CN106047934B

CN106047934B - 一种多编码框、非整合型慢病毒载体的构建和应用

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Publication number: CN106047934B
Application number: CN201610651245.XA
Authority: CN
Inventors: 李因传
Original assignee: Individual
Current assignee: Guangzhou Xiling Biotechnology Co ltd
Priority date: 2016-08-09
Filing date: 2016-08-09
Publication date: 2020-04-07
Anticipated expiration: 2036-08-09
Also published as: CN106047934A

Abstract

本发明“一种多编码框、非整合型慢病毒载体的构建和应用”，涉及基因/细胞治疗技术领域，所述慢病毒载体从上游到下游依次包含5’‑LTR序列、启动子序列、多克隆位点1、一个或者多个IRES、多克隆位点2和3’‑LTR序列；还包括病毒包装信号序列，用于增强入核；所述多克隆位点1和多克隆位点2用于装载目的外源表达基因。实验表明，在该慢病毒载体基础上可有效构建用于实体瘤、血液瘤、自身免疫性疾病、干细胞治疗、病毒性疾病和遗传性疾病的细胞免疫治疗载体。

Description

一种多编码框、非整合型慢病毒载体的构建和应用

技术领域

本发明涉及基因治疗和细胞治疗领域，特别是涉及一种多靶点非整合型的慢病毒载体及其在构建针对各种实体瘤和血液瘤、自身免疫性疾病、干细胞治疗、病毒性疾病和遗传性疾病的免疫治疗载体中的应用。

背景技术

病毒介导的基因导入技术是目前细胞治疗和基因靶向操作的关键工具技术，具有效率高和稳定整合表达所载入的基因的优点。

目前国际上主要开发了腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒等载体系统，其中腺病毒系统不能有效整合基因组，仅用于瞬时表达，逆转录病毒虽然感染和整合效率高，但风险性相对较高，腺相关病毒以免疫原性较低，定点整合的安全性优点，被视为基因治疗的理想工具，但是存在感染效率相对较低，载体容量有限的缺点，而慢病毒系统具有很强的感染能力，较大的载体容量，备受瞩目。但与逆转录病毒类似，存在较高的随机整合基因组的缺点，对基因组的随机整合对附近的基因的表达可能会造成干扰，对插入点的基因造成突变威胁，虽然有些以慢病毒为载体的治疗产品已经被FDA批准上市，在临床应用中尚存在一定的争议。为克服慢病毒的上述缺点，开发更加安全有效的病毒载体产品，是精准治疗的一个发展方向。

目前在该领域内，人们发现了一种叫做脚手架/基质附着区的DNA序列(S/MAR)较广泛的分布于基因组的某些位置，对基因的表达起着一定的调控作用，相当部分S/MAR能够增强基因的表达作用，最近人们发现某些S/MAR序列还能够使外源基因附着于细胞核的基质中，而不是插入基因组中，而且能够稳定随着细胞的分裂而传代，因此使用特定的S/MAR序列构建一些工具性载体，成为当前该领域内的一个热点。有必要尝试构建该类载体用于基因的细胞导入。而对于慢病毒的关键参与基因组整合的酶进行位点突变，可以进一步消除这些酶参与载体导入基因对基因组整合的可能性。

由于慢病毒一般使用5’-LTR作为基因的启动序列信号，3’-LTR作为终止序列信号，多靶点基因的装载一般需要在内部整合一个或者多个增强和启动子元件，这需要对5’-LTR和3’-LTR进行改造，以消除对内部启动元件的抑制作用，另外使用核糖体内部结合位点序列，可以减少内部启动子元件的使用数量，增加载体装载的有效容量。另外病毒细胞核的运输也需要增加一些特殊元件以增加其入核效率。

目前CAR-T细胞技术和基因的靶向修饰技术，均依赖于病毒介导的基因元件的细胞导入。

为了抑制CD47，可以使用分泌性的单链抗体分子或者可溶性的SIRPa胞外区的CD47结合结构域。为了使其分泌到胞外，需要添加分泌性的信号肽。另外，CAR主要使用了癌胚抗原CEA的鼠源scFV抗体链，并作了人源化修饰，该抗原是一个糖蛋白，较广泛分布于结肠癌、胰腺癌、直肠癌、胃癌、肺癌、胆道癌、乳腺癌和膀胱癌等；抗mucin1和mucin5a的鼠源抗体的scFV序列也作了人源化修饰和改造，该抗体所识别的肿瘤主要为胰腺癌、粘液性膀胱囊腺瘤、胰腺内粘液瘤和导管内乳头状黏液瘤。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)在肿瘤治疗中的应用，近年受到广泛重视，有望成为肿瘤治疗的第4类有效工具。但是由于肿瘤存在不断变异的特点，导致肿瘤细胞在生长过程中出现异质性的群体，导致常规的单靶点CAR-T治疗所存在的局限性。多靶点CAR-T正好适合该治疗需求，为达到这个目的，可以采用多个CAR-T混合或者多个CAR元件同时转入T细胞中，设计一个多编码框病毒，有利于该设计思想的实现。

