CN106190910A

CN106190910A - 炭疽芽孢杆菌及其在制备s‑利卡西平中的应用

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Publication number: CN106190910A
Application number: CN201610580097.7A
Authority: CN
Inventors: 欧志敏; 徐佳慧; 王莹
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2016-07-19
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2036-07-19
Also published as: CN106190910B

Abstract

本发明公开了一种炭疽芽孢杆菌及其在制备S‑利卡西平中的应用，所述应用以炭疽芽孢杆菌CGMCC NO.12337经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以奥卡西平为底物，以异丙醇为辅助底物，以有机溶剂和水为反应介质构成pH4.0‑7.0的两相反应体系，在25‑35℃、120rmp条件下转化反应，反应完全后，将转化液分离纯化，获得S‑利卡西平；本发明采用的两相体系生物法制备S‑利卡西平，工艺简单，成本低廉，环境友好，反应条件温和。两相体系可以大幅度提高难溶性底物的溶解度，增大底物的转化效率，使转化率提高了32.38％，底物浓度提高了47.8％。

Description

炭疽芽孢杆菌及其在制备S-利卡西平中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种S-利卡西平的制备，特别涉及一种以奥卡西平为原料，采用油-水两相体系作为催化反应的介质，以含有羰基还原酶的炭疽芽孢杆菌CGMCC NO.12337为生物催化剂，转化奥卡西平制备醋酸艾司利卡西平的关键手性中间体S-利卡西平。

(二)背景技术

奥卡西平作为钠离子通道抑制剂可用来治疗局限性及全身性的癫痫发作，S-利卡西平是奥卡西平的主要活性代谢产物，其作用在于阻断脑细胞的电压依赖性钠通道，因而可阻止病灶放电的散布，醋酸艾司利卡西平[S-(-)-10-乙酰氧基10,11-二氢-5H-二苯并[b,f]氮杂-5-甲酰胺]是由Sunovion Pharmaceuticals研究开发的S-利卡西平醋酸酯前药，于2013年11月8日经FDA批准上市，商品名为Aption。与奥卡西平相比，酸酸艾司利卡西平具有更好的耐受性。生物转化法制备S-利卡西平的反应式如下所示：

采用微生物不对称还原奥卡西平制备S-利卡西平，该途径是生物法制备醋酸艾司利卡西平的关键步骤，采用生物转化法合成S-利卡西平符合绿色化学的宗旨，减少化学合成带来的污染，具有专一性高，工艺简单，成本低廉等优点，同时利用微生物细胞中完整的辅酶系统，可以通过添加廉价的辅助底物(葡萄糖或异丙醇等)实现辅酶的再生和循环利用，降低了生产的成本。

采用油-水两相体系作为反应介质能有效地提高奥卡西平在反应体系中的溶解度，采用两相体系的生物转化法可以大幅度提高奥卡西平的转化浓度，达到较好的底物转化效率。

两相体系生物转化法生产S-利卡西平的工艺过程未见专利报导，是一种全新、高效的S-利卡西平的制备方法。

(三)发明内容

本发明目的是提供一株新菌株及制备S-利卡西平的应用，特别提供一种以有机溶剂(邻苯二甲酸二丁酯)-水为反应体系，以催化效率高的炭疽芽孢杆菌CGMCC NO.12337作为生物催化剂不对称还原奥卡西平制备S-利卡西平，可以大幅度提高奥卡西平的转化浓度，达到较好的底物转化效率。

本发明采用的技术方案是：

本发明涉及一株新菌株--炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)jut xjh21922，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2016年4月11日，保藏编号：CGMCC NO.12337，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明还提供一种所述炭疽芽孢杆菌CGMCC NO.12337在制备S-利卡西平中的应用，具体所述应用以炭疽芽孢杆菌CGMCC NO.12337经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以奥卡西平为底物，以有机溶剂和水为反应介质构成pH4.0-7.0的两相反应体系，在25-35℃、120rmp条件下转化反应，反应完全后，将转化液分离纯化，获得S-利卡西平。

