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CN105950775B - 一种检测npm1基因突变分型的试剂盒 - Google Patents

一种检测npm1基因突变分型的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测NPM1基因突变分型的试剂盒，包括RT‑PCR反应液、引物探针混合液、RT‑PCR反应酶系、DEPC H2O以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。由于本试剂盒应用一步法实时荧光PCR反应模式，并对特异性探针进行LNA修饰，能超敏快速检测急性髓性白血病患者骨髓及外周血样本中的NPM1基因12外显子突变，最低检出量为0.2ng，同时根据不同通道信号值可对A型、B型、D型突变进行分型，同时加入内标控制系统可检测样本提取效果，可广泛应用于急性髓性白血病化疗效果的预估。

Description

一种检测NPM1基因突变分型的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测NPM1基因突变核酸的超敏分型试剂盒，特别是涉及一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术及锁核酸修饰探针一管反应即可同时检测NPM1基因突变A型、B型、D型的试剂盒。
背景技术
急性髓系白血病(Acute myelogenous leukemia，AML)是起源于造血干/祖细胞的恶性克隆性血液疾病，以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征，临床以低热、代谢异常贫血、出血、感染和脏器的白血病细胞浸润为主要特点。流行病学调查显示，AML是最常见的成人急性白血病，年发生率为3/100000左右。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM1)是位于核仁颗粒区的主要蛋白分子之一，定位于第5号染色体长臂上(5q35)，广泛地表达于各种类型的细胞。NPM1高表达于增殖活跃的细胞包括肿瘤细胞和干细胞，在肿瘤形成过程中发挥重要作用。NPM1突变，目前已发现约50余种变异体，最常见的类型为12号外显子发生四个碱基的重复导致蛋白C端结构改变，最频繁的为突变A，占77％-80％病例，在野生型NPM1核苷酸序列的956～959位置上插入TCTG四个核苷酸重复构成。此外，突变B、D分别占10％、5％，分别是在相同的基因位点插入CATG、CCTG四个核苷酸。
根据美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network)2016年发补的NCCN临床实践指南：急性髓性白血病(2016.V1)中明确显示NPM1突变是预后良好的指标，并不能受益于异基因造血干细胞移植。因此对NPM1突变的检测是明确AML病患是否进行骨髓移植的重要决定因素。
目前检测NPM1突变的方法包括：Sanger测序法、CAPs法、RT-qPCR等。Sanger测序法又称一代测序法，应用双脱氧核苷酸作为链终止试剂(双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3-OH基团，所以可被用作链终止试剂)通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法，是为核酸检测的金标准，但其缺点也较为明确：灵敏度低、操作繁琐、容易污染。CAPs又称限制性片段长度多态性聚合酶链反应，基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带，此方法不需要成本较低且判读简单，但操作繁琐且灵敏度低。RT-qPCR又称一步法逆转录荧光定量PCR法，将逆转录与荧光定量PCR通过温度的调整达到一步完成的技术，操作过程闭管进行，不会造成样本污染，同时检测灵敏度高，应用范围广，但检测位点需明确突变类型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术对NPM1基因突变进行分型的高灵敏度试剂盒，利用本试剂盒可以准确检测NPM1基因A型、B型、D型突变。
根据GenBank中的NPM1基因A型、B型、D型突变基因序列，应用Primer Express3.0软件基因突变区设计特异性的引物及探针，并通过NCBI的BLAST功能对其特异性进行初步鉴定。三条基因分型探针分别用FAM、TEXAS RED和CY5并加入了锁核酸(Locked nucleicacid，LNA)修饰，增加了特异性及灵敏度，不同通道荧光标记可对检测出的基因突变进行分型，内标探针用HEX标记，可对样本质量及提取效果进行监控。这些引物探针在含有耐热DNA聚合酶，逆转录酶、高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的RT-PCR反应酶系以及含有Mg2+等成份的RT-PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增。
本发明所涉及的试剂盒主要包括：1)RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPC H2O，阴性质控品、阳性质控品和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
本发明的一个优选实施方案是引物探针混合液由NPM1基因特异性的正、反向引物及特异性的突变分型探针组成，分型探针同时进行了LNA修饰提高了灵敏度和特异性，NPM1基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-GGTGGTTCTCTTCCCAAAG-3’，5’-CTGTTACAGAAATGAAATAAGACG-3’；突变A型特异性锁核酸探针的序列是5’-CAAGATCTCTGT+CT+GGCAGTGG-3’，探针的5’和3’端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；突变B型特异性锁核酸探针的序列是5’-CAAGATCTCTGC+AT+GGCAGTGG-3’，探针的5’和3’端分别结合有荧光发生基团TEXASRED和荧光淬灭基团BHQ2；突变D型特异性锁核酸探针的序列是5’-CAAGATCTCTGC+CT+GGCAGTGG-3’，探针的5’和3’端分别结合有荧光发生基团CY5和荧光淬灭基团BHQ2；内标TBP基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-CTAAAGACCATTGCACTTCGT-3’，5’-ATCAGTGCCGTGGTTCGTG-3’；内标TBP基因特异性的探针序列是5’-AATCCCAAGCGGTTTGCTGCGGTAA-3’，探针的5’和3’端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1。(其中“+”表示对右侧碱基进行LNA修饰)
本发明的另一个优选实施方案是引物探针混合液中引物浓度为0.1～0.5μmol/L，探针浓度为0.1～0.25μmol/L。
本发明的另一个优选实施方案是RT-PCR反应液由Tris-HCl(50mmol/L，pH8.0～8.8)、MgCl2(3～8mmol/L)、KCl(150～350mmol/L)组成。
本发明的另一个优选实施方案是RT-PCR反应酶系由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成。热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs均可采用市售产品，如生工生物公司的产品，其中每人份RT-PCR反应酶系中热启动Taq酶的用量为5～10U，逆转录酶用量为1.5～5U，dNTPs用量为6～12mmol。