有鉴于此，需要设计一种非整合型的慢病毒载体，同时兼具非整合基因组的优点和多编码框表达的特点，而且由该载体衍生的多个靶向载体能够同时针对巨噬细胞的免疫抑制作用和抗肿瘤靶点的CAR，达到既能抑制免疫抑制的功能兼具杀伤肿瘤细胞的优点。

发明内容

基于上述领域的空白和需求，本发明整合多种因素，构建一种既高效包装、高效转染、高效导入细胞核，又能防止病毒DNA序列整合入基因组之中，避免或者减少对正常基因的干扰和/或突变作用的载体。本发明提供的技术方案如下：

一种多阅读框基因组非整合型表达的慢病毒载体，其特征在于：所述慢病毒载体从上游到下游依次含5’-LTR序列、启动子序列、多克隆位点1、一个或者多个IRES元件、多克隆位点2和3’-LTR序列；

还包括病毒包装信号序列，用于增强入核；

所述多克隆位点1和多克隆位点2用于装载目的外源表达基因。

本发明的慢病毒载体使用一个或者多个IRES序列，用于多个独立编码框的表达，尤其适用于含有N端信号肽的编码框。

进一步优选地，所述病毒包装信号序列含有cPPT/CTS、RRE和/或WPRE序列，该包装序列还可以包含CAR编码序列、受体或者配体的核酸序列。

进一步优选地，所述启动子序列包含EF-1、alpha-actin、beta-actin、UBC、PGK、beta-tubulin、hU6、CMV，SV40中的一个或多个。

进一步优选地，上述任一慢病毒载体，其特征在于：还包括用于增强在核基质中的附着和随有丝分裂而传代的能力的S/MAR序列。只要起增强在核基质中的附着和随细胞传代的能力的S/MAR序列都可适用于本发明载体的构建。

进一步优选地，所述S/MAR序列为人的IFN-beta 1的S/MAR序列，所述S/MAR序列的核苷酸序列如Seq ID No.19所示。

进一步优选地，所述多克隆位点1含有Seq ID No.21所示的核苷酸序列，和/或所述多克隆位点2含有Seq ID No.22所示的核苷酸序列。

优选地，上述慢病毒载体的核苷酸序如Seq ID No.1。

本发明还提供一种Gag-pol编码框中的编码突变的HIV-1整合酶序列，其特征在于，编码HIV-1整合酶的序列突变位点包括D64,D116,and E152的同时点突变，优选地进行D64K,D116Q,E152Q点突变而得，所述HIV-1整合酶的核苷酸序列如Seq ID No.10所示。由该序列构建的包装载体，与本发明的非整合型载体合用，可用于防止入核的病毒载体序列整合到细胞基因组，且密码子优化具有提高包装病毒的产量的功用。

本发明的另一方面，在上述慢病毒载体的基础上，构建了一系列可用于疾病治疗的细胞免疫治疗载体：即依靠新构建的载体应用于CAR-T技术，针对M2巨噬细胞在实体瘤免疫逃避作用，设计了针对M2巨噬细胞的复合CAR-T慢病毒载体，该载体主要针对的是CD47(GENBANK：NM_001777)和SIRPa(GENBANK：NM_001040022)在肿瘤逃避免疫作用中发挥“别吃我”的信号作用而设计的，表达在肿瘤细胞表面的CD47结合表达在巨噬细胞表面的SIRPa之后，激活巨噬细胞内的“别吃我”信号，从而抑制了巨噬细胞的吞噬作用，该载体在构建CAR-T细胞的肿瘤靶标的同时，亦兼顾靶向抑制CD47。其中对CD47或者SIRPa的抑制，有利于抑制肿瘤细胞通过其表面的CD47结合巨噬细胞表面的SIRPa，而二者的结合是引发“别吃我”效应的重要信号机制。具体如下：

一种细胞免疫治疗载体，其特征在于，在上述任一慢病毒载体的多克隆位点装载有目的基因，所述目的基因选自以下一种或多种基因：

编码抗体分子或者其scFV的核苷酸序列；

编码分泌性的抑制性效应分子的核苷酸序列；

编码嵌合抗原受体(CAR)靶向元件的核酸序列。

进一步优选地，其特征在于，

所述抗体分子或者其scFV指抗CD47的分泌性抗体或其scFV分子，所述抗体为鼠源抗体、人源抗体或嵌合抗体；

所述分泌性的抑制性效应分子指所述人SIRPa胞外结构域，其核苷酸序列如SeqID No.18所示，或者指所述人SIRPa胞外结构域进行不影响功能的修饰或改构而得的人工SIRPa胞外结构域；

