分子的序列元件和第二核酸分子的序列元件以使融合蛋白能够表达为单一多肽的方式相连接。
此外，在一些实施方案中，可在本发明的NGAL突变蛋白(包括包含在本发明的融合蛋白中的)中移除Cys76和Cys175之间天然存在的二硫键。在本发明的Tlc突变蛋白(包括包含在本发明的融合蛋白中的)的一些实施方案中，可以移除Cys61和Cys153之间天然存在的二硫键。因此，这种突变蛋白或融合蛋白可以在具有还原性氧化还原环境的细胞隔室中产生，例如，在革兰氏阴性细菌的细胞质中。
在本发明脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白包括分子内二硫键的情况下，可以优选的是，使用适合的信号序列将新生多肽引导至具有氧化性氧化还原环境的细胞隔室。这种氧化性环境可以由革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)的外周胞质、在革兰氏阳性细菌的细胞外环境中或在真核细胞的内质网腔中提供，并且这种氧化性环境通常有利于形成结构性二硫键。
然而，还可以在宿主细胞(优选大肠杆菌)的胞液中产生本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白。在这种情况下，该多肽可以以可溶和折叠状态直接获得，也可以以包涵体的形式回收，然后体外复性。其它选择为使用具有氧化性细胞内环境的特定宿主菌株，其可以因而允许在胞液中形成二硫键(Venturi等(2002)J.Mol.Biol.315,1-8.)。
然而，本文所述的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白可以不必定为仅通过利用基因工程生成或产生。而是，还可以通过化学合成或通过体外转录和翻译获得这种脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白，所述化学合成例如Merrifield固相多肽合成。例如可行的是，使用分子建模鉴定有希望的突变，然后体外合成希望的(设计的)多肽，然后研究对于IL-17A的结合活性。用于固相和/或液相合成蛋白的方法是本领域熟知的(参见例如Bruckdorfer等(2004)Curr.Pharm.Biotechnol.5,29-43)。
在另一个实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白可以使用本领域技术人员已知的成熟方法通过体外转录/翻译产生。
本领域技术人员将会理解可用于制备本发明预期的、但其蛋白或核酸序列在本文中没有明确地披露的脂质运载蛋白突变蛋白的方法。作为一个概述，这种氨基酸序列的修饰包括，例如，通过引入某些限制性酶的切割位点对单个氨基酸位置进行定点诱变，以便简化突变的脂质运载蛋白基因或其部分的亚克隆。此外，也可以引入这些突变以进一步提高脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白对给定靶标(如分别是IL-17A或IL-23p19)的亲和力。并且，如果必要，可以引入突变来调节突变蛋白或融合蛋白的某些特征，如提高折叠稳定性、血清稳定性、蛋白抗性或水溶性，或者减少聚集趋势。例如，天然存在的半胱氨酸残基可突变为其它氨基酸以防止形成二硫桥。
本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白以及其衍生物可以类似于抗体或其片段用在许多领域。例如，该脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白以及其相应衍生物可以用于以酶、抗体、放射活性物质或任何其他具有生物化学活性或确定的结合特征的基团进行标记。这样，它们各自的靶标可以被检测或者与它们接触。例如，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白和/或融合蛋白可以用于通过已建立的分析方法(如ELISA或蛋白质印迹)或通过显微术或免疫传感器来检测化学结构。在这个方面，检测信号可以通过使用合适的突变蛋白或合适的融合蛋白直接产生，或者通过经由抗体对结合的突变蛋白进行免疫化学检测而间接产生。
可以根据本发明工程化以提供以可检测的亲和力结合IL-17和/或IL-23的蛋白质突变蛋白的其它蛋白骨架包括：EGF样结构域，Kringle-结构域，纤连蛋白I型结构域，纤连蛋白II型结构域，纤连蛋白III型结构域，PAN结构域，G1a结构域，SRCR结构域，Kunitz/Bovine胰脏胰蛋白酶抑制剂结构域，淀粉酶抑肽(tendamistat)，Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域，Trefoil(p-型)结构域，血管性血友病因子C型结构域，过敏毒素样结构域，CUB结构域，甲状腺球蛋白I型重复序列，LDL受体A类结构域，Sushi结构域，链接(Link)结构域，血小板反应蛋白I型结构域，免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白样结构域(例如，结构域抗体或camel重链抗体)，C-型凝集素结构域，MAM结构域，血管性血友病因子A型结构域，生长调节素B结构域，WAP-型四个二硫化物核心结构域，F5/8C型结构域，血色素结合蛋白结构域，SH2结构域，SH3结构域，层粘连蛋白型EGF样结构域，C2结构域，“Kappabodies”(III.等“Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties ofboth heavy and light chain variable regions”Protein Eng 10:949-57(1997))，“Minibodies”(Martin等“The affinity-selection of a minibody polypeptideinhibitor of human interleukin-6”EMBO J 13:5303-9(1994))，“双体”(Holliger等“‘Diabodies’”：small bivalent and bispecific antibody fragments”PNAS USA 90:6444-6448(1993))，“Janusins”(Traunecker等“Bispecific single chain molecules(Janusins)target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells”EMBO J 10:3655-3659(1991)和Traunecker等“Janusin:new molecular designfor bispecific reagents”Int J Cancer Suppl 7:51-52(1992)，纳米抗体，adnectin，四连接素(tetranectin)，微体，affiIin，affibody或锚蛋白，晶状体蛋白，knottin，泛素，锌指蛋白，自荧光蛋白，锚蛋白或锚蛋白重复序列蛋白或富含亮氨酸的重复序列蛋白，avimer(SIIverman,Lu Q,BakkerA,To W,Duguay A,Alba BM,Smith R,Rivas A,Li P,Le H,Whitehorn E,Moore KW,Swimmer C,Perlroth V,Vogt M,Kolkman J,Stemmer WP 2005,Nat Biotech,Dec；23(12):1556-61,E-Publication in Nat Biotech.2005Nov 20版)；以及通过人受体结构域家族的外显子改组进化的多价avimer蛋白，其还描述于Silverman J,Lu Q,Bakker A,To W,Duguay A,Alba BM,Smith R,Rivas A,Li P,Le H,Whitehorn E,Moore KW,Swimmer C,Perlroth V,Vogt M,Kolkman J,Stemmer WP,Nat Biotech,Dec；23(12):1556-61,E-Publication in Nat.Biotechnology.2005Nov 20版)。
对本领域技术人员而言，经审查以下的实施例及其附图(其并非意图用于限制)，本发明的另外的目的、优点和特征将变得显而易见。因此，应当理解的是，虽然本发明通过示例性实施方案以及任选的特征进行特定的公开，但本领域技术人员可以采取本文所公开于其中的公开内容的修饰及变化，且认为这样的修饰及变化在本发明的范围内。
实施例
实施例1：通过SPR测量的脂质运载蛋白突变蛋白对IL-17A的亲和力
为了测量SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白对IL-17A的结合亲和力，使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)进行基于表面等离子体共振(SPR)的分析。在该SPR亲和力分析(图1)中，使用标准胺化学将IL-17A固定在传感器芯片上：使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化芯片的表面。随后，以10μL/min的流速施加在10mM pH5醋酸盐中的5μg/mL的IL-17A溶液，直到达到279共振单元(RU)的固定水平。用乙醇胺淬灭残余活化基团。在乙醇胺之后通过EDC/NHS处理来将参考通道进行空白固定。
为了测定亲和力，在HBS-EP+缓冲液中制备SEQ ID NO:1的四种稀释液，并将其施加至所制备的芯片表面。以300秒的接触时间、1200秒的解离时间并施加30μL/min的流速实施该结合分析。所有测量均在25℃下进行。固定有IL-17A的表面的再生通过以下方式获得：连续注射10mM H3PO4水溶液(30秒)以及10mM盐酸甘氨酸pH 1.5(15秒)，接下来是用流动的缓冲液的另外洗涤以及30秒的稳定期。在蛋白质测量之前，进行三个启动循环用于调节目的。数据用Biacore T200评估软件(V 1.0)进行评估。使用双重参考。1:1的结合模型用于拟合原始数据。
所得的拟合曲线示于图1。数据显示SEQ ID NO:1以高亲和力(ka＝7.0×104M-1sec-1的结合速率常数和kd＝5.3×10-5sec-1的解离速率常数，得到KD＝0.8nM的解离常数)结合IL-17A。
实施例2：以另一种形式通过SPR测量的脂质运载蛋白突变蛋白对IL-17A/F的亲和力
为了在以另一种分析形式(捕获SEQ ID NO:1作为配体并施加人IL-17A/F作为分析物)的基于表面等离子体共振(SPR)的分析中测量SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白对IL-17AF的结合亲和力，使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)。在该形式，使用人IL-17A/F(与实施例1中使用的同二聚体IL-17A相对)以避免分析中潜在的亲合力效应。施加合适的过量EZ-Link NHS-PEG4-生物素(Thermo,Cat#21329)使SEQ ID NO:1在室温下生物素化2小时，随后采用Zeba Spin Desalting Plate(Thermo,Cat#21329)，根据制造商的说明将未反应的生物素分离。
在该SPR亲和力分析中，使用生物素CAPture试剂盒(GE Healthcare)将生物素化的SEQ ID NO:1捕获在传感器芯片CAP上：使用ssDNA低聚核苷酸预固定传感器芯片CAP。以2μL/min的流速施加未稀释的生物素CAPture试剂(与互补的ss-DNA寡核苷酸缀合的链霉亲和素)300秒。然后，以5μL/min的流速施加0.4μL/mL至10μL/mL生物素化的SEQ ID NO:1 300秒。参考通道仅装载生物素CAPture试剂。
为了测定结合亲和力，在HBS-EP+缓冲液中制备人IL-17A/F的五种(0.2-20nM)稀释液，并将其施加至所制备的芯片表面。施加30μL/min的流速，以300秒的样品接触时间、2400秒的解离时间采用单循环动力学方法。配体固定后，在监测解离之前，以升序连续施加所有5个浓度。所有测量均在25℃下进行。传感器芯片CAP表面的再生通过以下方式获得：注射6M胍-HCl和0.25M NaOH，接着是用流动缓冲液的另外洗涤以及120秒的稳定期。数据用Biacore T200评估软件(V 1.0)进行评估。使用双重参考。单循环动力学1:1的结合模型用于拟合原始数据。
所得的拟合曲线示于图2。数据显示SEQ ID NO:1以高亲和力(ka＝1.2×104M-1sec-1的结合速率常数和kd＝1.2×10-4sec-1的解离速率常数，得到KD＝100pM的计算平衡解离常数)结合IL-17A/F。与实施例1比较显示，SPR分析的结果在某种程度上取决于分析形式。然而，在两种形式中，SEQ ID NO:1分别对人IL-17A和人IL-17A/F的亲和力高并且在亚纳摩尔范围内。该分析对允许SEQ ID NO:1与包含这种突变蛋白的融合蛋白之间的比较是非常重要的(参见下文实施例11)。
实施例3：结合IL-17A的脂质运载蛋白突变蛋白的作用的竞争模式
采用竞争ELISA形式在体外测试SEQ ID NO:1是否以竞争模式结合IL-17A(图3)。在该实验中，将恒定浓度的生物素化的人IL-17A用可变浓度的SEQ ID NO:1温育1小时。在溶液中的该预温育后，将该脂质运载蛋白突变蛋白/IL-17A混合物的等分试样转移至涂布了人IL-17RA的ELISA板上，以测量未被阻断而结合hIL-17RA的hIL-17A的浓度(图3)。
所有温育步骤均在300rpm振荡下进行，并且每个温育步骤后，用800μlPBS-T缓冲液(PBS，0.05％吐温20)洗涤板5次，其中使用Biotek EL405选择CW洗涤机。在第一步骤中，采用在PBS中1μg/mL的浓度的20μl可溶性人IL-17RA直接在4℃下涂布384孔MSD板过夜。洗涤后，用60μlPBS-T/BSA(在含有0.1％吐温20的PBS中的2％BSA)将涂布受体的孔在室温下阻断1小时。
将固定浓度的0.01nM人IL-17A在溶液中用可变浓度的SEQ ID NO:1或作为阴性对照的SEQ ID NO:41温育，其中采用合适起始浓度的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:41，该起始浓度在PBS-T/BSA缓冲液中以1:4的比率连续稀释至皮摩尔范围。在室温下温育1小时后，将20μl反应混合物转移至涂布hIL-17RA的MSD板，以在室温下捕获未结合(游离)或非-竞争性结合的hIL-17A 20分钟。为了使ELISA读出结果转化为绝对游离hIL-17A浓度(参见下文)，在PBS-T/BSA中制备含有不同浓度的hIL-17A的标准曲线，并也在相同的MSD板上温育20分钟。
为了允许检测和定量结合的生物素化的hIL-17A，移除残余的上清液，并以在PBS-T/BSA中1μg/mL的浓度加入20μl链霉亲和素磺基-标签，并在室温下温育1小时。洗涤后，向每个孔中加入60μl MSD读数缓冲液T(2x)，并在15分钟内读板。
采用SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)测量所得的电致化学发光(ECL)信号。评估如下进行：(根据平行测定的标准曲线)计算游离IL-17A浓度c(IL-17A)游离并相对于SEQ ID NO:1浓度c(SEQ ID NO:1)绘图。为了获得IL-17A/IL-17RA-复合物形成被阻断50％(IC50)时的SEQ ID NO:1浓度，根据c(IL-17A)游离＝c(IL-17A)总/(1+c(SEQ ID NO:1)/IC50))，使用单位点结合模型通过非线性回归，进行曲线拟合，其中总追踪剂浓度c(IL-17A)总和IC50值作为自由参数。使用GraphPad Prism 4软件进行曲线拟合。
图3显示阴性对照SEQ ID NO:41不结合hIL-17A；相反地，SEQ ID NO:1表现出对hIL-17A的强竞争结合，具有75pM的拟合的IC50值。
实施例4：脂质运载蛋白突变蛋白与IL-17A的特异性和物种交叉反应性
SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白的特异性和物种交叉反应性(图4)通过“溶液竞争ELISA”进行测定，其原理如下：将恒定浓度的SEQ ID NO:1用可变浓度的配体(人IL-17A、食蟹猕猴IL-17A(cIL-17A)和绒猴IL-17A配体)温育1小时。在溶液中的该预温育后，将该突变蛋白/配体混合物的等分试样转移至具有通过中性抗生物素蛋白固定的生物素化的hIL-17A的ELISA板上，以测量SEQ ID NO:1的剩余浓度(图3)。通过定量ELISA装置测定游离(非配体结合的)SEQ ID NO:1的浓度(图4)。注意，本分析依赖于所有配体靶向SEQ ID NO:1上的相同结合位点，即，与SEQ ID NO:1结合的配体彼此竞争。
在下面详细的实验方案中，温育和洗涤步骤如上面竞争ELISA方案中所述进行。采用在PBS中5μg/ml的浓度的20μl中性抗生物素蛋白在4℃下涂布适合用于荧光测量的384孔板(Greiner FLUOTRACTM600，黑色平底、高结合)过夜。洗涤后，将中性抗生物素蛋白涂布的孔用100μl阻断缓冲液(PBS-T/BSA)在室温下阻断1小时。再次洗涤后，在室温下加入以在PBS中1μg/ml的浓度的20μl生物素化的hIL-17A 1小时，并将过量的试剂移除。
固定浓度的0.25nM SEQ ID NO:1在溶液中用可变浓度的配体(hIL-17A、cIL-17A和狨猴IL-17A)温育，其中采用合适起始浓度，该起始浓度在PBS-T/BSA中以1:3的比率连续稀释至皮摩尔范围。在室温下温育1小时后，将20μl反应混合物转移至其上固定有生物素化的hIL-17A的384孔板，以在室温下捕获未结合(游离)的SEQ ID NO:1 20分钟。为了使ELISA读出结果转化为绝对游离SEQ ID NO:1浓度(参见下文)，在PBS-T/BSA中制备含有不同浓度的SEQ ID NO:1的标准曲线，并也在相同的ELISA板上温育20分钟。
移除残余的上清液，并以在PBS-T/BSA中的预定最佳浓度加入20μl HRP-标记的抗-脂质运载蛋白抗体，并在室温下培养1小时。通过用脂质运载蛋白突变蛋白的混合物免疫兔来获得抗-脂质运载蛋白抗体，并随后采用试剂盒(EZ-link Plus ActivatedPeroxidase,Thermo Scientific)根据制造商的说明将其偶联至HRP，以获得抗体-HRP缀合物。洗涤后，向每个孔中加入20μl荧光HRP底物(Quantablue,Pierce)，并使反应进行60分钟。使用Genios Plus微量板读板器(Tecan)读取在该板上每个孔的荧光强度。为了评估数据，基于标准曲线结果计算游离SEQ ID NO:1浓度c(SEQ ID NO:1)游离，并相对于配体浓度c(配体)绘图。为了获得IL-17A/SEQ ID NO:1复合物形成被阻断50％(IC50)时的配体浓度，根据c(SEQ ID NO:1)游离＝c(SEQ ID NO:1)总/(1+c(配体)/IC50))，使用单位点结合模型通过非线性回归，进行曲线拟合，其中总追踪剂浓度c(SEQ ID NO:1)总和IC50值作为自由参数。使用GraphPad Prism 4软件进行曲线拟合。
综上所述，曲线拟合得到如下结果：IC50hIL-17A＝0.1nM，IC50cIL-17A＝0.1nM和IC50狨猴IL-17A＝0.2nM。图4表明，数据证明SEQ ID NO:1显示出对来自人、食蟹猕猴和狨猴的IL-17A的高亲和力，因此，表明SEQ ID NO:1与食蟹猕猴和狨猴IL-17A完全交叉反应。
实施例5：在基于细胞的分析中脂质运载蛋白突变蛋白介导的IL-17A诱导的G-CSF分泌的阻断
采用基于细胞的分析来证明SEQ ID NO:1阻断IL-17A生物活性的能力。该分析基于在U87-MG细胞(ATCC目录#HTB-14)中IL-17A诱导的G-CSF分泌。采用这种高度灵敏的功能分析来比较SEQ ID NO:1与两种临床开发的基准抗体的效力。在该分析中，将重组hIL-17A用SEQ ID NO:1、基准抗体分子或对照预温育并加入细胞中。除SEQ ID NO:1之外，以下基准和对照也包含在该分析中：基准抗体1(重链SEQ ID NO:53；轻链SEQ ID NO:54)、基准抗体2(重链SEQ ID NO:55；轻链SEQ ID NO:56)和SEQ ID NO:2和人IgG同种型抗体(Dianova,CAT#009-000-002)作为阴性对照。之后通过ELISA测量上清液中G-CSF的浓度。
在标准条件(含有10％胎牛血清FCS(PAA Laboratories)的Dulbecco's ModifiedEagle培养基DMEM(PAN Biotech GmbH)，37℃，5％CO2气氛)下在细胞培养瓶中培养U87-MG细胞。
