CN107841541A - Idh1/2基因突变检测体系及其试剂盒 - Google Patents
Idh1/2基因突变检测体系及其试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107841541A CN107841541A CN201711361069.7A CN201711361069A CN107841541A CN 107841541 A CN107841541 A CN 107841541A CN 201711361069 A CN201711361069 A CN 201711361069A CN 107841541 A CN107841541 A CN 107841541A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- idh1
- nucleotide sequence
- seq
- nucleic acid
- codon
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102100039905 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Human genes 0.000 title claims abstract description 85
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 101001042041 Bos taurus Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit beta, mitochondrial Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 101000960234 Homo sapiens Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 title claims abstract description 35
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 34
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 28
- 101150046722 idh1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 48
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 48
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 28
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 4
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 3
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 3
- 101710102690 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Proteins 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 101000999657 Arabidopsis thaliana Isocitrate dehydrogenase [NAD] regulatory subunit 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 241000726103 Atta Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010075869 Isocitrate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000012011 Isocitrate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012372 quality testing Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种IDH1/2基因突变的检测体系及其试剂盒，试剂盒包括PCR检测液和SYBR GreenI混合液；PCR检测液A包括用于检测IDH1/2基因第394密码子C394T位点和第395密码子G395A位点的上下游引物A和肽核酸A，PCR检测液B包括用于检测IDH1/2基因第419密码子G419A位点的上下游引物B和肽核酸B,PCR检测液C包括用于检测IDH1/2基因第515密码子G515A位点的上下游引物C和肽核酸C。本发明的IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行IDH1/2基因突变检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测IDH1/2基因突变的方法和检测产品，属于生物技术领域。
背景技术
2008年，Parsons等对20661个蛋白质编码基因进行高通量表达分析研究，首次发现在胶质母细胞瘤中约有12％发生了异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1，IDH1)的基因突变，随后，更多学者进一步的研究发现IDH1/2突变作为预后良好标志普遍存在于Ⅱ级和Ⅲ级胶质瘤以及继发性胶质母细胞瘤，并在肿瘤的发生、发展以及演变过程发挥着重要作用。IDH1/2基因突变是最常见的代谢酶基因突变类型，在胶质瘤和急性髓细胞白血病的一些亚型中相当普遍。软骨肉瘤、胆管癌、副神经节瘤、大肠癌、前列腺癌、肺癌等实体瘤也有报道。IDH突变状态与肿瘤病理分型密切相关，并且IDH突变是胶质瘤发生进展的早期事件，因此，IDH突变检测不仅能在诊断上更为及时全面，而且对于进一步深入研究肿瘤发病机制和生物学特征具有重要意义。
IDH1/2基因突变检测有助于针对该突变位点及癌代谢物的靶向治疗药物的开发，使得靶向治疗更具有效性、特异性，并减少不良反应。因此IDH1/2基因突变检测方法的建立对肿瘤的预防和治疗具有重要的指导意义。