所述CAR靶向元件指抗癌胚抗原CEA，具有Seq ID No.23所示的核苷酸序列是将所述抗癌胚抗原CEA的鼠源抗体的可变区内的框架区经过部分人源化改造，连接一个CD8铰链区、跨膜区，4-1BB共激活信号区和CD3zeta信号区而得是将所述抗癌胚抗原CEA的抗体的可变区内的框架区经过部分人源化改造，连接一个CD8铰链区、跨膜区，4-1BB共激活信号区和CD3zeta信号区而得。

所述CAR靶向元件指抗非糖基化Mucin抗体scFV的核酸序列，具有Seq ID No.24所示的核苷酸序列，是将所述抗非糖基化Mucin的鼠源单抗的可变区框架区作部分人源化改造，连接一个CD8铰链区、跨膜区，4-1BB共激活信号区和CD3zeta信号区而得是将所述抗癌胚抗原CEA的抗体的可变区内的框架区经过部分人源化改造，连接一个CD8铰链区、跨膜区，4-1BB共激活信号区和CD3zeta信号区而得。

即针对M2型巨噬细胞的抑制作用，可以克隆一个抗CD47的分泌性抗体。增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤作用。含或者不含有S/MAR序列，抗CD47的抗体是分泌性的，鼠源或者人源，也包括嵌合抗CD47抗体的scFV分子序列，用于降低实体瘤的免疫逃避和耐受作用，增加CAR-T细胞的肿瘤细胞毒性作用。

针对M2型巨噬细胞的抑制作用，该载体还可以克隆一个阻断CD47的SIRPa胞外结构域，该结构域增加了N端信号肽，可以在CAR-T细胞中表达并分泌到胞外，目的是解除肿瘤细胞对巨噬细胞的抑制作用，增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤作用。但不仅限于分泌性的胞外区SIRPa，也包括修饰的或者改构的SIRPa胞外结构域，用于T细胞的分泌性表达，该载体含有或者不含S/MAR序列。用于降低巨噬细胞帮助实体瘤的免疫逃避和耐受作用，增加CAR-T细胞的肿瘤细胞毒性作用。

针对肿瘤细胞的靶向杀伤，该载体可克隆、装载一个CAR靶向元件，如抗癌胚抗原CEA的抗体的scFV，将抗体的可变区内的框架区经过部分人源化改造，连接一个CD8铰链区、跨膜区，4-1BB共激活信号区和CD3zeta信号区。本载体实验了一种针对癌胚抗原的CAR，并验证了其在该载体中的体外表达和肿瘤细胞杀伤能力。

优选地，所述细胞免疫治疗载体，含有Seq ID No.2-9任一所示的构建，所述构建是由装载在所述多克隆位点的所述目的基因与所述慢病毒载体中的IRES序列和/或S/MAR序列构成。

优选地，上述任一载体以含有pBR322复制起点和含有青霉素抗性基因的载体为基础质粒构建而得。

如本发明的一些具体实施方案中，所述慢病毒表达载体和其衍生的载体具有：

(ⅰ)空载体载体图谱，含多克隆位点、IRES的序列为Seq ID No.1

(ⅱ)衍生载体图谱，含CAR编码序列、IRES、抗CD47单链全长IgG1抗体、S/MAR的核苷酸序列为Seq ID No.3。

(ⅲ)衍生载体图谱，含CAR编码序列、IRES、SIRPa胞外区CD47结合结构域的核苷酸序列为Seq ID No.2和Seq ID No.4。

(ⅳ)衍生载体图谱，含多克隆位点、IRES和S/MAR序列，核苷酸序列为

Seq ID No.5；在此基础上，多克隆位点装载有识别癌细胞特定Mucin的CAR元件表达序列，核苷酸序列如Seq ID No.7所示。

(Ⅴ)衍生载体图谱，含多克隆位点、IRES、SIRPa胞外区CD47结合结构域、S/MAR的核苷酸序列为Seq ID No.6、Seq ID No.8和Seq ID No.9。

(Ⅵ)衍生图谱具有IRES、S/MAR，还具有抑制“别吃我”信号反应的阻断CD47的SIRPa胞外区修饰序列，还具有识别癌细胞特异非糖基化Mucin胞外区的CAR元件表达序列，该序列含有一个识别Mucin的scFV序列、一个CD8a铰链区、一个CD8a跨膜区、一个4-1BB辅助激活信号区、一个CD3zeta信号结构域，如核苷酸序列为Seq ID No.6、Seq ID No.8和SeqID No.9。

本发明的又一方面，提供一种用于疾病治疗的试剂盒，其特征在于，包含上述任一慢病毒载体，或上述任一细胞免疫治疗载体；所述疾病包括实体瘤、血液瘤、自身免疫性疾病、干细胞治疗、病毒性疾病和遗传性疾病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1：本发明所获得的部分载体图，其中

1a，pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS2(7473bp)图谱；

1b，pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD(9375bp)图谱；

1c，pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-anti_CD47_IgG1(10704bp)图谱；