在实验的第1天，采用Accutase(PAA Laboratories)根据制造商的说明从底物中解离粘附的细胞。然后将细胞以1000rpm离心5分钟，重悬于培养基中并通过100μm细胞过滤器(Falcon)过滤以移除细胞聚集体。然后，使用100μl的终体积，将细胞以每孔5000个细胞的密度接种在96孔平底组织培养板(Greiner)中。将这些细胞在标准条件下温育过夜。
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、人IgG同种型抗体(Dianova,CAT#009-000-002)、基准抗体1和基准抗体2(如上文所述)为研究分子(“MUS”)。第二天，用80μl新鲜培养基替换在96孔板中生长的细胞的培养基，并且随后将固定浓度的0.1nM重组hIL-17A和MUS溶液的稀释系列加入到细胞中。对每个MUS或对照一式三份地进行这一操作。将细胞在标准条件下再温育20-24小时。在收集上清液用于测量G-CSF水平之前，用显微镜目视检查孔。从评估中排除表现出大量细胞死亡或存在细胞聚集体的孔。采用来自MSD的G-CSF超敏感试剂盒测定G-CSF水平。为了评估数据，以任意单位的G-CSF浓度相对于MUS浓度c(MUS)作图。为了获得由U-87MG细胞产生G-CSF的诱导下降至50％(IC50)时的MUS浓度，根据c(G-CSF)＝c(G-CSF)最小+[c(G-CSF)最大-c(G-CSF)最小]/[1+c(MUS)/IC50]，使用单位点结合模型通过非线性回归，进行曲线拟合，其中自由参数是I C50、诱导的G-CSF浓度c(G-CSF)最大和未诱导的G-CSF浓度c(G-CSF)最小。这里，假设c(G-CSF)最大和c(G-CSF)最小独立于研究中的拮抗剂或对照分子，因此它们拟合于所有分子的常见值。
图5显示了该实验的代表性实例，该实验一式两份地实施。所得的SEQ ID NO:1的平均EC50值为0.13nM(在第一次实验中为0.17nM，在重复实验中为0.10nM)，其显著比显示出EC50＝2.33(2.65/2.01)nM的基准1更有效，并且与具有EC50＝0.12(0.14/0.10)nM的基准2相比在相似的范围中。由SEQ ID NO:2和人IgG同种型抗体(Dianova，CAT#009-000-002，图5中未示出)组成的阴性对照对细胞的IL-17A诱导的G-CSF产生没有影响。
实施例6：通过SPR测量的脂质运载蛋白突变蛋白对IL-23的亲和力
为了测量SEQ ID NO:2的脂质运载蛋白突变蛋白对人IL-23的结合亲和力，使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)进行基于表面等离子体共振(SPR)的分析。在该SPR亲和力分析(图6)中，使用标准胺化学将hIL-23固定在传感器芯片上：使用EDC和NHS活化芯片的表面。随后，以10μL/min的流速施加在10mM pH 4.5醋酸盐中的5μg/mL的hIL-23溶液，直到达到足够的固定水平。用乙醇胺淬灭残余活化基团。在乙醇胺之后用EDC/NHS(空白固定)处理参考通道。
为了测定SEQ ID NO:2的结合亲和力，在HBS-EP+缓冲液中制备SEQ ID NO:2的五种稀释液，并将其施加至所制备的芯片表面。以300秒的接触时间、1200秒的解离时间并施加30μL/min的流速实施该结合分析。所有测量均在25℃下进行。固定有hIL-23的表面的再生通过以下方式获得：注射10mM H3PO4水溶液(30秒)，接下来是用流动缓冲液的另外冲洗以及30秒的稳定期。在蛋白质测量之前，进行三个启动循环用于调节目的。数据用BiacoreT200评估软件(V 1.0)进行评估。使用双重参考。1:1的结合模型用于拟合原始数据。
图6显示了该实验的代表性实例，该实验一式三份地实施。所得的拟合曲线证明SEQ ID NO:2以高亲和力(ka＝5.0×104M-1sec-1的结合速率常数和kd＝1.9×10-5sec-1的解离速率常数)结合hIL-23。在三个重复实验中测定的平均解离常数等于KD＝0.35±0.20nM，这表明SEQ ID NO:2与人IL-23之间的高亲和力相互作用。
实施例7：以另一种形式通过SPR测量的脂质运载蛋白突变蛋白对IL-23的亲和力
为了在另一种分析形式(捕获SEQ ID NO:2作为配体并施加hIL-23作为分析物)中使用表面等离子体共振(SPR)测量SEQ ID NO:2对人IL-23的结合亲和力，使用BiacoreT200仪器(GE Healthcare)。如实施例2中所述将SEQ ID NO:2和对照生物素化。在该SPR亲和力分析中，使用生物素CAPture试剂盒(GE Healthcare)将生物素化的SEQ ID NO:2捕获在传感器芯片CAP上。为此，以2μL/min的流速施加未稀释的生物素CAPture试剂300秒。然后，以5μL/min的流速施加0.4μL/mL至10μL/mL生物素化的SEQ ID NO:2或对照300秒。参考通道仅装载生物素CAPture试剂。
为了测定结合亲和力，在补充有350mM NaCl的HBS-EP+缓冲液中制备hIL-23(7-600nM)的五种稀释液，并将其施加至所制备的芯片表面。需要添加350mM NaCl以使hIL-23与芯片表面的非特异性相互作用最小化。施加30μL/min的流速，以300秒的样品接触时间、4000秒或7200秒的解离时间采用单循环动力学方法。配体固定后，在监测解离之前，以升序连续施加所有5个浓度。所有测量均在25℃下进行。按照实施例2所述完成传感器芯片CAP表面的再生和数据评估。
所得的拟合曲线示于图7。数据显示SEQ ID NO:2以相当高的亲和力(ka＝1.23×104M-1sec-1的结合速率常数和kd＝3.55×10-5sec-1的解离速率常数，得到KD＝2.9nM的计算平衡解离常数)结合hIL-23。与实施例6比较显示，当使用该SPR分析形式时亲和力强烈降低，这归因于必须包括在缓冲液中以使hIL-23与芯片表面的非特异性相互作用最小并且因此便于这种形式的分析实施的NaCl(350mM)的高且非生理浓度。该分析对允许SEQ ID NO:2与包含这种突变蛋白的融合蛋白之间的比较是非常重要的(参见下文实施例11)。
实施例8：结合IL-23的脂质运载蛋白突变蛋白的作用的竞争模式
与实施例3类似，但是将hIL-23用作靶标，采用竞争ELISA形式在体外测试脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:2是否以竞争模式结合hIL-23(图8)。
所有温育步骤均在300rpm振荡下进行，并且每个温育步骤后，用80μl PBS/0.05％吐温20洗涤培养板5次，其中使用Biotek EL405选择CW洗涤机。采用在PBS中1μg/mL的浓度的20μl可溶性人IL-23受体直接在4℃下涂布384孔MSD板过夜。洗涤后，用60μl PBS-T/BSA将涂布受体的孔在室温下阻断1小时。
将固定浓度的0.01nM生物素化人IL-23在溶液中用可变浓度的SEQ ID NO:2或作为阴性对照的SEQ ID NO:43温育，其中采用合适起始浓度，该起始浓度在PBS-T/BSA中以1:4的比率连续稀释至皮摩尔范围。在室温下温育1小时后，将20μl反应混合物转移至涂布IL-23受体的MSD板，以在室温下捕获未结合(游离)或非-竞争性结合的hIL-23 20分钟。为了使ELISA读出结果转化为绝对游离hIL-23浓度(参见下文)，在PBS-T/BSA中制备含有以100nM起始的不同浓度(在11个步骤中1:4连续稀释)的hIL-23的标准曲线，并也在相同的MSD板上温育20分钟。为了允许检测和定量结合的生物素化的hIL-23，移除残余的上清液，并以在PBS-T/BSA中1μg/mL的浓度加入20μl链霉亲和素磺基-标签，并在室温下温育1小时。洗涤后，向每个孔中加入60μl MSD读数缓冲液T(2x)，并在15分钟内读板。
采用SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)测量所得的ECL信号。类似于实施例3进行评估。如图8所示，阴性对照SEQ ID NO:43不结合hIL-23；相反地，证明SEQ IDNO:2与hIL-23竞争结合，具有0.54nM的拟合的IC50值。
实施例9：脂质运载蛋白突变蛋白与IL-23的特异性和物种交叉反应性
与实施例4类似，但是研究不同的配体，即来自人、食蟹猕猴(cIL-23)、狨猴和小鼠的IL-23，通过“溶液竞争ELISA”测定SEQ ID NO:2的脂质运载蛋白突变蛋白的特异性和物种交叉反应性(图9)。
在下面详细的实验方案中，温育和洗涤步骤如上面竞争ELISA方案中所述进行。采用在PBS中5μg/ml的浓度的20μl中性抗生物素蛋白在4℃下涂布适合用于荧光测量的384孔板(Greiner FLUOTRACTM600，黑色平底、高结合)过夜。洗涤后，将中性抗生物素蛋白涂布的孔用100μl PBS-T/BSA在室温下阻断1小时。再次洗涤后，在室温下加入以在PBS中0.25μg/ml的浓度的20μl生物素化的hIL-23-Bio 1小时，并将过量的试剂移除。
固定浓度的0.5nM SEQ ID NO:2在溶液中用可变浓度的配体(hIL-23、cIL-23和狨猴IL-23和小鼠IL-23)温育，其中采用合适起始浓度，该起始浓度在PBS-T/BSA中以1:3的比率连续稀释至皮摩尔范围。在室温下温育20分钟后，将20μl反应混合物转移至涂布hIL-23的384孔板，以在室温下捕获未结合(游离)的SEQ ID NO:2 20分钟。为了使ELISA读出结果转化为绝对游离SEQ ID NO:2浓度(参见下文)，在PBS-T/BSA中制备含有不同浓度的SEQ IDNO:2的标准曲线，并也在相同的MSD板上温育20分钟。
为了定量板捕获的SEQ ID NO:2，移除残余的上清液，并以在PBS-T/BSA中的预定最佳浓度加入20μl HRP-标记的抗-脂质运载蛋白抗体，并在室温下培养1小时。通过用脂质运载蛋白突变蛋白的混合物免疫兔来获得抗-脂质运载蛋白抗体，并随后采用试剂盒(EZ-link Plus Activated Peroxidase,Thermo Scientific)根据制造商的说明将其偶联至HRP，以获得抗体-HRP缀合物。如实施例4中所述进行板的进一步处理、数据采集和评估。
如图9所示，结果证明SEQ ID NO:2与人和小鼠IL-23完全交叉反应，并对食蟹猕猴和狨猴的IL-23显示一定降低的亲和力，其中IC50hIL-23＝0.9nM、IC50cIL-23＝4.8nM、IC50marmIL-23＝12nM和IC50mIL-23＝0.5nM。
实施例10：脂质运载蛋白突变蛋白介导的IL-23在基于细胞的增殖分析中的阻断
使用重组表达人IL-23受体的细胞通过应用短期增殖生物分析来评估SEQ ID NO:2的脂质运载蛋白突变蛋白中和hIL-23的生物活性的能力。Ba/F3转染细胞系表达受体的两个亚单位hIL-23R和hIL-12Rβ1，并且对人IL-23和食蟹猕猴IL-23都有响应。Ba/F3细胞以剂量依赖方式响应于hIL-23增殖，并且可以通过hIL-23中和剂抑制该增殖。在该分析中，将不同浓度的SEQ ID NO:2用恒定量的hIL-23预温育，然后将混合物加入培养中的Ba/F3细胞。培养三天后，通过定量活细胞的数量来评估增殖的程度。这使用CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay(Promega CAT#G7571)进行，以测量与代谢活性细胞的数量相关的ATP水平。通过其IC50值(即导致hIL-23诱导的增殖的半最大抑制的脂质运载蛋白突变蛋白的浓度)来评估SEQ ID NO:2中和hIL-23的能力。
以下描述建立该分析的详细程序。将Ba/F3转染子保持在RPMI-1640培养基(10％胎牛血清、0.05mM 2-巯基乙醇、500μg/mL遗传霉素(G418)、1ng/mL mIL-3、2μg/mL嘌呤霉素和200μg/mL博来霉素(zeocin))中。在RPMI-1640培养基(10％胎牛血清和0.05mM 2-巯基乙醇)中进行Ba/F3增殖分析。在384孔白色透明平底板(Greiner)中以25μL/孔进行分析。
第一天，对来自Ba/F3悬浮细胞培养物的细胞计数、沉淀、在分析培养基中洗涤两次并以2500个细胞/孔的密度接种。将50pM的hIL-23(CAT#HZ-1254，HumanZyme)(对应于诱导Ba/F3细胞增殖所需的预定EC50)和SEQ ID NO:2的稀释系列、阴性对照(人IgG同种型抗体，CAT#009-000-003，Dianova)和基准抗体(基准3：SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58，基准4：SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60)加入孔中。所有滴定系列在分析培养基中以系列1:3稀释和合适的起始浓度进行。随后，使细胞在37℃下增殖72小时。为了确保hIL-23的效力不受日间和日内变异性影响，通过将单独的hIL-23的稀释系列加入到Ba/F3细胞中，检查Ba/F3细胞对hIL-23的剂量依赖性增殖响应，其中在分析培养基中使用50nM起始的1:3稀释步骤。为了在72小时后定量细胞增殖，将25μL CellTiter-Glo试剂加入每个孔中的细胞中，并在轨道摇床上温育2分钟以诱导细胞裂解，并使用PheraStar FS读数器测量发光。
使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)通过对发光信号与样品浓度绘图和使用采用S形剂量-响应模型的数据的非线性回归来确定EC50值。
该实验的结果示于图10。上文公开的增殖分析代表两个独立实验。SEQ ID NO:2显示的平均EC50值为1.2nM(在第一次实验中为1.7nM，在重复实验中为0.7nM)，基准3显示的EC50为3.0nM(3.1/2.9)和基准4显示的EC50为1.2nM(0.8/1.5)。阴性对照对增殖无影响。因此，数据证明SEQ ID NO:2和基准分子在该功能分析中表现出相当的效力。
实施例11：融合蛋白的设计和表征
含有IL-17A和IL-23结合脂质运载蛋白突变蛋白之一或两者的各种融合蛋白如下产生、表达和表征，并如图11所示。
SEQ ID NO:8是SEQ ID NO:1与源自链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域的去免疫的白蛋白结合肽(dABD,SEQ ID NO:15)的融合蛋白。
SEQ ID NO:7是SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:15的融合蛋白。
SEQ ID NO:10是以连接子SEQ ID NO:18连接的成一排的两个SEQ ID NO:1序列并且与SEQ ID NO:15融合的同二聚体融合蛋白。
SEQ ID NO:3是以连接子SEQ ID NO:18连接的SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2的异二聚体融合蛋白；而SEQ ID NO:4是具有相反脂质运载蛋白突变蛋白顺序SEQ ID NO:2和SEQID NO:1并以稍微不同的连接子SEQ ID NO:19连接的异二聚体融合蛋白。
SEQ ID NO:5是对应于SEQ ID NO:3、但具有与链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域(SEQ ID NO:14)的另外C-末端融合的融合蛋白。
SEQ ID NO:9是对应于SEQ ID NO:3、但具有与dABD(SEQ ID NO:15)的另外C-末端融合的融合蛋白。
SEQ ID NO:6是由C-末端融合至SEQ ID NO:2和dABD(SEQ ID NO:15)的成一排的两个SEQ ID NO:1序列组成的三聚体融合蛋白。脂质运载蛋白之间的连接子由SEQ ID NO:18组成。
我们还生成了一个或多个SEQ ID NO:1部分与IgG1的Fc部分的融合蛋白，该融合蛋白对应于SEQ ID NO:16：
SEQ ID NO:11是对应于SEQ ID NO:1通过肽连接子SEQ ID NO:19连接而C末端融合至SEQ ID NO:16的融合蛋白。
SEQ ID NO:12是对应于SEQ ID NO:1的N-和C-末端双重融合使得SEQ ID NO:16的Fc分子被赋予在SEQ ID NO:1的N-和C-末端二者的融合蛋白。
SEQ ID NO:13是对应于SEQ ID NO:10的同二聚体融合蛋白C末端融合至SEQ IDNO:16的Fc分子的融合蛋白。
适当时，所有融合蛋白通过确切如上文针对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所述的分析完全表征：针对hIL-17A(实施例3)和hIL-23(实施例8)的竞争ELISA分析；SPR分析，该分析中融合蛋白被固定在针对hIL-17AF(实施例2)和hIL-23(实施例6)的SPR芯片上；以及如所述的针对hIL-17A(实施例5)和hIL-23(实施例10)基于功能细胞的分析。
实验结果总结在表1。该表提供了在竞争ELISA、表面等离子体共振(SPR)和基于功能细胞的分析中，各个脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相比于它们的融合蛋白SEQ ID NO:3-13的活性概述。根据各自的构建体是否含有IL-17A结合脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:1、IL-23-结合脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:2或两者来测定与IL-17和/或IL-23的相互作用的值。为了分别测定对IL-17和IL-23的活性，按照实施例3和/或实施例8所述实施竞争ELISA实验；按照实施例2和/或实施例6所述以反向形式实施SPR分析(即蛋白质构建体固定在传感器芯片上)；并且细胞分析基于IL-17A诱导的G-CSF分泌(实施例5)和/或IL-23诱导的Ba/F3细胞增殖(实施例10)。应注意，为测定IL-23亲和力而实施的反向形式的SPR实验是在非生理高浓度NaCl存在下进行的，并且因此得到的值不反映生理条件下对IL-23的亲和力，但是该实验用于确定，将融合蛋白SEQ ID NO:3-13与各个脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相比，对IL-23的相对亲和力是否不同。表1证明在全部分析形式下，含有SEQ ID NO:1的全部融合蛋白的IL-17A结合活性至少与SEQID NO:1本身的活性一样好。因此，SEQ ID NO:1可灵活地用于任何融合蛋白而没有活性损失。在全部分析形式下，含有SEQ ID NO:2的全部融合蛋白的IL-23结合活性与SEQ ID NO:2本身的活性非常接近。因此，SEQ ID NO:2可灵活地用于任何融合蛋白而没有显著的活性损失。
实施例12：设计为通过融合蛋白同时结合全部靶标的SPR实验
为了证明SEQ ID NO:9的融合蛋白与hIL-17A、hIL-23和人血清白蛋白(HSA)同时结合，采用Biacore T200仪器(GE Healthcare)进行基于表面等离子体共振(SPR)的分析。按照实施例2所述将SEQ ID NO:9生物素化。在该SPR亲和力分析中，使用生物素CAPture试剂盒(GE Healthcare)将生物素化的SEQ ID NO:9捕获在传感器芯片CAP上。对此，以2μL/min的流速施加未稀释的生物素CAPture试剂300秒。然后，以5μL/min的流速施加0.4μL/mL至10μL/mL生物素化的SEQ ID NO:9 300秒。参考通道仅装载生物素CAPture试剂。
为了证明同时结合，在补充有350mM NaCl的HBS-EP+缓冲液中制备hIL-17A/F、hIL-23和HAS(200nM、1000nM和2000nM)的稀释液，并连续施加至所制备的芯片表面。施加30μL/min的流速，以300秒的样品接触时间连续注射hIL-17A/F、hIL-23和HAS。还使用单个配体hIL-17A/F、hIL-23和HSA进行靶标向固定的SEQ ID NO：9的应用，以通过结合单个靶标来获得可获得的最大结合水平用于比较。
图12对测量的结合曲线与反映全部配体完全结合的理论结合曲线进行了比较。后者通过汇集SEQ ID NO:9对各个配体的实验响应获得。测量的和理论的曲线几乎相同，所显示出的差异是由于实验曲线中靶标的解离。数据表明，与仅结合单一靶标相比，SEQ ID NO:9能够同时结合全部靶标hIL-17A、hIL-23和HSA而没有信号强度的损失或动力学改变。
实施例13：另外的脂质运载蛋白突变蛋白对IL-23的亲和力
为了测量脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46对人IL-23的结合亲和力，使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)进行基于表面等离子体共振(SPR)的分析。在该SPR亲和力分析(图13)中，使用标准胺化学将hIL-23固定在传感器芯片上：按照实施例6所述实施芯片活化、hIL-23的固定、SPR测量和数据评估。
如图13所示，所得的拟合曲线证明SEQ ID NO:45以高亲和力(ka＝3.0×105M-1sec-1的结合速率常数和kd＝3×10-5sec-1的解离速率常数，得到KD＝100pM的解离常数)结合hIL-23。类似地，如图13所示，SEQ ID NO:46以高亲和力(ka＝7.0×104M-1sec-1的结合速率常数和kd＝4.0×10-5sec-1的解离速率常数，得到KD＝0.6nM的解离常数)结合hIL-23。
实施例14：的脂质运载蛋白突变蛋白对IL-23的作用的竞争模式
采用竞争ELISA形式在体外测试脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:45和SEQ IDNO:46是否以竞争模式结合人hIL-23(图14)。与实施例8相比，实验和评估以相同的方式进行。
该实验的结果示于图14。SEQ ID NO:45表现出与hIL23的竞争性结合，具有0.1nM的拟合的IC50值，且SEQ ID NO:46也展现出与hIL23的竞争性结合，具有1.1nM的拟合的IC50值。
实施例15：脂质运载蛋白突变蛋白介导的IL-23在基于细胞的增殖分析中的阻断
使用重组表达人IL-23受体的细胞通过应用短期增殖生物分析来评估脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46中和hIL-23的生物活性的能力。类似于实施例10实施实验和评估。将SEQ ID NO:43用作阴性对照。
该实验的结果示于图15。SEQ ID NO:45显示的平均EC50值为3.7nM，和SEQ ID NO:46显示平均EC50值为5.4nM。阴性对照对增殖无影响。因此，数据证明SEQ ID NO:2与SEQ IDNO:45和SEQ ID NO:46的脂质运载蛋白突变蛋白在该功能分析中表现出相当的效力。
实施例16：融合蛋白对IL-17A的特异性
我们采用ELISA分析测定SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:62的融合蛋白对IL-17A的特异性。将中性抗生物素蛋白溶解在PBS(5μg/mL)中并在4℃下在微滴定板上涂布过夜。每个温育步骤后，用100μl补充有0.1％(v/v)吐温20的PBS(PBS-T)洗涤培养板5次。在室温下，用PBS-T(PBS-TB)中2％BSA(w/v)阻断培养板1小时，然后洗涤。已生物素化的IL-17A(Peprotech)在中性抗生物素蛋白上以1μg/ml的浓度捕获20分钟。洗去未结合的蛋白。随后，将不同浓度的SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白加入孔中并在室温下温育1小时，然后进行洗涤步骤。用在PBS-TB中1:2000稀释的缀合至HRP的抗-人TLc抗体温育后，检测结合的融合蛋白或脂质运载蛋白突变蛋白。在另外的洗涤步骤后，向每个孔中加入荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)，并使用荧光微板读数器检测荧光强度。
实验结果与从1:1结合S形拟合得到的拟合曲线一起示于图16，其中EC50值和最大信号是自由参数，并且斜率固定为一。得到的EC50值提供在表2中，包括数据的S形拟合的误差。在实验的误差内，对于抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合蛋白和脂质运载蛋白突变蛋白观察到的EC50值非常相似。实验显示，包含在融合蛋白中的SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白可以与SEQ ID NO:61和62的抗体融合，而没有对IL-17A的活性的损失。
表2—IL-17A结合的ELISA数据
Figure BDA0001216391380000791
实施例17：融合蛋白对IL-23的特异性
我们采用ELISA分析测定SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:62的融合蛋白对IL-23的特异性。将中性抗生物素蛋白溶解在PBS(5μg/mL)中并在4℃下在微滴定板上涂布过夜。每个温育步骤后，用100μl补充有0.1％(v/v)吐温20的PBS(PBS-T)洗涤培养板5次。在室温下，用PBS-T(PBS-TB)中2％BSA(w/v)阻断培养板1小时，然后洗涤。生物素化的IL-23在中性抗生物素蛋白上以1μg/ml的浓度捕获20分钟。洗去未结合的蛋白。随后，将不同浓度的SEQ IDNO:2的脂质运载蛋白突变蛋白或融合蛋白加入孔中并在室温下温育1小时，然后进行洗涤步骤。用在补充有2％(w/v)BSA(PBS-TB)的PBS-TB中1:1000稀释的与HRP缀合的抗-人NGAL抗体温育后，测定结合的融合蛋白或脂质运载蛋白。在另外的洗涤步骤后，向每个孔中加入荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)，并使用荧光微板读数器检测荧光强度。
实验结果与从1:1结合S形拟合得到的拟合曲线一起示于图17，其中EC50值和最大信号是自由参数，并且斜率固定为一。得到的EC50值提供在表3中。在实验的误差内，对于抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合蛋白和脂质运载蛋白突变蛋白观察到的EC50值非常相似。这证明，包含在融合蛋白中的SEQ ID NO:2的脂质运载蛋白突变蛋白可以与SEQ ID NO:64和62的抗体融合，而没有对IL-23的活性的损失。
表3—IL-23结合的ELISA数据
Figure BDA0001216391380000801
实施例18：融合蛋白对TNF-α的特异性
我们采用ELISA分析测定SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:62的融合蛋白和SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65的融合蛋白对TNF-α的特异性。SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62的抗体作为阳性对照。将重组的TNF-α(R&D System，210-TA-100/CF)溶解在PBS(1μg/mL)中并在4℃下在微滴定板上涂布过夜。每个温育步骤后，用100μL PBS-T洗涤培养板5次。在室温下，用PBS-T中2％BSA(w/v)阻断培养板1小时，然后洗涤。将不同浓度的TNF-α特异性亲本抗体或融合蛋白加入孔中并在室温下温育1小时，然后进行洗涤步骤。在室温下用在PBS-TB中1:5000稀释的与HRP(Jackson Laboratories)缀合的羊抗-人IgG Fab抗体温育1小时后，检测结合的融合蛋白或抗体。在另外的洗涤步骤后，向每个孔中加入荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)，并使用荧光微板读数器检测荧光强度。
实验结果与从1:1结合S形拟合得到的拟合曲线一起示于图18，其中EC50值和最大信号是自由参数，并且斜率固定为一。得到的EC50值提供在表4中。对所有测试的蛋白观察到的EC50值非常相似。这证明，包含在融合蛋白中的抗体可以与不同脂质运载蛋白突变蛋白融合，而不损害其对TNF-α的活性。
表4—TNF-α结合的ELISA数据
Figure BDA0001216391380000802
Figure BDA0001216391380000811
实施例19：在基于ELISA的设置中融合蛋白的同时靶标结合的证明
为了证明SEQ ID NO:63和62的融合蛋白和SEQ ID NO:64和62的融合蛋白分别同时与TNF-α和hIL-17A或IL-23结合，采用双重结合ELISA形式。将在PBS(1μg/mL)中的重组的TNF-α(R&D System，210-TA-100/CF)在4℃下在微滴定板上涂布过夜。每个温育步骤后，用100μL PBS-T洗涤培养板5次。在室温下，用在PBS-T中2％BSA(w/v)阻断培养板1小时，然后再次洗涤。将不同浓度的融合蛋白加入孔中并在室温下温育1小时，然后进行洗涤步骤。随后，将生物素化的IL-17A(在SEQ ID NO:63和62的情况下)或生物素化的IL-23(在SEQ IDNO:64和62的情况下)以在PBS-TB中恒定浓度1μg/mL加入1小时。洗涤后，将Extravidin-HRP(Sigma-Adrich，PBS-TB中1:5000)加入孔中1小时。在另外的洗涤步骤后，向每个孔中加入荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)，并使用荧光微板读数器检测荧光强度。
实验结果与从1:1结合S形拟合得到的拟合曲线一起示于图19，其中EC50值和最大信号是自由参数，并且斜率固定为一。得到的EC50值提供在表5中。所有融合蛋白均显示具有在单个数字纳摩尔范围内的EC50值的清晰的结合信号，这表明融合蛋白能够同时结合TNF-α和IL-17A或IL-23。
表5——同时靶标结合的ELISA数据
名称 EC50双重结合[nM]
SEQ ID NO:63和62 2.70±0.22
SEQ ID NO:64和62 1.54±0.16
本文示例性所描述的实施方式可以适当地在本文中未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制存在或不存在的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被宽泛地解读且无限制。另外，本文所采用的术语和表达被用作描述的术语而非限制的术语，并且无意图在使用这些术语和表达时，排除掉显示和描述的特征的任何等同物或其部分，而是认可各种修饰可以在本发明的范围内。因此，应当理解的是，虽然这些实施方式已通过优选的实施方式和任选的特征而被具体公开，本领域技术人员可以寻求其修饰和变化，并且这样的修饰和变化被认为是在本发明的范围内。本文所述的所有专利、专利申请、教科书和同行评审的出版物均通过引用全文并入本文。此外，当在通过引用并入本文的参考文献中的定义或使用的术语与本文所提供该术语的定义不一致或相反时，适用本文所提供的该术语的定义，而不适用该参考文献中该术语的定义。每个较窄种类和亚属分组落入类属的公开范围内，也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述，且具有从该种类中取出任何主题的条件或负面限制，而不管该去除的材料是否在本文中具体陈述。此外，当特征是以马库什组的形式描述时，本领域技术人员将认识到，本发明还由此以该马库什组中任何单独成员或成员亚组的形式描述。进一步的实施方式将由以下的权利要求书中变得显而易见。
等价物：本领域的技术人员使用不超过常规实验就会认识到或者能够确定许多于此处描述的本发明的具体实施方式的等价物。以下的权利要求意欲涵盖这些等价物。在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此完整引入本说明书中作为参考，就像每个单独的出版物、专利或专利申请具体地且分别指出引入本文作为参考一样。
序列表
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Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Phe Trp Cys Ser Gly Ile His Glu Glu Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asp Ile Glu Gly Phe Leu Gln Glu Phe Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser Arg Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Asp Cys Pro Gly Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val Gly
100 105 110
Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala
115 120 125
Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln
130 135 140
Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
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1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
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Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
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Arg Lys Met Thr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gly
85 90 95
Ile Glu Ser Met Pro Gly Met Thr Ser Phe Leu Val Arg Val Val Ser
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Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Ile Val Phe Phe Lys Tyr Val Tyr Gln
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Asn Arg Glu Tyr Phe Glu Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
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Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
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Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Ala Ile
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Asp Gly
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<213> 人工
<220>
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100 105 110
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115 120 125
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<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
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245 250 255
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260 265 270
Ile Arg Ser Arg Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr Ser Glu Gly Asp
275 280 285
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<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 6
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<220>
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<223> 融合蛋白
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260 265 270
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275 280 285
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370 375 380
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385 390
<210> 12
<211> 553
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 12
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Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala
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Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln
130 135 140
Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
165 170 175
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
180 185 190
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
195 200 205
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
210 215 220
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
225 230 235 240
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
245 250 255
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
260 265 270
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
275 280 285
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
290 295 300
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
305 310 315 320
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
325 330 335
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
340 345 350
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
355 360 365
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
370 375 380
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
385 390 395 400
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
405 410 415
Ala Met Thr Val Asp Phe Trp Cys Ser Gly Ile His Glu Glu Ser Val
420 425 430
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
435 440 445
Val Thr Met Asp Ile Glu Gly Phe Leu Gln Glu Phe Lys Ala Val Leu
450 455 460
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
465 470 475 480
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser Arg Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
485 490 495
Ser Glu Gly Asp Cys Pro Gly Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val Gly
500 505 510
Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala
515 520 525
Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln
530 535 540
Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly Ser Asp
545 550
<210> 13
<211> 553
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 13
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Asp
225 230 235 240
Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr
245 250 255
Val Asp Phe Trp Cys Ser Gly Ile His Glu Glu Ser Val Thr Pro Met
260 265 270
Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys Val Thr Met
275 280 285
Asp Ile Glu Gly Phe Leu Gln Glu Phe Lys Ala Val Leu Glu Lys Thr
290 295 300
Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His Val Ala Tyr
305 310 315 320
Ile Ile Arg Ser Arg Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr Ser Glu Gly
325 330 335
Asp Cys Pro Gly Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val Gly Arg Asp Pro
340 345 350
Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala
355 360 365
Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr
370 375 380
Ser Ser Pro Gly Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
385 390 395 400
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
405 410 415
Ala Met Thr Val Asp Phe Trp Cys Ser Gly Ile His Glu Glu Ser Val
420 425 430
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
435 440 445
Val Thr Met Asp Ile Glu Gly Phe Leu Gln Glu Phe Lys Ala Val Leu
450 455 460
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
465 470 475 480
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser Arg Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
485 490 495
Ser Glu Gly Asp Cys Pro Gly Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val Gly
500 505 510
Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala
515 520 525
Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln
530 535 540
Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly Ser Asp
545 550
<210> 14
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 白蛋白结合结构域
<400> 14
Ser Ala Gly Ala Val Asp Ala Asn Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu
1 5 10 15
Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn
20 25 30
Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp
35 40 45
Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
50 55
<210> 15
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 白蛋白结合结构域
<400> 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala
1 5 10 15
Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp
20 25 30
Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu
35 40 45
Ala Ala Leu Pro
50
<210> 16
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Fc部分
<400> 16
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 蛋白质标签
<400> 17
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成连接子
<400> 18
Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成连接子
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 20
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成连接子
<400> 20
Ser Asp
1
<210> 21
<211> 453
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 21
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gatttttggt gttctgggat tcatgaggag tctgttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattg agggatttct tcaagagttt 180
aaggcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240
gttgcctata tcattcgcag ccgtgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggagat 300
tgtcctggtc cggttccagg ggtgtggctc gtgggcagag accccaagaa caacctggaa 360
gccttggagg actttgagaa agccgcagga gcccgcggac tcagcacgga gagcatcctc 420
atccccaggc agagcgaaac cagctctcca ggg 453
<210> 22
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 22
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120
ttgctgcgtg aggataagga tccgaggaaa atgacggcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat atgacgtcac ccgggtggag tttggggcta agacatacaa gtaccagatt 240
gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcggtat tgaaagtatg 300
ccgggcatga catcattttt ggtccgtgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccata 360
gtgttcttca agtatgtgta tcagaaccgc gagtattttg agatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc aggctatcga cggc 534
<210> 23
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 23
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gatttttggt gttctgggat tcatgaggag tctgttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattg agggatttct tcaagagttt 180
aaggcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240
gttgcctata tcattcgcag ccgtgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggagat 300
tgtcctggtc cggttccagg ggtgtggctc gtgggcagag accccaagaa caacctggaa 360
gccttggagg actttgagaa agccgcagga gcccgcggac tcagcacgga gagcatcctc 420
atccccaggc agagcgaaac cagctctcca gggagcgacg gtggtggtgg ttctggtggt 480
ggtggatcgc aggactccac ctcagacctg atcccagccc cacctctgag caaggtccct 540
ctgcagcaga acttccagga caaccaattc catgggaaat ggtatgtcgt gggcgaggcc 600
ggaaatcttt tgctgcgtga ggataaggat ccgaggaaaa tgacggcgac catttacgag 660
ttgaaagaag ataaatcata tgacgtcacc cgggtggagt ttggggctaa gacatacaag 720
taccagattg ggacctttgt gccggggagc cagccgggcg agtttacttt aggcggtatt 780
gaaagtatgc cgggcatgac atcatttttg gtccgtgtcg tgagcaccaa ctacaaccag 840
catgccatag tgttcttcaa gtatgtgtat cagaaccgcg agtattttga gatcacactg 900
tacgggcgca cgaaagaact gacaagcgag ctgaaggaaa attttatccg cttttccaaa 960
tctctgggcc tccctgaaaa ccacatcgtc ttccctgtcc caatcgacca ggctatcgac 1020
ggcagcgctt ggtctcaccc gcagttcgaa aaa 1053
<210> 24
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 24
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120
ttgctgcgtg aggataagga tccgaggaaa atgacggcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat atgacgtcac ccgggtggag tttggggcta agacatacaa gtaccagatt 240
gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcggtat tgaaagtatg 300
ccgggcatga catcattttt ggtccgtgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccata 360
gtgttcttca agtatgtgta tcagaaccgc gagtattttg agatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc aggctatcga cggcggcggt 540
ggtggttctg gtggtggtgg atcggcctca gacgaggaga ttcaggatgt gtcagggacg 600
tggtatctga aggccatgac ggtggatttt tggtgttctg ggattcatga ggagtctgtt 660
acgccaatga ctctgactac ccttgaaggc ggcaatctgg aggctaaggt caccatggat 720
attgagggat ttcttcaaga gtttaaggca gtgttagaga agacagatga accgggtaaa 780
tatacggccg atggcggtaa acatgttgcc tatatcattc gcagccgtgt gaaagatcat 840
tacatctttt atagcgaggg agattgtcct ggtccggttc caggggtgtg gctcgtgggc 900
agagacccca agaacaacct ggaagccttg gaggactttg agaaagccgc aggagcccgc 960
ggactcagca cggagagcat cctcatcccc aggcagagcg aaaccagctc tccagggagc 1020
gcttggtctc acccgcagtt cgaaaaa 1047
<210> 25
<211> 1218
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 25
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gatttttggt gttctgggat tcatgaggag tctgttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattg agggatttct tcaagagttt 180
aaggcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240
gttgcctata tcattcgcag ccgtgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggagat 300
tgtcctggtc cggttccagg ggtgtggctc gtgggcagag accccaagaa caacctggaa 360
gccttggagg actttgagaa agccgcagga gcccgcggac tcagcacgga gagcatcctc 420
atccccaggc agagcgaaac cagctctcca gggagcgacg gtggtggtgg ttctggtggt 480
ggtggatcgc aggactccac ctcagacctg atcccagccc cacctctgag caaggtccct 540
ctgcagcaga acttccagga caaccaattc catgggaaat ggtatgtcgt gggcgaggcc 600
ggaaatcttt tgctgcgtga ggataaggat ccgaggaaaa tgacggcgac catttacgag 660
ttgaaagaag ataaatcata tgacgtcacc cgggtggagt ttggggctaa gacatacaag 720
taccagattg ggacctttgt gccggggagc cagccgggcg agtttacttt aggcggtatt 780
gaaagtatgc cgggcatgac atcatttttg gtccgtgtcg tgagcaccaa ctacaaccag 840
catgccatag tgttcttcaa gtatgtgtat cagaaccgcg agtattttga gatcacactg 900
tacgggcgca cgaaagaact gacaagcgag ctgaaggaaa attttatccg cttttccaaa 960
tctctgggcc tccctgaaaa ccacatcgtc ttccctgtcc caatcgacca ggctatcgac 1020
ggcagcgctg gtgccgtcga cgctaactct ctggctgaag ctaaagttct ggctaaccgt 1080
gaactggaca aatacggtgt ttccgactac tacaaaaacc tcatcaacaa cgctaaaacc 1140
gttgaaggtg ttaaagctct gatcgacgaa attctcgcag cactgccgag cgcttggtct 1200
cacccgcagt tcgaaaaa 1218
<210> 26
<211> 1671
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 26
gcaagtgatg aagaaattca ggatgttagc ggcacctggt atctgaaagc aatgaccgtt 60
gatttttggt gcagcggtat tcatgaagaa agcgttaccc cgatgaccct gaccaccctg 120
gaaggtggta atctggaagc aaaagttacc atggatattg agggttttct gcaagaattt 180
aaagccgtgc tggaaaaaac cgatgaaccg ggtaaatata ccgcagatgg tggtaaacat 240
gtggcctata ttatccgtag ccgtgtgaaa gatcactata tcttttatag cgaaggtgat 300
tgtccgggtc cggttccggg tgtttggctg gttggtcgtg atccgaaaaa taacctggaa 360
gcactggaag attttgaaaa agcagccggt gcacgtggtc tgagcaccga aagcattctg 420
attccgcgtc agagcgaaac cagcagtcct ggatccgacg gtggtggtgg ttctggtggt 480
ggtggatcgg cctcagacga ggagattcag gatgtgtcag ggacgtggta tctgaaggcc 540
atgacggtgg atttttggtg ttctgggatt catgaggagt ctgttacgcc aatgactctg 600
actacccttg aaggcggcaa tctggaggct aaggtcacca tggatattga gggatttctt 660
caagagttta aggcagtgtt agagaagaca gatgaaccgg gtaaatatac ggccgatggc 720
ggtaaacatg ttgcctatat cattcgcagc cgtgtgaaag atcattacat cttttatagc 780
gagggagatt gtcctggtcc ggttccaggg gtgtggctcg tgggcagaga ccccaagaac 840
aacctggaag ccttggagga ctttgagaaa gccgcaggag cccgcggact cagcacggag 900
agcatcctca tccccaggca gagcgaaacc agctctccag ggagcgacgg cggaggtggc 960
tcaggaggtg gcggatccca ggactccacc tcagacctga tcccagcccc acctctgagc 1020
aaggtccctc tgcagcagaa cttccaggac aaccaattcc atgggaaatg gtatgtcgtg 1080
ggcgaggccg gaaatctttt gctgcgtgag gataaggatc cgaggaaaat gacggcgacc 1140
atttacgagt tgaaagaaga taaatcatat gacgtcaccc gggtggagtt tggggctaag 1200
acatacaagt accagattgg gacctttgtg ccggggagcc agccgggcga gtttacttta 1260
ggcggtattg aaagtatgcc gggcatgaca tcatttttgg tccgtgtcgt gagcaccaac 1320
tacaaccagc atgccatagt gttcttcaag tatgtgtatc agaaccgcga gtattttgag 1380
atcacactgt acgggcgcac gaaagaactg acaagcgagc tgaaggaaaa ttttatccgc 1440
ttttccaaat ctctgggcct ccctgaaaac cacatcgtct tccctgtccc aatcgaccag 1500
gctatcgacg gcagcggcgg cggcggctct ctggctgaag ctaaagaagc ggctaacgcg 1560
gaactggact cttacggtgt ttccgacttt tacaaacgtc tcatcgataa agctaaaacc 1620
gttgaaggtg ttgaagctct gaaagacgcg attctcgcag cactgccgaa a 1671
<210> 27
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 27
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120
ttgctgcgtg aggataagga tccgaggaaa atgacggcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat atgacgtcac ccgggtggag tttggggcta agacatacaa gtaccagatt 240
gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcggtat tgaaagtatg 300
ccgggcatga catcattttt ggtccgtgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccata 360
gtgttcttca agtatgtgta tcagaaccgc gagtattttg agatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc aggctatcga cggcagcggc 540
ggcggcggct ctctggctga agctaaagaa gcggctaacg cggaactgga ctcttacggt 600
gtttccgact tttacaaacg tctcatcgat aaagctaaaa ccgttgaagg tgttgaagct 660
ctgaaagacg cgattctcgc agcactgccg agcgcttggt ctcacccgca gttcgaaaaa 720
<210> 28
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 28
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gatttttggt gttctgggat tcatgaggag tctgttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattg agggatttct tcaagagttt 180
aaggcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240
gttgcctata tcattcgcag ccgtgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggagat 300
tgtcctggtc cggttccagg ggtgtggctc gtgggcagag accccaagaa caacctggaa 360
gccttggagg actttgagaa agccgcagga gcccgcggac tcagcacgga gagcatcctc 420
atccccaggc agagcgaaac cagctctcca gggagcgata gcggcggcgg cggctctctg 480
gctgaagcta aagaagcggc taacgcggaa ctggactctt acggtgtttc cgacttttac 540
aaacgtctca tcgataaagc taaaaccgtt gaaggtgttg aagctctgaa agacgcgatt 600
ctcgcagcac tgccgagcgc ttggtctcac ccgcagttcg aaaaa 645
<210> 29
<211> 1209
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 29
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gatttttggt gttctgggat tcatgaggag tctgttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattg agggatttct tcaagagttt 180
aaggcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240
gttgcctata tcattcgcag ccgtgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggagat 300
tgtcctggtc cggttccagg ggtgtggctc gtgggcagag accccaagaa caacctggaa 360
gccttggagg actttgagaa agccgcagga gcccgcggac tcagcacgga gagcatcctc 420
atccccaggc agagcgaaac cagctctcca gggagcgacg gcggaggtgg ctcaggaggt 480
ggcggatccc aggactccac ctcagacctg atcccagccc cacctctgag caaggtccct 540
ctgcagcaga acttccagga caaccaattc catgggaaat ggtatgtcgt gggcgaggcc 600
ggaaatcttt tgctgcgtga ggataaggat ccgaggaaaa tgacggcgac catttacgag 660
ttgaaagaag ataaatcata tgacgtcacc cgggtggagt ttggggctaa gacatacaag 720
taccagattg ggacctttgt gccggggagc cagccgggcg agtttacttt aggcggtatt 780
gaaagtatgc cgggcatgac atcatttttg gtccgtgtcg tgagcaccaa ctacaaccag 840
catgccatag tgttcttcaa gtatgtgtat cagaaccgcg agtattttga gatcacactg 900
tacgggcgca cgaaagaact gacaagcgag ctgaaggaaa attttatccg cttttccaaa 960
tctctgggcc tccctgaaaa ccacatcgtc ttccctgtcc caatcgacca ggctatcgac 1020
ggcagcggcg gcggcggctc tctggctgaa gctaaagaag cggctaacgc ggaactggac 1080
tcttacggtg tttccgactt ttacaaacgt ctcatcgata aagctaaaac cgttgaaggt 1140
gttgaagctc tgaaagacgc gattctcgca gcactgccga gcgcttggtc tcacccgcag 1200
ttcgaaaaa 1209
<210> 30
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 30
gcaagtgatg aagaaattca ggatgttagc ggcacctggt atctgaaagc aatgaccgtt 60
gatttttggt gcagcggtat tcatgaagaa agcgttaccc cgatgaccct gaccaccctg 120
gaaggtggta atctggaagc aaaagttacc atggatattg agggttttct gcaagaattt 180
aaagccgtgc tggaaaaaac cgatgaaccg ggtaaatata ccgcagatgg tggtaaacat 240
gtggcctata ttatccgtag ccgtgtgaaa gatcactata tcttttatag cgaaggtgat 300
tgtccgggtc cggttccggg tgtttggctg gttggtcgtg atccgaaaaa taacctggaa 360
gcactggaag attttgaaaa agcagccggt gcacgtggtc tgagcaccga aagcattctg 420
attccgcgtc agagcgaaac cagcagtcct ggatccgacg gtggtggtgg ttctggtggt 480
ggtggatcgg cctcagacga ggagattcag gatgtgtcag ggacgtggta tctgaaggcc 540
atgacggtgg atttttggtg ttctgggatt catgaggagt ctgttacgcc aatgactctg 600
actacccttg aaggcggcaa tctggaggct aaggtcacca tggatattga gggatttctt 660
caagagttta aggcagtgtt agagaagaca gatgaaccgg gtaaatatac ggccgatggc 720
ggtaaacatg ttgcctatat cattcgcagc cgtgtgaaag atcattacat cttttatagc 780
gagggagatt gtcctggtcc ggttccaggg gtgtggctcg tgggcagaga ccccaagaac 840
aacctggaag ccttggagga ctttgagaaa gccgcaggag cccgcggact cagcacggag 900
agcatcctca tccccaggca gagcgaaacc agctctccag ggagcgatag cggcggcggc 960
ggctctctgg ctgaagctaa agaagcggct aacgcggaac tggactctta cggtgtttcc 1020
gacttttaca aacgtctcat cgataaagct aaaaccgttg aaggtgttga agctctgaaa 1080
gacgcgattc tcgcagcact gccgagcgct tggtctcacc cgcagttcga aaaa 1134
<210> 31
<211> 1173
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 31
gacaaaaccc acacctgccc accttgtcct gcccctgaac tgctgggagg accttctgtg 60
tttctgttcc caccaaaacc aaaagatacc ctgatgatct ctagaacccc tgaggtgaca 120
tgtgtggtgg tggatgtgtc tcatgaggac cctgaggtca aattcaactg gtacgtggat 180
ggagtggaag tccacaatgc caaaaccaag cctagagagg aacagtacaa ttcaacctac 240
agagtggtca gtgtgctgac tgtgctgcat caggattggc tgaatggcaa ggaatacaag 300
tgtaaagtct caaacaaggc cctgcctgct ccaattgaga aaacaatctc aaaggccaag 360
ggacagccta gggaacccca ggtctacacc ctgccacctt caagagagga aatgaccaaa 420
aaccaggtgt ccctgacatg cctggtcaaa ggcttctacc cttctgacat tgctgtggag 480
tgggagtcaa atggacagcc tgagaacaac tacaaaacaa ccccccctgt gctggattct 540
gatggctctt tctttctgta ctccaaactg actgtggaca agtctagatg gcagcagggg 600
aatgtctttt cttgctctgt catgcatgag gctctgcata accactacac tcagaaatcc 660
ctgtctctgt ctcctggcaa aggcggcgga ggatccggcg gaggaggtag cgcatcagac 720
gaggaaatcc aggacgtgtc agggacctgg tacctgaaag ccatgaccgt ggatttttgg 780
tgctccggca tccatgagga gtcagtcact cccatgaccc tgacaaccct agaaggtggg 840
aatctggagg ccaaagtgac aatggatatt gagggctttc tccaggagtt caaagccgtc 900
ctcgagaaga cagacgagcc tggaaagtat actgctgatg ggggaaaaca cgtagcctat 960
atcattcgat ctcgggtgaa ggatcattat atcttctatt ccgagggcga ctgccccggc 1020
cctgtgccag gtgtctggct agttgggagg gaccccaaga acaatctcga ggctctggag 1080
gacttcgaga aggcagctgg tgccagggga ttgagcactg agtctatcct tatcccacgc 1140
cagagcgaga cctcaagccc agggtccgac tga 1173
<210> 32
<211> 1659
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 32
gcatcagacg aggaaatcca ggacgtgtca gggacctggt acctgaaagc catgaccgtg 60
gatttttggt gctccggcat ccatgaggag tcagtcactc ccatgaccct gacaacccta 120
gaaggtggga atctggaggc caaagtgaca atggatattg agggctttct ccaggagttc 180
aaagccgtcc tcgagaagac agacgagcct ggaaagtata ctgctgatgg gggaaaacac 240
gtagcctata tcattcgatc tcgggtgaag gatcattata tcttctattc cgagggcgac 300
tgccccggcc ctgtgccagg tgtctggcta gttgggaggg accccaagaa caatctcgag 360
gctctggagg acttcgagaa ggcagctggt gccaggggat tgagcactga gtctatcctt 420
atcccacgcc agagcgagac ctcaagccca gggtccgacg gcggtggagg atccggtgga 480
ggcggttctg acaaaaccca cacctgccca ccttgtcctg cccctgaact gctgggagga 540
ccttctgtgt ttctgttccc accaaaacca aaagataccc tgatgatctc tagaacccct 600
gaggtgacat gtgtggtggt ggatgtgtct catgaggacc ctgaggtcaa attcaactgg 660
tacgtggatg gagtggaagt ccacaatgcc aaaaccaagc ctagagagga acagtacaat 720
tcaacctaca gagtggtcag tgtgctgact gtgctgcatc aggattggct gaatggcaag 780
gaatacaagt gtaaagtctc aaacaaggcc ctgcctgctc caattgagaa aacaatctca 840
aaggccaagg gacagcctag ggaaccccag gtctacaccc tgccaccttc aagagaggaa 900
atgaccaaaa accaggtgtc cctgacatgc ctggtcaaag gcttctaccc ttctgacatt 960
gctgtggagt gggagtcaaa tggacagcct gagaacaact acaaaacaac cccccctgtg 1020
ctggattctg atggctcttt ctttctgtac tccaaactga ctgtggacaa gtctagatgg 1080
cagcagggga atgtcttttc ttgctctgtc atgcatgagg ctctgcataa ccactacact 1140
cagaaatccc tgtctctgtc tcccgggaaa gggggtgggg gatccggcgg aggaggtagc 1200
gcatcagacg aggaaatcca ggacgtgtca gggacctggt acctgaaagc catgaccgtg 1260
gatttttggt gctccggcat ccatgaggag tcagtcactc ccatgaccct gacaacccta 1320
gaaggtggga atctggaggc caaagtgaca atggatattg agggctttct ccaggagttc 1380
aaagccgtcc tcgagaagac agacgagcct ggaaagtata ctgctgatgg gggaaaacac 1440
gtagcctata tcattcgatc tcgggtgaag gatcattata tcttctattc cgagggcgac 1500
tgccccggcc ctgtgccagg tgtctggcta gttgggaggg accccaagaa caatctcgag 1560
gctctggagg acttcgagaa ggcagctggt gccaggggat tgagcactga gtctatcctt 1620
atcccacgcc agagcgagac ctcaagccca gggtccgac 1659
<210> 33
<211> 1659
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 33
gacaaaaccc acacctgccc accttgtcct gcccctgaac tgctgggagg accttctgtg 60
tttctgttcc caccaaaacc aaaagatacc ctgatgatct ctagaacccc tgaggtgaca 120
tgtgtggtgg tggatgtgtc tcatgaggac cctgaggtca aattcaactg gtacgtggat 180
ggagtggaag tccacaatgc caaaaccaag cctagagagg aacagtacaa ttcaacctac 240
agagtggtca gtgtgctgac tgtgctgcat caggattggc tgaatggcaa ggaatacaag 300
tgtaaagtct caaacaaggc cctgcctgct ccaattgaga aaacaatctc aaaggccaag 360
ggacagccta gggaacccca ggtctacacc ctgccacctt caagagagga aatgaccaaa 420
aaccaggtgt ccctgacatg cctggtcaaa ggcttctacc cttctgacat tgctgtggag 480
tgggagtcaa atggacagcc tgagaacaac tacaaaacaa ccccccctgt gctggattct 540
gatggctctt tctttctgta ctccaaactg actgtggaca agtctagatg gcagcagggg 600
aatgtctttt cttgctctgt catgcatgag gctctgcata accactacac tcagaaatcc 660
ctgtctctgt ctcctggcaa aggcggcgga ggatccggcg gaggaggtag cgcatcagac 720
gaggaaatcc aggacgtgtc agggacctgg tacctgaaag ccatgaccgt ggatttttgg 780
tgctccggca tccatgagga gtcagtcact cccatgaccc tgacaaccct agaaggtggg 840
aatctggagg ccaaagtgac aatggatatt gagggctttc tccaggagtt caaagccgtc 900
ctcgagaaga cagacgagcc tggaaagtat actgctgatg ggggaaaaca cgtagcctat 960
atcattcgat ctcgggtgaa ggatcattat atcttctatt ccgagggcga ctgccccggc 1020
cctgtgccag gtgtctggct agttgggagg gaccccaaga acaatctcga ggctctggag 1080
gacttcgaga aggcagctgg tgccagggga ttgagcactg agtctatcct tatcccacgc 1140
cagagcgaga cctcaagccc agggtccgac ggcggcggtg ggtccggcgg cggtggctcc 1200
gcgtccgatg aagaaatcca ggatgtgagc ggcacctggt atctgaaagc aatgaccgtt 1260
gacttctggt gctccggcat ccatgaagaa agcgtgaccc caatgacctt gaccacgctg 1320
gaaggcggta atttagaagc caaagtaact atggatatcg aaggcttcct gcaggaattt 1380
aaagcggtgc tggaaaaaac tgatgagcca ggtaaataca ccgccgacgg tggcaaacac 1440
gtggcctata ttatccgttc tcgtgtcaaa gaccattata tcttctactc tgaaggcgat 1500
tgccccggtc cggttccggg cgtctggctt gtcggtcgtg acccgaaaaa caacctggaa 1560
gcactcgaag acttcgaaaa agcggcaggc gcgcgtggtc tgtctaccga gagcatcctt 1620
atcccacgtc agagcgaaac ctccagccct ggttccgat 1659
<210> 34
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 白蛋白结合结构域
<400> 34
agcgctggtg ccgtcgacgc taactctctg gctgaagcta aagttctggc taaccgtgaa 60
ctggacaaat acggtgtttc cgactactac aaaaacctca tcaacaacgc taaaaccgtt 120
gaaggtgtta aagctctgat cgacgaaatt ctcgcagcac tgccg 165
<210> 35
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 白蛋白结合结构域
<400> 35
agcggcggcg gcggctctct ggctgaagct aaagaagcgg ctaacgcgga actggactct 60
tacggtgttt ccgactttta caaacgtctc atcgataaag ctaaaaccgt tgaaggtgtt 120
gaagctctga aagacgcgat tctcgcagca ctgccg 156
<210> 36
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Fc部分
<400> 36
gacaaaaccc acacctgccc accttgtcct gcccctgaac tgctgggagg accttctgtg 60
tttctgttcc caccaaaacc aaaagatacc ctgatgatct ctagaacccc tgaggtgaca 120
tgtgtggtgg tggatgtgtc tcatgaggac cctgaggtca aattcaactg gtacgtggat 180
ggagtggaag tccacaatgc caaaaccaag cctagagagg aacagtacaa ttcaacctac 240
agagtggtca gtgtgctgac tgtgctgcat caggattggc tgaatggcaa ggaatacaag 300
tgtaaagtct caaacaaggc cctgcctgct ccaattgaga aaacaatctc aaaggccaag 360
ggacagccta gggaacccca ggtctacacc ctgccacctt caagagagga aatgaccaaa 420
aaccaggtgt ccctgacatg cctggtcaaa ggcttctacc cttctgacat tgctgtggag 480
tgggagtcaa atggacagcc tgagaacaac tacaaaacaa ccccccctgt gctggattct 540
gatggctctt tctttctgta ctccaaactg actgtggaca agtctagatg gcagcagggg 600
aatgtctttt cttgctctgt catgcatgag gctctgcata accactacac tcagaaatcc 660
ctgtctctgt ctcctggcaa g 681
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 蛋白质标签
<400> 37
agcgcttggt ctcacccgca gttcgaaaaa 30
<210> 38
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成连接子
<400> 38
agcgacggtg gtggtggttc tggtggtggt ggatcg 36
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成连接子
<400> 39
ggtggtggtg gttctggtgg tggtggatcg 30
<210> 40
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成连接子
<400> 40
agcgac 6
<210> 41
<211> 158
<212> PRT
<213> 人
<400> 41
His His Leu Leu Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr
1 5 10 15
Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn
20 25 30
Leu Glu Ser Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn
35 40 45
Leu Glu Ala Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val
50 55 60
Lys Ala Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp
65 70 75 80
Gly Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His
85 90 95
Tyr Ile Phe Tyr Cys Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val Arg Gly
100 105 110
Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu
115 120 125
Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile
130 135 140
Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly Ser Asp
145 150 155
<210> 42
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 42
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Phe Trp Cys Ser Gly Ile His Glu Glu Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asp Ile Glu Gly Phe Leu Gln Glu Phe Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Asp Cys Pro Gly Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val Gly
100 105 110
Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala
115 120 125
Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln
130 135 140
Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 43
<211> 178
<212> PRT
<213> 人
<400> 43
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile
65 70 75 80
Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn
85 90 95
Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 44
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 44
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Arg Lys Met Thr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Arg Val Glu Phe Gly Val Lys Thr Tyr Lys Tyr Gln Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gly
85 90 95
Ile Lys Ser Met Pro Gly Met Thr Ser Phe Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Tyr Val Tyr Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Tyr Phe Glu Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Ala Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 45
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 45
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Arg Lys Met Thr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Arg Val Glu Phe Gly Val Lys Thr Arg Lys Tyr Arg Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gly
85 90 95
Ile Lys Ser Met Pro Gly Met Thr Ser Phe Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Tyr Val Tyr Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Tyr Phe Glu Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Ala Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 46
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 46
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Arg Lys Met Thr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Arg Val Glu Phe Gly Val Lys Thr Tyr Lys Tyr Gln Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gly
85 90 95
Ile Lys Ser Met Pro Gly Met Thr Ser Phe Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Tyr Val Tyr Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Tyr Phe Glu Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Ala Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 47
<211> 456
<212> DNA
<213> 人
<400> 47
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacagggagt tccctgagat gaatctggaa tcggtgacac ccatgaccct cacgaccctg 120
gaagggggca acctggaagc caaggtcacc atgctgataa gtggccggtg ccaggaggtg 180
aaggccgtcc tggagaaaac tgacgagccg ggaaaataca cggccgacgg gggcaagcac 240
gtggcataca tcatcaggtc gcacgtgaag gaccactaca tcttttactg tgagggcgag 300
ctgcacggga agccggtccg aggggtgaag ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aacctgctct ccaggg 456
<210> 48
<211> 453
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 48
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gatttttggt gttctgggat tcatgaggag tctgttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattg agggatttct tcaagagttt 180
aaggcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240
gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggagat 300
tgtcctggtc cggttccagg ggtgtggctc gtgggcagag accccaagaa caacctggaa 360
gccttggagg actttgagaa agccgcagga gcccgcggac tcagcacgga gagcatcctc 420
atccccaggc agagcgaaac cagctctcca ggg 453
<210> 49
<211> 534
<212> DNA
<213> 人
<400> 49
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccaggggaag tggtatgtgg taggcctggc agggaatgca 120
attctcagag aagacaaaga cccgcaaaag atgtatgcca ccatctatga gctgaaagaa 180
gacaagagct acaatgtcac ctccgtcctg tttaggaaaa agaagtgtga ctactggatc 240
aggacttttg ttccaggttg ccagcccggc gagttcacgc tgggcaacat taagagttac 300
cctggattaa cgagttacct cgtccgagtg gtgagcacca actacaacca gcatgctatg 360
gtgttcttta agaaagtttc tcaaaacagg gagtacttca agatcaccct ctacgggaga 420
accaaggagc tgacttcgga actaaaggag aacttcatcc gcttctccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534
<210> 50
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 50
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120
ttgctgcgtg aggataagga tccgaggaaa atgacggcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac ccgggtggag tttggggtta agacatacaa gtaccagatt 240
gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcggtat taaaagtatg 300
ccgggcatga catcattttt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agtatgtgta tcagaaccgc gagtattttg agatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc aggctatcga cggc 534
<210> 51
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 51
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgtag taggtgaggc cggaaatctg 120