本发明的一个优选实施方案是试剂盒提供了质控品，分别为阴性质控品和阳性质控品。阴性质控品为灭菌纯水，阳性质控品为人工合成的含有NPM1突变A型、B型、D型基因的体外转录RNA。试剂盒中进行待检标本检测可同时进行两种质控品的检测，仅当阳性质控品检测时FAM、TEXAS RED、CY5、HEX通道荧光信号均呈阳性，阴性质控品检测4个通道荧光信号均呈阴性时，待检标本的检测结果才有效。
本发明的一个优选实施方案是操作整个流程为使用核酸提取试剂盒提取全血或骨髓样本中的RNA；试剂盒PCR扩增的条件为：50℃ 15分钟，94℃ 2分钟；94℃ 15秒，58℃35秒，40个循环(退火时收集荧光信号)；PCR结果判断通过各检测通道Ct值确定，内标通道的Ct值小于35的样本的检测结果视为有效，其他检测通道Ct值小于37视为该通道检测基因突变型阳性。
本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。准确检测急性髓性白血病患者骨髓及外周血样本中的NPM1基因12外显子突变，同时根据不同通道信号值可对A型、B型、D型突变进行分型，同时加入内标控制系统可检测样本提取效果，可广泛应用于急性髓性白血病化疗效果的预估。
本发明与现有技术相比优点为：①对NPM1突变进行分型检测，可反映出样本中NPM1基因的突变具体型别，同时检测灵敏度大大提升，可用于急性髓系白血病化疗效果的预估及微小残留跟踪；②分别针对NPM1基因A型、B型、D型突变特异性序列设计专用引物、探针，保证检测的特异性和准确性，也具有较高通量，操作简便、相对降低成本的优点；③一份样本同时对NPM1基因突变三种型别进行特异性检测，检测过程只需1.5h，相比一个样本进行3次检测，大大减少了工作量，提高了检测效率；相对于已有的核酸Sanger测序法，检测所需时间大大减少；④试剂采用阴阳性质控品作为质控，能够对试剂的质量进行严格的把控；⑤试剂采用RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系的大包装设置，适合多种荧光检测设备，具有适用性更加广泛的特点。
附图说明
图1显示NPM1基因A型突变体外转录RNA的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明试剂盒具有很好的线性相关性，且可以检出0.2ng的浓度样本。
图2显示NPM1基因B型突变体外转录RNA的扩增曲线。图中TEXAS RED通道的扩增曲线为S型，说明试剂盒具有很好的线性相关性，且可以检出0.2ng的浓度样本。
图3显示NPM1基因D型突变体外转录RNA的扩增曲线。图中CY5通道的扩增曲线为S型，说明试剂盒具有很好的线性相关性，且可以检出0.2ng的浓度样本。
图4显示NPM1基因A型突变样本核酸的扩增曲线。图中FAM和HEX通道的扩增曲线为S型，TEXAS RED和CY5通道荧光信号均呈阴性。
图5显示NPM1基因B型突变样本核酸的扩增曲线。图中TEXAS RED和HEX通道的扩增曲线为S型，FAM和CY5通道荧光信号均呈阴性。
图6显示NPM1基因D型突变样本核酸的扩增曲线。图中CY5和HEX通道的扩增曲线为S型，FAM和TEXAS RED通道荧光信号均呈阴性。
图7显示试剂盒阴性质控品的扩增曲线。图中没有S型扩增曲线，说明FAM、TEXASRED、CY5和HEX通道荧光信号均呈阴性。
图8显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中FAM、TEXAS RED、CY5和HEX通道的扩增曲线为S型，说明该通道的荧光信号呈阳性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 NPM1基因突变分型的试剂盒的制备及其使用
1、制备包括下列组成成分的试剂盒
引物探针混合液(25μl/管)1管，RT-PCR反应液(125μl/管)，RT-PCR反应酶系(75μl/管)1管，阳性质控品(200μl/管)1管，阴性质控品(200μl/管)1管，DEPC H2O(2000μl/管)1管。
2、样本提取
提取NPM1基因A型突变的体外转录RNA，编号1号(0.2ng)、2号(2ng)、3号(20ng)、4号(200ng)，NPM1基因B型突变的体外转录RNA，编号5号(0.2ng)、6号(2ng)、7号(20ng)、8号(200ng)，NPM1基因D型突变的体外转录RNA，编号9号(0.2ng)、10号(2ng)、11号(20ng)、12号(200ng)，同时提取3例已经Sanger测序法确认的临床样本，编号13号(A型突变)、14号(B型突变)、15号(D型突变)，将以上15个样本使用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取试剂盒进行核酸提取。
3、实时荧光定量PCR扩增及检测
3.1 试剂准备：
按比例取相应量的引物探针混合液1μl、RT-PCR反应液5μl、RT-PCR反应酶系3μl、DEPC H2O 11μl，充分混匀后备用。
3.2 加样：
向PCR反应管中，分别加入阴、阳性质控品、样本提取后核酸溶液5μl，盖紧管盖，放入仪器样品槽。
3.3 编辑(ABI Prism 7500荧光定量PCR仪)
打开Setup窗口，按对应顺序设置阴、阳性质控品和待测标本，并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，双击，选择Add Detector，选择Reporter为FAM和Quencher为none，再选择Reporter为HEX和Quencher为none；再选择Reporter为Texas Red和Quencher为none；然后选择Reporter为Cy5和Quencher为none后关闭窗口。在PassiveReference中选择(none)。打开instrument窗口设置循环条件：50℃ 15分钟，94℃ 2分钟；94℃ 15秒，58℃35秒，40个循环。所有设置完成后保存文件，运行。
3.4 结果分析：
反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Ampplot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start：3，stop：10，并打开manual设定Threshold：1.5±100000。双击Rn坐标上数值打开Graph settings窗口，将Post Run Settings中Log改为Linear，OK后打开Analysis preferences窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。PCR结果判断通过各检测通道Ct值确定，内标通道的Ct值小于35的样本的检测结果视为有效，其他检测通道Ct值小于37视为该通道检测基因突变型阳性。
4、检测结果
对编号1、2、3号样本，FAM通道有S型曲线，其他通道没有曲线。对编号4、5、6号样本，TEXAS RED通道有S型曲线，其他通道没有曲线。对编号7、8、9号样本，CY5通道有S型曲线，其他通道没有曲线。对编号10号样本，FAM、HEX通道有S型曲线，其他通道没有曲线。对编号11号样本，TEXAS RED、HEX通道有S型曲线，其他通道没有曲线。对编号12号样本，CY5、HEX通道有S型曲线，其他通道没有曲线。本发明可以对NPM1基因突变进行分型，具有良好特异性和较高的灵敏度，可以检测低至0.2ng的样本，证明本发明的方法是可行、准确、可靠的。