1d，pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD(9390bp)图谱；

1e，pLV-CMV-MCS-IRES-S/MAR(9659bp)图谱；

1f，pLV-CMV-MCS-IRES-SIRPaECD-S/MAR(10124bp)图谱；

1g，pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-S/MAR(11096bp)图谱；

1h，pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD-S/MAR(11561bp)图谱；

1i，pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD-S/MAR(11576bp)图谱；

图2：anti_CD47抗体的体外分泌和SIRPaECD的体外分泌表达鉴定结果，其中

(A)1：感染pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS细胞的上清提取物；

2：感染pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-anti_CD47_IgG1的细胞上清提取物，抗CD47IgG1抗体约65kD。

(B)感染pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS细胞的上清抗体的浓度和感染pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-anti_CD47_IgG1病毒的细胞浓度，达到了220ng/ml的分泌浓度，结果误差线为+SD。

(C)1，pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS；

2，pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD；

3，pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD；

4，pLV-CMV-MCS-IRES-SIRPaECD-S/MAR；

5，pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD-S/MAR；

6，pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD-S/MAR。

浓缩的上清蛋白经过抗C-MYC标签抗体WB染色，分子量约20kD，4种表达载体均有正常的表达，说明载体的元件采用和构建合理，S/MAR元件的加入没有影响基因的表达。

(D)293T细胞感染病毒2天和3天后的培养上清的混合样中，SIRPaECD的分泌和浓度测定，几种位于IRES元件后的SIRPaECD的正常表达不受影响，结果误差线为+SD。

图3：抗CD47抗体的细胞毒性效应实验结果，其中

为抗CD47的抗体1μg/ml加入HUVEC细胞，加入20或50倍人外周血单核细胞，通过上清中LDH的测定来检测该抗体的ADCC效应，相比IgG1抗体对照，抗CD-47的IgG1抗体显示出较强的ADCC效应。

图4：S/MAR非整合传代能力检测实验结果，其中

(A)1，用XhoI酶切的空载体样品对照；

2，XhoI酶切的感染病毒pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS2-S/MAR的基因组DNA；

3，XhoI酶切的感染pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD-S/MAR病毒的基因组DNA；2和3酶切DNA显示质粒在传50代后的基因组中依然稳定而且没有发生整合现象。

(B)1，用EcoRI酶切的空载体样品对照；

2,EcoRI酶切的pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS2-S/MAR病毒感染的基因组DNA；

3，EcoRI酶切的感染pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD-S/MAR病毒的基因组DNA；Southern blot显示2和3,均未发生基因组的整合现象。根据XhoI和EcoRI酶切的基因组DNA显示，插入的S/MAR序列能够有效的抑制相应的质粒元件插入基因组中，能够正常的随母代细胞的有丝分裂传代到子细胞中。图5：不同元件构建的CAR_T_Muc和CAR_T_CEA T细胞在靶细胞存在下，引起的细胞因子释放的比较实验

图中显示除空载体外，均产生较多的IFNγ,因此加和不加S/MAR元件的质粒，对细胞因子的IFNγ的产生效应类似。

图6：CAR_T_Muc和CAR_T_CEA的体外表达和毒性验证结果

(A)MTT检测的CAR_T_Muc对PanC1细胞的细胞毒性效应，所构建的所有含有CAR_T_Muc的质粒均能产生细胞毒性效应，添加S/MAR序列的质粒细胞毒性效应类似于不加S/MAR序列的质粒。

(B)MTT检测的CAR_T_CEA对过表达CEACAM1的HUVEC细胞的毒性效应，所构建的2个含有CAR_T_Muc的质粒均能产生细胞毒性效应。

具体实施方式

本发明公开了多编码框载体及其应用于CAR-T元件的构建，在不脱离本发明内容、范围内对本文所述的方法和载体进行改动或适当变更与组合而得出的技术方案，都属于本发明请求保护的范围内。

实施例1、载体的构建和测序鉴定

选用含有pBR322复制起点和含有青霉素抗性基因的基础质粒为基础，PCR构建一段线性基础质粒序列，将慢病毒的5’-LTR序列、病毒包装信号序列、Rev应答元件RRE序列、前病毒整合元件入核增强序列cPPT/CTS序列和一个多克隆位点整合成一个环状质粒序列，然后将慢病毒的土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列WPRE和3’-LTR序列PCR克隆入该质粒的多克隆位点的下游。

以该质粒为基础质粒序列构建一系列特定功能的治疗载体。

在上述基础质粒基础上，将人的IFN-beta 1的S/MAR序列Seq ID No.19(通过PCR法，扩增293T细胞基因组，获得带有上游带有XbaI和下游带有PacI序列的2.2kb序列)经过XbaI和PacI双酶切，将所得2.2kb片段插入上述基础质粒的多克隆位点中。