目前对肿瘤相关基因的临床检测主要是测序法和ARMS法，并不适用。使用灵敏度较低的常规方法检测只能发现小部分患者在接受特定治疗前的肿瘤变异，采用高灵敏度法(如dPCR)检测则可以发现较高比例的携带突变型患者。目前进行IDH1/2基因突变检测的方法主要有芯片技术、探针引物技术、酶切、焦磷酸测序技术和HRM分析技术等，价格贵、繁琐或准确性不高。因此，开发一种检测IDH1/2基因突变的产品，以实现更高灵敏度、更低成本、更方便快捷的IDH1/2基因突变检测是非常有必要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行IDH1/2基因突变检测的IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种IDH1/2基因突变检测体系，包括用于检测IDH1/2基因第394密码子C394T位点和第395密码子G395A位点的上下游引物A，用于检测IDH1/2基因第419密码子G419A位点的上下游引物B，用于检测IDH1/2基因第515密码子G515A位点的上下游引物C，荧光染料SYBR GreenI，以及肽核酸；
所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述上游引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述上游引物C的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述下游引物C的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
所述肽核酸包括核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第394密码子C394T位点和野生型第395密码子G395A位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的肽核酸A，核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第419密码子G419A位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的肽核酸B，核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第515密码子G515A位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的肽核酸C。
上述上下游引物进行了LNA修饰。
上述上下游引物在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L。
上述上下游引物A在反应体系中的最终浓度为0.19μM/L，所述上下游引物B在反应体系中的最终浓度为0.2μM/L，所述上下游引物C在反应体系中的最终浓度为0.15μM/L。
上述肽核酸在反应体系中的最终浓度均为1～1.5μM/L。
上述肽核酸A、B、C在反应体系中的最终浓度均为1.25μM/L。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述检测体系的IDH1/2基因突变检测产品。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种IDH1/2基因突变检测试剂盒，包括PCR检测液A、PCR检测液B、PCR检测液C和SYBR GreenI混合液；
所述PCR检测液A包括用于检测IDH1/2基因第394密码子C394T位点和野生型第395密码子G395A位点的上下游引物A和肽核酸A，PCR检测液B包括用于检测IDH1/2基因第419密码子G419A位点的上下游引物B和肽核酸B，PCR检测液C包括用于检测IDH1/2基因第515密码子G515A位点的上下游引物C和肽核酸C；
所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述上游引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
所述上游引物C的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述下游引物C的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
所述肽核酸包括核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第394密码子C394T位点和野生型第395密码子G395A位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的肽核酸A，核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第419密码子G419A位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的肽核酸B，核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第515密码子G515A位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的肽核酸C。
上述上下游引物进行了LNA修饰；所述上下游引物在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L；所述肽核酸在反应体系中的最终浓度均为1～1.5μM/L。
上述IDH1/2基因突变检测试剂盒还包括阳性对照P1、阳性对照P2和阴性对照；
所述阳性对照液P1是浓度为100ng/μL的包含IDH1/2基因C394T、G395A、G419A、G515A位点的野生型质粒溶液；
所述阳性对照液P2是浓度为100ng/μL的包含IDH1/2基因C394T、G395A、G419A、G515A位点的突变型质粒溶液；
所述阴性对照液是不含IDH1/2基因的基因组DNA溶液。
本发明具有积极的效果：