Claims (6)

1.一种检测NPM1基因突变分型的试剂盒，包括：1)RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPC H2O、阴性质控品、以及阳性质控品，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒；其中引物探针混合液由NPM1突变A型、B型、D型基因特异性的引物、探针及内标组成，分别如下：
1)NPM1基因特异性的正向和反向引物的序列分别是：5’-GGTGGTTCTCTTCCCAAAG-3’和5’-CTGTTACAGAAATGAAATAAGACG-3’；
2)突变A型特异性锁核酸探针的序列是5’-CAAGATCTCTGT+CT+GGCAGTGG-3’，探针的5’和3’端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；
3)突变B型特异性锁核酸探针的序列是5’-CAAGATCTCTGC+AT+GGCAGTGG-3’，探针的5’和3’端分别结合有荧光发生基团TEXASRED和荧光淬灭基团BHQ2；
4)突变D型特异性锁核酸探针的序列是5’-CAAGATCTCTGC+CT+GGCAGTGG-3’，探针的5’和3’端分别结合有荧光发生基团CY5和荧光淬灭基团BHQ2；
5)内标TBP基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-CTAAAGACCATTGCACTTCGT-3’，5’-ATCAGTGCCGTGGTTCGTG-3’；
6)内标TBP基因特异性的探针序列是5’-AATCCCAAGCGGTTTGCTGCGGTAA-3’，探针的5’和3’端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1；
其中各序列种“+”表示对右侧碱基进行LNA修饰。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于引物探针混合液中引物浓度均为0.1～0.5μmol/L，探针浓度均为0.1～0.25μmol/L。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于RT-PCR反应液由pH值为8.0～8.8的50mmol/L Tris-HCl、3～8mmol/L MgCl2、150～350mmol/L KCl组成。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中RT-PCR反应酶系由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成，其特征在于每人份RT-PCR反应酶系中热启动Taq酶的用量为5～10U；逆转录酶用量为1.5～5U；dNTPs为6～12mmol。
5.根据权利要求1的试剂盒，其特征在于阴性质控品为灭菌纯水，阳性质控品为人工合成的含有NPM1突变A型、B型、D型基因的体外转录RNA。
6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于该试剂盒的使用包括以下步骤：
1)样本提取：使用核酸提取试剂盒提取全血或骨髓样本中的RNA；
2)PCR扩增：条件为50℃15分钟，94℃2分钟；94℃15秒，58℃35秒，40个循环；
3)检测结果判定：PCR结果判断通过各检测通道Ct值确定，内标通道的Ct值小于35的样本的检测结果视为有效，其他检测通道Ct值小于37视为该通道检测基因突变型阳性。
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