引物序列：

S/MAR-S(XbaI):5’-ATACTCGAGAGCAAGGTCGCCA和

S/MAR-R(PacI):5’-CGCTTAATTAATATCAAGATATTTAAAGA，测序鉴定阳性克隆。

然后该质粒继续使用XbaI酶切，PCR扩增如Seq ID No.20所示的IRES元件，经过SpeI和XbaI酶切，将该片段插入XbaI位点，测序鉴定正反向。

克隆IRES的引物序列：

IRES-S(SpeI):5’-ACAACTAGTGCCCCTCTCCCT-3’；

IRES-R(XbaI):5’-CTGTCTAGAATTATCATCGTGTTTTTC-3’，

测序引物：5’-CTAG T CTC GAG GGG CCC GGG TGA TC-3’。

pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS2的多克隆位点：

MCS1：

MCS2：

为了提高病毒的包装效率，5’-LTR和3’-LTR之间的序列长度尽可能在8.5kb以内。

所得的基础质粒序列的结构如图1a所示，其中一种基础质粒的序列如Seq IDNo.1所示，其中5’-LTR：1–636；病毒包装信号：686–823；RRE:1304–1536；cPPT:2028–2151；CMV启动子：2185–2788；MCS1：2799-2831；IRES：2838-3413；MCS2：3414-3439；WPRE:3442-4033；3’-LTR:4237-4873；pUC复制起点：5343-6013；青霉素抗性基因Amp^r：6158-7154。

在得到的基础质粒基础上，在多克隆位点装载编码抗CD47的分泌性抗体的scFV分子序列的基因、编码SIRPa胞外结构域的基因和/或编码CAR靶向元件的基因。

所述抗CD47的分泌性抗体的scFV分子来自鼠源、人源或嵌合的抗CD47单克隆抗体；

所述SIRPa胞外结构域的氨基酸序列如Seq ID No.18。原始SIRPa胞外结构域，或对所述原始SIRPa胞外结构域进行不影响功能的修饰或改构而得的人工SIRPa胞外结构域；

所述CAR靶向元件指抗癌胚抗原CEA的抗体scFV，是将所述抗癌胚抗原CEA抗体的可变区内的框架区经过部分人源化改造，连接一个CD8铰链区、跨膜区、4-1BB共激活信号区和CD3zeta信号区而得。

具体地，根据上述设计思路，获得的几种可用于治疗的细胞免疫治疗载体，如图1b、1c、1d、1e、1f、1g、1h和1i所示，包含有核苷酸序列如Seq ID No.2-9所示的构建序列。

图1b，pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD；构建过程：人工合成的CAR_T_Muc(2805-4277)，插入位点为XhoI和EcoRI；人工合成的SIRPaECD(4857-5315)插入位点为XbaI，并作测序鉴定插入方向的正反性；其中的CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD结构的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

图1c，，pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-anti_CD47_IgG1；构建过程：人工合成的CAR_T_Muc(2805-4277)插入位点为XhoI和EcoRI；anti_CD47_IgG1(4857-6644)插入位点为XbaI，并作测序鉴定插入方向的正反性，该抗体分子的SCFV序列(GENBANK：NM_001777)添加人IgG1的恒定区序列，经过DNA合成的方法获得全长单链抗人CD47抗体分子；其中的CAR_T_Muc-IRES-anti_CD47_IgG1的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。

图1d，pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD；构建过程：人工合成的CAR_T_CEA序列(2805-4277)插入基础质粒pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS2的XhoI和EcoRI位点；然后将合成的SIRPaECD序列(4872-5330)插入XbaI位点，并作正反向鉴定；其中的CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD结构的核苷酸序列如Seq ID No.4

图1e，pLV-CMV-MCS-IRES-S/MAR；构建过程：人基因组DNA PCR扩增S/MAR序列，上下游引物两端分别带有XbaI和PacI酶切位点，酶切后插入基础质粒pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS2的XbaI和PacI位点，S/MAR插入序列位置(3420-5617)；其中的MCS1-IRES-S/MAR结构的核苷酸序列如Seq ID No.5所示。

图1f，pLV-CMV-MCS-IRES-SIRPaECD-S/MAR；构建过程，人工合成SIRPaECD(3420-3878)，插入pLV-CMV-MCS-IRES-S/MAR质粒的XbaI位点，并作正反向鉴定；其中的MCS-IRES-SIRPaECD-S/MAR结构的核苷酸序列如Seq ID No.6所示。

图1g，pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-S/MAR；构建过程，人工合成的CAR_T_Muc(2805-4277)插入克隆质粒pLV-CMV-MCS-IRES-S/MAR的XhoI-EcoRI位点；其中CAR_T_Muc-IRES-S/MAR结构的核苷酸序列如Seq ID No.7所示。

图1h，pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD-S/MAR；

在图1g所示的pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-S/MAR质粒基础上，将SIRPaECD序列(4857-5315)插入XbaI位点，鉴定正反向；