(1)本发明采用PNA钳制实时定量PCR检测法，仅需通过熔解曲线分析，即可将IDH1/2基因突变型与野生型区分开。通过一步反应，可解决PCR扩增、突变富集及定量整个过程，无需诸如电泳、杂交、酶切等后续步骤，大大简化了实验过程，整个反应过程在密封管内完成，最大限度地减少了污染的可能，降低假阳性率。
(2)本发明的IDH1/2基因突变检测方法及其试剂盒，可同时检测第394/395、419、515密码子任意一种突变，灵敏度高。灵敏度可达到0.1％～0.5％，与常规PCR的浓度相比，本发明容易地检测出非常低浓度样本的IDH1/2位点的基因型，克服了TaqMan探针法需要使用多条特异性探针分别进行检测的缺点，满足大样本量临床筛查的要求。
(3)本发明选择SYBR GreenI作为荧光染料，价格低廉，大大降低检测成本。
附图说明
图1采用实施例的试剂盒检测阳性对照P1的C394T和G395A位点野生型特异性产物峰Tm值。
图2是采用实施例的试剂盒检测阳性对照P1的G419A位点野生型特异性产物峰Tm值。
图3采用实施例的试剂盒检测阳性对照P1的G515A位点野生型特异性产物峰Tm值。
图4是采用实施例的试剂盒检测阳性对照P2的C394T和G395A位点突变型特异性产物峰Tm值。
图5是采用实施例的试剂盒检测阳性对照P2的G419A位点突变型特异性产物峰Tm值。
图6是采用实施例的试剂盒检测阳性对照P2的G515A位点突变型特异性产物峰Tm值。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
一、试剂盒的组成。
本实施例的IDH1/2基因突变检测试剂盒，包括PCR检测液A、PCR检测液B、PCR检测液C、SYBR GreenI混合液、阴性对照、阳性对照P1和阳性对照P2。试剂盒各成分如表1所示。
表1试剂盒成分表
| 成分 | 分装 | 组成 |
| PCR检测液A | 1管 | C394T和G395A位点引物、肽核酸 |
| PCR检测液B | 1管 | G419A位点引物、肽核酸 |
| PCR检测液C | 1管 | G515A位点引物、肽核酸 |
| SYBR GreenI混合液 | 1管 | —— |
| 阳性对照P1 | 1管 | 含野生型IDH1/2基因的质粒 |
| 阳性对照P2 | 1管 | 含突变型IDH1/2基因的质粒 |
| 阴性对照 | 1管 | 不含IDH1/2基因的基因组DNA溶液 |
上述表1中试剂盒组分的说明如下：
1)SYBR GreenI混合液的主要成分包括DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、SYBRGreenI、缓冲液等(由Bioer公司提供，货号：B255l1)。
2)PCR检测液A包括:用于检测IDH1/2基因C394T位点和G395A位点的上下游引物A和与野生型C394T位点和G395A位点完全互补的肽核酸A。PCR检测液B包括:用于检测G419A位点的上下游引物B和与野生型G419A位点完全互补的肽核酸B。PCR检测液C包括:用于检测G515A位点的上下游引物C和与野生型G515A位点完全互补的肽核酸C。
本实施例对上下游引物进行了LNA修饰。即在寡核苷酸链中引入一个LNA碱基，并通过调整LNA碱基在引物中的位置来调节最佳熔点(Tm)和杂交的特异性。经过修饰后的引物具有更高的Tm值，能够更好与突变模板结合，修饰后的实时定量PCR引物，长度较短，可以增加设计的灵活性。
本实施例在PCR检测液中加入少量肽核酸(PNA)，不足以完全抑制野生型基因扩增，此时野生型的Tm值无变化，扩增效率较未加入PNA时明显降低，而对突变型基因扩增无影响，但其Tm下降明显，二者的Tm差值增大，此时可通过溶解曲线分析将两种类型的基因区分开。
3)阳性对照液P1是浓度为100ng/μl的含IDH1/2基因野生型质粒的溶液。
4)阳性对照液P2是浓度为100ng/μl的含IDH1/2基因突变型质粒的溶液。
5)阴性对照液是不含IDH1/2基因的基因组DNA溶液。
野生型质粒的获取为野生型质粒常规构建步骤：设计位于突变位点两侧的引物，扩增含对应位点的野生型产物，构建入质粒，挑选并测序验证。
突变型质粒的获取为纯合子突变质粒常规构建步骤：设计一条覆盖相应多态性位点并将等位碱基引入到引物序列中的特异引物，与相对应的上游或下游野生型引物配对，扩增含4种突变位点的目的片段产物，构建入质粒，挑选并测序验证。
二、引物、肽核酸设计。
本发明设计的引物长度为15～22bp，产物长度200～220bp.特异性肽核酸PNA片段与野生型多态性位点序列完全互补,长度为15～20bp。如表2所示。
表2引物肽核酸序列表
| 位置 | 检测类别 | Seq No. | Sequence(5’—3’) |
| C394T/G395A | 上游引物A | 1 | TATCCCCCGGCTTGT |
| C394T/G395A | 下游引物A | 2 | GCAAAATCACATTA |
| C394T/G395A | 肽核酸A | 7 | TATCATCATAGGTT |
| G419A | 上游引物B | 3 | AGTTCAAGCTGAAGA |
| G419A | 下游引物B | 4 | CCAGGGACTAGGCGT |
| G419A | 肽核酸B | 8 | AATGGAACTATCCA |
| G515A | 上游引物C | 5 | ACGCCTAGTCCCT |
| G515A | 下游引物C | 6 | CAGGTCAGTGGAT |
| G515A | 肽核酸C | 9 | ATCACCATTGGCAA |
引物和肽核酸由上海百力格生物技术有限公司合成，按照引物说明书由干粉稀释成工作母液，再由母液配置成检测工作液，引物和肽核酸混合液均由母液加入灭菌超纯水稀释而成。
本发明中肽核酸PNA在反应体系中的浓度至关重要，0.25～8.0μmol/L浓度范围内，当PNA浓度低于3.75μmol/L时，野生型模板的熔解曲线上出现野生特异性扩增峰，表明野生型基因背景未完全抑制，此时无法判断是否存在突变基因；当PNA浓度在3.75～4.0μmol/L时，突变型模板经PCR扩增后的熔解曲线可观察到突变峰，而野生型只有引物二聚体峰，即野生型模板完全被抑制无法扩增；随着PNA浓度的增加，可观察到无论是野生型还是突变型模板的扩增效率均逐渐降低，当PNA浓度高于引物40倍，达8.0μmol/L时，所有的模板均受抑制而无任何扩增峰存在。
三试剂盒的使用方法。
1、样本DNA提取