attctgcgtg aggataagga tccgagaaaa atgactgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat atgacgtcac cagggtggag tttggggtga agacgcgtaa gtaccggatt 240
gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcggtat taaaagtatg 300
ccgggcatga catcattttt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agtacgtgta tcagaaccgc gagtattttg agatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc aggctatcga cggc 534
<210> 52
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 52
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120
ttgctgcgtg aggataagga tccgaggaaa atgacggcga ccatttacga gttgagagaa 180
gataaatcat atgacgtcac ccgggtggag tttggggtta agacatacaa gtaccagatt 240
gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcggtat taaaagtatg 300
ccgggcatga catcattttt ggtccgcgtc gtgagcaccg actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agtatgtgta tcagaaccgc gagtattttg agatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gttgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc aggctatcga cggc 534
<210> 53
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 参考抗体重链
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr Trp
100 105 110
Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
130 135 140
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
195 200 205
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
210 215 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225 230 235 240
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
275 280 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
290 295 300
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
325 330 335
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
340 345 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
355 360 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
420 425 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 54
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 参考抗体轻链
<400> 54
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 55
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 参考抗体重链
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
His Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Glu Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 56
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 参考抗体轻链
<400> 56
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Lys His Ser
20 25 30
Arg Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 57
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 参考抗体重链
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Lys Thr Phe Trp Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Thr Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Asp Gln Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 58
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 参考抗体轻链
<400> 58
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser
20 25 30
Gly Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Gln Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr Tyr Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 59
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 参考抗体重链
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asn Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Tyr Tyr Lys Pro Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 60
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 参考抗体轻链
<400> 60
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Thr Asp Gly
85 90 95
Leu Ser Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
145 150 155 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165 170 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180 185 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195 200 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 61
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 基准抗体重链
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 62
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 基准抗体轻链
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 63
<211> 619
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 融合多肽
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr
465 470 475 480
Leu Lys Ala Met Thr Val Asp Phe Trp Cys Ser Gly Ile His Glu Glu
485 490 495
Ser Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu
500 505 510
Ala Lys Val Thr Met Asp Ile Glu Gly Phe Leu Gln Glu Phe Lys Ala
515 520 525
Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly
530 535 540
Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser Arg Val Lys Asp His Tyr Ile
545 550 555 560
Phe Tyr Ser Glu Gly Asp Cys Pro Gly Pro Val Pro Gly Val Trp Leu
565 570 575
Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu
580 585 590
Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro
595 600 605
Arg Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly Ser Asp
610 615
<210> 64
<211> 644
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 融合多肽
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser
465 470 475 480
Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys
485 490 495
Trp Tyr Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Leu Leu Arg Glu Asp Lys
500 505 510
Asp Pro Arg Lys Met Thr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
515 520 525
Ser Tyr Asp Val Thr Arg Val Glu Phe Gly Ala Lys Thr Tyr Lys Tyr
530 535 540
Gln Ile Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu
545 550 555 560
Gly Gly Ile Glu Ser Met Pro Gly Met Thr Ser Phe Leu Val Arg Val
565 570 575
Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Ile Val Phe Phe Lys Tyr Val
580 585 590
Tyr Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Glu Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys
595 600 605
Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser
610 615 620
Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln
625 630 635 640
Ala Ile Asp Gly
<210> 65
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 基准抗体重链
<400> 65
gaagtgcagc tggtcgaaag tggtggtggt ctggtgcagc ccggtagaag tctgcgtctg 60
tcttgtgccg catctggttt tacattcgac gattacgcaa tgcattgggt gagacaggcc 120
cccggcaagg gactggagtg ggtctccgct atcacctgga acagcgggca tattgactac 180
gcagattccg tggaaggcag gttcacaatc tctcgggaca acgccaagaa tagtctgtat 240
ctgcagatga attcactgag ggccgaggat accgccgtgt actattgcgc taaagtctct 300
tatctgtcta ccgcatcatc tctggattac tggggtcagg gaacactggt cactgtctcc 360
tctgctagca caaagggccc tagtgtgttt cctctggctc cctcttccaa atccacttct 420
ggtggcactg ctgctctggg atgcctggtg aaggattact ttcctgaacc tgtgactgtc 480
tcatggaact ctggtgctct gacttctggt gtccacactt tccctgctgt gctgcagtct 540
agtggactgt actctctgtc atctgtggtc actgtgccct cttcatctct gggaacccag 600
acctacattt gtaatgtgaa ccacaaacca tccaacacta aagtggacaa aaaagtggaa 660
cccaaatcct gtgacaaaac ccacacctgc ccaccttgtc ctgcccctga actgctggga 720
ggaccttctg tgtttctgtt cccaccaaaa ccaaaagata ccctgatgat ctctagaacc 780
cctgaggtga catgtgtggt ggtggatgtg tctcatgagg accctgaggt caaattcaac 840
tggtacgtgg atggagtgga agtccacaat gccaaaacca agcctagaga ggaacagtac 900
aattcaacct acagagtggt cagtgtgctg actgtgctgc atcaggattg gctgaatggc 960
aaggaataca agtgtaaagt ctcaaacaag gccctgcctg ctccaattga gaaaacaatc 1020
tcaaaggcca agggacagcc tagggaaccc caggtctaca ccctgccacc ttcaagagag 1080
gaaatgacca aaaaccaggt gtccctgaca tgcctggtca aaggcttcta cccttctgac 1140
attgctgtgg agtgggagtc aaatggacag cctgagaaca actacaaaac aaccccccct 1200
gtgctggatt ctgatggctc tttctttctg tactccaaac tgactgtgga caagtctaga 1260
tggcagcagg ggaatgtctt ttcttgctct gtcatgcatg aggctctgca taaccactac 1320
actcagaaat ccctgtctct gtctcctggc aaa 1353
<210> 66
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 基准抗体轻链
<400> 66
gacatccaga tgacccagag cccaagttcc ctgagcgcaa gcgtcggaga tcgtgtgact 60
attacctgta gagcaagcca gggcatcaga aactacctgg catggtatca gcagaagccc 120
ggtaaagccc ctaagctgct gatctacgcc gcttccactc tgcagtctgg cgtgccaagc 180
aggttctctg gcagtggatc agggaccgac tttaccctga caatttccag cctgcagccc 240
gaggatgtcg ctacatacta ttgccagcgg tacaatcggg caccttatac attcggtcag 300
gggactaaag tggaaatcaa gagaactgtc gcggcgcctt ctgtgttcat tttcccccca 360
tctgatgaac agctgaaatc tggcactgct tctgtggtct gtctgctgaa caacttctac 420
cctagagagg ccaaagtcca gtggaaagtg gacaatgctc tgcagagtgg gaattcccag 480
gaatctgtca ctgagcagga ctctaaggat agcacatact ccctgtcctc tactctgaca 540
ctgagcaagg ctgattacga gaaacacaaa gtgtacgcct gtgaagtcac acatcagggg 600
ctgtctagtc ctgtgaccaa atccttcaat aggggagagt gc 642
<210> 67
<211> 1857
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合多肽
<400> 67
gaagtgcagc tggtcgaaag tggtggtggt ctggtgcagc ccggtagaag tctgcgtctg 60
tcttgtgccg catctggttt tacattcgac gattacgcaa tgcattgggt gagacaggcc 120
cccggcaagg gactggagtg ggtctccgct atcacctgga acagcgggca tattgactac 180
gcagattccg tggaaggcag gttcacaatc tctcgggaca acgccaagaa tagtctgtat 240
ctgcagatga attcactgag ggccgaggat accgccgtgt actattgcgc taaagtctct 300
tatctgtcta ccgcatcatc tctggattac tggggtcagg gaacactggt cactgtctcc 360
tctgctagca caaagggccc tagtgtgttt cctctggctc cctcttccaa atccacttct 420
ggtggcactg ctgctctggg atgcctggtg aaggattact ttcctgaacc tgtgactgtc 480
tcatggaact ctggtgctct gacttctggt gtccacactt tccctgctgt gctgcagtct 540
agtggactgt actctctgtc atctgtggtc actgtgccct cttcatctct gggaacccag 600
acctacattt gtaatgtgaa ccacaaacca tccaacacta aagtggacaa aaaagtggaa 660
cccaaatcct gtgacaaaac ccacacctgc ccaccttgtc ctgcccctga actgctggga 720