其中CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD-S/MAR结构的核苷酸序列如Seq ID No.8所示

图1i，pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD-S/MAR；在图1e所示的pLV-CMV-MCS-IRES-S/MAR质粒基础上将CAR_T_CEA(2805-4277)插入XhoI和EcoRI位点，然后将SIRPaECD(4857-5315)插入XbaI位点，并鉴定正反向，其中CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD-S/MAR结构的核苷酸序列如Seq ID No.9所示

实施例2：anti_CD47抗体的体外分泌鉴定和SIRPaECD的体外分泌表达鉴定

293T细胞在DMEM培养基(含5-10％FBS，含青霉素链、霉素)和5％CO₂条件下，37℃培养，用pLV-CMV-MCS-IRES、pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-anti_CD47包装分别感染293T细胞，感染48小时后裂解细胞。

裂解液为中等强度RIPA裂解液(50mM Tris-Cl、150mM NaCl、1％NP-40、0.25％脱氧胆酸钠、1mM MgCl₂、5mM EDTA、5％甘油，添加罗氏蛋白酶抑制剂cocktail)。

蛋白经过SDS-PAGE电泳之后，PVDF膜转膜，经过脱脂牛奶的封闭之后，用辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗人IgG1恒定区抗体孵育，PVDF膜用发光底物处理，X光片感光，用显影液和定影液处理X光片。

为了检测IRES对其后面编码框的表达有效性，采用以下

pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS2、

pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD、

pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD、

pLV-CMV-MCS-IRES-SIRPaECD-S/MAR、

pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD-S/MAR、

及pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD-S/MAR包装的慢病毒分别感染293T细胞，感染后36小时、48小时和72小时，收集细胞培养液，混合，添加蛋白酶抑制剂，经过冷冻干燥浓缩，蛋白再经过Western blot，由于SIRPaECD含有一个C末端的c-Myc标签，用鼠抗c-Myc标签的抗体进行一抗孵育，然后用标记HRP的羊抗鼠抗体孵育，最后X光片曝光显影和定影。

结果显示如图2(A)1，感染pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS细胞的上清提取物；2，感染pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-anti_CD47_IgG1的细胞上清提取物，抗CD47IgG1抗体约65kD。

为了检测抗CD47抗体的分泌浓度，感染病毒的293T细胞上清混合液(感染48小时和72小时)，包被96孔板，做ELISA检测，用生物素标记的抗人IgG孵育，然后用HRP标记的链霉亲和素孵育，加TMB底物，终止反应后，测定吸光度，已知浓度的抗CD47抗体标定曲线。

结果如图2(B)所示，感染pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS细胞的上清抗体的浓度和感染pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-anti_CD47_IgG病毒的细胞浓度，达到了220ng/ml的分泌浓度，结果误差线为+SD。

如图2(C)

1，pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS；

2，pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD；

3，pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD；

4，pLV-CMV-MCS-IRES-SIRPaECD-S/MAR；

5，pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD-S/MAR；

6，pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD-S/MAR所示，浓缩的上清蛋白经过抗C-MYC标签抗体WB染色，分子量约20kD，4种表达载体均有正常的表达，说明载体的元件采用和构建合理，S/MAR元件的加入没有影响基因的表达。

为了检测细胞上清中的SIRPaECD的浓度，感染病毒的293T细胞上清混合液(感染48小时和72小时)，做ELISA检测，细胞培养上清液包被培养板，然后再用生物标记的抗C-MYC标签抗体孵育，然后用HRP标记的链霉亲和素孵育，加TMB底物，终止反应后，测定吸光度，已知浓度的纯化SIRPaECD用于标定浓度曲线。

结果如图2(D)293T细胞感染病毒2天和3天后的培养上清的混合样中，SIRPaECD的分泌和浓度测定，几种位于IRES元件后的SIRPaECD的正常表达不受影响，结果误差线为+SD。

实施例3：抗CD47抗体的细胞毒性效应(ADCC)

编码CD47抗体的病毒(pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-anti_CD47_IgG1)感染293T细胞，48小时和72小时后收集上清液，经过蛋白A柱纯化(GE Health公司)，洗脱，透析，对所得抗CD47的IgG1的浓缩抗体进行定量，少量用于Western blot检测，其余用于下述的ADCC检测。

HUVEC靶细胞的构建：根据人CD47(GENBANK：NM_001777)序列设计引物，以人CD47质粒(Sinobiological)为模板PCR扩增其编码框序列，连入我们构建的慢病毒载体pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS，获得稳定转染CD47的HUVEC细胞。

引物hCD47a-S(XhoI):5’-GGCCTCGAGATGTGGCCCCTGGTA-3’；hCD47a-R(BamHI):5’-CGTGGATCCAGTTATTCATCATTCATC-3’；

ADCC采用常规的外周血单核细胞(PBMC)法测定，PBMC采自健康志愿者。96孔板中加入HUVEC靶细胞，并加入1μg/ml抗CD47抗体，然后按效应细胞PBMC和HUVEC靶细胞比例10:1、20:1和50:1比例加入PBMC，在37℃培养箱中培养6小时，对照为人的非特异性IgG。