采用试剂盒(Axygen Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)提取样本血液样本DNA，或者采用康为世纪生物科技有限公司的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(货号：CW0530S)抽提口腔黏膜样本DNA，具体的操作参见试剂盒产品说明书。
2、样本DNA质量检测。
获得样本DNA后，通过Thermo-Fisher核酸蛋白定量仪(NanoDrop 2000)测定浓度和纯度，控制样本质量，最终加入反应体系中的样本。OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间的可获得最优反应结果，浓度稀释为5～20ng/μl。
3、PCR反应。
采用本实施例的IDH1/2基因突变检测试剂盒试进行检测，反应体系的体积为10μl，其中PCR检测液2μl，SYBR GreenI混合液5μl，模板DNA 1μl，超纯水2μl。(反应体系的体积还可以是20μl，在配制时将10μl反应体系中的组分翻倍即可)。采用突变位点对应引物的PCR反应体系A、B和C分别检测同一个样本。
1)配制10μl的检测PCR反应体系：
检测PCR反应体系：分别取2μl PCR检测液，5μl SYBR GreenI混合液，2μl超纯水，1μl模板(如果是DNA样本，浓度5～20ng/μl)，并设置重复。
反应体系中的模板分别指对应的样本DNA，阳性对照，阴性对照。
2)PCR反应程序。
各反应体系在ABI实时荧光定量PCR扩增仪(stepone)上进行实时荧光PCR反应，最优反应程序如表3所示。
表3 PCR反应程序表
优选地，PCR扩增的条件为：预变性阶段的条件95℃，1min；循环1，40个循环，条件为95℃15s，70℃PNA结合10s，引物退火及延伸温度60℃，时间为1min；；循环2条件为4℃保温。
反应结束后立即进行溶解曲线分析：95℃持续15s，冷却至65℃保持1min，并以0.3℃/s的速度逐渐升温至95℃持续15s。仪器软件自动分析出Ct值，即S YBR Green I检测荧光信号显著高于背景信号时的循环数。
4、PCR结果判定。
1)试剂盒有效性的判定。
阳性对照P1：阳性对照FAM信号通道所有的扩增曲线有明显的指数增长期，且Ct值均阳性≤30；溶解曲线分析，各位点PCR产物的Tm值如表4所示。
阳性对照P2:阳性对照FAM信号通道所有的扩增曲线有明显的指数增长期，且Ct值均阳性≤30；溶解曲线分析，各位点PCR产物的Tm值如表4所示。
阴性对照：阴性对照FAM信号通道所有的扩增曲线无明显的指数增长期，或溶解曲线上无特异性产物峰。
表4 IDH1/2基因各位点PCR产物的Tm值
| C394T/G395A | G419A | G515A | |
| 阳性对照P1 | 89.2±0.6℃ | 80.1±0.6℃ | 81.0±0.5℃ |
| 阳性对照P2 | 84.1±0.5℃ | 74.9±0.5℃ | 76.9±0.7℃ |
2)基因突变检测结果的判定。
通过以上步骤，确定实验结果有效的前提下，再对样本的结果进行判定。按照样本溶解曲线Tm值与野生型阳性对照溶解曲线Tm值的差值对样本检测结果进行判读，确定样本基因型。根据公式“△Tm值＝阳性对照P1的Tm值-样本的Tm值”计算有效检测样本的△Tm值，并按照以下步骤和表5对样本检测结果进行判读，确定样本是否存在突变。
表5结果判定
若样本检测反应管的△Tm值大于对应的△Tm Cut-Off参考值，则该样本为该反应管对应的突变阳性；反之则为该反应管对应的野生型样本。
产物峰Tm值类似于图1所示，检测样本的IDH1/2基因C394T或G395A位点为野生型。产物峰Tm值类似于图2所示，检测样本的IDH1/2基因G419A位点为野生型。产物峰Tm值类似于图3所示，检测样本的IDH1/2基因G515A位点为野生型。产物峰Tm值类似于图4所示，检测样本的IDH1/2基因C394T或G395A位点为突变型。产物峰Tm值类似于图5所示，检测样本的IDH1/2基因G419A位点为突变型。产物峰Tm值类似于图6所示，检测样本的IDH1/2基因G515A位点为突变型。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 上海赛安生物医药科技股份有限公司
<120> IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒
<130> 无
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 1
tatcccccgg cttgt 15
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 2
gcaaaatcac atta 14
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 3
agttcaagct gaaga 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 4
ccagggacta ggcgt 15
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 5
acgcctagtc cct 13
<210> 6
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 6
caggtcagtg gat 13
<210> 7
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 7
tatcatcata ggtt 14
<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 8
aatggaacta tcca 14
<210> 9
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 9
atcaccattg gcaa 14
Claims (10)
1.一种IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：包括用于检测IDH1/2基因第394密码子C394T位点和第395密码子G395A位点的上下游引物A，用于检测IDH1/2基因第419密码子G419A位点的上下游引物B，用于检测IDH1/2基因第515密码子G515A位点的上下游引物C，荧光染料SYBR Green ，以及肽核酸；