ggaccttctg tgtttctgtt cccaccaaaa ccaaaagata ccctgatgat ctctagaacc 780
cctgaggtga catgtgtggt ggtggatgtg tctcatgagg accctgaggt caaattcaac 840
tggtacgtgg atggagtgga agtccacaat gccaaaacca agcctagaga ggaacagtac 900
aattcaacct acagagtggt cagtgtgctg actgtgctgc atcaggattg gctgaatggc 960
aaggaataca agtgtaaagt ctcaaacaag gccctgcctg ctccaattga gaaaacaatc 1020
tcaaaggcca agggacagcc tagggaaccc caggtctaca ccctgccacc ttcaagagag 1080
gaaatgacca aaaaccaggt gtccctgaca tgcctggtca aaggcttcta cccttctgac 1140
attgctgtgg agtgggagtc aaatggacag cctgagaaca actacaaaac aaccccccct 1200
gtgctggatt ctgatggctc tttctttctg tactccaaac tgactgtgga caagtctaga 1260
tggcagcagg ggaatgtctt ttcttgctct gtcatgcatg aggctctgca taaccactac 1320
actcagaaat ccctgtctct gtctcctggc aaaggcggcg gaggatccgg cggaggaggt 1380
agcggcggag gaggtagcgc atcagacgag gaaatccagg acgtgtcagg gacctggtac 1440
ctgaaagcca tgaccgtgga tttttggtgc tccggcatcc atgaggagtc agtcactccc 1500
atgaccctga caaccctaga aggtgggaat ctggaggcca aagtgacaat ggatattgag 1560
ggctttctcc aggagttcaa agccgtcctc gagaagacag acgagcctgg aaagtatact 1620
gctgatgggg gaaaacacgt agcctatatc attcgatctc gggtgaagga tcattatatc 1680
ttctattccg agggcgactg ccccggccct gtgccaggtg tctggctagt tgggagggac 1740
cccaagaaca atctcgaggc tctggaggac ttcgagaagg cagctggtgc caggggattg 1800
agcactgagt ctatccttat cccacgccag agcgagacct caagcccagg gtccgac 1857
<210> 68
<211> 1932
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合多肽
<400> 68
gaagtgcagc tggtcgaaag tggtggtggt ctggtgcagc ccggtagaag tctgcgtctg 60
tcttgtgccg catctggttt tacattcgac gattacgcaa tgcattgggt gagacaggcc 120
cccggcaagg gactggagtg ggtctccgct atcacctgga acagcgggca tattgactac 180
gcagattccg tggaaggcag gttcacaatc tctcgggaca acgccaagaa tagtctgtat 240
ctgcagatga attcactgag ggccgaggat accgccgtgt actattgcgc taaagtctct 300
tatctgtcta ccgcatcatc tctggattac tggggtcagg gaacactggt cactgtctcc 360
tctgctagca caaagggccc tagtgtgttt cctctggctc cctcttccaa atccacttct 420
ggtggcactg ctgctctggg atgcctggtg aaggattact ttcctgaacc tgtgactgtc 480
tcatggaact ctggtgctct gacttctggt gtccacactt tccctgctgt gctgcagtct 540
agtggactgt actctctgtc atctgtggtc actgtgccct cttcatctct gggaacccag 600
acctacattt gtaatgtgaa ccacaaacca tccaacacta aagtggacaa aaaagtggaa 660
cccaaatcct gtgacaaaac ccacacctgc ccaccttgtc ctgcccctga actgctggga 720
ggaccttctg tgtttctgtt cccaccaaaa ccaaaagata ccctgatgat ctctagaacc 780
cctgaggtga catgtgtggt ggtggatgtg tctcatgagg accctgaggt caaattcaac 840
tggtacgtgg atggagtgga agtccacaat gccaaaacca agcctagaga ggaacagtac 900
aattcaacct acagagtggt cagtgtgctg actgtgctgc atcaggattg gctgaatggc 960
aaggaataca agtgtaaagt ctcaaacaag gccctgcctg ctccaattga gaaaacaatc 1020
tcaaaggcca agggacagcc tagggaaccc caggtctaca ccctgccacc ttcaagagag 1080
gaaatgacca aaaaccaggt gtccctgaca tgcctggtca aaggcttcta cccttctgac 1140
attgctgtgg agtgggagtc aaatggacag cctgagaaca actacaaaac aaccccccct 1200
gtgctggatt ctgatggctc tttctttctg tactccaaac tgactgtgga caagtctaga 1260
tggcagcagg ggaatgtctt ttcttgctct gtcatgcatg aggctctgca taaccactac 1320
actcagaaat ccctgtctct gtctcctggc aaaggcggcg gaggatccgg gggtggggga 1380
agcggcggag gaggtagcca ggattcaacc agcgatctga ttccagcacc gccactgtcg 1440
aaagtgccac tgcaacaaaa ctttcaagat aaccagtttc acggcaagtg gtatgtggtc 1500
ggggaggccg gtaacctgct gctgagggaa gacaaagatc cacggaaaat gaccgccacc 1560
atctacgagc tgaaagagga taagtcctac gacgtgactc gggtggagtt cggcgcaaaa 1620
acctacaagt accagatcgg caccttcgtg cccggctctc agcctggcga gtttaccctg 1680
ggcggcatcg aatctatgcc cggcatgacc agctttctcg tgcgggtggt gtccaccaac 1740
tacaaccagc acgccatcgt gttcttcaaa tacgtgtacc agaaccgcga gtacttcgag 1800
atcaccctgt acggccggac caaagagctg acctccgaac tgaaagagaa cttcatccgg 1860
ttctccaagt ccctgggcct gcccgagaac cacatcgtgt tccccgtgcc tatcgaccag 1920
gccatcgacg gc 1932

Claims (64)

1.一种具有IL-17A结合特异性的多肽，其中，所述多肽包含脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白能够以100 pM或更低的IC50值抑制IL-17A与其受体IL-17RA的结合。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白能够抑制IL-17A与其受体IL-17RA的结合，且其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白具有的平均EC50值至少与包含(i) SEQ ID NO: 53或55作为第一亚单位和(ii) SEQ ID NO: 54或56作为第二亚单位的多肽的平均EC50值一样好或更优。
4.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白与人IL-17A、猕猴IL-17A和绒猴IL-17A交叉反应。
5.前述权利要求中任一项所述的多肽在制备用于检测IL-17A的组合物中的用途，包括：
i. 使所述多肽与样品在合适条件下接触，由此允许在所述多肽与IL-17A或其结构域或片段之间形成复合物，和
ii. 通过合适信号检测所述复合物。
6.权利要求1至4中任一项所述的多肽在制备用于分离IL-17A的组合物中的用途，包括：
i. 使所述多肽与样品在合适条件下接触，由此允许在所述多肽与IL-17A或其结构域或片段之间形成复合物，和
ii. 从所述样品中分离所述复合物。
7.一种包含权利要求1至4中任一项所述的多肽的诊断或分析试剂盒。
8.权利要求1至4中任一项所述的多肽在制备用于检测样品中IL-17A的存在的组合物中的用途。
9.权利要求1至4中任一项所述的多肽在制备用于结合受试者中IL-17A的组合物中的用途。
10.权利要求1至4中任一项所限定的一种或多种多肽在制备用于抑制受试者中IL-17A与其受体结合的组合物中的用途。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白与有机分子缀合。
12.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白与化合物缀合，所述化合物选自酶标记、放射活性标记、着色标记、显色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、细胞抑制剂、毒素、金属复合物、金属和胶体金。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白与荧光标记缀合。
14.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白在其N-末端和/或其C-末端与部分融合，所述部分是蛋白质、蛋白质结构域或肽。
15.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白与延长所述突变蛋白的血清半衰期的部分缀合。
16.根据权利要求15所述的多肽，其中，所述延长所述突变蛋白的血清半衰期的部分选自聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合结构域、白蛋白结合肽和白蛋白结合蛋白。
17.根据权利要求16所述的多肽，其中，所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)或其活化衍生物。
18.一种包含权利要求1至4中任一项所述的多肽的组合物。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含至少一种药学上可接受的佐剂或载体。
20.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含至少一种药学上可接受的稀释剂。
21.一种试剂盒，其在一个或多个容器中单独或以混合物的形式包含权利要求1至4中任一项所述的多肽。
22.一种多肽，所述多肽包含至少两个亚单位，其中一个亚单位包含脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1；
并且其中，另一个亚单位包含具有IL-23p19结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述具有IL-23p19结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2和45-46。
23.根据权利要求22所述的多肽，其中，所述多肽包含如SEQ ID NO: 3-4中任一个所示的氨基酸序列。
24.权利要求22或23所述的多肽在制备用于检测IL-23p19的组合物中的用途，包括：
i. 使所述多肽与怀疑含有IL-23p19的测试样品在合适条件下接触，由此允许在所述多肽与IL-23p19或其结构域或片段之间形成复合物，和
ii. 通过合适信号检测所述复合物。
25.权利要求22或23所述的多肽在制备用于分离IL-23p19的组合物中的用途，包括：
i. 使所述多肽与怀疑含有IL-23p19的测试样品在合适条件下接触，由此允许在所述多肽与IL-23p19或其结构域或片段之间形成复合物，和
ii. 从所述样品中分离所述复合物。
26.一种包含权利要求22或23所述的多肽的诊断或分析试剂盒。
27.权利要求22或23所述的多肽在制备用于检测样品中IL-23p19的存在的组合物中的用途。
28.权利要求22或23所述的多肽在制备用于结合受试者中IL-17A或IL-17A和IL-23p19的组合物中的用途。
29.权利要求22或23所述的多肽在制备用于抑制受试者中IL-17A或IL-17A和IL-23p19与其受体结合的组合物中的用途。
30.一种多肽，所述多肽包含至少两个亚单位，其中所述两个亚单位具有IL-17A结合特异性，并且其中，所述多肽的至少一个亚单位包含脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1。
31.一种多肽，所述多肽包含至少两个亚单位，其中，一个亚单位包含脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1；并且其中，另一个亚单位包含白蛋白结合结构域(ABD)或白蛋白结合肽，所述白蛋白结合结构域(ABD)或白蛋白结合肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15。
32.根据权利要求31所述的多肽，其中，所述多肽包含具有IL-17A结合特异性的再一个亚单位。
33.根据权利要求32所述的多肽，其中，所述再一个亚单位包含权利要求22所限定的具有IL-23p19结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。
34.根据权利要求31所述的多肽，其中，所述多肽还包含具有IL-17A结合特异性的第二亚单位。
35.根据权利要求31所述的多肽，其中，所述多肽能够同时与所有HAS、IL-17A和IL-23p19结合。
36.一种多肽，所述多肽包含至少两个亚单位，其中，一个亚单位包含脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1；并且其中，另一个亚单位为人抗体的Fc部分。
37.根据权利要求36所述的多肽，所述多肽包含如SEQ ID NO: 5-6和8-13中任一个所示的氨基酸序列。
38.一种多肽，所述多肽包含至少两个亚单位，其中，一个亚单位包含脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1；并且其中，另一个亚单位含有TNF-α抑制蛋白，其中所述TNF-α抑制蛋白是SEQ ID NO: 61和62的抗体。
39.根据权利要求38所述的多肽，其中，所述多肽能够结合IL-17A，且其中，所述多肽具有的平均EC50值至少与包含在所述多肽中的脂质运载蛋白突变蛋白的平均EC50值一样好或更优。
40.根据权利要求38所述的多肽，其中，所述多肽能够结合TNF-α，且其中，所述多肽具有的平均EC50值至少与包含在所述多肽中的抗体的平均EC50值一样好或更优。
41.根据权利要求38所述的多肽，其中，所述多肽包含SEQ ID NO: 63和62的氨基酸序列。
42.权利要求22至23和权利要求30至41中任一项所述的多肽或包含这种多肽的组合物在制备用于结合受试者中IL-17A或IL-17A和IL-23p19的组合物中的用途。
43.根据权利要求22至23和权利要求30至41中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包含连接子，所述连接子将一个亚单位与另一个亚单位共价连接。
44.根据权利要求22至23和权利要求30至41中任一项所述的多肽，其中，所述多肽的一个亚单位直接或通过化学连接子与所述多肽的另一个亚单位连接。
45.根据权利要求22至23和权利要求30至41中任一项所述的多肽，其中，所述多肽与有机分子缀合。
46.根据权利要求22至23和权利要求30至41中任一项所述的多肽，其中，所述多肽与化合物缀合，所述化合物选自酶标记、放射活性标记、着色标记、显色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、细胞抑制剂、毒素、金属复合物、金属和胶体金。
47.根据权利要求22至23和权利要求30至41中任一项所述的多肽，其中，所述多肽与荧光标记缀合。
48.根据权利要求22至23和权利要求30至41中任一项所述的多肽，其中，所述多肽与部分融合，所述部分是蛋白质、蛋白质结构域或肽。
49.根据权利要求22至23和权利要求30至41中任一项所述的多肽，其中，所述多肽与延长所述突变蛋白的血清半衰期的部分缀合。
50.根据权利要求49所述的多肽，其中，所述延长所述突变蛋白的血清半衰期的部分选自聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽和白蛋白结合蛋白。
51.权利要求22至23和权利要求30至41中任一项所述的多肽或包含这种多肽的组合物在制备用于抑制受试者中IL-17A或IL-17A和IL-23p19与其相应受体结合的组合物中的用途。
52.权利要求22至23和权利要求30至41中任一项所述的多肽在制备用于与IL-17A或IL-17A和IL-23p19形成复合物的组合物中的用途。
53.权利要求22至23和权利要求30至41中任一项所述的多肽在制备用于检测IL-17A或IL-17A和IL-23p19的组合物中的用途。
54.一种试剂盒，所述试剂盒包含至少一个权利要求22至23和权利要求30至41中任一项所述的多肽。
55.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码权利要求1至4、权利要求11至17、权利要求22至23和权利要求30至41中任一项所述的多肽的核苷酸序列。
56.根据权利要求55所述的核酸分子，其中，所述核酸分子可操作地连接调节序列以允许表达所述核酸分子。
57.根据权利要求55或56所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含在载体或噬菌粒载体中。
58.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求55至57中任一项所述的核酸分子。
59.一种产生权利要求1至4、权利要求11至17、权利要求22至23和权利要求30至41中任一项所述的多肽的方法，其中，通过遗传工程方法从编码所述多肽的核酸开始产生所述多肽。
60.根据权利要求59所述的方法，其中，在细菌或真核宿主生物体中产生所述多肽，并将其从这种宿主生物体或其培养物中分离。
61.多肽在制备用于治疗疾病的组合物中的用途，其中，所述多肽包含脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1，其中，所述疾病选自多发性硬化症、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、幼年特发性关节炎、银屑病、银屑病性疾病、哮喘和系统性红斑狼疮(SLE)。
62.根据权利要求61所述的用途，其中，所述银屑病性疾病是银屑病性关节炎。
63.根据权利要求61所述的用途，其中，所述银屑病是斑块状银屑病。
64.根据权利要求61至63中任一项所述的用途，其中，所述多肽能够抑制IL-17A与其受体的结合。
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