然后测定上清中的乳酸脱氢酶LDH活性。

如图3所示。抗CD47的抗体1μg/ml加入HUVEC细胞，加入10、20或50倍人外周血单核细胞，通过测定上清中LDH来测定ADCC效应，相比IgG1抗体对照，抗CD-47的IgG1抗体显示了较强的ADCC效应。

实施例4：S/MAR非整合传代能力检测

为了检测S/MAR对非整合和传代的有效性，我们进行了Southern blot分析，和多代传代分析。

pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS2-S/MAR和

pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD-S/MAR分别与I型突变的HIV整合酶(Seq IDNo.10所示)的第三代包装质粒转染293T细胞，获得病毒粒子，转染后48小时、72小时收集培养液。

采用收集的培养液对HepG2细胞进行感染，感染后的细胞每2-3天传一次代，共传代50代，然后收获部分细胞，提取基因组DNA，基因组DNA用限制性内切酶NotI和PacI酶切，电泳后电转到尼龙膜上。

探针由载体公共序列部分的1kb片段(不含S/MAR序列)连入pGEM-t载体，T7聚合酶体外转录获得整合地高辛核苷酸的探针，探针杂交后，先后与生物素标记的抗地高辛抗体，HRP标记的链霉亲和素孵育，X光片曝光、显影和定影。

结果如图4所示，(A)1，用XhoI酶切的空载体样品对照；2，XhoI酶切的感染病毒pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS2-S/MAR的基因组DNA；3，XhoI酶切的感染pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD-S/MAR病毒的基因组DNA；酶切DNA显示2和3在传代50代后的基因组中没有发生整合现象。

(B)1，用EcoRI酶切的空载体样品对照；2,EcoRI酶切的pLV-CMV-MCS1-IRES-MCS2-S/MAR病毒感染的基因组DNA；3，EcoRI酶切的感染pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD-S/MAR病毒的基因组DNA；Southern blot显示2和3均未结合均未发生基因组的整合现象。根据XhoI和EcoRI酶切的基因组DNA显示，插入的S/MAR序列能够有效的抑制相应的质粒元件插入基因组中，能够正常的随母代细胞的有丝分裂传代到子细胞中。

实施例5：不同元件构建的CAR_T_Muc和CAR_T_CEA T细胞的细胞毒性试验

实验材料：

所用载体含如图1a，1b，1c，1d，1h，和1i所示的序列。

CAR_T_Muc T细胞(即分别感染pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD、pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-anti_CD47_IgG1和pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD-S/MAR病毒的T细胞)

靶细胞：2X10³PanC1细胞(ATCC)

过表达人CEACAM1质粒(Sino Biological)的HUVEC细胞；

CAR_T_CEA细胞(即分别感染pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD、、pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD-S/MAR的T细胞)

方法：

感染健康志愿者提供的T细胞。

靶细胞为2X10³PanC1细胞，

对照为感染pLV-CMV-MCS-IRES-S/MAR病毒的T细胞和靶细胞PanC1细胞，

按照CAR-T细胞的培养、病毒感染和细胞因子刺激的常规步骤，即从健康志愿者血液中分离T细胞，用抗人CD3/CD28Dynabead磁珠(Thermofisher)分选、活化CD3+细胞(beads/cells 1:1或2:1)，培养体系为：AIM-V无血清培养基(GIBCO)、5％热灭活人AB血清(GIBCO)、1％glutamax(GIBCO)、40IU/ml IL-2(EMD Millipore)、细胞起始密度为1×10⁶cells/ml、培养器皿为培养袋)；第2天或第3天：逆转录病毒感染一次。继续培养7至10天，隔天补充新鲜培养基，细胞密度维持在0.4×10⁶cells/ml。获得具有细胞毒性的CAR-T细胞(CAR_T_CEA T细胞和CAR_T_Muc T细胞)。

将过表达人CEACAM1质粒(Sino Biological)的HUVEC细胞接种于96孔板，然后将CAR_T_Muc和CAR_T_CEA T细胞：靶细胞按10:1,20:1或50:1接种到上述96孔板中，培养12小时，取培养上清，使用IFNγ的ELISA试剂盒(Peprotech)进行检测。

ELISA分别检测CAR_T_Muc和CAR_T_CEA产生的细胞因子效应。

结果图5所示，图中显示除空载体外，均产生较多的IFNγ,因此加和不加S/MAR元件的质粒，对细胞因子的IFNγ的产生效应类似。

实施例6:CAR_T_Muc和CAR_T_CEA的体外表达和毒性验证

Day 0：采集健康志愿者的PBMC(一部分冻存)，

用抗人CD3/CD28Dynabead磁珠(Thermofisher)分选、活化CD3+细胞(beads/cells2:1、600×10⁶)，

培养体系为：AIM-V无血清培养基(GIBCO)、5％热灭活人AB血清(GIBCO)、1％glutamax(GIBCO)、40IU/ml IL-2(EMD Millipore)、细胞起始密度为1×10⁸cells/ml、培养器皿为培养瓶或者培养袋；

Day 2和3：慢病毒上清各感染一次。

继续培养6至8天，隔天补充新鲜培养基，细胞密度维持在0.4×10⁶cells/ml。

CAR_T_Muc对细胞的毒性效应是通过感染pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD、pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-anti_CD47_IgG1、pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD、pLV-CMV-CAR_T_Muc-IRES-SIRPaECD-S/MAR、pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD-S/MAR来进行检测，

对照是pLV-CMV-MCS-IRES-S/MAR病毒感染的T细胞，

靶细胞为人胰腺癌细胞PanC1；

CAR_T_CEA对靶细胞的毒性效应是通过

pLV-CMV-CAR_T_CEA-IRES-SIRPaECD-S/MAR，对照同上，靶细胞为过表达CEACAM1(ATCC)的Huvec细胞。

结果如图6所示，(A)MTT(噻唑蓝)检测的CAR_T_Muc对PanC1细胞的细胞毒性效应，所构建的所有含有CAR_T_Muc的质粒均能产生细胞毒性效应，添加S/MAR序列的质粒细胞毒性效应类似于不加S/MAR序列的质粒的效应。(B)MTT检测的CAR_T_CEA对过表达CEACAM1的HUVEC细胞的毒性效应，所构建的2个含有CAR_T_Muc的质粒均能产生细胞毒性效应。

Claims

1.一种多编码框、非整合型的慢病毒载体，其特征在于：从上游到下游包含5’-LTR序列、启动子序列、多克隆位点1、一个或者多个IRES元件、多克隆位点2和3’-LTR序列,cPPT/CTS、RRE和/或WPRE序列；

所述多克隆位点1和多克隆位点2用于装载目的外源表达基因；

所述多克隆位点1含有Seq ID No.21所示的核苷酸序列，和/或所述多克隆位点2含有Seq ID No.22所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于：还含有用于增强在核基质中的附着和随细胞传代的S/MAR序列。

3.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于：其核苷酸序列如Seq ID No.1。

4.一种细胞免疫治疗载体，其特征在于，在权利要求1-3任一所述的慢病毒载体的多克隆位点进一步装载有目的基因；所述目的基因选自以下一种或多种基因：

编码抗体分子或者其scFV的核苷酸序列；

编码分泌性的协同或抑制效应分子的核苷酸序列；

编码CAR靶向元件的核酸序列。

5.根据权利要求4所述的细胞免疫治疗载体，其特征在于，

所述抗体分子或者其scFV指抗CD47的分泌性抗体或其scFV分子，所述抗体为鼠源、人源或嵌合抗体；

所述分泌性的抑制性效应分子指所述人SIRPa胞外结构域，其核苷酸序列如Seq IDNo.18所示，或者指所述人SIRPa胞外结构域进行不影响功能的修饰或改构而得的人工SIRPa胞外结构域；

所述CAR靶向元件指抗癌胚抗原CEA，具有Seq ID No.23所示的核苷酸序列是将所述抗癌胚抗原CEA的鼠源抗体的可变区内的框架区经过部分人源化改造，连接一个CD8铰链区、跨膜区，4-1BB共激活信号区和CD3 zeta信号区而得是将所述抗癌胚抗原CEA的抗体的可变区内的框架区经过部分人源化改造，连接一个CD8铰链区、跨膜区，4-1BB共激活信号区和CD3 zeta信号区而得。

所述CAR靶向元件指抗非糖基化Mucin抗体scFV的核酸序列，具有Seq ID No.24所示的核苷酸序列，是将所述抗非糖基化Mucin的鼠源单抗的可变区框架区作部分人源化改造，连接一个CD8铰链区、跨膜区，4-1BB共激活信号区和CD3 zeta信号区而得是将所述抗癌胚抗原CEA的抗体的可变区内的框架区经过部分人源化改造，连接一个CD8铰链区、跨膜区，4-1BB共激活信号区和CD3 zeta信号区而得。

6.根据权利要求4所述的细胞免疫治疗载体，其特征在于：含有Seq ID No.2-9任一所示的构建，所述构建是由装载在所述多克隆位点的所述目的基因与所述慢病毒载体中的IRES序列和/或S/MAR序列构成。

7.一种用于疾病治疗的工具，其特征在于，包含权利要求1-3任一所述的慢病毒载体，或权利要求4-6任一所述的细胞免疫治疗载体，所述疾病包括实体瘤、血液瘤、自身免疫性疾病、干细胞治疗、病毒性疾病和遗传性疾病。