进一步，所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体干重计为10～70g/L反应体系(优选50～70g/L)，所述底物终浓度为0.5～5g/L反应体系(优选0.5～2g/L)，所述有机溶剂体积终浓度为22.1～75％(优选50％)，所述有机溶剂与水体积比为0.3～3:1(优选1:1)，所述异丙醇体积终浓度为5～50g/L(优选30g/L)。

进一步，所述有机溶剂为正己烷、正庚烷、十二烷、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二辛酯、乙酸乙酯、1-丁醇或乙酸丁酯中的一种。

进一步，有机溶剂的加入虽然能提高奥卡西平在反应体系中的溶解度，但有机溶剂对含酶菌体有一定的毒性，会使细胞失活，降低酶的催化活性等。有机溶剂的选择既要考虑到能增加奥卡西平的溶解度，又要考虑到其生物相容性和对含酶菌体细胞的毒害。所述有机溶剂优选为邻苯二甲酸二丁酯。

进一步，所述反应体系中还含有辅助底物，所述辅助底物为异丙醇。所述异丙醇体积终浓度为5～50g/L反应体系。

进一步，所述转化反应在30℃、120rmp条件下转化反应8-72h。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：

(1)斜面培养：将炭疽芽孢杆菌CGMCC NO.12337接种到斜面培养基，30℃培养1-2天，得斜面菌体；所述斜面培养基组成：葡萄糖15g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水硫酸镁0.25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，琼脂25g/L，自然pH值，溶剂为水；

(2)种子培养：从斜面培养基中挑取一环菌体转接到种子培养基，30℃，摇床转速为120r/min，培养24h，得种子液；所述种子培养基组成：葡萄糖20g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水硫酸镁0.25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄0.5g/L，自然pH值，溶剂为水；

(3)发酵培养：取种子液，以体积浓度10-20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为30℃，摇床转速为120r/min，培养36h，得到含酶湿菌体的发酵液，离心，获得湿菌体；所述发酵培养基组成：葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，蛋白胨15g/L，无水硫酸镁0.25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄0.5g/L，自然pH值，溶剂为水。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明采用的两相体系生物法制备S-利卡西平与化学合成法相比具有以下优点：①微生物菌体易于大规模培养，可以获得大量的生物催化剂，工艺简单，成本低廉。②菌体制备过程中不需要使用有毒有害的有机试剂，环境友好，反应条件温和。③易于实现大规模工业化生产。④两相体系可以大幅度提高难溶性底物的溶解度，增大底物的转化效率，使转化率提高了32.38％，底物浓度提高了47.80％。⑤由于是全细胞生物转化，因此反应过程中不需要添加价格昂贵的辅酶。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

(1)菌株筛选

本发明所涉及的微生物菌种是通过以下方法筛选得到:

①菌种初筛：取采自浙江工业大学的土样1g加入到装有50ml无菌水的100ml锥形瓶中，摇匀，静置12h，取土壤样品上清液1ml，用涂布棒均匀涂布在初筛固体平板上，置于30℃恒温培养箱中培养2-3天。初筛固体平板配方如下：0.1g/L奥卡西平，3g/L酵母膏，5g/L(NH₄)₂SO₄，0.25g/L MgSO₄，1g/L K₂HPO₄·3H₂O，1g/L KH₂PO₄，20g/L琼脂，自然pH值，溶剂为水；

②菌种复筛：将初筛固体平板上生长的不同的菌落用接种环依次接种到复筛液体培养基中，在30℃，120r/min的恒温摇床中培养24h。将复筛液体培养基中长出的菌体用平板划线法依次接种到固体平板上，在30℃恒温培养箱中培养2-3天。复筛液体培养基配方如下：0.1g/L奥卡西平，3g/L酵母膏，5g/L(NH₄)₂SO₄，0.25g/L MgSO₄，1g/L K₂HPO₄·3H₂O，1g/LKH₂PO₄，自然pH值，溶剂为水；平板培养基配方为：30g/L葡萄糖，3g/L酵母膏，5g/L(NH₄)₂SO₄，0.25g/L MgSO₄，1g/L K₂HPO₄·3H₂O，1g/L KH₂PO₄，20g/L琼脂，自然pH值，溶剂为水。

③斜面培养：从平板中生长的菌落中挑取单菌落进行斜面培养，在30℃恒温培养箱中培养2-3天至出现丰满的菌苔后，置于4℃冰箱保存，备用。斜面培养基配方同平板培养基。

④种子培养：从培养成熟的斜面中挑一环菌体接入装有50ml种子培养基的100ml锥形中，30℃、120rpm培养24小时。种子培养基配方如下：30g/L葡萄糖，3g/L酵母膏，5g/L(NH₄)₂SO₄，0.25g/L MgSO₄，1g/L K₂HPO₄·3H₂O，1g/L KH₂PO₄，自然pH值，溶剂为水。

⑤发酵培养：以体积浓度10％的接种量将种子液转接到装有50ml发酵培养基的100ml锥形瓶中，30℃、120rmp培养24小时。发酵培养基配方同种子培养基。

⑥生物转化反应：将离心得到的菌体1g悬浮于20ml水中，加入0.01g奥卡西平，置于30℃、120rmp摇床中转化48h。转化结束后，离心得到上清液，采用高效液相色谱法分析奥卡西平的转化率和产物S-利卡西平的对映体过剩值。采用这种方法共筛选出对奥卡西平有还原活性的菌株12株，筛选结果如表1所示：

表1：不对称还原奥卡西平菌种的筛选结果

综合反应的转化率和立体选择性两方面，菌株ZJH#2.2(即菌株Zjut xjh21922)是筛选出的最好的菌株，催化奥卡西平不对称还原为S-利卡西平的转化率为67.4％，e.e.为100％。

(2)菌株鉴定：以提取到的菌株ZJH#2.2细胞总DNA为模板，利用引物扩增菌株Zjutxjh21922的16S rDNA基因，再将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳切胶纯化。再经测序确认所述菌株Zjut xjh21922的16S rDNA基因序列如下(SEQ ID NO.1)：

CTATACATGCAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGT

将菌株Zjut xjh21922的16S rDNA序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对(BLAST)，结果表明：菌株Zjut xjh21922与芽孢杆菌属(Bacillus)的部分菌株序列同源性较高。菌株Zjut xjh21922与Bacillusanthracis；S9菌株(NCBI登录号为(AB190221)的序列同源性达到100％。根据分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)Zjut xjh21922，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2016年4月11日，保藏编号：CGMCCNO.12337。

实施例2

(1)斜面培养：将炭疽芽孢杆菌CGMCC NO.12337接种到斜面培养基，30℃培养1-2天，得菌体斜面；所述的斜面培养基组成：葡萄糖15g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水硫酸镁0.25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，琼脂25g/L，自然pH值，溶剂为水；120℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。

(2)种子培养：从斜面培养基中挑取一环炭疽芽孢杆菌CGMCC NO.12337接种到种子培养基，30℃，摇床转速为120r/min培养24h，得种子液；所述种子培养基组成：葡萄糖20g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水硫酸镁0.25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，自然pH值，溶剂为水。

(3)发酵培养：取种子液以体积浓度10％的接种量装有500ml发酵培养基的1000ml锥形瓶中，培养温度为30℃，摇床转速为120r/min培养36h，得到含有菌体细胞的发酵液，离心分离，得到湿菌体14.3g，将离心所得湿菌体置于烘箱中烘干至恒重，得菌体干重8.9g。所述发酵培养基组成：葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，蛋白胨15g/L，无水MgSO₄ 0.25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，自然pH值，溶剂为水。

实施例3

两相体系20ml：称取实施例2方法制备的0.3g(干重)湿菌体置于50ml锥形瓶中，加入10ml无菌水和10ml有机溶剂(见表1)，在30℃，120r/min的摇床中培养24h后离心，得菌体沉淀0.18g，将0.18g菌体沉淀加入10ml含有0.2g葡萄糖的无菌水中培养4h，离心，取上清液1ml用无菌水稀释10倍后采用分光光度计测葡萄糖浓度(葡萄糖浓度的测定采用DNS法)，根据葡萄糖标准曲线计算出溶液中剩余的葡萄糖浓度，并与加入的葡萄糖浓度相比，获得耗糖量。

无菌水体系：将两相体系中有机溶剂替换为10ml无菌水，其它操作相同。

微生物细胞的代谢活力保留值R，其定义为：

R＝(两相体系耗糖量)/(无菌水体系耗糖量)×100％

DNS方法为：

(1)配置DNS溶液：DNS溶液的质量组成如下：3,5-二硝基水杨酸1％，苯酚2％，亚硫酸钠5％，氢氧化钠1％，酒石酸钾钠20％，溶剂为去离子水，按上述比例配置DNS溶液，并将其保存在棕色瓶中闭光稳定一周再使用。

(2)绘制葡萄糖标准曲线：精确配制浓度为0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.4g/L和1.6g/L的标准葡萄糖水溶液，在试管中加1ml标准葡萄糖溶液、3ml DNS溶液，沸水中煮10min，然后冷却至室温加水至25ml。以水为空白，测550nm处的吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线(y＝0.5486x-0.0024)。

细胞的代谢活力保留值R越大，说明该溶剂对微生物细胞的毒性越小，其生物相容性越好。结果表明，对细胞毒性较小的有机溶剂为十二烷、正己烷、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二辛酯。

表2：不同有机溶剂对细胞的毒性

溶剂	R％
		正己烷	96.3
正庚烷	71.6
		十二烷	104.2
邻苯二甲酸二乙酯	59.2
		邻苯二甲酸二丁酯	90.5
邻苯二甲酸二辛酯	98.1
		乙酸乙酯	5.6
1-丁醇	6.8
		乙酸丁酯	21.8

实施例4：

在6只50ml的锥形瓶中分别加入实施例2方法制备的0.5g(干重)湿菌体，加入底物奥卡西平0.5g/L(0.01g)，分别加入10ml有机溶剂(邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、乙酸丁酯、正己烷和正庚烷)以及10ml去离子水构成两相反应体系20ml。30℃、120rpm摇床中反应48h，反应结束后将反应液离心，获得分层的有机相和水相。将水相用乙酸乙酯萃取三次，用高效液相色谱测定水相中底物的摩尔转化率和S-利卡西平的对映体过剩值，用高效液相色谱直接测定有机相中底物的摩尔转化率和S-利卡西平的对映体过剩值。结果表明采用邻苯二甲酸二丁酯为有机溶剂时的转化率和S-利卡西平的对映体过剩值最高。选择邻苯二甲酸二丁酯-水两相体系最为最佳反应体系进一步研究。

采用岛津1100系列的液相色谱仪中进行检测，以C₁₈作为分析柱，以乙腈/0.1％乙醇水(40：60，v/v)作为流动相，检测波长210nm，流速1.0ml/min，计算出反应的摩尔转化率。采用手性柱OD-H作为分析柱，以含有0.05％三氟乙酸的正己烷/乙醇(75:25，v/v)为流动相，检测波长为215nm，流动相流速为0.8ml/min，柱温25℃。

表3：不同有机溶剂对转化率和S-利卡西平的对映体过剩值的影响

实施例5：

在6只50ml的锥形瓶中分别加入实施例2方法制备的0.5g(干重)湿菌体，加入底物奥卡西平0.01g，分别加入3ml、5ml、10ml、15ml、20ml、30ml的邻苯二甲酸二丁酯和10ml的去离子水，使得邻苯二甲酸二丁酯和水的体积比分别为：3:10，5:10，10:10，15:10，20:10，30:10。30℃、120rpm摇床中反应48h，反应结束后将反应液离心，获得分层的有机相和水相。将水相用乙酸乙酯萃取三次，用高效液相色谱测定水相和有机相中底物的摩尔转化率和S-利卡西平的对映体过剩值。当V_有机：V_水为1:1时，S-利卡西平的对映体过剩值为100％，因此选择V_有机：V_水为1:1进行后续的研究。

表4：不同相体积比对转化率和S-利卡西平的对映体过剩值的影响

实施例6：

在6只盛有10ml邻苯二甲酸二丁酯和10ml去离子水的50ml的锥形瓶中，分别加入实施例2方法制备的1g(干重)湿菌体，加入奥卡西平1g/L(0.02g)，加入辅助底物异丙醇的量分别为0g/L(0g)，5g/L(0.1)，10g/L(0.2g)，20g/L(0.4g)，30g/L(0.6g)，40g/L(0.8g)和50g/L(1.0g)，构成两相反应体系20ml，置于30℃，120r/min的摇床中反应48h，反应结束后将反应液离心，获得分层的有机相和水相。将水相用乙酸乙酯萃取三次，用高效液相色谱测定水相和有机相中底物的摩尔转化率和S-利卡西平的对映体过剩值。结果表明，30g/L异丙醇为最佳辅助底物。异丙醇的添加有助于辅酶的原位再生，提高反应的转化率。

表5：添加异丙醇对转化率及S-利卡西平对映体过剩值的影响

异丙醇(g/L)	转化率(％)	S-利卡西平的对映体过剩值(％)
			0	62.33	100
5	76.49	100
			10	78.89	100
20	89.6	100
			30	99.78	100
40	60.87	100
			50	62.45	100

实施例7：

在6只分别盛有10ml邻苯二甲酸二丁酯和10ml去离子水的50ml锥形瓶中，分别加入实施例2方法制备的1g(干重)湿菌体，分别加入奥卡西平使其浓度分别为0.5g/L(0.01g)，1g/L(0.02g)，2g/L(0.04g)，3g/L(0.06g)，4g/L(0.08g)和5g/L(0.1g)，加入30g/L(0.6g)的异丙醇作为辅助底物，构成两相反应体系20ml。置于30℃，120r/min的摇床中反应48h，反应结束后，将反应液离心，获得分层的有机相和水相。将水相用乙酸乙酯萃取三次，用高效液相色谱测定水相和有机相中底物的摩尔转化率和S-利卡西平的对映体过剩值。结果表明，随着底物浓度的加大，反应转化率逐渐降低，可能底物浓度提高会抑制炭疽杆菌CGMCC No.12337的酶活性，导致转化率随着底物浓度的升高而降低。

表6：底物初始浓度对转化率及S-利卡西平对映体过剩值的影响

底物浓度(g/L)	转化率(％)	S-利卡西平的对映体过剩值(％)
			0.5	99.80	100
1	99.78	100
			2	97.89	100
3	78.34	100
			4	60.88	100
5	51.30	100

实施例8:

在6只分别盛有10ml邻苯二甲酸二丁酯和10ml去离子水的50ml锥形瓶中分别加入实施例2方法制备的0.2g，0.5g，0.8g，1.0g，1.2g，和1.4g(干重)湿菌体，加入奥卡西平的浓度为1g/L(0.02g)，加入30g/L(0.6g)的异丙醇作为辅助底物，构成两相反应体系20ml。置于30℃，120r/min的摇床中反应48h，反应结束后，将反应液离心，获得分层的有机相和水相。将水相用乙酸乙酯萃取三次，用高效液相色谱测定水相和有机相中底物的摩尔转化率和S-利卡西平的对映体过剩值。结果表明，随着菌体用量的加大，转化率逐渐提高。菌体用量加大，可以进一步提高氧化还原酶和辅酶的用量，有助于提高转化率。

表7：菌体量对转化率及S-利卡西平对映体过剩值的影响

菌体量(g)	转化率(％)	S-利卡西平的对映体过剩值(％)
			0.2	24.32	100
0.5	57.34	100
			0.8	69.51	100
1.0	99.78	100
			1.2	99.90	100
1.4	99.92	100

实施例9：

在6只分别盛有10ml邻苯二甲酸二丁酯和10ml去离子水的50ml锥形瓶中，分别加入实施例2方法制备的1.0g(干重)湿菌体，加入奥卡西平的浓度为1g/L(0.02g)，加入30g/L(0.6g)的异丙醇作为辅助底物，构成两相反应体系20ml。置于30℃，120r/min的摇床中分别反应8h，24h，36h，48h，54h，72h，反应结束后，将反应液离心，获得分层的有机相和水相。将水相用乙酸乙酯萃取三次，用高效液相色谱测定水相和有机相中底物的摩尔转化率和S-利卡西平的对映体过剩值。结果表明，随着反应时间的延长，反应转化率逐渐提高。当反应时间达到48h时，转化率达到99.9％。当反应时间继续延长，转化率出现了下降，说明产物S-利卡西平可能被微生物继续转化。48h是制备S-利卡西平较为合适的反应时间。

表8:反应时间对转化率及S-利卡西平对映体过剩值的影响

反应时间(h)	转化率(％)	S-利卡西平的对映体过剩值(％)
			8	38.56	100
24	54.90	100
			36	82.89	100
48	99.78	100
			54	97.32	100
72	92.76	100

Claims

1.炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)Zjut xjh21922，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2016年4月11日，保藏编号：CGMCC NO.12337，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

2.一种权利要求1所述炭疽芽孢杆菌CGMCC NO.12337在制备S-利卡西平中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用以炭疽芽孢杆菌CGMCC NO.12337经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以奥卡西平为底物，以有机溶剂和水为反应介质构成pH4.0-7.0的两相反应体系，在25-35℃、120rmp条件下转化反应，反应完全后，将转化液分离纯化，获得S-利卡西平。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体干重计为10～70g/L反应体系，所述底物终浓度为0.5～5g/L反应体系，所述有机溶剂体积终浓度为22.1～75％，所述有机溶剂与水体积比为0.3～3:1。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述有机溶剂为正己烷、正庚烷、十二烷、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二辛酯、乙酸乙酯、1-丁醇或乙酸丁酯中的一种。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述有机溶剂为邻苯二甲酸二丁酯。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应体系中还含有辅助底物，所述辅助底物为异丙醇。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述异丙醇体积终浓度为5～50g/L反应体系。

9.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化反应在30℃、120rmp条件下转化反应8-72h。

10.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：

(1)斜面培养：将炭疽芽孢杆菌CGMCC NO.12337接种到斜面培养基，30℃培养1-2天得斜面菌体；所述斜面培养基组成：葡萄糖15g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水硫酸镁0.25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，琼脂25g/L，自然pH值，溶剂为水；

(2)种子培养：从斜面培养基中挑取一环菌体转接到种子培养基，30℃，摇床转速为120r/min，培养24h，得种子液；所述种子培养基组成：葡萄糖20g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水硫酸镁0.25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，自然pH值，溶剂为水；

(3)发酵培养：取种子液，以体积浓度10-20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为30℃，摇床转速为120r/min，培养36h，得到含酶湿菌体的发酵液，离心，获得湿菌体；所述发酵培养基组成：葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，蛋白胨15g/L，无水硫酸镁0.25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，自然pH值，溶剂为水。