所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQID No.2所示；
所述上游引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQID No.4所示；
所述上游引物C的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述下游引物C的核苷酸序列如SEQID No.6所示；
所述肽核酸包括核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第394密码子C394T位点和野生型第395密码子G395A位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的肽核酸A，核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第419密码子G419A位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的肽核酸B，核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第515密码子G515A位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的肽核酸C。
2.根据权利要求1所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述上下游引物进行了LNA修饰。
3.根据权利要求1所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述上下游引物在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L。
4.根据权利要求3所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述上下游引物A在反应体系中的最终浓度为0.19μM/L，所述上下游引物B在反应体系中的最终浓度为0.2μM/L，所述上下游引物C在反应体系中的最终浓度为0.15μM/L。
5.根据权利要求1所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述肽核酸在反应体系中的最终浓度均为1～1.5μM/L。
6.根据权利要求5所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述肽核酸A、B、C在反应体系中的最终浓度均为1.25μM/L。
7.一种采用如权利要求1所述的检测体系的IDH1/2基因突变检测产品。
8.一种IDH1/2基因突变检测试剂盒，其特征在于：包括PCR检测液A、PCR检测液B、PCR检测液C和SYBR Green混合液；
所述PCR检测液A包括用于检测IDH1/2基因第394密码子C394T位点和野生型第395密码子G395A位点的上下游引物A和肽核酸A，PCR检测液B包括用于检测IDH1/2基因第419密码子G419A位点的上下游引物B和肽核酸B，PCR检测液C包括用于检测IDH1/2基因第515密码子G515A位点的上下游引物C和肽核酸C；
所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQID No.2所示；
所述上游引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQID No.4所示；
所述上游引物C的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述下游引物C的核苷酸序列如SEQID No.6所示；
所述肽核酸包括核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第394密码子C394T位点和野生型第395密码子G395A位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的肽核酸A，核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第419密码子G419A位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的肽核酸B，核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第515密码子G515A位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的肽核酸C。
9.根据权利要求8所述的IDH1/2基因突变检测试剂盒，其特征在于：所述上下游引物进行了LNA修饰；所述上下游引物在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L；所述肽核酸在反应体系中的最终浓度均为1～1.5μM/L。
10.根据权利要求8所述的IDH1/2基因突变检测试剂盒，其特征在于：还包括阳性对照P1、阳性对照P2和阴性对照；
所述阳性对照液P1是浓度为100ng/μL的包含IDH1/2基因C394T、G395A、G419A、G515A位点的野生型质粒溶液；
所述阳性对照液P2是浓度为100ng/μL的包含IDH1/2基因C394T、G395A、G419A、G515A位点的突变型质粒溶液；
所述阴性对照液是不含IDH1/2基因的基因组DNA溶液。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2017110947020 | 2017-11-09 | ||
| CN201711094702 | 2017-11-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107841541A true CN107841541A (zh) | 2018-03-27 |
Family
ID=61664344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711361069.7A Pending CN107841541A (zh) | 2017-11-09 | 2017-12-18 | Idh1/2基因突变检测体系及其试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107841541A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114752677A (zh) * | 2022-06-13 | 2022-07-15 | 北京思诺普斯生物科技有限公司 | 一种快速检测idh1突变的引物组、试剂盒及扩增方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103436613A (zh) * | 2013-08-21 | 2013-12-11 | 中国人民解放军第二军医大学 | Idh1/idh2基因突变的荧光pcr检测试剂盒及其用途 |
| CN105368924A (zh) * | 2014-11-29 | 2016-03-02 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | Idh1/2基因突变检测体系及其试剂盒 |
-
2017
- 2017-12-18 CN CN201711361069.7A patent/CN107841541A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103436613A (zh) * | 2013-08-21 | 2013-12-11 | 中国人民解放军第二军医大学 | Idh1/idh2基因突变的荧光pcr检测试剂盒及其用途 |
| CN105368924A (zh) * | 2014-11-29 | 2016-03-02 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | Idh1/2基因突变检测体系及其试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 林寒等: ""应用肽核酸钳制 PCR技术检测胰腺癌 K-ras基因突变"", 第二军医大学学报, vol. 30, no. 7, pages 762 - 764 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114752677A (zh) * | 2022-06-13 | 2022-07-15 | 北京思诺普斯生物科技有限公司 | 一种快速检测idh1突变的引物组、试剂盒及扩增方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107419018B (zh) | 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒 | |
| CN102367478B (zh) | 用于KRAS基因突变分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法 | |
| CN104099425B (zh) | 一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒 | |
| CN104805208B (zh) | 用于检测人类kras基因7种热点突变的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 | |
| US8980556B2 (en) | High resolution melting analysis as a prescreening tool | |
| CN107034277B (zh) | 一种检测低丰度基因突变的方法 | |
| CN110964814B (zh) | 用于核酸序列变异检测的引物、组合物及方法 | |
| CN114277135B (zh) | 胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒 | |
| CN103695555A (zh) | K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒及检测方法 | |
| CN107447013B (zh) | 检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒 | |
| CN106987640A (zh) | Pik3ca基因突变检测引物探针及其试剂盒 | |
| CN105256021B (zh) | 基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒 | |
| CN105420361B (zh) | 基于酶切灵敏检测人类egfr基因突变的方法及试剂盒 | |
| CN107488711A (zh) | 点突变的基因型检测的方法及其试剂盒 | |
| CN108456721B (zh) | 同步检测基因突变和甲基化的方法及其应用 | |
| CN104862401B (zh) | 检测kras基因热点突变位点的引物、试剂盒及其pcr方法 | |
| CN110408697A (zh) | Npm1基因突变分型检测方法及试剂盒 | |
| CN108004320A (zh) | Egfr基因突变检测体系及其试剂盒 | |
| CN107904290A (zh) | Pdgfra基因突变检测体系及其试剂盒 | |
| CN107513577A (zh) | 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒 | |
| CN107937505A (zh) | Cyp2d6*10基因多态性检测体系及其试剂盒 | |
| CN107841541A (zh) | Idh1/2基因突变检测体系及其试剂盒 | |
| CN108004317A (zh) | Pik3ca基因突变检测体系及其试剂盒 | |
| CN109136367B (zh) | 提高braf基因v600e突变的诊断效率的方法 | |
| CN105969908B (zh) | Ctnnb1第三外显子突变检测引物探针及其试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180327 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |