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CN105916519B - 抗Siglec-8抗体及其使用方法 - Google Patents

抗Siglec-8抗体及其使用方法 Download PDF

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CN105916519B CN201480067583.8A CN201480067583A CN105916519B CN 105916519 B CN105916519 B CN 105916519B CN 201480067583 A CN201480067583 A CN 201480067583A CN 105916519 B CN105916519 B CN 105916519B
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Abstract

本发明提供人源化抗Siglec‑8抗体和它们在治疗和预防嗜曙红细胞介导的病症和/或肥大细胞介导的病症中的用途，以及包含该人源化抗Siglec‑8抗体的组合物和试剂盒。

Description

抗Siglec-8抗体及其使用方法
对相关申请的交叉援引
本申请要求2013年12月9日提交的美国临时专利申请No.61/913,891的优先权，将其通过援引完整收入本文。
ASCII文本文件上序列表的提交
ASCII文本文件上的下述提交的内容通过援引完整收入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名称：701712000140SeqList.txt，记录日期：2014年12月9日，大小：115KB)。
发明领域
本发明涉及抗人Siglec-8抗体和治疗或预防由表达Siglec-8的细胞介导的疾病的方法。
发明背景
Siglec(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素)是主要在白细胞上找到的单次跨膜细胞表面蛋白，特征在于它们对附着至细胞表面糖缀合物的唾液酸的特异性。Siglec家族含有至少15个在哺乳动物中找到的成员(Pillai et al.,Annu Rev Immunol.,2012,30:357-392)。这些成员包括唾液酸粘附素(Siglec-1)，CD22(Siglec-2)，CD33(Siglec-3)，髓磷脂相关糖蛋白(Siglec-4)，Siglec-5，OBBP1(Siglec-6)，AIRM1(Siglec-7)，SAF-2(Siglec-8)，和CD329(Siglec-9)。在人中表达但在小鼠中不表达的一个成员，Siglec-8最初是作为鉴定新颖人嗜曙红细胞蛋白质的成就的一部分发现的。在由嗜曙红细胞表达以外，它还由肥大细胞和嗜碱性细胞表达。Siglec-8识别一种硫酸化聚糖，即6’-磺基-唾液酰基Lewis X或6’-磺基-唾液酰基-N-乙酰基-S-乳糖胺，而且含有细胞内免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)结构域，其显示出抑制肥大细胞功能。
连同肥大细胞一起，嗜曙红细胞能促进发挥有益功能性作用的炎症应答，诸如控制特定组织部位处的感染。在炎症应答期间，嗜曙红细胞的凋亡可以经由存活促进细胞因子(诸如IL-3和GM-CSF)的活性受到抑制。然而，没有通过凋亡快速去除的已活化的嗜曙红细胞增多可导致嗜曙红细胞颗粒蛋白质在早已发炎部位的释放，这会损害组织及引起炎症进一步加剧。数种疾病已经显示出与嗜曙红细胞活化有联系，诸如丘-施二氏综合征，类风湿性关节炎，和变应性哮喘(Wechsler et al.,J Allergy Clin Immunol.,2012,130(3):563-71)。当前需要能控制涉及炎症的免疫细胞的活性(诸如嗜曙红细胞和肥大细胞的活性)的疗法。
先前的研究已经证明嗜曙红细胞在Siglec-8与针对Siglec-8细胞外部分生成的特异性鼠抗体交联时经历凋亡(Nutku et al.,Blood,2003,336:918-24)。这些抗体描述于美国专利No.8,207,305，美国专利No.8,197,811，美国专利No.7,871,612，和美国专利No.7,557,191。然而，仍然需要开发以高亲和力和特异性识别人Siglec-8的人源化抗Siglec-8抗体。此类抗Siglec-8抗体的发现可容许开发由嗜曙红细胞和/或肥大细胞的活性介导的疾病的治疗。
通过援引将本文中引用的所有参考文献(包括专利申请，专利出版物，和科学文献)完整收入本文,就像明确且个别指出通过援引收录每一篇参考文献。
发明概述
本文中提供抗Siglec-8抗体(包括人源化抗Siglec-8抗体)，包含它的组合物，和使用它的方法。
一方面，本文中提供一种特异性结合人Siglec-8的人源化抗体，其中该人源化抗体对人Siglec-8的结合亲和力和/或结合亲合力比抗体2E2和/或抗体2C4对人Siglec-8的结合亲和力和/或结合亲合力要高。在一些实施方案中，该人Siglec-8是二聚体。在一些实施方案中，该人Siglec-8包含融合至免疫球蛋白Fc区的人Siglec-8胞外域。在一些实施方案中，该Fc区是人IgG1Fc区。在一些实施方案中，该Fc区是人IgG4Fc区。在一些实施方案中，该人Siglec-8包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该人源化抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO:16或21的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含包含人IgG Fc区的重链Fc区。在进一步的实施方案中，该人IgG Fc区包含人IgG1或IgG4。在一些实施方案中，该人IgG1包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。在一些实施方案中，该人IgG4包含SEQ IDNO:79的氨基酸序列。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链；和/或包含选自SEQ ID NO:76或77的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，该人IgG4包含氨基酸替代S228P，其中氨基酸残基是依照Kabat中的EU索引编号的。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链；和/或包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，已经工程化改造该抗体以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一些实施方案中，该抗体包含两条重链且其中该抗体的两条重链至少一条或两条是非岩藻糖基化的。
另一方面，本文中提供一种特异性结合人Siglec-8的人源化抗体，其中该抗体在热转移测定法(thermal shift assay)中具有至少约70℃至至少约72℃的Tm。在一些实施方案中，该抗体在热转移测定法中具有约70℃，约71℃，或约72℃的Tm。在一些实施方案中，该抗体具有与嵌合2C4抗体相比相同或更高的Tm。在一些实施方案中，该抗体具有与具有包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链的抗体相比相同或更高的Tm。
在一些实施方案中，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO:16或21的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含包含人IgG Fc区的重链Fc区。在进一步的实施方案中，该人IgG Fc区包含人IgG1或IgG4。在一些实施方案中，该人IgG1包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。在一些实施方案中，该人IgG4包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链；和/或包含选自SEQ ID NO:76或77的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，该人IgG4包含氨基酸替代S228P，其中氨基酸残基是依照Kabat中的EU索引编号的。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链；和/或包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，已经工程化改造该抗体以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一些实施方案中，该抗体的重链至少一条或两条是非岩藻糖基化的。
还有另一方面，本文中提供一种特异性结合人Siglec-8的人源化抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ IDNO:63和67-70的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQID NO:66或71的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含包含选自SEQ IDNO:11-14的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO:23-24的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H3；和/或该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含包含选自SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO:16或21的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含包含人IgG Fc区的重链Fc区。在进一步的实施方案中，该人IgG Fc区包含人IgG1或IgG4。在一些实施方案中，该人IgG1包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。在一些实施方案中，该人IgG4包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。在一些实施方案中，该人IgG4包含氨基酸替代S228P，其中氨基酸残基是依照Kabat中的EU索引编号的。在一些实施方案中，已经工程化改造该抗体以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一些实施方案中，该抗体的重链至少一条或两条是非岩藻糖基化的。
还有另一方面，本文中提供一种特异性结合人Siglec-8的人源化抗体，其中该抗体包含包含选自SEQ ID NO:2-14的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO:16-24的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，已经工程化改造该抗体以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一些实施方案中，该抗体的重链至少一条或两条是非岩藻糖基化的。
还有另一方面，本文中提供一种特异性结合人Siglec-8的人源化抗体，其中该抗体包含包含选自SEQ ID NO:2-10的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO:16-22的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，已经工程化改造该抗体以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一些实施方案中，该抗体的重链至少一条或两条是非岩藻糖基化的。
另一方面，本文中提供一种特异性结合人Siglec-8的人源化抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中(a)该重链可变区包含：(1)包含选自SEQ ID NO:26-29的氨基酸序列的HC-FR1；(2)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1；(3)包含选自SEQ IDNO:31-36的氨基酸序列的HC-FR2；(4)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2；(5)包含选自SEQ ID NO:38-43的氨基酸序列的HC-FR3；(6)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H3；和(7)包含选自SEQ ID NO:45-46的氨基酸序列的HC-FR4，和/或(b)该轻链可变区包含：(1)包含选自SEQ ID NO:48-49的氨基酸序列的HC-FR1；(2)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-H1；(3)包含选自SEQ ID NO:51-53的氨基酸序列的HC-FR2；(4)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-H2；(5)包含选自SEQ ID NO:55-58的氨基酸序列的HC-FR3；(6)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-H3；和(7)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的HC-FR4。在一些实施方案中，已经工程化改造该抗体以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一些实施方案中，该抗体的重链至少一条或两条是非岩藻糖基化的。
还有另一方面，本文中提供一种分离的抗体，其结合人Siglec-8并通过ADCC活性杀死表达Siglec-8的肥大细胞。在一些实施方案中，该抗体在体外杀死表达Siglec-8的肥大细胞(例如在实施例2中描述的细胞培养物测定法中测量的)。在一些实施方案中，该抗体在施用治疗有效量时在受试者中消减表达Siglec-8的肥大细胞。在一个进一步的实施方案中，与处理前的基线水平相比，该抗体消减自该受试者获得的样品中至少约20％(例如至少)的表达Siglec-8的肥大细胞。在本文中的任何实施方案中，该样品可以是组织样品或生物学流体样品。在一些实施方案中，该组织样品是选自下组的一项或多项：皮肤，肺，骨髓，和鼻息肉。在一些实施方案中，该生物学流体样品是选自下组的一项或多项：血液，支气管肺泡灌洗液，和鼻灌洗液。在本文中的任何实施方案中，可以工程化改造该抗体以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一些实施方案中，该抗体的重链至少一条或两条是非岩藻糖基化的。在进一步的实施方案中，可以在具有α1,6-岩藻糖基转移酶(Fut8)敲除的细胞系中生成该抗体。在一些进一步的实施方案中，可以在过表达β1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶(acetylglycosminyltransferase)III(GnT-III)的细胞系中生成该抗体。在进一步的实施方案中，该细胞系另外过表达高尔基μ-甘露糖苷酶II(ManII)。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以在Fc区中包含至少一处改善ADCC活性的氨基酸替代。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以是人源化抗体，嵌合抗体或人抗体。在一些实施方案中，该抗体是人IgG1抗体。在一些实施方案中，该抗体是鼠抗体。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQID NO:91的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的HVR-L3。在一个进一步的实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的HVR-L3。在一个进一步的实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含SEQID NO:110的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L3。在一个进一步的实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-L3。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:67-70的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-L3。在本文中的任何实施方案中，该受试者可以是人。
仍有另一方面，本文中提供一种抗体，其结合人Siglec-8和非人灵长类Siglec-8。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ IDNO:95的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的HVR-L3。在一个进一步的实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L3。在一个进一步的实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以结合人Siglec-8结构域1(例如包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的结构域1)中的表位。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以结合人Siglec-8结构域3(例如包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的结构域3)中的表位。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以结合人Siglec-8结构域2(例如包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的结构域2)中的表位。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以是人源化抗体，嵌合抗体或人抗体。在一些实施方案中，该抗体是鼠抗体。在一些实施方案中，该抗体是IgG1或IgG4抗体(例如人IgG1或IgG4)。
另一方面，本文中提供一种抗人Siglec-8抗体，其结合包含SEQ ID NO:116的氨基酸的融合蛋白但不结合包含SEQ ID NO:115的氨基酸的融合蛋白。在一些实施方案中，本文所述抗体结合包含SEQ ID NO:117的氨基酸的融合蛋白但不结合包含SEQ ID NO:115的氨基酸的融合蛋白。在一些实施方案中，本文所述抗体结合包含SEQ ID NO:117的氨基酸的融合蛋白但不结合包含SEQ ID NO:116的氨基酸的融合蛋白。在本文中的一些实施方案中，该抗体可以包含重链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ IDNO:100的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的HVR-L3。在一个进一步的实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的一些实施方案中，该抗体可以包含重链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的HVR-L3。在一个进一步的实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的一些实施方案中，该抗体可以包含重链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L3。在一个进一步的实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含SEQID NO:111的氨基酸序列的轻链可变区。
另一方面，本文中提供一种结合人Siglec-8的人源化抗体，其中消减已活化的人嗜曙红细胞的EC50少于抗体2E2或2C4对人Siglec-8的EC50。在一些实施方案中，该人源化抗体的EC50是抗体2E2或2C4对人Siglec-8的EC50的约85％或更少。在一些实施方案中，该人源化抗体的EC50是抗体2E2或2C4对人Siglec-8的EC50的约85％，约80％，约70％，约65％，约60％，约55％，约50％，约45％，约40％，约35％，约30％，约25％，约20％，约15％，约10％或约5％或更少。在本文中的任何实施方案中，该人源化抗体可以包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-L3。在本文中的任何实施方案中，该人源化抗体可以包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO:16或21的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，该人源化抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQID NO:67-70的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQID NO:71的氨基酸序列的HVR-L3。在本文中的任何实施方案中，该人源化抗体可以包含包含选自SEQ ID NO:2-14的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO:16-24的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的HVR-L3。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ IDNO:101的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的HVR-L3。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L3。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含包含人IgG Fc区的重链Fc区。在进一步的实施方案中，该人IgG Fc区包含人IgG1或IgG4。在一些实施方案中，该人IgG1包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。在一些实施方案中，该人IgG4包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链；和/或包含选自SEQ ID NO:76或77的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，该人IgG4包含氨基酸替代S228P，其中氨基酸残基是依照Kabat中的EU索引编号的。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链；和/或包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链。
另一方面，本文中提供一种核酸，其编码上文和本文所述任何抗体。还有另一方面，本文中提供一种载体，其包含本文所述核酸。在一个实施方案中，该载体是表达载体。还有另一方面，本文中提供一种宿主细胞，其包含本文所述核酸。在一些实施方案中，该宿主细胞表达且生成该抗体。
另一方面，本文中提供一种生成抗体的方法，其包括在生成该抗体的条件下培养包含编码本文所述抗体的一种或多种核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括回收由该宿主细胞生成的抗体。本文中还提供通过该方法生成的抗Siglec-8抗体。本文中还提供本文所述抗Siglec-8抗体的抗原结合片段。
另一方面，本文中提供一种药物组合物，其包含上文和本文所述抗体或其抗原结合片段和药学可接受载剂。
另一方面，本文中提供一种包含特异性结合人Siglec-8的抗体或其片段的组合物，其中该抗体包含Fc区和连接至该Fc区的N-糖苷连接的碳水化合物链，其中该组合物中少于50％的该N-糖苷连接的碳水化合物链含有岩藻糖残基。在一些实施方案中，基本上无一该N-糖苷连接的碳水化合物链含有岩藻糖残基。在一些实施方案中，该抗体是人源化抗体，嵌合抗体或人抗体。在一些实施方案中，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:2-10的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:16-22的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:67-70的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含包含选自SEQ ID NO:11-14的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO:23-24的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体包含包含选自SEQ ID NO:2-14的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO:16-24的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的任何实施方案中，该组合物可以进一步包含药学可接受载剂。在本文中的任何实施方案中，该抗体对人Siglec-8的结合亲和力和/或结合亲合力可以比抗体2E2或2C4对人Siglec-8的结合亲和力和/或结合亲合力要高。在本文中的任何实施方案中，该抗体在热转移测定法中可以具有至少约70℃至至少约72℃的Tm。在一些实施方案中，该抗体具有约70℃，约71℃，或约72℃的Tm。在一些实施方案中，该抗体具有与嵌合2C4抗体相比相同或更高的Tm。在一些实施方案中，该抗体具有与具有包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链的抗体相比相同或更高的Tm。
另一方面，本文中提供一种在受试者中治疗或预防由表达Siglec-8的细胞介导的疾病的方法，该方法包括对该受试者施用有效量的本文所述抗体或其抗原结合片段或本文所述组合物。在一些实施方案中，该疾病是嗜曙红细胞介导疾病。在一些实施方案中，该疾病是肥大细胞介导疾病。在一些实施方案中，该疾病选自下组：哮喘，变应性鼻炎，鼻息肉病，特应性皮炎，慢性荨麻疹，肥大细胞增多，嗜曙红细胞性白血病，和嗜曙红细胞增多综合征。在一些实施方案中，该疾病选自下组：少粒细胞性哮喘，急性或慢性气道超敏感性，嗜曙红细胞性食道炎，丘-施二氏综合征，与细胞因子的有关的炎症，与表达Siglec-8的细胞有关的炎症，与表达Siglec-8的细胞有关的恶性，物理性荨麻疹，寒冷性荨麻疹，压迫性荨麻疹，大疱性类天疱疮，食物过敏，和变应性支气管肺曲霉病(ABPA)。在一些实施方案中，该抗体抑制变应性反应的一种或多种症状。在一些实施方案中，该变应性反应是I型超敏感性反应。在本文中的任何实施方案中，该受试者可以罹患通过吸入式皮质类固醇，短效β2激动剂，长效β2激动剂，或其组合没有得到恰当控制的哮喘。
另一方面，本文中提供一种在受试者中消减表达Siglec-8的肥大细胞的方法，其包括对该受试者施用有效量的结合人Siglec-8的抗体，其中该抗体通过ADCC活性杀死表达Siglec-8的肥大细胞。在一些实施方案中，该抗体在体外杀死表达Siglec-8的肥大细胞(例如在实施例2中描述的细胞培养物测定法中测量的)。在一些实施方案中，与处理前的基线水平相比，该抗体消减自该受试者获得的样品中至少约20％的表达Siglec-8的肥大细胞。在本文中的任何实施方案中，该样品可以是组织样品或生物学流体样品。在一些实施方案中，该组织是选自下组的一项或多项：皮肤，肺，骨髓，和鼻息肉。在一些实施方案中，该生物学流体样品是选自下组的一项或多项：血液，支气管肺泡灌洗液，和鼻灌洗液。在本文中的任何实施方案中，可以工程化改造该抗体以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含两条重链且其中该抗体的两条重链至少一条或两条是非岩藻糖基化的。在进一步的实施方案中，该抗体可以在具有aα1,6-岩藻糖基转移酶(Fut8)敲除的细胞系中生成。在一些进一步的实施方案中，该抗体可以在过表达β1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnT-III)的细胞系中生成。在进一步的实施方案中，该细胞系另外过表达高尔基μ-甘露糖苷酶II(ManII)。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以在Fc区中包含至少一处改善ADCC活性的氨基酸替代。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以是人源化抗体，嵌合抗体或人抗体。在一些实施方案中，该抗体是人IgG1抗体。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的HVR-L3。在一个进一步的实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的HVR-L3。在一个进一步的实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L3。在一个进一步的实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQID NO:66的氨基酸序列的HVR-L3。在本文中的任何实施方案中，该抗体可以包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:67-70的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-L3。在本文中的任何实施方案中，该受试者具有由表达Siglec-8的细胞介导的疾病。在一些实施方案中，该疾病选自下组：哮喘，变应性鼻炎，鼻息肉病，特应性皮炎，慢性荨麻疹，肥大细胞增多，嗜曙红细胞性白血病，和嗜曙红细胞增多综合征。在一些实施方案中，该疾病选自下组：少粒细胞性哮喘(pauci granulocytic asthma)，急性或慢性气道超敏感性，嗜曙红细胞性食道炎，丘-施二氏综合征，与细胞因子的有关的炎症，与表达Siglec-8的细胞有关的炎症，与表达Siglec-8的细胞有关的恶性，物理性荨麻疹，寒冷性荨麻疹，压迫性荨麻疹，大疱性类天疱疮，食物过敏，和变应性支气管肺曲霉病(ABPA)。在一些实施方案中，该抗体抑制变应性反应的一种或多种症状。在一些实施方案中，该变应性反应是I型超敏感性反应。在本文中的任何实施方案中，该受试者可以罹患通过吸入式皮质类固醇，短效β2激动剂，长效β2激动剂，或其组合没有得到恰当控制的哮喘。在本文中的任何实施方案中，该受试者可以是人。
要理解的是，可以组合本文所述各种实施方案的一项，一些，或所有特性以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面对本领域技术人员会变得显而易见。通过下面的详细描述进一步描述本发明这些和其它实施方案。
附图简述
图1是一项序列比对，显示人源化抗体重链序列的比较。小鼠2E2抗体的分子模型中距CDR
Figure BDA0001014201170000141
内的框架残基通过*代表；距CDR
Figure BDA0001014201170000142
内的残基和在受体人框架中不同的VCI残基以^突显,受体人框架中的这些残基变成小鼠的回复突变通过@指示；来自人种系的体细胞突变通过°指示；如果那些残基与AF471521FW和mou2E2(即小鼠2E2)不同或与AF471521框架不同且与mou2E2(即小鼠2E2)相同，那么将受体人框架的对应残基回复突变成人种系并通过+指示。重链型式2中突显的序列代表mou2E2(即小鼠2E2)CDR进入最接近的人种系家族(即最接近的种系序列)的直接嫁接。m2E2VH对应于SEQ ID NO:1；人FW AF471521对应于SEQID NO:120；种系X92218VH366对应于SEQ ID NO:121；2E2RHA对应于SEQ ID NO:2；2E2RHB对应于SEQ ID NO:3；2E2RHC对应于SEQ ID NO:4；2E2RHD对应于SEQ ID NO:5；2E2RHE对应于SEQ ID NO:6；2E2RHF对应于SEQ ID NO:7；2E2RHG对应于SEQ ID NO:8；IGHV4-59FW对应于SEQ ID NO:122；2E2RHA2对应于SEQ ID NO:9；而2E2RHB2对应于SEQ ID NO:10。
图2是一项序列比对，显示人源化抗体轻链序列的比较。小鼠2E2抗体的分子模型中距CDR
Figure BDA0001014201170000151
内的框架残基通过*代表；距CDR
Figure BDA0001014201170000152
内的残基和在受体人框架中不同的VCI残基通过+指示；人FW中的这些残基变成小鼠的回复突变通过@指示；变成在X93721框架中与小鼠不同的残基的人种系的回复突变通过#指示。m2E2VK对应于SEQ ID NO:15；X93721对应于SEQ ID NO:123；种系X01668对应于SEQ ID NO:124；m2E2RKA对应于SEQ ID NO:16；m2E2RKB对应于SEQ ID NO:17；m2E2RKC对应于SEQ ID NO:18；m2E2RKD对应于SEQ ID NO:19；m2E2RKE对应于SEQ ID NO:20；m2E2RKF对应于SEQ ID NO:21；而m2E2RKG对应于SEQ ID NO:22。
图3是一项序列比对，显示人源化抗体轻和重链二者中突变的CDR序列的比较。在变体中突变成更接近种系序列的CDR残基以#指示。2E2RKA对应于SEQ ID NO:16；2E2RKF对应于SEQ ID NO:21；2E2RKA F-Y突变对应于SEQ ID NO:23；2E2RKF F-Y突变对应于SEQ IDNO:24；2E2RHA对应于SEQ ID NO:2；2E2RHE对应于SEQ ID NO:6；2E2RHE S-G突变对应于SEQID NO:11；2E2RHE E-D突变对应于SEQ ID NO:12；2E2RHE Y-V突变对应于SEQ ID NO:13；而2E2RHE E-D三重突变对应于SEQ ID NO:14。
图4是一幅图，显示于所示温度加热10分钟，然后冷却至4℃，之后实施Siglec-8结合ELISA，已纯化的由嵌合2C4或2E2RHE与2E2RKA，2E2RKF，2E2RKA CDR3突变体，或2E2RKFCDR3突变体的组合编码的候选抗体的Siglec-8抗原结合的比较。
图5是一幅图，显示已纯化的2C4候选抗体与ch2C4(即嵌合2C4抗体)相比的Tm。
图6是一幅图，显示于-20℃冷冻60分钟并于室温融化后嵌合和人源化抗Siglec-8抗体的稳定性。
图7是一幅图，显示抗Siglec-8抗体对嗜曙红细胞的杀伤。在所示抗Siglec-8和对照抗体浓度存在下将总外周血白细胞温育16小时。通过流式细胞术监测嗜曙红细胞数目的减少，并作为具有高侧散射(SSC高)的CD16阴性IL5Rα+细胞的损失来量化。
图8是一系列图，显示抗Siglec-8抗体对人肥大细胞的体外凋亡和体内消减。图8A。HEKA IgG4抗体，非岩藻糖基化的HEKA IgG1抗体和低岩藻糖嵌合1H10IgG1抗体对来自移植有人造血干细胞的NSGS小鼠的腹膜灌洗液的原代人肥大细胞的NK细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性，通过48小时时的LDH释放展现。对照指示岩藻糖基化的不结合Siglec-8的人IgG1同种型抗体。图8B。体内Siglec-8阳性肥大细胞的消减。用HEKAIgG4抗体，非岩藻糖基化的HEKA IgG1抗体，鼠1C3抗体，或不结合Siglec-8的人IgG4同种型对照抗体腹膜内处理以与人肥大细胞上的相当的水平在肥大细胞表面上选择性表达Siglec-8的Siglec-8转基因小鼠。n＝4只小鼠每组。
图9是一幅图，显示人源化抗Siglec-8IgG4抗体对人源化小鼠中I型超敏感性反应的抑制。通过用抗NP-IgE(投递至右耳)或PBS对照(投递至左耳)敏化并在敏化后24小时施用NP-BSA，在移植NSGS小鼠的耳中诱发被动皮肤过敏反应。敏化前24小时(通过*指示)或敏化后2小时(通过@指示)用HEKA IgG4或不结合Siglec-8的人IgG4同种型对照抗体处理小鼠。显示了攻击后3小时或24小时时耳厚度的均值变化和标准误差。HEKA IgG4抗体处理的小鼠，n＝5只小鼠每组；而同种型对照抗体处理的小鼠，n＝4只小鼠每组。
图10是一系列柱形图，显示鼠抗Siglec-8单克隆抗体2E2，1C3，和1H10对狒狒和人嗜曙红细胞(CD49+CD16-SSC高细胞)的结合，通过流式细胞术展现。柱形图显示狒狒或人血液嗜曙红细胞的数目，针对荧光强度为每种抗体绘图，与不结合Siglec-8的小鼠IgG1同种型对照抗体比较。
发明详述
I.定义
在详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于特定组合物或生物学系统，它们当然可以有所变化。还应理解本文中所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并非意图对其进行限制。如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数所指物，除非另有明确说明。如此，例如，提及“一个/种分子”任选包括两个/种或更多个/种此类分子的组合，诸如此类。
如本文中使用的，术语“约”指此技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。本文中提到“约”数值或参数包括(且描述)涉及该数值或参数本身的实施方案。
理解的是，本文所述发明的各个方面和实施方案包括“包含”，“由……组成”，和“基本上由……组成”方面和实施方案。
术语“抗体”包括多克隆抗体，单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)，具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，双抗体，和单链分子，及抗体片段(例如Fab，F(ab’)2，和Fv)。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”可互换使用。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成，而且包含10个抗原结合位点，而IgA抗体包含与J链组合的2-5个能聚合而形成多价装配物的基本4链单元。在IgG的情况中，4链单元通常是约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在N-末端具有一个可变域(VH)，接着是三个(对于α和γ链)或四个(对于μ和ε同种型)恒定域(CH)。每条轻链在N-末端具有一个可变域(VL)，接着是其另一端的一个恒定域(CL)。VL与VH排列在一起，而CL与重链第一恒定域(CH1)排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成界面。一个VH和一个VL一起配对而形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见例如Basicand Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Sties,Abba I.Terr and TristramG.Parsolw(编),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,第71页和第6章。
根据其恒定域氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的L链可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。根据其重链恒定域(CH)氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类别或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，分别具有称作α，δ，ε，γ和μ的重链。根据CH序列和功能的较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人类表达下列亚类：IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。IgG1抗体可以以多种多态性变体存在，称作同种异型(综述见Jefferis and Lefranc 2009.mAbs Vol 1Issue 4 1-7)，它们任一均适合于在本发明中使用。人群中的常见同种异型变体就是那些通过字母a,f,n,z表示的。
“分离”抗体指已经鉴定，自其生成环境(例如天然或重组)的一种成分分开和/或回收的抗体。在一些实施方案中，分离的多肽与其生成环境的所有其它成分没有关联。其生成环境的污染性成分(诸如源自重组转染细胞的)是通常会干扰抗体的研究，诊断或治疗用途的材料，而且可以包括酶，激素，和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一些实施方案中，多肽纯化至(1)以重量计超过95％的抗体，如通过例如Lowry法测定的，而且在一些实施方案中，以重量计超过99％；(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N端或内部氨基酸序列的程度；或(3)均质，根据非还原性或还原性条件下的SDS-PAGE使用考马斯蓝或银染剂。分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为抗体的天然环境的至少一种成分不会存在。然而，分离的多肽或抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变和/或翻译后修饰(例如异构化，酰胺化)外。在一些实施方案中，单克隆抗体在重链和/或轻链处具有C端切割。例如，在重链和/或轻链的C端切割1，2，3，4，或5个氨基酸残基。在一些实施方案中，C端切割自重链去除C端赖氨酸。在一些实施方案中，单克隆抗体在重链和/或轻链处具有N端切割。例如，在重链和/或轻链的N端切割1，2，3，4，或5个氨基酸残基。在一些实施方案中，截短形式的单克隆抗体可以通过重组技术来生成。在一些实施方案中，单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。在一些实施方案中，单克隆抗体是高度特异性的，针对多个抗原性位点(诸如双特异性抗体或多特异性抗体)。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，有待依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法，重组DNA法，噬菌体展示技术，及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术。
术语“裸抗体(裸露的抗体)”指未缀合细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。
术语“全长抗体”，“完整抗体”和“全抗体”可互换使用，指基本上完整形式的抗体，与抗体片段不同。具体而言，完整抗体包括那些具有重链和轻链(包括Fc区)的。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。在有些情况中，完整抗体可具有一项或多项效应器功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的例子包括Fab，Fab’，F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利No.5,641,870,实施例2；Zapata等,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由完整L链及H链可变区域(VH)和重链第一恒定域(CH1)组成。每个Fab片段对于抗原结合是单价的，即它具有一个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab’)2片段，它大体相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有不同抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab’)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应器功能由Fc区中的序列来决定，该区域也受到在某些类型的细胞上找到的Fc受体(FcR)识别。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密，非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中生发出六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。
“单链Fv”，也缩写成“sFv”或“scFv”，是包含连接成一条多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施方案中，sFv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得sFv能够形成结合抗原的期望结构。关于sFv的综述参见Pluckthun，于《ThePharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994。
本发明抗体的“功能性片段”包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结合或可变区或抗体的保留或具有改良FcR结合能力的Fc区。抗体片段的例子包括线性抗体，单链抗体分子和自抗体片段形成的多特异性抗体。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过用例如感兴趣抗原免疫短尾猴(macaque monkey)而生成的抗体。如本文中所使用的，“人源化抗体”是“嵌合抗体”的一个子集。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的HVR残基用具有期望特异性，亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。一般而言，人源化抗体将包含至少一个，通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白序列的高变环，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR区，尽管FR区可包含一处或多处改进抗体性能(诸如结合亲和力，异构化，免疫原性等)的个别FR残基替代。在一些实施方案中，FR中这些氨基酸替代的数目，H链中不超过6处，L链不超过3处。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；及美国专利No.6,982,321和7,087,409。在一些实施方案中，人源化抗体针对单一抗原性位点。在一些实施方案中，人源化抗体针对多个抗原性位点。一种备选人源化方法记载于美国专利No.7,981,843和美国专利申请公开文本No.2006/0134098。
抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链可变域和轻链可变域分别可以称为“VH”和“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分(相对于同一类的其它抗体而言)且包含抗原结合位点。
术语“高变区”，“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1，H2，H3)，三个在VL中(L1，L2，L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu等，Immunity 13:37-45(2000)；Johnsonand Wu,于:Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman等,Nature 363:446-448(1993)；及Sheriff等,NatureStruct.Biol.3:733-736(1996)。
本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。作为Kabat互补决定区(CDR)的HVR是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。Chothia HVR改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
Figure BDA0001014201170000211
除非另外指明，可变域残基(HVR残基和框架区残基)是依照Kabat等,见上文编号的。
“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的HVR残基外的那些残基。
表述“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变体指Kabat等,见上文中用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a，82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
为了本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或人共有框架衍生的VL或VH框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架“衍生”的受体人框架或人共有框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有先前存在的氨基酸序列变化。在一些实施方案中，先前存在的氨基酸变化的数目是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大比对所需的任何算法。例如，给定氨基酸序列A相对于(to)，与(with)，或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于，与，或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y 乘 100
其中X是由序列比对程序在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。
“结合”或“特异性结合”特定多肽或特定多肽上的表位或者对其“特异”的抗体指结合该特定多肽或特定多肽上的表位且基本上不结合任何其它多肽或多肽表位的抗体。在一些实施方案中，本文所述抗Siglec-8抗体对无关的非Siglec-8多肽的结合小于该抗体对Siglec-8的结合的约10％，如通过本领域已知方法(例如酶联免疫吸附测定法(ELISA))测量的。在一些实施方案中，结合Siglec-8(例如二聚体形式的Siglec-8Fc融合蛋白(SEQ IDNO:74))的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤2nM，≤1nM，≤0.7nM，≤0.6nM，≤0.5nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
如本文中使用的，术语“Siglec-8”指人Siglec-8蛋白。该术语还包括Siglec-8的天然发生变体，包括剪接变体或等位变体。一种例示性人Siglec-8的氨基酸序列显示于SEQID NO:72。另一种例示性人Siglec-8的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:73。在一些实施方案中，人Siglec-8蛋白包含融合至免疫球蛋白Fc区的人Siglec-8胞外域。一种例示性的融合至免疫球蛋白Fc区的人Siglec-8胞外域的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:74。SEQ ID NO:74中标有下划线的氨基酸序列指示Siglec-8Fc融合蛋白氨基酸序列的Fc区。
人Siglec-8氨基酸序列
GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGGAGATALAFLSFCIIFIIVRSCRKKSARPAAGVGDTGMEDAKAIRGSASQGPLTESWKDGNPLKKPPPAVAPSSGEEGELHYATLSFHKVKPQDPQGQEATDSEYSEIKIHKRETAETQACLRNHNPSSKEVRG(SEQ ID NO：72)
人Siglec-8氨基酸序列
GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHPRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGGAGATALAFLSFCIIFIIVRSCRKKSARPAAGVGDTGMEDAKAIRGSASQGPLTESWKDGNPLKKPPPAVAPSSGEEGELHYATLSFHKVKPQDPQGQEATDSEYSEIKIHKRETAETQACLRNHNPSSKEVRG(SEQ ID NO：73)
Siglec-8Fc融合蛋白氨基酸序列
GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGGIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：74)
“诱导凋亡”的或“凋亡性的”抗体指那些根据标准凋亡测定法的测定，诱导程序性细胞死亡的抗体，所述测定法诸如膜联蛋白V结合，DNA断裂，细胞收缩，内质网膨胀，细胞破裂，和/或膜囊(称作凋亡小体)形成。例如，本发明抗Siglec-8抗体的凋亡活性可通过膜联蛋白V对细胞染色来显示。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体“武装”(arm)细胞毒性细胞，而且是通过此机制杀死靶细胞所要求的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。在一些实施方案中，本文所述抗Siglec-8抗体增强ADCC。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.,PNAS USA 95:652-656(1998)中所披露的。改变ADCC活性和其它抗体特性的其它Fc变体包括Ghetie et al.,Nat Biotech.15:637-40,1997；Duncan et al,Nature 332:563-564,1988；Lund et al.,J.Immunol 147:2657-2662,1991；Lund et al,Mol Immunol 29:53-59,1992；Alegre et al,Transplantation 57:1537-1543,1994；Hutchins et al.,ProcNatl.Acad Sci USA 92:11980-11984,1995；Jefferis et al,Immunol Lett.44:111-117,1995；Lund et al.,FASEB J9:115-119,1995；Jefferis et al,Immunol Lett 54:101-104,1996；Lund et al,J Immunol 157:4963-4969,1996；Armour et al.,Eur J Immunol29:2613-2624,1999；Idusogie et al,J Immunol 164:4178-4184,200；Reddy et al,JImmunol 164:1925-1933,2000；Xu et al.,Cell Immunol 200:16-26,2000；Idusogie etal,J Immunol 166:2571-2575,2001；Shields et al.,J Biol Chem 276:6591-6604,2001；Jefferis et al,Immunol Lett 82:57-65.2002；Presta et al.,Biochem SocTrans 30:487-490,2002；Lazar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:4005-4010,2006；美国专利No.5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,194,551；6,737,056；6,821,505；6,277,375；7,335,742；和7,317,091披露的那些。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区，包括天然序列Fc区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。适合本发明抗体中使用的天然序列Fc区包括人IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。可以引入单一氨基酸替代(S228P，依照Kabat编号方式；称作IgG4Pro)以消除在重组IgG4抗体中观察到的异质性。参见Angal,S.et al.(1993)Mol Immunol 30,105-108。
“非岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺陷的”抗体指包含如下Fc区的糖基化抗体变体，其中附着于Fc区的碳水化合物结构具有减少的岩藻糖或缺乏岩藻糖。在一些实施方案中，具有减少的岩藻糖或缺乏岩藻糖的抗体具有改善的ADCC功能。相对于细胞系中生成的相同抗体上岩藻糖的量，非岩藻糖基化的或岩藻糖缺陷的抗体具有减少的岩藻糖。本文中涵盖的非岩藻糖基化的或岩藻糖缺陷的抗体组合物是如下组合物，其中少于约50％的附着于组合物中抗体的Fc区的N连接的聚糖包含岩藻糖。
术语“岩藻糖基化”或“岩藻糖基化的”指附着于抗体的肽主链的寡糖内存在岩藻糖残基。具体而言，岩藻糖基化的抗体在附着于抗体Fc区的N连接的寡糖之一或二者中最内部N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)残基处包含α(l,6)连接的岩藻糖，例如人IgG1 Fc域的位置Asn297(Fc区残基的EU编号方式)。由于免疫球蛋白中的微小序列变异，Asn297也可以位于第297位上游或下游约+3个氨基酸，即介于第294和300位之间。
“岩藻糖基化的程度”指相对于通过本领域已知方法鉴定的所有寡糖，岩藻糖基化寡糖的百分比，例如在经N-糖苷酶F处理的抗体组合物中通过基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱术(MALDI TOF MS)评估的。在“完全岩藻糖基化的抗体”的组合物中，基本上所有寡糖包含岩藻糖残基，即是岩藻糖基化的。在一些实施方案中，完全岩藻糖基化的抗体的组合物具有至少约90％的岩藻糖基化程度。因而，此类组合物中的抗体个体通常在Fc区的两个N连接的寡糖的每一个中包含岩藻糖残基。相反，在“完全非岩藻糖基化的”抗体的组合物中，基本上无一寡糖是岩藻糖基化的，而且此类组合物中的抗体个体在Fc区的两个N连接的寡糖的每一个中不含岩藻糖残基。在一些实施方案中，完全非岩藻糖基化的抗体的组合物具有少于约10％的岩藻糖基化程度。在“部分岩藻糖基化的抗体”的组合物中，只有部分寡糖包含岩藻糖。此类组合物中的抗体个体在Fc区的N连接的寡糖二者，任一或无一中包含岩藻糖残基，前提是该组合物并非包含在Fc区的N连接的寡糖中缺乏岩藻糖残基的基本上所有抗体个体，也并非包含在Fc区的N-连接寡糖二者中含有岩藻糖残基的基本上所有抗体个体。在一个实施方案中，部分岩藻糖基化的抗体的组合物具有约10％至约80％(例如约50％至约80％，约60％至约80％，或约70％至约80％)的岩藻糖基化程度。
如本文中使用的，“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间非共价相互作用的强度。在一些实施方案中，抗体对Siglec-8(它可以是二聚体，诸如本文所述Siglec-8-Fc融合蛋白)的亲和力一般可以通过解离常数(Kd)来表示。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。
如本文中使用的，“结合亲合力”指分子(例如抗体)的多个结合位点与其结合配偶(例如抗原)的结合强度。
“分离的”编码本文中抗体的核酸分子指已经鉴定且与生成它的环境中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。在一些实施方案中，分离的核酸与同生成环境有关的所有成分没有关联。分离的编码本文中多肽和抗体的核酸分子处于不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与细胞中天然存在的编码本文中多肽和抗体的核酸有区别。
术语“药物配制剂”指其形式允许活性组分的生物学活性是有效的，且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的制备物。此类配制剂是无菌的。
“载体”在用于本文时包括药剂学可接受的载体，赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM，聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
如本文中使用的，术语“治疗”或“处理”指设计用于在临床病理学的进程中改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预。治疗的期望效果包括减缓疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，及免除或改善预后。如果一种或多种与病症(例如嗜曙红细胞介导的疾病)有关的症状得到减轻或消除，那么说例如个体得到成功“治疗”。例如，如果治疗导致罹患疾病的个体的生活质量提高，治疗疾病需要的其它药疗的剂量降低，降低疾病复发的频率，减轻疾病的严重程度，延迟疾病发生或进展，和/或延长个体的存活，那么个体得到成功“治疗”。
如本文中使用的，“与……联合”指在一种治疗形态之外施用另一种治疗形态。如此，“与……联合”指对个体施用一种治疗形态之前，期间或之后施用另一种治疗形态。
如本文中使用的，术语“预防”包括就个体中疾病的发生或复发而言提供防范。个体可以倾向于病症，对病症易感，或有风险发生病症，但是尚未诊断有病症。在一些实施方案中，使用本文所述抗Siglec-8抗体来延迟病症的发生。
如本文中使用的，“有风险”发生病症的个体可以具有或没有可检测疾病或疾病症状，而且可以在本文所述治疗方法之前展示或不展示可检测疾病或疾病症状。“有风险”表示个体具有一项或多项风险因素，它们是与嗜曙红细胞介导的病症和/或肥大细胞介导的病症的发生有关的可测量参数，如本领域已知。具有一项或多项这些风险因素的个体具有比没有一项或多项这些风险因素的个体更高的概率发生病症。
“有效量”指至少在必需的剂量和时间上有效实现期望的或指定的效果(包括治疗或预防结果)的量。有效量可以在一次或多次施用中提供。“治疗有效量”至少指实现特定病症的可测量改善所需要的最小浓度。本文中的治疗有效量可根据诸如患者的疾病状态，年龄，性别和体重及该抗体在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还可以指该抗体的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量可低于治疗有效量。
“长期”施用指与短期模式相反，以连续模式施用药物，从而将初始治疗效果(活性)维持较长一段时间。“间歇”施用指不是无间断连续进行的治疗，而是本质上周期性的。
如本文中使用的，“个体”或“受试者”为哺乳动物。为了治疗目的，“哺乳动物”包括人，家畜和牲畜，及动物园，运动或宠物动物，诸如犬，马，家兔，牛，猪，仓鼠，沙鼠，小鼠，雪貂，大鼠，猫等。在一些实施方案中，个体或受试者指人。
II.抗Siglec-8抗体和组合物
一方面，本发明提供分离的结合人Siglec-8的抗体。在一些实施方案中,本文所述抗Siglec-8抗体具有一项或多项下述特征：(1)结合人Siglec-8；(2)结合人Siglec-8的胞外域；(3)以比小鼠抗体2E2和/或小鼠抗体2C4要高的亲和力结合人Siglec-8；(4)以比小鼠抗体2E2和/或小鼠抗体2C4要高的亲合力结合人Siglec-8；(5)在热转移测定法中具有约70℃-72℃或更高的Tm；(6)具有降低程度的岩藻糖基化或是非岩藻糖基化的；(7)结合在嗜曙红细胞上表达的人Siglec-8并诱导嗜曙红细胞凋亡；(8)结合在肥大细胞上表达的人Siglec-8并消减肥大细胞；(9)结合在肥大细胞上表达的人Siglec-8并抑制肥大细胞的FcεRI依赖性活性(例如组胺释放，PGD2释放，Ca2+流，和/或β-己糖胺酶释放，等)；(10)已经工程化改造以改善ADCC活性；(11)结合在肥大细胞上表达的人Siglec-8并通过ADCC活性杀死肥大细胞(在体外和/或在体内)；(12)结合人和非人灵长类的Siglec-8；(13)结合人Siglec-8的结构域1，结构域2，和/或结构域3，或结合包含人Siglec-8结构域1，结构域2，和/或结构域3的Siglec-8多肽(例如本文所述融合蛋白)；和(14)以小于小鼠抗体2E2或2C4的EC50的EC50消减已活化的嗜曙红细胞。
一方面，本发明提供结合人Siglec-8的抗体。在一些实施方案中，该人Siglec-8包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方案中，该人Siglec-8包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述抗体结合人Siglec-8结构域1中的表位，其中结构域1包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述抗体结合人Siglec-8结构域2中的表位，其中结构域2包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述抗体结合人Siglec-8结构域3中的表位，其中结构域3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述抗体结合包含SEQ ID NO:116的氨基酸的融合蛋白但不结合包含SEQ ID NO:115的氨基酸的融合蛋白。在一些实施方案中，本文所述抗体结合包含SEQ ID NO:117的氨基酸的融合蛋白但不结合包含SEQ ID NO:115的氨基酸的融合蛋白。在一些实施方案中，本文所述抗体结合包含SEQ ID NO:117的氨基酸的融合蛋白但不结合包含SEQ ID NO:116的氨基酸的融合蛋白。在一些实施方案中，本文所述抗体结合人Siglec-8胞外域中的线性表位。在一些实施方案中，本文所述抗体结合人Siglec-8胞外域中的构象表位。在一些实施方案中，本文所述抗体结合在嗜曙红细胞上表达的人Siglec-8并诱导嗜曙红细胞凋亡。在一些实施方案中，本文所述抗体结合在肥大细胞上表达的人Siglec-8并消减肥大细胞。在一些实施方案中，本文所述抗体结合在肥大细胞上表达的人Siglec-8并抑制肥大细胞介导的活性。在一些实施方案中，本文所述抗体结合在肥大细胞上表达的人Siglec-8并通过ADCC活性杀死肥大细胞。在一些实施方案中，本文所述抗体消减肥大细胞并抑制肥大细胞活化。在一些实施方案中，本文中的抗体消减已活化的嗜曙红细胞并抑制肥大细胞活化。
本文中提供一种分离的结合人Siglec-8和非人灵长类Siglec-8的抗Siglec-8抗体。具有灵长类交叉反应性的抗体的鉴定对于抗Siglec-8抗体在非人灵长类中的临床前测试会是有用的。一方面，本发明提供结合非人灵长类Siglec-8的抗体。一方面，本发明提供结合人Siglec-8和非人灵长类Siglec-8的抗体。在一些实施方案中，该非人灵长类Siglec-8包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列或其部分。在一些实施方案中，该非人灵长类Siglec-8包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列或其部分。在一些实施方案中，该非人灵长类是狒狒(例如绿狒狒(Papio Anubis))。在一些实施方案中,结合人Siglec-8和非人灵长类Siglec-8的抗体结合人Siglec-8结构域1中的表位。在一个进一步的实施方案中，人Siglec-8的结构域1包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。在一些实施方案中,结合人Siglec-8和非人灵长类Siglec-8的抗体结合人Siglec-8结构域3中的表位。在一个进一步的实施方案中，人Siglec-8的结构域3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。在一些实施方案中,结合人Siglec-8和非人灵长类Siglec-8的抗体是人源化抗体，嵌合抗体，或人抗体。在一些实施方案中,结合人Siglec-8和非人灵长类Siglec-8的抗体是鼠抗体。在一些实施方案中,结合人Siglec-8和非人灵长类Siglec-8的抗体是人IgG1抗体。
一方面，本文所述抗Siglec-8抗体是单克隆抗体。一方面，本文所述抗Siglec-8抗体是抗体片段(包括抗原结合片段)，例如Fab，Fab′-SH，Fv，scFv，或(Fab′)2片段。一方面，本文所述抗Siglec-8抗体是嵌合，人源化，或人抗体。一方面，本文所述任何抗Siglec-8抗体是已纯化的。
一方面，提供与鼠2E2抗体和鼠2C4抗体竞争结合Siglec-8的抗Siglec-8抗体。还提供与鼠2E2抗体和鼠2C4抗体结合相同表位的抗Siglec-8抗体。一方面，提供与本文所述任何抗Siglec-8抗体(例如HEKA，HEKF，1C3，1H10，4F11)竞争结合Siglec-8的抗Siglec-8抗体。还提供与本文所述任何抗Siglec-8抗体(例如HEKA，HEKF，1C3，1H10，4F11)结合相同表位的抗Siglec-8抗体。
在本发明的一个方面，提供编码抗Siglec-8抗体的多核苷酸。在某些实施方案中，提供包含编码抗Siglec-8抗体的多核苷酸的载体。在某些实施方案中，提供包含此类载体的宿主细胞。在本发明的另一个方面，提供包含抗Siglec-8抗体或编码抗Siglec-8抗体的多核苷酸的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物是用于治疗嗜曙红细胞介导的病症和/或肥大细胞介导的病症(诸如本文中列举的那些)的药物配制剂。
一方面，本文中提供包含鼠抗体2C4的1，2，3，4，5，或6种HVR序列的抗Siglec-8抗体。一方面，本文中提供包含鼠抗体2E2的1，2，3，4，5，或6种HVR序列的抗Siglec-8抗体。在一些实施方案中，该HVR是Kabat CDR或Chothia CDR。
一方面，本文中提供包含鼠抗体1C3的1，2，3，4，5，或6种HVR序列的抗Siglec-8抗体。一方面，本文中提供包含鼠抗体4F11的1，2，3，4，5，或6种HVR序列的抗Siglec-8抗体。一方面，本文中提供包含鼠抗体1H10的1，2，3，4，5，或6种HVR序列的抗Siglec-8抗体。在一些实施方案中，该HVR是Kabat CDR或Chothia CDR。
在一些实施方案中，本文所述抗体结合人Siglec-8结构域1中的表位，其中结构域1包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述抗体结合人Siglec-8结构域2中的表位，其中结构域2包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述抗体结合人Siglec-8结构域3中的表位，其中结构域3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述抗体结合包含SEQ ID NO:116的氨基酸的融合蛋白但不结合包含SEQ ID NO:115的氨基酸的融合蛋白。在一些实施方案中，本文所述抗体结合包含SEQ ID NO:117的氨基酸的融合蛋白但不结合包含SEQ ID NO:115的氨基酸的融合蛋白。在一些实施方案中，本文所述抗体结合包含SEQ ID NO:117的氨基酸的融合蛋白但不结合包含SEQ ID NO:116的氨基酸的融合蛋白。
一方面，本文中提供是一种包含重链可变区和轻链可变区的抗Siglec-8抗体，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-L3。
一方面，本文中提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗Siglec-8抗体，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:67-70的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ IDNO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-L3。
一方面，本文中提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗Siglec-8抗体，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，本文中提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗Siglec-8抗体，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:67-70的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ IDNO:65的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，本文中提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗Siglec-8抗体，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区，其包含(i)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，本文所述抗体结合人Siglec-8结构域2中的表位，其中结构域2包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列。
另一方面，本文中提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗Siglec-8抗体，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的HVR-H3；和/或该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，本文所述抗体结合人Siglec-8结构域3中的表位，其中结构域3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述抗体结合人Siglec-8和非人灵长类Siglec-8。
另一方面，本文中提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗Siglec-8抗体，其中该重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的HVR-H3；和/或该轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，本文所述抗体结合人Siglec-8结构域1中的表位，其中结构域1包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述抗体结合人Siglec-8和非人灵长类Siglec-8。
本文所述抗Siglec-8抗体可以包含任何合适的框架可变结构域序列，前提是该抗体保留结合人Siglec-8的能力。如本文中使用的,重链框架区称作“HC-FR1-FR4”，而轻链框架区称作“LC-FR1-FR4”。在一些实施方案中，该抗Siglec-8抗体包含SEQ ID NO:26，34，38，和45(分别是HC-FR1，HC-FR2，HC-FR3，和HC-FR4)的重链可变结构域框架序列。在一些实施方案中，该抗Siglec-8抗体包含SEQ ID NO:48，51，55，和60(分别是LC-FR1，LC-FR2，LC-FR3，和LC-FR4)的轻链可变结构域框架序列。在一些实施方案中，该抗Siglec-8抗体包含SEQ ID NO:48，51，58，和60(分别是LC-FR1，LC-FR2，LC-FR3，和LC-FR4)的轻链可变结构域框架序列。
在一个实施方案中，抗Siglec-8抗体包含包含框架序列和高变区的重链可变结构域，其中该框架序列包含分别是SEQ ID NO:26-29(HC-FR1)，SEQ ID NO:31-36(HC-FR2)，SEQ ID NO:38-43(HC-FR3)，和SEQ ID NO:45或46(HC-FR4)的HC-FR1-HC-FR4序列；HVR-H1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；HVR-H2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；且HVR-H3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗Siglec-8抗体包含包含框架序列和高变区的重链可变结构域，其中该框架序列包含分别是SEQ ID NO:26-29(HC-FR1)，SEQ IDNO:31-36(HC-FR2)，SEQ ID NO:38-43(HC-FR3)，和SEQ ID NO:45或46(HC-FR4)的HC-FR1-HC-FR4序列；HVR-H1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；HVR-H2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；且HVR-H3包含选自SEQ ID NO:67-70的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗Siglec-8抗体包含包含框架序列和高变区的轻链可变结构域，其中该框架序列包含分别是SEQ IDNO:48或49(LC-FR1)，SEQ ID NO:51-53(LC-FR2)，SEQ ID NO:55-58(LC-FR3)，和SEQ IDNO:60(LC-FR4)的LC-FR1-LC-FR4序列；HVR-L1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；HVR-L2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；且HVR-L3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗Siglec-8抗体包含包含框架序列和高变区的轻链可变结构域，其中该框架序列包含分别是SEQ ID NO:48或49(LC-FR1)，SEQ ID NO:51-53(LC-FR2)，SEQ ID NO:55-58(LC-FR3)，和SEQ ID NO:60(LC-FR4)的LC-FR1-LC-FR4序列；HVR-L1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；HVR-L2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；且HVR-L3包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在这些抗体的一个实施方案中，该重链可变域包含选自SEQ ID NO:2-10的氨基酸序列且该轻链可变域包含选自SEQ ID NO:16-22的氨基酸序列。在这些抗体的一个实施方案中，该重链可变域包含选自SEQ ID NO:2-10的氨基酸序列且该轻链可变域包含选自SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列。在这些抗体的一个实施方案中，该重链可变域包含选自SEQ ID NO:11-14的氨基酸序列且该轻链可变域包含选自SEQ ID NO:16-22的氨基酸序列。在这些抗体的一个实施方案中，该重链可变域包含选自SEQ ID NO:11-14的氨基酸序列且该轻链可变域包含选自SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列。在这些抗体的一个实施方案中，该重链可变域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列且该轻链可变域包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在这些抗体的一个实施方案中，该重链可变域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列且该轻链可变域包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在一些实施方案中,重链HVR序列包含下述：
a)HVR-H1(IYGAH(SEQ ID NO:61))；
b)HVR-H2(VIWAGGSTNYNSALMS(SEQ ID NO:62))；和
c)HVR-H3(DGSSPYYYSMEY(SEQ ID NO:63)；DGSSPYYYGMEY(SEQ ID NO:67)；DGSSPYYYSMDY(SEQ ID NO:68)；DGSSPYYYSMEV(SEQ ID NO:69)；或GSSPYYYGMDV(SEQ IDNO:70))。
在一些实施方案中,重链HVR序列包含下述：
a)HVR-H1(SYAMS(SEQ ID NO:88)；DYYMY(SEQ ID NO:89)；或SSWMN(SEQ ID NO:90))；
b)HVR-H2(IISSGGSYTYYSDSVKG(SEQ ID NO:91)；RIAPEDGDTEYAPKFQG(SEQ ID NO:92)；或QIYPGDDYTNYNGKFKG(SEQ ID NO:93))；和
c)HVR-H3(HETAQAAWFAY(SEQ ID NO:94)；EGNYYGSSILDY(SEQ ID NO:95)；或LGPYGPFAD(SEQ ID NO:96))。
在一些实施方案中,重链FR序列包含下述：
a)HC-FR1(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT(SEQ ID NO:26)；EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLT(SEQ ID NO:27)；QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS(SEQ ID NO:28)；或QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLT(SEQ ID NO:29))；
b)HC-FR2(WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:31)；WVRQAPGKGLEWLG(SEQ ID NO:32)；WVRQAPGKGLEWLS(SEQ ID NO:33)；WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO:34)；WIRQPPGKGLEWIG(SEQID NO:35)；或WVRQPPGKGLEWLG(SEQ ID NO:36))；
c)HC-FR3(RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:38)；RLSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:39)；RLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ IDNO:40)；RFSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:41)；RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO:42)；或RLSISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO:43))；和
d)HC-FR4(WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:45)；或WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:46))。
在一些实施方案中,轻链HVR序列包含下述：
a)HVR-L1(SATSSVSYMH(SEQ ID NO:64))；
b)HVR-L2(STSNLAS(SEQ ID NO:65))；和
c)HVR-L3(QQRSSYPFT(SEQ ID NO:66)；或QQRSSYPYT(SEQ ID NO:71))。
在一些实施方案中,轻链HVR序列包含下述：
a)HVR-L1(SASSSVSYMH(SEQ ID NO:97)；RASQDITNYLN(SEQ ID NO:98)；或SASSSVSYMY(SEQ ID NO:99))；
b)HVR-L2(DTSKLAY(SEQ ID NO:100)；FTSRLHS(SEQ ID NO:101)；或DTSSLAS(SEQID NO:102))；和
c)HVR-L3(QQWSSNPPT(SEQ ID NO:103)；QQGNTLPWT(SEQ ID NO:104)；或QQWNSDPYT(SEQ ID NO:105))。
在一些实施方案中,轻链FR序列包含下述：
a)LC-FR1(EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO:48)；或EIILTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO:49))；
b)LC-FR2(WFQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO:51)；WFQQKPGQAPRLWIY(SEQ ID NO:52)；或WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO:53))；
c)LC-FR3(GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:55)；GVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:56)；GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC(SEQ IDNO:57)；或GIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:58))；和
d)LC-FR4(FGPGTKLDIK(SEQ ID NO:60))。
在一些实施方案中，本文中提供一种特异性结合人Siglec-8的抗Siglec-8抗体(例如人源化抗Siglec-8)抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中该抗体包含：
(a)重链可变结构域，其包含：
(1)包含选自SEQ ID NO:26-29的氨基酸序列的HC-FR1；
(2)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H1；
(3)包含选自SEQ ID NO:31-36的氨基酸序列的HC-FR2；
(4)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H2；
(5)包含选自SEQ ID NO:38-43的氨基酸序列的HC-FR3；
(6)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H3；和
(7)包含选自SEQ ID NO:45-46的氨基酸序列的HC-FR4，和/或
(b)轻链可变结构域，其包含：
(1)包含选自SEQ ID NO:48-49的氨基酸序列的LC-FR1；
(2)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-L1；
(3)包含选自SEQ ID NO:51-53的氨基酸序列的LC-FR2；
(4)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L2；
(5)包含选自SEQ ID NO:55-58的氨基酸序列的LC-FR3；
(6)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-L3；和
(7)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的LC-FR4。
一方面，本文中提供一种包含选自SEQ ID NO:2-10的重链可变结构域和/或包含选自SEQ ID NO:16-22的轻链可变结构域的抗Siglec-8抗体。一方面，本文中提供一种包含选自SEQ ID NO:2-10的重链可变结构域和/或包含选自SEQ ID NO:23或24的轻链可变结构域的抗Siglec-8抗体。一方面，本文中提供一种包含选自SEQ ID NO:11-14的重链可变结构域和/或包含选自SEQ ID NO:16-22的轻链可变结构域的抗Siglec-8抗体。一方面，本文中提供一种包含选自SEQ ID NO:11-14的重链可变结构域和/或包含选自SEQ ID NO:23或24的轻链可变结构域的抗Siglec-8抗体。一方面，本文中提供一种包含SEQ ID NO:6的重链可变结构域和/或包含选自SEQ ID NO:16或21的轻链可变结构域的抗Siglec-8抗体。
一方面，本文中提供一种包含选自SEQ ID NO:106-108的重链可变结构域和/或包含选自SEQ ID NO:109-111的轻链可变结构域的抗Siglec-8抗体。一方面，本文中提供一种包含SEQ ID NO:106的重链可变结构域和/或包含SEQ ID NO:109的轻链可变结构域的抗Siglec-8抗体。一方面，本文中提供一种包含SEQ ID NO:107的重链可变结构域和/或包含SEQ ID NO:110的轻链可变结构域的抗Siglec-8抗体。一方面，本文中提供一种包含SEQ IDNO:108的重链可变结构域和/或包含SEQ ID NO:111的轻链可变结构域的抗Siglec-8抗体。
在一些实施方案中，本文中提供一种抗Siglec-8抗体，其包含包含与选自SEQ IDNO:2-14的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施方案中，本文中提供一种抗Siglec-8抗体，其包含包含与选自SEQ ID NO:106-108的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的氨基酸序列相对于参照序列含有替代，插入，或删除，但是包含该氨基酸序列的抗体保留结合人Siglec-8的能力。在一些实施方案中，该替代，插入，或删除(例如1，2，3，4，或5个氨基酸)在HVR以外的区域中(即在FR中)发生。在一些实施方案中，抗Siglec-8抗体包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗Siglec-8抗体包含包含选自SEQ ID NO:106-108的氨基酸序列的重链可变结构域。
在一些实施方案中，本文中提供一种抗Siglec-8抗体，其包含包含与选自SEQ IDNO:16-24的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，本文中提供一种抗Siglec-8抗体，其包含包含与选自SEQ ID NO:109-111的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的氨基酸序列相对于参照序列含有替代，插入，或删除，但是包含该氨基酸序列的抗体保留结合人Siglec-8的能力。在一些实施方案中，该替代，插入，或删除(例如1，2，3，4，或5个氨基酸)在HVR以外的区域中(即在FR中)发生。在一些实施方案中，抗Siglec-8抗体包含包含SEQ ID NO:16或21的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗Siglec-8抗体包含包含选自SEQ ID NO:109-111的氨基酸序列的重链可变结构域。
在一些实施方案中，本文中提供一种抗Siglec-8抗体，其包含图1或图3中所示重链可变结构域。
在一些实施方案中，本文中提供一种抗Siglec-8抗体，其包含图2或图3中所示轻链可变结构域。
一方面，本发明提供一种抗Siglec-8抗体，其包含(a)一种，两种，或三种选自图1或图3中所示VH HVR的VH HVR和/或(b)一种，两种，或三种选自图2或图3中所示VL HVR的VLHVR。一方面，本发明提供一种抗Siglec-8抗体，其包含选自图1或图3中所示重链可变结构域的重链可变结构域和选自图2或图3中所示轻链可变结构域的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，本文中提供一种抗Siglec-8抗体，其包含表3中所示抗体(例如HAKA抗体，HAKB抗体，HAKC抗体，等)的重链可变域和/或轻链可变结构域。
有五大类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，具有分别称作α，δ，ε，γ和μ的重链。γ和α类进一步分成亚类，例如，人表达下述亚类：IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。IgG1抗体可以以多种多态性变体存在，称作同种异型(综述见Jefferis and Lefranc2009.mAbs Vol 1Issue 4 1-7)，它们任一均适合于在本文中的一些实施方案中使用。人群中的常见同种异型变体就是那些通过字母a，f，n，z或其组合表示的。在本文中的任何实施方案中，该抗体可包含包含人IgG Fc区的重链Fc区。在进一步的实施方案中，该人IgG Fc区包含人IgG1或IgG4。在一些实施方案中，该人IgG4包含氨基酸替代S228P，其中氨基酸残基是依照Kabat中的EU索引编号的。在一些实施方案中，该人IgG1包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。在一些实施方案中，该人IgG4包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供一种抗Siglec-8抗体，其包含包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链；和/或包含选自SEQ ID NO:76或77的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，该抗体可以包含包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链；和/或包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，该抗Siglec-8抗体消减肥大细胞且抑制肥大细胞活化。在一些实施方案中，该抗Siglec-8抗体消减已活化的嗜曙红细胞且抑制肥大细胞活化。
1.抗体亲和力
在一些方面，本文所述抗Siglec-8抗体以与小鼠抗体2E2和/或小鼠抗体2C4相比大致相同或更高的亲和力和/或更高的亲合力结合人Siglec-8。在某些实施方案中，本文中提供的抗Siglec-8抗体具有≤1μM，≤150nM，≤100nM，≤50nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在一些实施方案中，本文所述抗Siglec-8抗体以比小鼠抗体2E2和/或小鼠抗体2C4高约1.5倍，约2倍，约3倍，约4倍，约5倍，约6倍，约7倍，约8倍，约9倍或约10倍的亲和力结合人Siglec-8。在本文中的一些实施方案中，该抗Siglec-8抗体包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO:16或21的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗Siglec-8抗体的结合亲和力可以通过表面等离振子共振测定法来测定。例如,可以于25℃使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)用固定化的抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)来测量Kd或Kd值。简言之，依照供应商的说明书用N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,
Figure BDA0001014201170000391
Inc.)。用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释捕捉抗体(例如抗人Fc)，之后以30μl/min的流速注射，并用抗Siglec-8抗体进一步固定化。对于动力学测量，于25℃以大约25μl/min的流速注射二聚体Siglec-8在含0.05％Tween 20的PBS(PBST)中的两倍连续稀释液。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(
Figure BDA0001014201170000401
Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比koff/kon来计算平衡解离常数(Kd)。参见例如Chen,Y.,et al.,(1999)J.Mol.Biol.293:865-881。
在另一个实施方案中，可以使用生物层干涉法来测定抗Siglec-8抗体针对Siglec-8的亲和力。在一种例示性测定法中，将带Fc标签的Siglec-8蛋白固定化到抗人捕捉传感器上，并与渐增浓度的小鼠，嵌合，或人源化抗Siglec-8Fab片段一起温育，以使用诸如例如Octet Red 384System(ForteBio)等仪器获得亲和力测量。
例如，抗Siglec-8抗体的结合亲和力还可以通过Munson et al.,Anal.Biochem.,107:220(1980)中描述的Scatchard分析使用相关领域公知的标准技术来测定。还可参见Scatchard,G.,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660(1947)。
2.抗体亲合力
在一个实施方案中，抗Siglec-8抗体的结合亲合力可以通过表面等离振子共振测定法来测定。例如，可以使用BIAcore T100来测量Kd或Kd值。在CM5芯片上固定化捕捉抗体(例如山羊抗人Fc和山羊抗小鼠Fc)。可以用抗人或抗小鼠抗体固定化流动室。于某个温度以某个流速进行测定法，例如于25℃以30μl/min的流速。以多种浓度在测定缓冲液中稀释二聚体Siglec-8，例如范围为15nM至1.88pM的浓度。捕捉抗体，并进行高效注射，接着解离。用例如50mM甘氨酸pH 1.5等缓冲液再生流动室。以空参照室和多次测定缓冲液注射作为空白，并用1:1全局拟合参数分析结果。
3.竞争测定法
可以使用竞争测定法来测定两种抗体是否通过识别相同的或空间交叠的表位而结合相同表位或一种抗体竞争性抑制另一种抗体结合抗原。这些测定法是本领域已知的。典型地，在多孔板上固定化抗原或抗原表达细胞，并测量未标记抗体阻断已标记抗体结合的能力。此类竞争测定法的常用标记物是放射性标记物或酶标记物。在一些实施方案中，本文所述抗Siglec-8抗体与本文所述2E2抗体竞争结合一种细胞(例如嗜曙红细胞)的细胞表面上存在的表位。在一些实施方案中，本文所述抗Siglec-8抗体与包含包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争结合一种细胞(例如嗜曙红细胞)的细胞表面上存在的表位。在一些实施方案中，本文所述抗Siglec-8抗体与本文所述2C4抗体竞争结合一种细胞(例如嗜曙红细胞)的细胞表面上存在的表位。在一些实施方案中，本文所述抗Siglec-8抗体与包含包含SEQ ID NO:2(如美国专利No.8,207,305中找到的)的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:4(如美国专利No.8,207,305中找到的)的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争结合一种细胞(例如嗜曙红细胞)的细胞表面上存在的表位。
4.热稳定性
在一些方面，本文所述抗Siglec-8在热转移测定法中具有至少约70℃，至少约71℃，或至少约72℃的解链温度(Tm)。在一种例示性热转移测定法中，在qPCR热循环仪中将包含人源化抗Siglec-8抗体的样品与荧光染料(Sypro Orange)一起温育71个循环，每个循环升高1℃，以测定Tm。在本文中的一些实施方案中，抗Siglec-8抗体具有与小鼠2E2抗体和/或小鼠2C4抗体相比相似或更高的Tm。在本文中的一些实施方案中，抗Siglec-8抗体包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO:16或21的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗Siglec-8抗体具有与嵌合2C4抗体相比相同或更高的Tm。在一些实施方案中，抗Siglec-8抗体具有与具有包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链的抗体相比相同或更高的Tm。
5.生物学活性测定法
在一些方面，本文所述抗Siglec-8诱导嗜曙红细胞凋亡。在一些其它方面，本文所述抗Siglec-8消减肥大细胞。用于评估细胞凋亡的测定法是本领域公知的，例如用膜联蛋白V染色和TUNNEL测定法。在一种例示性细胞凋亡测定法中，在培养基中重悬浮来自血液样品的新鲜血沉棕黄层，并在96孔U底板中分配。将抗Siglec-8抗体的一系列连续5倍稀释液添加至每个孔，并将板于37℃，5％CO2温育超过4小时。用在PBS中稀释的低聚甲醛固定细胞，并用对嗜曙红细胞特异性的已缀合抗体染色，用于使用显微镜的检测。对在抗Siglec-8抗体存在下温育的血沉棕黄层评估总外周血白细胞中的嗜曙红细胞群，与未在抗Siglec-8抗体存在下温育的血沉棕黄层比较。在另一种例示性测定法，在培养基中重悬浮自血液样品纯化的嗜曙红细胞(例如Miltenyi嗜曙红细胞分离试剂盒)，并在IL-5存在或缺失下培养过夜。随后通过离心收获培养的嗜曙红细胞，在培养基中重悬浮，并在96孔U底板中分配。将抗Siglec-8抗体的一系列连续5倍稀释液添加至每个孔，并将板于37℃，5％CO2温育超过4小时。使用本领域公知的标准技术，固定细胞，并用Annexin-V染色。使用显微镜检测嗜曙红细胞的数目。对在抗Siglec-8抗体存在下温育的已纯化的细胞评估样品中的嗜曙红细胞群，与未在抗Siglec-8抗体存在下温育的已纯化的细胞比较。
在一些方面，本文所述抗Siglec-8抗体诱导ADCC活性。在一些其它方面，本文所述抗Siglec-8抗体通过ADCC活性杀死表达Siglec-8的肥大细胞。在一些实施方案中，组合物包含非岩藻糖基化的(即无岩藻糖基化的)抗Siglec-8抗体。在一些实施方案中，与包含部分岩藻糖基化的抗Siglec-8抗体的组合物相比，包含非岩藻糖基化的本文所述抗Siglec-8抗体的组合物增强ADCC活性。用于评估ADCC活性的测定法是本领域公知的且本文中有描述。在一种例示性测定法中，使用效应细胞和靶细胞来测量ADCC活性。效应细胞的例子包括天然杀伤(NK)细胞，大颗粒淋巴细胞(LGL)，淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞和包含NK和LGL的PBMC，或在细胞表面上具有Fc受体的白细胞，诸如嗜中性细胞，嗜曙红细胞和巨噬细胞。靶细胞是在细胞表面上表达要评估的抗体能识别的抗原的任何细胞。此类靶细胞的一种例子是在细胞表面上表达Siglec-8的嗜曙红细胞。此类靶细胞的另一种例子是在细胞表面上表达Siglec-8的肥大细胞。用使得细胞溶解得以检测的试剂标记靶细胞。用于标记的试剂的例子包括放射性物质，诸如铬酸钠(Na2 51CrO4)。参见例如Immunology,14,181(1968)；J.Immunol.Methods,172,227(1994)；和J.Immunol.Methods,184,29(1995)。
在一些方面，本文所述抗Siglec-8抗体抑制肥大细胞介导的活性。已经使用肥大细胞类胰蛋白酶作为总肥大细胞数目和活化的生物标志物。例如，可以测量血液或尿液中的总的和有活性的类胰蛋白酶以及组胺，N-甲基组胺，和11-β-前列腺素F2以评估肥大细胞的减少。一种例示性肥大细胞活性测定法参见例如公开号US 20110293631的美国专利申请。还可以使用本文中实施例2中描述的测定法来评估抗Siglec-8抗体对肥大细胞的ADCC和凋亡活性。
6.融合蛋白结合测定法
可以使用用融合蛋白进行的结合测定法来测定受到抗体识别的表位。使用融合蛋白进行表位定位的测定法是本领域已知的。例如，在多孔板上固定化包含融合至人Ig-Fc的部分Siglec-8蛋白的融合蛋白，并测量抗体结合融合蛋白的能力。在一些实施方案中，本文所述抗Siglec-8抗体结合包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的融合蛋白。在一些实施方案中，本文所述抗Siglec-8抗体结合包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的融合蛋白。在一些实施方案中，本文所述抗Siglec-8抗体结合包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的融合蛋白。在一些实施方案中，本文所述抗Siglec-8抗体结合包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的融合蛋白。
III.抗体制备
本文所述抗体使用本领域中用于生成抗体的可用技术来制备，下述各节更为详细地描述了其例示性方法。
1.抗体片段
本发明涵盖抗体片段。抗体片段可以通过传统手段来生成，诸如酶促消化，或者通过重组技术来生成。在某些情况中，使用抗体片段有优势，而不是完整抗体。某些抗体片段的综述参见Hudson et al.(2003)Nat.Med.9:129-134。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.,Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)；及Brennan et al.,Science 229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab，Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carteret al.,Bio/Technology 10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基，具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员会是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及5,587,458。Fv和scFv是具有完整结合位点，缺少恒定区的唯一类型；如此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering,Borrebaeck编,见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
2.人源化抗体
本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。基本上可遵循Winter的方法进行人源化(Joneset al.(1986)Nature 321:522-525；Riechmann et al.(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen et al.(1988)Science239:1534-1536)，即用高变区序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中显著少于完整的人可变域用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。
用于制备人源化抗体的人轻链和重链二者可变域的选择对于降低抗原性可能是重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类(例如小鼠)抗体的可变域序列对已知人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims et al.(1993)J.Immunol.151:2296；Chothia et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901)。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285；Presta et al.(1993)J.Immunol.151:2623)。
一般还希望的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。
3.人抗体
本发明的人抗Siglec-8抗体可以通过组合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成本发明的人单克隆抗Siglec-8抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner et al.,J.Immunol.,147:86(1991).
有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature 362:255(1993)；Bruggermann et al.,Year in Immunol.7:33(1993)。
基因改组也可用于自非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitopeimprinting)，如本文所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变区用人V结构域基因全集替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致如下非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后恢复了抗原结合位点，即表位决定人链配偶的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCT WO 93/06213，公布于1993年4月1日)。与传统的通过CDR嫁接进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的FR或CDR残基。
4.双特异性抗体
双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对Siglec-8，结合特异性之另一针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合Siglec-8的两种不同表位。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达Siglec-8的细胞。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的(参见Millstein and Cuello,Nature 305:537(1983)；WO 93/08829,公布于1993年5月13日；及Traunecker et al.,EMBOJ.10:3655(1991))。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh et al.,Methods in Enzymology 121:210(1986)。双特异性抗体包括交联或“异源缀合”抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可以与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。可使用任何便利的交联方法来制备异源缀合抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。
5.单域抗体
在有些实施方案中，本发明的抗体是单域抗体(single-domain antibody)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或者整个或部分轻链可变域的单一多肽链。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,Mass.；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。在一个实施方案中，单域抗体由抗体的整个或部分重链可变域组成。
6.抗体变体
在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以是通过将适宜的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除，插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基酸序列。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells(1989)Science 244:1081-1085中所述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如arg，asp，his，lys，和glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达的免疫球蛋白筛选期望的活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含一百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶或延长抗体血清半衰期的多肽融合。
在某些实施方案中，本发明的抗体发生了改变以提高或降低抗体糖基化的程度。多肽的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺，半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体中添加或删除糖基化位点可通过改变氨基酸序列从而创建或消除一个或多个上述三肽序列而便利地完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加，删除，或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。
若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申请号US2003/0157108(Presta,L.)中记载了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合物结构附着于抗体Fc区的抗体。还可参见US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd.)。WO 2003/011878(Jean-Mairet等)和美国专利No.6,602,684(Umana等)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 1997/30087(Patel等)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改碳水化合物附着于其Fc区的抗体还可参见WO 1998/58964(Raju,S.)和WO 1999/22764(Raju,S.)。关于具有改良糖基化的抗原结合分子还可参见US 2005/0123546(Umana等)。
在某些实施方案中，糖基化变体包含Fc区，其中附着于Fc区的碳水化合物结构缺乏岩藻糖或具有减少的岩藻糖。此类变体具有改进的ADCC功能。任选的是，Fc区还包含进一步改进ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区位置298，333和/或334处的替代(Eu残基编号方式)。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；Okazaki et al.,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka et al.,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1,Presta,L；及WO 2004/056312A1,Adams等,尤其是实施例11)和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnukiet al.,Biotech.Bioeng.87:614(2004))和过表达β1,4-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnT-III)和高尔基μ-甘露糖苷酶II(ManII)的细胞。
本文中涵盖相对于在野生型CHO细胞中生成的相同抗体上岩藻糖的量，具有降低的岩藻糖的抗体。例如，该抗体的岩藻糖的量比其它情况下如果由天然CHO细胞(例如生成天然糖基化样式的CHO细胞，诸如含有天然FUT8基因的CHO细胞)生成的话所具有的量要低。在某些实施方案中，本文中提供的抗Siglec-8抗体是如下的抗体，该抗体上少于约50％，40％，30％，20％，10％，5％或1％的N连接的聚糖包含岩藻糖。在某些实施方案中，本文中提供的抗Siglec-8抗体是如下的抗体，该抗体上无一N连接的聚糖包含岩藻糖，即该抗体完全没有岩藻糖或没有岩藻糖或是非岩藻糖基化的或是无岩藻糖基化的。可以通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如复合的，杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。在一些实施方案中，抗体的至少一条或两条重链是非岩藻糖基化的。
在一个实施方案中，抗体进行了改变以改进其血清半衰期。为了延长抗体的血清半衰期，可以将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)，如例如美国专利No.5,739,277中所记载的。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4)Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位(US 2003/0190311；美国专利No.6,821,505；美国专利No.6,165,745；美国专利No.5,624,821；美国专利No.5,648,260；美国专利No.6,165,745；美国专利No.5,834,597)。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。进行替代诱变的感兴趣位点包括高变区，但是也涵盖FR改变。表1中“优选替代”栏显示了保守替代。如果此类替代导致期望的生物学活性变化，那么可导入表1中称为“例示替代”的或如下文参照氨基酸分类进一步描述的更实质变化，并筛选产物。
表1
原始残基 例示替代 优选替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
对抗体生物学特性的实质性修饰可通过选择对维持以下方面的效果差异显著的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如(折叠)片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，可将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger,于Biochemistry,第2版,pp.73-75,Worth Publishers,New York(1975))：
(1)非极性的：Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Pro(P)，Phe(F)，Trp(W)，Met(M)
(2)不带电荷的，极性的：Gly(G)，Ser(S)，Thr(T)，Cys(C)，Tyr(Y)，Asn(N)，Gln(Q)
(3)酸性的：Asp(D)，Glu(E)
(4)碱性的：Lys(K)，Arg(R)，His(H)
或者，根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性，亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。此类替代残基还可以导入保守替代位点，或导入剩余(非保守)位点。
一类替代变体涉及替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体会具有改变的(例如改进的)生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的噬菌体外壳蛋白(例如M13基因III产物)至少一部分的融合物。然后对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行扫描诱变(例如丙氨酸扫描)以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本领域已知的技术(包括本文详述的技术)进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，使用本领域已知的技术(包括本文所述的技术)对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对较早制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变，PCR诱变和盒式诱变来制备。
可能希望在本发明抗体的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置(包括铰链半胱氨酸的位置)包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc区)。在一些实施方案中，Fc区变体包含人IgG4Fc区。在一个进一步的实施方案中，该人IgG4Fc区包含氨基酸替代S228P，其中氨基酸残基是依照Kabat中的EU索引编号的。
依照此描述和本领域的教导，涵盖在有些实施方案中，本发明的抗体与野生型对应抗体相比可包含一处或多处改变(在例如Fc区中)。与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍会基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可以在Fc区中进行会导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即或是增强或是削弱)的某些改变，例如WO99/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它例子的Duncan and Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO94/29351。WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。半衰期延长且对新生儿Fc受体(FcRn)(它负责将母体IgG转移给胎儿)(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)及Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))的结合改良的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)。这些抗体包含具有一处或多处改进Fc区与FcRn结合的替代的Fc区。具有改变的Fc区氨基酸序列且C1q结合能力升高或降低的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1,WO99/51642。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
7.载体，宿主细胞和重组方法
为了重组生产本发明的抗体，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规流程容易的分离编码抗体的DNA并测序(如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。一般而言，宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物)起源的。应当领会，任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG，IgM，IgA，IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以从任何人或动物物种获得。
使用原核宿主细胞生成抗体：
a)载体构建
可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。可从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于：复制起点，选择标志基因，启动子，核糖体结合位点(RBS)，信号序列，异源核酸插入片段，和转录终止序列。
一般而言，包含衍生自与宿主细胞相容物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主一起使用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322，其衍生物，或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利No.5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例。
另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEM.TM.-11来构建可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。
本发明的表达载体可包含两对或多对启动子-顺反子，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游(5′)的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动子指响应培养条件的变化(如营养物的存在与否或温度变化)而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。
众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，由此可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。
适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子，β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接(Siebenlist et al.,Cell 20:269(1980))。
在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜易位的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶，青霉素酶，Ipp，或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列，LamB，PhoE，PelB，OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达，折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(如大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Probaand Pluckthun,Gene 159:203(1995)。
本发明的抗体还可使用如下表达系统来生成，其中所表达多肽构件的数量比率可以受到调控，从而将分泌且正确装配的本发明抗体的产量最大化。这种调控是至少部分通过同时调控多肽构件的翻译强度而实现的。
Simmons等人，美国专利No.5,840,523中公开了用于调控翻译强度的一种技术。它在顺反子内利用翻译起始区(TIR)的变体。对于指定TIR，可创建具有一定范围翻译强度的一系列氨基酸或核酸序列变体，由此提供针对特定链的期望表达水平调整此因素的方便手段。可通过常规诱变技术导致能改变氨基酸序列的密码子变化来生成TIR变体。在某些实施方案中，核苷酸序列中的变化是沉默的。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno序列的数目或间距的改变，及信号序列中的改变。用于生成突变型信号序列的一种方法是在编码序列的开端生成不改变信号序列氨基酸序列的“密码子库”(即变化是沉默的)。这可通过改变每个密码子的第三个核苷酸位置来实现；另外，有些氨基酸，诸如亮氨酸，丝氨酸，和精氨酸，具有多种第一个和第二个位置，这可在建库中增加复杂性。Yansura et al.,METHODS:ACompanion to Methods in Enzymol.4:151-158(1992)中详细记载了这种诱变方法。
在一个实施方案中，对于载体中的每个顺反子，生成具有一定范围TIR强度的一组载体。这个有限集合提供了每条链的表达水平以及期望抗体产物的产量在各种TIR强度组合下的比较。可通过量化报道基因的表达水平来测定TIR强度，Simmons等人，美国专利No.5,840,523中有详细描述。根据翻译强度的比较，选择期望的个别TIR在本发明的表达载体构建物中进行组合。
适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(如大肠埃希氏菌E.coli)，芽孢杆菌属(Bacillus)(如枯草芽孢杆菌B.subtilis)，肠杆菌属(Enterobacteria)，假单胞菌属(Pseudomonas)(如铜绿假单胞菌P.aeruginosa)物种，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形菌属(Proteus)，志贺氏菌属(Shigella)，根瘤菌属(Rhizobium)，透明颤菌属(Vitreoscilla)，或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular andMolecular Biology，第2卷，Washington,D.C.，美国微生物学学会，1987，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac IqlacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR的菌株33D3(美国专利No.5,639,635)。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)，大肠杆菌B，大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)也是合适的。这些实例只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass et al.,Proteins8:309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322，pBR325，pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌，沙雷氏菌属，或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。
b)抗体生成
用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子，选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。
转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。
在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的实例包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。
在碳，氮，和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽，半胱氨酸，胱胺，巯基乙酸盐/酯，二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。
在合适的温度培养原核宿主细胞。在某些实施方案中，对于培养大肠杆菌，培养的温度范围为约20℃至约39℃，约25℃至约37℃，或约30℃。主要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。在某些实施方案中，对于大肠杆菌，pH为约6.8至约7.4，或约7.0。
如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。在某些实施方案中，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons et al.,J.Immunol.Methods 263:133-147(2002))。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。
在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常牵涉破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰(osmotic shock)，超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可能转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表达多肽。
在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵流程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，在某些实施方案中是约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。
在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度(如OD550约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养较短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。
为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA，DsbB，DsbC，DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式,反式-异构酶)的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen et al.,J.Biol.Chem.274:19601-19605(1999)；Georgiou等人，美国专利No.6,083,715；Georgiou等人，美国专利No.6,027,888；Bothmann and Pluckthun,J.Biol.Chem.275:17100-17105(2000)；Ramm and Pluckthun,J.Biol.Chem.275:17106-17113(2000)；Arie et al.,Mol.Microbiol.39:199-210(2001)。
为了将所表达异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解降至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III，OmpT，DegP，Tsp，蛋白酶I，蛋白酶Mi，蛋白酶V，蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly et al.,(1998)见上文；Georgiou等人，美国专利No.5,264,365；Georgiou等人，美国专利No.5,508,192；Hara et al.,Microbial Drug Resistance 2:63-72(1996)。
在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。
c)抗体纯化
在一个实施方案中，进一步纯化本文中生成的抗体蛋白质以获得基本上同质的制品，用于进一步的测定和使用。可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的流程是合适纯化流程的例示：免疫亲和或离子交换柱上的分级，乙醇沉淀，反相HPLC，硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析，层析聚焦，SDS-PAGE，硫酸铵沉淀，和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一个方面，将固定在固相上的蛋白A用于本发明抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983)。蛋白A固定其上的固相可以是具有玻璃或石英表面的柱子，或者可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，用以有可能防止污染物的非特异粘附。
作为纯化的第一步，可以将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗体特异结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收目的抗体。
使用真核宿主细胞生成抗体：
用于真核宿主细胞的载体通常包括一种或多种如下非限制性构件：信号序列，复制起点，一种或多种标志基因，增强子元件，启动子，和转录终止序列。
a)信号序列构件
在真核宿主细胞中使用的载体还可在目的成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异切割位点的其它多肽。可以选择受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹病毒gD信号。将这些前体区的DNA以符合读码框的方式连接至编码抗体的DNA。
b)复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因包含早期启动子才使用。
c)选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，如氨苄青霉素，新霉素，甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。
选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素，霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个实例是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR，胸苷激酶，金属硫蛋白I和II，灵长类金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等。
例如，在有些实施方案中，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在有些实施方案中，在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(如ATCC CRL-9096)。
或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素如卡那霉素，新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体，野生型DHFR蛋白，和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利No.4,965,199。宿主细胞可包括NS0，CHOK1，CHOK1SV或衍生物，包括谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷的细胞系。使用GS作为哺乳动物细胞的选择标志的方法记载于美国专利No.5,122,464和美国专利No.5,891,693。
d)启动子构件
表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与编码感兴趣多肽(例如抗体)的核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。例如，事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。在某些实施方案中，任何或所有这些序列可以合适的插入真核表达载体中。
在哺乳动物宿主细胞中自载体转录受到例如从病毒(诸如多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒(诸如2型腺病毒)，牛乳头瘤病毒，禽类肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙肝病毒，和猿猴病毒40(SV40))基因组获得的，来自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)的，来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种修改。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes et al.,Nature 297:598-601(1982)。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
e)增强子元件构件
常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白，弹性蛋白酶，清蛋白，α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期侧的增强子(bp 100-270)，人巨细胞病毒早期启动子增强子，小鼠巨细胞病毒早期启动子增强子，多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子，和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强子元件还可参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5′或3′位置，但是一般位于启动子的5′位点。
f)转录终止构件
在真核宿主细胞中使用的表达载体还可包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。
g)宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)，人胚肾系(293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham et al.,J.Gen.Virol.36:59(1977))，幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)，中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))，小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))，猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)，非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL 1587)，人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)，犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)，牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)，人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)，人肝细胞(Hep G2，HB 8065)，小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)，TRI细胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))，MRC 5细胞，FS4细胞，CHOK1细胞，CHOK1SV细胞或其衍生物和人肝细胞瘤(hepatoma)系(Hep G2)。
为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子，选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。
h)宿主细胞的培养
可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)，极限必需培养基(MEM，Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素，运铁蛋白或表皮生长因子)，盐(诸如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)，缓冲剂(诸如HEPES)，核苷酸(诸如腺苷和胸苷)，抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)，痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它补充物。培养条件诸如温度，pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然的。
i)抗体的纯化
在使用重组技术时，可在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先可以通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。如果抗体分泌到培养基中，那么可以首先使用商品化蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可使用例如羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析和亲和层析(亲和层析是一种便利的技术)来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1，γ2，或γ4重链的抗体(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.,EMBO J.5:1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质可以是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用BakerbondABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分级，乙醇沉淀，反相HPLC，硅土上的层析，肝素SEPHAROSETM上的层析，阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析，层析聚焦，SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可将含有目的抗体和污染物的混合物进行进一步的纯化，例如低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，在低盐浓度(如约0-0.25M盐)进行。
一般而言，用于制备供研究，测试和临床使用的抗体的各种方法是本领域已完善建立的，与上文所述方法是一致的和/或本领域技术人员认为对于特定的感兴趣抗体是适宜的。
非岩藻糖基化抗体的生成
本文中提供用于制备岩藻糖基化程度降低的抗体的方法。例如，本文中涵盖的方法包括但不限于使用蛋白质岩藻糖基化缺陷的细胞系(例如Lec13CHO细胞，α-1,6-岩藻糖基转移酶基因敲除CHO细胞，过表达β1,4-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III且进一步过表达高尔基μ-甘露糖苷酶II(ManII)的细胞，等)，及在用于生成抗体的细胞培养基中添加岩藻糖类似物。参见Ripka et al.,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请No.US 2003/0157108A1,Presta,L；WO 2004/056312A1；Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；和美国专利No.8,574,907。别的用于降低抗体岩藻糖含量的技术包括美国专利申请公开文本No.2012/0214975中记载的Glymaxx技术。别的用于降低抗体的岩藻糖含量的技术还包括在用于生成抗体的细胞培养基中添加一种或多种糖苷酶抑制剂。糖苷酶抑制剂包括α-葡萄糖苷酶I，α-葡萄糖苷酶II，和α-甘露糖苷酶I。在一些实施方案中，糖苷酶抑制剂是α-甘露糖苷酶I的抑制剂(例如几夫碱)。
如本文中使用的，“核心岩藻糖基化”指在N连接的聚糖的还原性末端对N-乙酰基葡糖胺(“GlcNAc”)添加岩藻糖(“岩藻糖基化”)。还提供通过此类方法生成的抗体及其组合物。
在一些实施方案中，结合至Fc区(或域)的复合N-糖苷连接的糖链的岩藻糖基化是降低的。如本文中使用的，“复合N-糖苷连接的糖链”通常结合至天冬酰胺297(依照Kabat编号)，尽管复合N-糖苷连接的糖链也可以连接至其它天冬酰胺残基。“复合N-糖苷连接的糖链”排除高甘露糖型糖链，其中在核心结构的非还原性末端只掺入甘露糖，但是包括1)复合型，其中核心结构的非还原性末端侧具有一个或多个半乳糖-N-乙酰基葡糖胺(也称作“gal-GlcNAc”)分支且Gal-GlcNAc的非还原性末端任选具有唾液酸，两分型N-乙酰基葡糖胺，诸如此类；或2)杂合型，其中核心结构的非还原性末端侧具有高甘露糖N-糖苷连接的糖链和复合N-糖苷连接的糖链两种分支。
在一些实施方案中，“复合N-糖苷连接的糖链”包括复合型，其中核心结构的非还原性末端侧具有零个，一个或多个半乳糖-N-乙酰基葡糖胺(也称作“gal-GlcNAc”)的分支且Gal-GlcNAc的非还原性末端侧任选进一步具有诸如唾液酸，两分型N-乙酰基葡糖胺，诸如此类的结构。
依照本方法，复合N-糖苷连接的糖链中通常只掺入极小量的岩藻糖。例如，在各种实施方案中，组合物中少于约60％，少于约50％，少于约40％，少于约30％，少于约20％，少于约15％，少于约10％，少于约5％，或少于约1％的抗体具有岩藻糖所致的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，组合物中的基本上无一(即少于约0.5％)抗体具有岩藻糖所致核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，组合物中多于约40％，多于约50％，多于约60％，多于约70％，多于约80％，多于约90％，多于约91％，多于约92％，多于约93％，多于约94％，多于约95％，多于约96％，多于约97％，多于约98％，或多于约99％的抗体是非岩藻糖基化的。
在一些实施方案中，本文中提供如下的抗体，其中基本上无一(即少于约0.5％)N-糖苷连接的碳水化合物链含有岩藻糖残基。在一些实施方案中，本文中提供如下的抗体，其中抗体重链至少一条或两条是非岩藻糖基化的。
如上所述，可以利用多种哺乳动物宿主-表达载体系统来表达抗体。在一些实施方案中，培养基未补充岩藻糖。在一些实施方案中，对培养基添加有效量的岩藻糖类似物。在此语境中，“有效量”指类似物足以将岩藻糖并入抗体复合N-糖苷-连接的糖链降低至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％或至少约50％的量。在一些实施方案中，与在岩藻糖类似物缺失下培养的宿主细胞生成的抗体相比，通过本方法生成的抗体包含至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％或至少约50％非核心岩藻糖基化蛋白(例如缺乏核心岩藻糖基化)。
可以例如如实施例中描述的测定岩藻糖没有结合至糖链的还原性末端中的N-乙酰基葡糖胺的糖链对岩藻糖结合至糖链的还原性末端中的N-乙酰基葡糖胺的糖链的含量(例如比率)。其它方法包括肼解或酶消化(参见例如Biochemical ExperimentationMethods 23:Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain(Japan ScientificSocieties Press),edited by Reiko Takahashi(1989))，荧光标记或放射性同位素标记释放的糖链，然后通过层析分出已标记的糖链。还有，可以通过用HPAEC-PAD法分析链来测定释放的糖链的组合物(参见例如J.Liq Chromatogr.6:1557(1983))(一般参见美国专利申请公开文本No.2004/0110282)。
IV.组合物
在一些方面，本文中还提供包含本文所述任何抗Siglec-8抗体的组合物(例如药物组合物)。在一些方面，本文中提供包含本文所述抗Siglec-8抗体的组合物，其中该抗体包含Fc区和连接至该Fc区的N-糖苷连接的碳水化合物链，其中少于约50％的该N-糖苷连接的碳水化合物链含有岩藻糖残基。在一些方面，本文中提供包含本文所述抗Siglec-8抗体的组合物，其中该抗体包含Fc区和连接至该Fc区的N-糖苷连接的碳水化合物链，其中基本上无一该N-糖苷连接的碳水化合物链含有岩藻糖残基。
通过将具有期望纯度的活性成分与任选的药学可接受载体，赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,Lippincott Williams&Wiklins,Pub.,Gennaro编,Philadelphia,Pa.2000)混合来制备治疗配制剂，供贮存用。可接受的载体，赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸，甲硫氨酸，维生素E，偏亚硫酸氢钠；防腐剂；等渗调节剂(isotonicifier)；稳定剂；金属复合物，例如Zn-蛋白质复合物；螯合剂，诸如EDTA；和/或非离子表面活性剂。
可以使用缓冲剂来将pH控制在优化治疗功效的范围内，尤其在稳定性依赖于pH的情况中。缓冲剂可以以范围为约50mM至约250mM的浓度存在。适于与本发明一起使用的缓冲剂包括有机酸和无机酸两者及其盐，例如柠檬酸盐，磷酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，延胡索酸盐，葡萄糖酸盐，草酸盐，乳酸盐，乙酸盐。另外，缓冲剂可以由组氨酸和三甲胺盐诸如Tris构成。
可以添加防腐剂来防止微生物生长，而且通常以约0.2％-1％(w/v)的范围存在。适于与本发明一起使用的防腐剂包括氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双铵；苯扎卤铵(例如苯扎氯铵，苯扎溴铵，苯扎碘铵)，苄索氯铵；硫柳汞；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚。
存在等渗剂(有时称为“稳定剂”)以调节或维持组合物中液体的等渗性。当与大的，带电荷的生物分子诸如蛋白质和抗体一起使用时，它们常常称作“稳定剂”，因为它们能与氨基酸侧链的带电荷基团相互作用，由此减轻分子间和分子内相互作用的势(potential)。等渗剂可以以约0.1％至约25％(以重量计)，或约1至约5％之间的任何量存在，其中考虑了其它成分的相对量。在一些实施方案中，等渗剂包括多羟基糖醇，三羟基的或更高级的糖醇，诸如甘油，赤藓糖醇，阿糖醇，木糖醇，山梨醇和甘露醇。
别的赋形剂包括能承担以下一项或多项功能的药剂：(1)填充剂(bulkingagent)；(2)增溶剂；(3)稳定剂；和(4)防止变性或对容器壁的粘着的药剂。此类赋形剂包括：多羟基糖醇(上文列举的)；氨基酸，诸如丙氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，亮氨酸，2-苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如蔗糖，乳糖，乳糖醇，海藻糖，水苏糖，甘露糖，山梨糖，木糖，核糖，核糖醇，肌肉肌糖，肌肉肌醇，半乳糖，半乳糖醇，甘油，环多醇(例如肌醇)，聚乙二醇；含硫的还原剂，诸如尿素，谷胱甘肽，硫辛酸，巯基乙酸钠，硫代甘油，α-一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，诸如人血清清蛋白，牛血清清蛋白，明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，例如木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；二糖，例如乳糖，麦芽糖，蔗糖；三糖，诸如棉子糖；和多糖，诸如糊精或葡聚糖(dextran)。
可以存在非离子型表面活性剂或去污剂(也称为“湿润剂”)以帮助溶解治疗剂以及以保护治疗用蛋白质免于搅动诱导的聚集，其还容许配制剂在暴露于剪切表面应力时不引起活性治疗用蛋白质或抗体变性。非离子型表面活性剂以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，或约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。在一些实施方案中，非离子型表面活性剂以约0.001％至约0.1％w/v或约0.01％至约0.1％w/v或约0.01％至约0.025％w/v的范围存在。
合适的非离子型表面活性剂包括Polysorbate(20,40,60,65,80等)，Polyoxamer(184,188等)，
Figure BDA0001014201170000651
多元醇，
Figure BDA0001014201170000652
聚氧乙烯山梨聚糖单醚(
Figure BDA0001014201170000653
等)，Lauromacrogol 400，Polyoxyl 40硬脂酸酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油10,50和60，甘油单硬脂酸酯，蔗糖脂肪酸酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子去污剂包括十二烷基硫酸钠，二辛基磺基琥珀酸钠和十六烷基磺酸钠。阳离子去污剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了配制剂用于体内施用，它们必须是无菌的。通过无菌滤膜过滤，可以使得配制剂变成无菌的。一般将本文中的治疗性组合物置入具有无菌存取口的容器中，例如具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶。
施用路径依照已知的和可接受的方法，诸如通过合适方式的一次或多次推注或一长段时间里的输注，例如通过皮下，静脉内，腹膜内，肌肉内，动脉内，病变内或关节内路径的注射或输注，表面施用，吸入或通过持续释放或延长释放手段。
本文中的配制剂还可以含有超过一种的，所治疗特定适应症所必需的活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。或者/另外，组合物可包含细胞毒剂，细胞因子或生长抑制剂。此类分子合适地以对于预定目的有效的量组合存在。
V.治疗方法
本文中提供用于在受试者中治疗或预防由表达Siglec-8的细胞介导的疾病的方法，其包括对该受试者施用有效量的本文所述抗Siglec-8抗体(例如人源化抗Siglec-8抗体)或其组合物。在一些实施方案中，该受试者(例如人患者)已经诊断有嗜曙红细胞介导的病症或有风险发生嗜曙红细胞介导的病症。在一些实施方案中，该受试者(例如人患者)已经诊断有肥大细胞介导的病症或有风险发生该肥大细胞介导的病症。在一些实施方案中，该受试者具有嗜曙红细胞介导的病症或肥大细胞介导的病症。
本文中提供消减或减少嗜曙红细胞的方法，其包括对受试者施用有效量的本文所述抗Siglec-8抗体(例如人源化抗Siglec-8抗体)。在一些实施方案中，嗜曙红细胞的消减或减少是通过比较用该抗体处理后来自受试者的样品(例如组织样品)中的嗜曙红细胞群数目与用该抗体处理前来自受试者的样品中的嗜曙红细胞群数目测量的。在一些实施方案中，嗜曙红细胞的消减或减少是通过比较用该抗体处理后来自受试者的样品(例如组织样品)中的嗜曙红细胞群数目与来自没有该抗体处理的另一受试者的样品中的嗜曙红细胞群数目或来自没有该抗体处理的受试者的样品中的平均嗜曙红细胞群数目测量的。在一些实施方案中，该样品是组织样品(例如肺样品，鼻息肉病样品，等)。在一些实施方案中，嗜曙红细胞的消减或减少是由于已活化的嗜曙红细胞的凋亡。嗜曙红细胞可以通过细胞因子或激素来活化或敏化，诸如但不限于IL-5，GM-CSF，IL-33，IFN-γ，TNF-α，和瘦蛋白。在一些实施方案中，嗜曙红细胞的消减或减少是由于静息嗜曙红细胞的凋亡。在一些实施方案中，嗜曙红细胞的消减或减少是由于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，阻止或降低嗜曙红细胞生成炎症介导物。例示性炎症介导物包括但不限于反应性氧种类，粒蛋白(granule protein)(例如嗜曙红细胞阳离子蛋白，主要碱性蛋白，嗜曙红细胞衍生的神经毒素，嗜曙红细胞过氧化物酶，等)，脂质介导物(例如PAF，PGE1，PGE2，等)，酶(例如弹性蛋白酶)，生长因子(例如VEGF，PDGF，TGF-α，TGF-β，等)，趋化因子(例如RANTES，MCP-1，MCP-3，MCP4，嗜曙红细胞活化趋化因子(eotaxin)，等)和细胞因子(例如IL-3，IL-5，IL-10，IL-13，IL-15，IL-33，TNF-α，等)。
本文中还提供消减或减少肥大细胞的方法，其包括对受试者施用有效量的本文所述抗Siglec-8抗体(例如人源化抗Siglec-8抗体)。在一些实施方案中，该肥大细胞的消减或减少是通过比较用该抗体处理后来自受试者的样品(例如组织样品或生物学流体样品)中的肥大细胞群数目与用该抗体处理前来自受试者的样品中的肥大细胞群数目测量的。在一些实施方案中，肥大细胞的消减或减少是通过比较用该抗体处理后来自受试者的样品(例如组织样品或生物学流体样品)中的肥大细胞群数目与来自没有该抗体处理的另一受试者的样品中的肥大细胞群数目或来自没有该抗体处理的受试者的样品中的平均肥大细胞群数目测量的。在一些实施方案中，该样品是组织样品(例如皮肤样品，肺样品，骨髓样品，鼻息肉病样品，等)。在一些实施方案中，该样品是生物学流体样品(例如血液样品，支气管肺泡灌洗液样品，和鼻灌洗液样品)。在一些实施方案中，肥大细胞的消减或减少是由于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，肥大细胞的消减或减少是减少或阻止肥大细胞生成预形成的或新形成的炎症介导物。例示性炎症介导物包括但不限于组胺，N-甲基组胺，酶(例如类胰蛋白酶(tryptase)，类糜蛋白酶(chymase)，组织蛋白酶G，羧肽酶，等)，脂质介导物(例如前列腺素D2，前列腺素E2，白三烯B4，白三烯C4，血小板活化因子，11-β-前列腺素F2，等)，趋化因子(例如CCL2，CCL3，CCL4，CCL11(即嗜曙红细胞活化趋化因子)，CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL10，等)，和细胞因子(例如IL-3，IL-4，IL-5，IL-15，IL-33，GM-CSF，TNF，等)。
本文中还提供在受试者中消减表达Siglec-8的肥大细胞的方法，其包括对该受试者施用有效量的本文所述抗Siglec-8抗体(例如人源化抗Siglec-8抗体)，其中该抗Siglec-8抗体通过ADCC活性杀死表达Siglec-8的肥大细胞。在一些实施方案中，与处理前的基线水平相比，该抗Siglec-8抗体将自该受试者获得的样品中的表达Siglec-8的肥大细胞消减至少约20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％或约100％。在一些实施方案中，与处理前的基线水平相比，该抗Siglec-8抗体将自该受试者获得的样品中的表达Siglec-8的肥大细胞消减至少约20％。在一些实施方案中，肥大细胞的消减或杀伤是通过比较用该抗体处理后来自受试者的样品(例如组织样品或生物学流体样品)中的肥大细胞群数目与用该抗体处理前来自受试者的样品中的肥大细胞群数目测量的。在一些实施方案中，肥大细胞的消减或杀伤是通过比较用该抗体处理后来自受试者的样品(例如组织样品或生物学流体样品)中的肥大细胞群数目与来自没有该抗体处理的另一受试者的样品中的肥大细胞群数目或来自没有该抗体处理的受试者的样品中的平均肥大细胞群数目测量的。在一些实施方案中，该样品是组织样品(例如皮肤样品，肺样品，骨髓样品，鼻息肉病样品，等)。在一些实施方案中，该样品是生物学流体样品(例如血液样品，支气管肺泡灌洗液样品，和鼻灌洗液样品)。在一些实施方案中，该抗Siglec-8抗体已经工程化改造以改善ADCC活性。在一些实施方案中，该抗Siglec-8抗体在Fc区中包含至少一处改善ADCC活性的氨基酸替代。在一些实施方案中，该抗体的重链至少一条或两条是非岩藻糖基化的。在一些实施方案中，肥大细胞的消减或杀伤是减少或阻止肥大细胞生成预形成的或新形成的炎症介导物。例示性炎症介导物包括但不限于组胺，N-甲基组胺，酶(例如类胰蛋白酶，类糜蛋白酶，组织蛋白酶G，羧肽酶，等)，脂质介导物(例如前列腺素D2，前列腺素E2，白三烯B4，白三烯C4，血小板衍生因子，11-β-前列腺素F2，等)，趋化因子(例如CCL2，CCL3，CCL4，CCL11(即嗜曙红细胞活化趋化因子)，CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL10，等)，和细胞因子(例如IL-3，IL-4，IL-5，IL-13，IL-15，IL-33，GM-CSF，TNF，等)。
本文中还提供抑制肥大细胞介导的活性的方法，其包括对受试者施用有效量的本文所述抗Siglec-8抗体(例如人源化抗Siglec-8抗体)。在一些实施方案中，肥大细胞介导的活性的抑制是通过比较用该抗体处理后来自受试者的样品(例如组织样品或血液样品)中的肥大细胞介导的活性与用该抗体处理前来自受试者的样品中的肥大细胞介导的活性测量的。在一些实施方案中，肥大细胞介导的活性的抑制是通过比较用该抗体处理后来自受试者的样品(例如组织样品或生物学样品)中的肥大细胞介导的活性与来自没有该抗体处理的另一受试者的样品中的肥大细胞介导的活性或来自没有该抗体处理的受试者的样品中的平均肥大细胞介导的活性测量的。在一些实施方案中，该样品是组织样品(例如皮肤样品，肺样品，骨髓样品，鼻息肉病样品，等)。在一些实施方案中，该样品是生物学流体样品(例如血液样品，支气管肺泡灌洗液样品，和鼻灌洗液样品)。在一些实施方案中，肥大细胞介导的活性的抑制是肥大细胞脱粒的抑制。在一些实施方案中，肥大细胞介导的活性的抑制是气道平滑肌收缩的抑制。在一些实施方案中，肥大细胞介导的活性的抑制是肥大细胞中的钙流的抑制。在一些实施方案中，肥大细胞介导的活性的抑制是肥大细胞释放预形成的或新形成的炎症介导物的抑制。例示性炎症介导物包括但不限于组胺，N-甲基组胺，酶(例如类胰蛋白酶，类糜蛋白酶，组织蛋白酶G，羧肽酶，等)，脂质介导物(例如前列腺素D2，前列腺素E2，白三烯B4，白三烯C4，血小板衍生因子，11-β-前列腺素F2，等)，趋化因子(例如CCL2，CCL3，CCL4，CCL11(即嗜曙红细胞活化趋化因子)，CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL10，等)，和细胞因子(例如IL-3，IL-4，IL-5，IL-13，IL-15，IL-33，GM-CSF，TNF，等)。
为了疾病的预防或治疗，活性剂的适宜剂量会取决于所要治疗的疾病的类型(如上文所定义的)，疾病的严重程度和进程，施用药剂是出于预防目的还是治疗目的，先前的疗法，受试者的临床史和对药剂的响应，及主治医师的判断。所述药剂适合于在一次或一系列的治疗中施用于受试者。在本文所述方法的一些实施方案中，所述抗Siglec-8抗体施用之间的间隔为约一个月或更长。在一些实施方案中，施用之间的间隔为约两个月，约三个月，约四个月，约五个月，约六个月或更长。如本文中使用的，施用之间的间隔指一次施用抗体和下一次施用抗体之间的时间段。如本文中使用的，约一个月的间隔包括四周。因而，在一些实施方案中，施用之间的间隔为约4周，约8周，约12周，约16周，约20周，约24周，或更长。在一些实施方案中，所述治疗包括多次施用所述抗体，其中施用之间的间隔可以变化。例如，第一次施用和第二次施用之间的间隔为约一个月，而后续施用之间的间隔为约三个月。在一些实施方案中，第一次施用和第二次施用之间的间隔为约一个月，第二次施用和第三次施用之间的间隔为约两个月，而后续施用之间的间隔为约三个月。在一些实施方案中，以平剂量(flat dose)施用本文所述抗Siglec-8抗体。在一些实施方案中，以约150至约450mg每剂的剂量对受试者施用本文所述抗Siglec-8抗体。在一些实施方案中，以约150mg，200mg，250mg，300mg，350mg，400mg，和450mg每剂任一的剂量对受试者施用所述抗Siglec-8抗体。在一些实施方案中，以约0.1mg/kg至约10mg/kg或约1.0mg/kg至约10mg/kg的剂量将本文所述抗Siglec-8抗体施用于受试者。在一些实施方案中，以约0.1mg/kg，0.5mg/kg，1.0mg/kg，1.5mg/kg，2.0mg/kg，2.5mg/kg，3.0mg/kg，3.5mg/kg，4.0mg/kg，4.5mg/kg，5.0mg/kg，5.5mg/kg，6.0mg/kg，6.5mg/kg，7.0mg/kg，7.5mg/kg，8.0mg/kg，8.5mg/kg，9.0mg/kg，9.5mg/kg，或10.0mg/kg任一的剂量将本文所述抗Siglec-8抗体施用于受试者。可使用上文所述任何剂量给药频率。
本文中涵盖的一种治疗方法是用本文所述抗Siglec-8抗体治疗嗜曙红细胞介导的病症和/或肥大细胞介导的病症。嗜曙红细胞介导的病症包括与嗜曙红细胞迁移，趋化性，生成，或粒化有关的病症或疾病。类似地，肥大细胞介导的病症包括与肥大细胞迁移，趋化性，生成，或粒化有关的病症或疾病。用本发明的配制剂可治疗的嗜曙红细胞介导的病症和/或肥大细胞介导的病症包括哮喘，变应性鼻炎，鼻息肉病，特应性皮炎，慢性荨麻疹(例如慢性特发性荨麻疹和慢性自发性荨麻疹)，肥大细胞增多，嗜曙红细胞性白血病，和嗜曙红细胞增多综合征。用本发明的配制剂可治疗的嗜曙红细胞介导的病症和/或肥大细胞介导的病症还包括少粒细胞性哮喘，急性或慢性气道超敏感性，嗜曙红细胞性食道炎，丘-施二氏综合征，与细胞因子的有关的炎症，与表达Siglec-8的细胞有关的炎症，与表达Siglec-8的细胞有关的恶性，物理性荨麻疹，寒冷性荨麻疹，压迫性荨麻疹，大疱性类天疱疮，食物过敏，和变应性支气管肺曲霉病(ABPA)。
在本文中的方法的一些实施方案中，本文中提供的抗Siglec-8抗体抑制变应性反应的一种或多种症状。在一些实施方案中，该变应性反应是I型超敏感性反应。
变应性鼻炎(也称作变应性鼻结膜炎或干草热)是对吸入的变应原的特应性反应的最常见表现，其严重程度和持续时间常常与对变应原的暴露的强度和时间长度有关。它是一种慢性病，可首次出现于任何年龄，但是通常在儿童期或青少年期发作。典型发作包括大量水样鼻漏，阵发性打喷嚏，鼻塞，及鼻和腭的搔痒。鼻后粘液引流也引起咽喉痛，清嗓和咳嗽。还可以有变应性睑缘结膜炎的症状，带有结膜和眼睑的强烈搔痒，发红，流泪，和畏光。严重发作常常伴有全身不适，虚弱，疲劳，和有时，强烈喷嚏期后的肌肉酸痛。
哮喘(也称作可逆阻塞性气道疾病)的特征在于气管支气管树对呼吸刺激和支气管收缩性化学药品的高应答性，产生哮鸣，呼吸困难，胸部紧迫感，和咳嗽的发作，它们是自发可逆的或借助治疗可逆的。它是一种涉及整个气道的慢性病，但是严重程度自偶见的轻度暂时发作至重度，长期，危及生命的支气管梗阻而变化。哮喘发作的体征包括呼吸急促，听得到的哮鸣，和使用辅助呼吸肌。通常还存在脉速和血压升高，正如鼻分泌和外周血中升高的嗜曙红细胞水平。哮喘和特应性可共存，但是只有大约一半的哮喘病人也是特应性的，而且甚至更小百分比的特应性患者也具有哮喘。然而，特应性和哮喘并非是完全独立的，因为与非特应性个体相比，哮喘更加频繁地在特应性个体中发生，尤其是在儿童期。哮喘在组织学上进一步地被分成两个亚组，即外源性哮喘和内源性哮喘。另外，哮喘牵涉气道的慢性炎症，不同患者间频率不同且响应环境触发物而发生的急性恶化。在严重病例中，可发生气道的慢性重塑。
外源性哮喘(也称作变应性，特应性或免疫学哮喘)描述一般在生命早期，通常在婴儿期或儿童期发生哮喘的患者。特应性的其它表现(包括湿疹或变应性鼻炎)常常共存。哮喘发作可在花粉季期间，在存在动物的情况中，或在暴露于室尘，羽毛枕，或其它变应原时发生。皮试显示对致病变应原的阳性风团和潮红反应。有趣的是，血清总IgE浓度常常是升高的，但是有时是正常的。内源性哮喘(也称作非变应性或特发性哮喘)通常首次发生于成人期，在表观呼吸道感染之后。症状包括与花粉季或暴露于其它变应原无关的慢性或复发性支气管梗阻。对常见特应性变应原的皮试是阴性的，血清IgE浓度是正常的。别的症状包括痰血和嗜曙红细胞增多。为本专利申请的目的，术语“嗜曙红细胞介导的病症”包括变应性和非变应性这两种哮喘。在一些实施方案中，具有嗜曙红细胞介导的病症和/或肥大细胞介导的病症的受试者罹患通过吸入式皮质类固醇，短效β2激动剂，长效β2激动剂，或其组合没有得到恰当控制的哮喘。
特应性皮炎(也称作湿疹，神经性皮炎，特应性湿疹或贝尼埃氏(Besnier)痒疹)是对一个患者亚群特异的常见慢性皮肤病症，该患者亚群具有家族性和免疫学特征的特应性。本质特征是搔痒性皮肤炎症应答，其诱导特征性的，对称性分布的皮肤斑疹，对某些部位有偏爱。虽然特应性皮炎被归为皮肤形式的特应性(因为它与变应性鼻炎和哮喘和高IgE水平有关)，但是皮试时皮炎的严重程度并非总是与变应原暴露有关，而且脱敏(与其它变应性疾病不同)不是有效治疗方法。虽然高血清IgE能证实变应性哮喘的诊断，但是正常水平也不能排除变应性哮喘的诊断。该疾病的发作可发生于任何年龄，而且病变开始急，有红斑水肿丘疹或带有脱皮的斑块。搔痒导致渗液和结痂，然后是慢性苔藓样变。在细胞水平，急性病变是水肿性的，而且真皮浸润有单个核细胞，即CD4淋巴细胞。嗜中性细胞，嗜曙红细胞，浆细胞和嗜碱性细胞是罕见的，但是存在脱粒的肥大细胞。慢性病变的特征为表皮增生，过度角化和角化不全，而且真皮浸润有单个核细胞，朗格汉斯氏(Langerhans)细胞和肥大细胞。还可以有纤维化的病灶区，包括小神经的神经束膜的参与。
荨麻疹和血管性水肿指身体肿胀，红斑和搔痒(其源自浅表皮肤血管中受组胺刺激的受体)，而且是系统性过敏反应的标志性皮肤特征。系统性过敏反应是源自药物，昆虫毒液或食物，在多种器官中同时发生的IgE介导的反应。它是由变应原诱导，肥大细胞加载IgE而突然引起的，导致深刻的和危及生命的，多种生命器官的机能的改变。血管塌陷，急性气道阻塞，皮肤血管舒张和水肿，及胃肠和泌尿生殖肌肉痉挛几乎同时发生，虽然并非总是相同程度。过敏反应的病理学包括血管性水肿和肺充气过度，带有气道粘液填塞和局灶性肺不张。在细胞水平，肺的表现与急性哮喘发作期类似，带有支气管粘膜下层腺分泌过多，粘膜和粘膜下层水肿，支气管周围血管淤血/充血(congestion)和支气管壁中的嗜曙红细胞增多。可存在肺水肿和出血。也可以存在支气管肌肉痉挛，充气过度，和甚至肺泡破裂。人过敏反应的主要特征包括水肿，血管淤血/充血，及喉，气管，会厌和下咽的固有层中的嗜曙红细胞增多。对变应原的暴露可以经由摄食，注射，吸入或皮肤或粘膜接触。反应在暴露于变应原后数秒或数分内开始。可以有厄运迫近的初始畏惧或感觉，紧接着是一个或多个靶器官系统：心血管，呼吸，皮肤或胃肠中的症状。对过敏反应负有责任的变应原不同于那些通常与特应性有关的变应原。食物，药物，昆虫毒液或胶乳是常见来源。食物变应原包括那些在甲壳动物，软体动物(例如龙虾，虾，蟹)，鱼，豆(例如花生，豌豆，菜豆(bean)，甘草)，种子(例如芝麻，棉籽，葛缕子(caraway)，芥子，亚麻子，向日葵)，坚果，浆果，蛋白，荞麦粉和乳中找到的。药物变应原包括那些在异源蛋白质和多肽，多糖和半抗原药物中找到的。昆虫变应原包括膜翅目昆虫，包括蜜蜂，小黄蜂(yellow jacket)，大黄蜂(hornet)，黄蜂(wasp)和火蚁。虽然肾上腺素是过敏反应的典型治疗，但是抗组胺剂或其它组胺阻断剂通常在处方中用于减轻严重的荨麻疹或血管水肿反应。
鼻息肉病是上呼吸道的一种慢性炎性疾病，特征在于发炎组织长出进入鼻腔，而且虽然尚不知道确切病因，但是已知具有1至5％成人的流行性(Settipane G A:Epidemiology of nasal polyps.Allergy Asthma Proc,1996,17:231-236)。鼻息肉病通常存在于20岁或更年长的男性中，并引起鼻塞，嗅觉减退，和屡发感染，具有比终年变应性鼻炎显著更大的对生活质量的影响(Li et al.,Characterizing T-Cell Phenotypes inNasal Polyposis in Chinese Patients,J Investig Allergol Clin Immunol,2009；Vol.19(4):276-282)。多至三分之一的所有鼻息肉病患者报告具有哮喘，然而只有7％的哮喘患者具有鼻息肉病。牵连鼻息肉病的主要细胞类型包括嗜曙红细胞和肥大细胞。
VI.制品或试剂盒
另一方面，提供包含本文所述抗Siglec-8抗体的制品或试剂盒。所述制品或试剂盒可进一步包含关于在本发明的方法中使用所述抗体的说明书。如下，在某些实施方案中，所述制品或试剂盒包含关于在用于在个体中治疗或预防嗜曙红细胞介导的病症和/或肥大细胞介导的病症的方法中使用抗Siglec-8抗体的说明书，该方法包括对个体施用有效量的抗Siglec-8抗体。在某些实施方案中，所述个体为人。在一些实施方案中，所述个体具有选自下组的疾病：哮喘，变应性鼻炎，鼻息肉病，特应性皮炎，慢性荨麻疹，肥大细胞增多，嗜曙红细胞性白血病，和嗜曙红细胞增多综合征。在某些实施方案中，所述个体具有选自下组的疾病：少粒细胞性哮喘，急性或慢性气道超敏感性，嗜曙红细胞性食道炎，丘-施二氏综合征，与细胞因子的有关的炎症，与表达Siglec-8的细胞有关的炎症，与表达Siglec-8的细胞有关的恶性，物理性荨麻疹，寒冷性荨麻疹，压迫性荨麻疹，大疱性类天疱疮，食物过敏，和变应性支气管肺曲霉病(ABPA)。
所述制品或试剂盒可进一步包含容器。合适的容器包括例如瓶，管形瓶(例如双室管形瓶)，注射器(诸如单室或双室注射器)和试管。所述容器可以用各种材料诸如玻璃或塑料制成。该容器装有配制剂。
所述制品或试剂盒可进一步包含标签或包装插页，其在容器上或与所述容器相连，可指明关于配制剂重建和/或使用的说明。所述标签或包装插页可进一步指明所述配制剂可用于或意图用于皮下，静脉内，或其它模式的施用以在个体中治疗或预防嗜曙红细胞介导的病症和/或肥大细胞介导的病症。所述装有配制剂的容器可以是单次使用的管形瓶或多次使用的管形瓶，其容许重建配制剂的重复施用。所述制品或试剂盒可进一步包含第二容器，其中装有合适的稀释剂。所述制品或试剂盒可进一步包括从商业，治疗，和使用者立场看想要的其它物质，包括其它缓冲剂，稀释剂，滤器，针头，注射器，和印有使用说明书的包装插页。
在一个具体的实施方案中，本发明提供用于单剂施用单位的试剂盒。此类试剂盒包含治疗性抗体的水性配制剂的容器，包括单室或多室预装填注射器。例示性预装填注射器可以自Vetter GmbH(Ravensburg,Germany)获得。
本文中的制品或试剂盒任选进一步包含装有第二药物的容器，其中所述抗Siglec-8抗体为第一药物，且该制品或试剂盒进一步在标签或包装插页上包含关于以有效量用所述第二药物治疗受试者的说明书。所述例示性的第二药物可以是抗IgE抗体，抗组胺剂，支气管扩张药，糖皮质激素，NSAID，解充血药，镇咳剂，镇痛药，TNF-拮抗剂，整联蛋白拮抗剂，免疫抑制剂，IL-4拮抗剂，IL-13拮抗剂，双重IL-4/IL-13拮抗剂，DMARD，与B细胞表面标志物结合的抗体，和/或BAFF拮抗剂。
在另一个实施方案中，本文中提供制品或试剂盒，其包含本文中所描述的配制剂，其用于在自我注射器装置中施用。自我注射器可以描述成在开动后无需别的来自患者或施用者的必需动作就会投递其内容物的注射装置。当投递速率必须恒定且投递时间大于少许片刻(a few moment)的时候，它们特别适于治疗性配制剂的自我药疗。
通过参考下述实施例，会更加全面地理解本发明。然而，它们不应解释为限制本发明的范围。要理解，本文所述实施例和实施方案只是出于例示目的，而且根据它们，本领域技术人员会想到各种变更和变化，而且它们被包括在本申请的精神和范围及所附权利要求的范围内。
实施例
Siglec(结合唾液酸的，免疫球蛋白样凝集素)是主要在白细胞上找到的单次跨膜细胞表面蛋白。Siglec家族的一个成员，Siglec-8最初是作为鉴定新颖人嗜曙红细胞蛋白质的成就的一部分发现的。在由人嗜曙红细胞表达以外，它还由肥大细胞表达。Siglec-8识别一种硫酸化聚糖，6’-磺基-唾液酰基Lewis X，而且含有细胞内免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)结构域，其显示出抑制肥大细胞功能。针对Siglec-8的鼠抗体，2E2和2C4抗体描述于美国专利No.8,207,305；美国专利No.8,197,811，美国专利No.7,871,612，和美国专利No.7,557,191。小鼠抗Siglec-8 2C4抗体的重链可变域和轻链可变结构域的氨基酸序列可以见例如美国专利No.8,207,305，分别是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。
实施例1：嵌合抗Siglec-8抗体的生成和表征。
自小鼠2E2抗体和小鼠2C4抗体生成嵌合抗体，并随后分析对人Siglec-8的结合活性。
方法和结果
嵌合2E2抗体(ch2E2)和嵌合2C4抗体(ch2C4)的生成
为了生成嵌合2E2抗体(ch2E2)，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)依照制造商的方案加工骤冻小鼠杂交瘤2E2细胞裂解物以分离总RNA。使用第一链cDNA合成试剂盒(GELife Sciences)依照制造商的方案逆转录3μg分离的RNA样品以生成2E2cDNA。随后使用Phusion Flash高保真PCR大师级混合物(Thermo Scientific)通过PCR扩增2E2cDNA，并确认PCR反应中的序列。使用Phusion高保真PCR大师级混合物PCR扩增免疫球蛋白重链可变区(VH)cDNA和卡帕轻链可变区(VL)。每项PCR反应的结果均是单一扩增产物，使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)依照制造商的方案纯化的，并获得每条免疫球蛋白链的序列。卡帕轻链可变区的共有序列称作2E2VK，而重轻链可变区的共有序列称作2E2VH。2E2VK蛋白质序列与小鼠2C4IgG1抗体的蛋白质序列相同(参见Kikly et al.,J.Allergy Clin Immunol.,2000；105:1093-1100)，第一个残基除外，在那里Gln用Glu替换，而2E2VH蛋白质序列与2C4的蛋白质序列完全相同。
嵌合表达载体的构建需要使用连接酶不依赖性克隆将扩增的可变区克隆入IgG/卡帕恒定区载体。简言之，用BfuA1(BsPM1)消化pCMV载体，通过凝胶电泳纯化经过消化的载体，并通过与T4DNA聚合酶和100mM dATP一起温育生成载体中的相容悬垂。对于插入物，用含有前导序列的3’端(即正向引物)或恒定区(IgG1或卡帕)的开始(即反向引物)，接着是可变区的开始(在每个方向上)的引物通过PCR自2E2cDNA扩增抗体序列。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化扩增的插入物，并通过与T4DNA聚合酶和100mM dTTP一起温育在插入物中生成互补悬垂。于室温温育载体和插入物，并用于转化化学感受态TOP10细菌(Invitrogen)，随后在含有卡那霉素的培养板上涂板。分离数个克隆，并通过PCR筛选菌落。选择含有正确大小的PCR产物的克隆，使用微量制备试剂盒(Qiagen)分离DNA，并对DNA测序。
为了生成嵌合2C4抗体(ch2C4)，合成(GeneScript)2C4重链可变区(VH)和卡帕轻链可变区(VK)，并应用用于克隆嵌合2E2抗体的相同方法。使用与Expi293表达系统试剂盒(Invitrogen)一起提供的ExpiFectamine 293试剂依照制造商的方案用编码ch2E2重链和ch2E2卡帕轻链的构建物或编码ch2C4重链和ch2C4卡帕轻链的构建物(各1μg DNA)共转染在Expi293转染培养基(Invitrogen)和抗生素中生长的Expi293悬浮细胞(人胚肾细胞)。将细胞在2ml生长培养基中在6孔板中培养7天，之后收获培养基，并通过ELISA测定重组蛋白表达。
嵌合抗体的Siglec-8结合活性
通过ELISA测量嵌合2E2和嵌合2C4IgG1K抗体对重组人Siglec-8胞外域(ECD)的结合。对于Siglec-8结合测定法，如下准备384孔SpectraPlate(Perkin Elmer)，即用30μL每孔0.4μg/mL Siglec-8ECD于4℃包被过夜，接着通过在清洗缓冲液(0.1％Tween 20)中清洗孔去除包被溶液，并用90μL 5％BSA/TBS溶液于室温封闭2小时。将嵌合抗体(ch2E2或ch2C4)或小鼠抗体(m2E2或m2C4)在0.2％BSA/TBS中的3倍连续稀释液(起始浓度为5000ng/mL)添加至每个经过包被的孔。将板于室温温育2小时，随后清洗孔，之后添加在0.2％BSA/TBS溶液中稀释的山羊抗人Fc过氧化物酶缀合物(1:10000稀释)或抗小鼠Fc过氧化物酶缀合物(1:30000稀释)。将板于室温温育45分钟，接着清洗，并对每个孔添加30μL K-blue HRP底物(SkyBio Ltd)。于室温温育15分钟后，通过对每个孔添加10μL Red停止溶液(SkyBioLtd)来停止反应。使用ELISA读数仪PHERAStar FS(BMG Labtech)于650nm读取光密度或实验样品。
两种嵌合抗体以相当的EC50值结合完整Siglec-8ECD。嵌合抗体ch2E2以与小鼠抗体m2E2相比更低的EC50值结合Siglec-8ECD(表2)。
表2。抗体对人Siglec-8ECD的结合。
m2E2 ch2E2已纯化的 ch2E2 ch2C4
EC50 0.1003 0.05701 0.04759 0.07411
实施例2：人源化抗Siglec-8抗体的生成和表征。
使用嵌合抗体2E2和嵌合抗体2C4的序列来设计小鼠2E2抗体的人源化型式。
方法和结果
人源化抗Siglec-8抗体的设计
使用来自International Immunogenetics Database 2009(Lefranc,MP.,Nucleic Acid Res.,2003,31(1):307-10)和Kabat Database Release 5of Sequences ofProteins of Immunological Interest(最后一次更新1999年11月17日)(Kabat et al.,NIH National Technical Information Service,1991,1-3242)的人和小鼠免疫球蛋白的蛋白质序列在Kabat比对中汇编人免疫球蛋白序列的数据库。汇编的数据库含有10,906种VH序列和2,912种VK序列。
已经使用Discovery Studio包(Accelrys,Inc.)中包括的Modeller程序(Eswaret al.,Curr.Protoc.Bioinformatics,2006,Ch.5:Unit 5.6)计算了小鼠抗体2C4可变区的同源性模型。1a7O.pdb，1dqd.pdb和1ORS.pdb的原子坐标分别是VH，VL和主链/界面的最高框架同一性序列模板，如通过抗体pdb结构数据库(Accelrys，Inc.)的基本局部比对搜索工具(BLAST)分析测定的。使用这些模板为框架生成30种初始模型，并使用最低能量模型生成20种环模型(包括所有CDR环)，用它的5种最佳环模板，使用Kabat定义来最后生成最终的小鼠2C4模型。
人源化需要鉴定合适的人V区。使用Gibbs序列分析程序(MRCT)使用各种选择标准用2C4VH和VK蛋白质序列查询人VH和VK数据库。使用Discovery Studio程序(Accelrys)，鉴定小鼠抗体2C4的最终同源性模型中距CDR残基(Kabat定义)
Figure BDA0001014201170000771
内的框架(FW)残基，并称作“
Figure BDA0001014201170000772
CDR包壳”。没有人VH序列与拥有高
Figure BDA0001014201170000773
CDR包壳的2C4分享CDR 1，2和3长度同一性和/或与2C4VH分享VCI同一性。AF471521是下一个最佳候选，CDR3大小为14个残基，关键框架残基(19/24
Figure BDA0001014201170000774
包壳和18/22VCI)具有最高同一性得分，而其它序列具有另外的差异，使得它们处于更低的优先级。然而，AF471521自它的种系VH基因X92218具有11处体细胞突变。为了减轻体细胞突变，将任何不同于种系和/或在小鼠中未保留的框架残基回复突变成人种系序列。因此，将6个框架残基回复突变成种系，而剩余5个不同于种系的残基是关键框架残基且与小鼠序列相同。
既然已经使用2C4抗体的同源性模型鉴定出一种合适的受体人框架，那么通过将2E2抗体的CDR嫁接到该受体人框架上来设计合成的蛋白质和DNA序列。2E2RHA的初始设计将来自2E2VH的CDR 1，2和3嫁接入AF471521的受体FW中。2E2VH CDR(灰色阴影)进入AF471521FW序列的插入产生初始人源化变体，2E2RHA的设计(图1)。在2E2RHA中没有保留Kabat位置24，48，49，67和68处的5个
Figure BDA0001014201170000775
CDR包壳/VCI残基，而且在人源化型式2E2RHB中将这些回复突变成小鼠等同残基，或者在下述变体中一次突变一个：在计算机中组装序列，并命名为2E2RHA至2E2RHG(图1)。
为了人源化轻链，在与重链相似的过程中鉴定出人卡帕链。AY867246是在
Figure BDA0001014201170000781
CDR包壳/VCI方面与2E2VK具有最高同一性的序列但具有6处体细胞突变。凭借X93721丢弃AY867246，X93721含有21/25个
Figure BDA0001014201170000782
包壳和15/17个VCI和仅1个自最接近种系VK基因，X01668的体细胞突变。使用来自X93721的框架设计人源化构建物的DNA和蛋白质。将来自2E2VK的CDR 1，2和3(灰色阴影)嫁接入X93721的受体FW中以生成2E2RKA(图2)。2E2RKA中有4个不匹配的
Figure BDA0001014201170000783
CDR包壳残基(即3，47，58和71)，在变体2E2RKB中回复突变成等同小鼠残基，或者在下述变体中个别突变：在计算机中组装序列，并命名为2E2RKA至2E2RKG(图2)。
人源化抗Siglec-8抗体的生成
合成(GenScript)2E2RHA和2E2RKA的基因，并为人序列优化密码子。在计算机中组装天然人框架序列AF471521和X93721(分别是重和轻链)，和天然小鼠CDR序列，并命名为2E2RHA至2E2RHG和2E2RKA至2E2RKG。使用软件算法(GenScript)，通过沉默诱变优化序列以使用人细胞优先利用的密码子，并合成。如上文在实施例1中关于PCR扩增嵌合抗体描述的,用对表达载体和插入物特异性的引物PCR扩增RHA/B和RKA/B构建物，通过连接酶不依赖性克隆反应插入IgG/卡帕恒定区载体中，并如实施例1关于生成嵌合抗体中描述的，用于转化TOP10细菌。随后使用QuickChange Lightning定点诱变试剂盒(Stratagene)依照制造商的方案通过PCR诱变修饰RKA和RHA以获得所有人抗体变体(图1，图2，表3，表4，和表5)。
表3：嵌合和人源化抗体变体的可变区的氨基酸序列
Figure BDA0001014201170000791
Figure BDA0001014201170000801
Figure BDA0001014201170000811
Figure BDA0001014201170000821
表4：来自2E2和人源化抗体变体的HVR的氨基酸序列
Figure BDA0001014201170000822
Figure BDA0001014201170000831
表5：来自2E2和人源化抗体变体的FR的氨基酸序列
Figure BDA0001014201170000832
Figure BDA0001014201170000841
Figure BDA0001014201170000851
对克隆测序，并使用质粒微量制备试剂盒(Qiagen)或PureYield质粒大量制备系统(Promega)依照制造商的方案制备表达质粒DNA。如上文在实施例1中描述的，使用编码人源化或嵌合VH和VK的表达质粒制备物转染Expi293细胞(Invitrogen)。在无血清培养基中将细胞培养7天，此后自细胞收获条件化培养基，并通过ELISA测定以确认抗体的生成。
由人源化VH和VK构建物编码的抗体的Siglec-8结合
将基本人源化重和轻链与它们的嵌合对应物配对，试图鉴定人源化设计的任何总体问题。如实施例1中描述的，通过ELISA使用Siglec-8抗原测量抗体结合。2E2RHB在与嵌合轻链配对时表现出比RHA重链更加有力，而与重链嵌合构建物(cVH)联合的RKB构建物以比配对的cVK构建物二者要高的效力结合Siglec-8抗原。这些结果确认了重和轻链二者的人源化设计大致正确且均结合Siglec-8，但是需要进一步的工作来鉴定另外的具有更好结合特征的人源化抗体。
与嵌合对应物组合的完全人源化抗体的Siglec-8结合
组合完全人源化抗体重和轻链并与嵌合抗体比较以确定替换
Figure BDA0001014201170000861
和规范框架残基和界面残基是否足以成功人源化2E2。用不同人源化轻链载体联合不同人源化重链载体的组合共转染Expi293细胞。如实施例1中描述的，通过ELISA使用Siglec-8抗原测量抗体结合。与嵌合对照相比，这些抗体对Siglec8的结合显示HBKA和HBKB表现是比HAKA和HAKB更好的组合(表6)。
完全人源化抗体的Siglec-8结合
为了确定重链中单一氨基酸替代的相对重要性，与所有轻链变体组合表达人源化重链RHC(A24V)，RHD(V48L)，RHE(S49G)，RHF(F67L)和RHG(T68S)，并与RHA和RHB型式和嵌合抗体对照比较。这些抗体结合Siglec-8ECD的结果提示所有这些人源化抗体组合以相同的效力结合Siglec-8，家族RHA，RHF和RHG(及所有轻链变体)除外(表6)。
接下来确定用单一氨基酸替代将轻链自RKA变成RKB是否会影响抗体结合。评估由所有重链变体与轻链RKC(V3I)，RKD(V48L)，RKE(L47W)和RKF(E58V)的组合组成的抗体的结合，与嵌合抗体和RKA和RKB型式比较。没有表现出显著影响结合样式的轻链变体(表6)。另外，还在与所有重链变体的组合中检查了轻链种系残基F71Y(RKG)的相关性，结果证明这个残基通常引起结合大大降低。
看来，HEKA和HEKF是最好的针对Siglec-8的候选抗体。因此，实施ELISA来再次测试以最高效力结合抗原的抗体，与嵌合抗体和作为对照的HEKA和HEKF二者比较。结果指示人源化重链和人源化轻链的不同组合以相似方式结合Siglec-8，与RHA的组合除外(表6)。结果突显了HEKA和HEKF是很好的候选，比较而言优于嵌合阳性对照且在框架中具有最小限度小鼠残基。
2E2RH型式2和CDR突变变体的生成
随后基于最接近的种系基因生成了一种人源化重链。以上文描述的其它构建物相同的方式，使用与2E2VH最相似的种系，IGHV4-59种系序列(图1)来设计小鼠CDR的嫁接物，合成(GenScript)，并制备，以生成人源化抗体，与RHA和RHB链的第一种型式比较。另外，为了测定抗体是否能耐受某些CDR3残基变成种系，通过定点诱变在RHE变体重链的CDR3中引入3处突变(单一和三重突变)及在RKA和RKF轻链的CDR3中引入1处突变(图3)。使用上文描述的相同方法，表达含有RHE突变或RKA/RKF突变的抗体，并与整组互补链组合。
将嫁接入人种系中的重链CDR与其它重链型式比较。直接嫁接物(RHA2)完全破坏对抗原的结合，而
Figure BDA0001014201170000872
/VCI残基回复突变成小鼠的种系框架(RHB2)显现与第一种RHB变体非常相似，但是与RHB的5个相比含有10个小鼠残基。结合数据例证在两条链的CDR3中引入突变的影响，而且提示重链中的突变对结合Siglec-8具有有害影响，而轻链突变本身也不提供太多改善，尽管最好的抗体是含有重链候选RHB(所有小鼠回复突变)和RHE的(表6)。
表6：抗体对人Siglec-8ECD的结合。
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注意：每栏代表一项实验；NA指示不可得。
人源化候选抗体对高温的热稳定性
比较人源化抗体的热稳定性。使抗体经受自-20至85℃变化的较高温度10分钟，冷却至室温，并以每种候选的EC80浓度在ELISA测定法中评估。引导抗体候选表现为稳定的(图4)。HEKA/KF具有CDRL3(即轻链的CDR3)突变的抗体在68℃完全无活性，而嵌合在70℃无活性，在该温度引导候选HEKA和HEKF仍有25-50％活性，只在75℃显示完全无活性。
人源化候选抗体Tm的测定
为了测定引导抗体的解链温度，在两步亲和层析和凝胶过滤系统中纯化嵌合，HEKA，HEKF和具有CDRL3(即轻链的CDR3)突变的相同人源化候选，并在热转移测定法中测试。在qPCR热循环仪中将两种不同浓度的抗体与荧光染料(Sypro Orange)一起温育71个循环，每个循环升高1℃。Tm定义为最大荧光50％时的温度。嵌合和5种人源化抗体的Tm确认了在热稳定性测定法中获得的结果：最稳定的抗体是HEKA和HEKF，它们具有比测试的其它人源化抗体要高的Tm。HEKA具有比嵌合抗体要高的Tm(图5和表7)。
表7：嵌合和人源化抗体的Tm
抗体 TM
chVHVK 2uM 71℃
chVHVK 1uM 71℃
HEKA 2uM 72℃
HEKA 1uM 72℃
HEKF 2uM 70℃
HEKF 1uM 70℃
HEKAmut 2uM 68℃
HEKAmut 1uM 68℃
HEKFmut 2uM 67℃
HEKFmut 1uM 68℃
人源化候选抗体的亲和力和亲合力
使用Biacore T200通过SPR分析进行抗体亲合力测定。在Biacore T100上测量人Siglec-8ECD蛋白对小鼠，嵌合和人源化抗Siglec-8抗体的结合。在CM5芯片上依照制造商的方案(Biacore,GE)固定化捕捉抗体(来自Jackson Immunoresearch的山羊抗人Fc和山羊抗小鼠Fc)。用抗人抗体固定化流动室1，2和3，并用抗小鼠抗体固定化流动室4。于25℃以30μl/min的流速进行测定法。测定缓冲液是20mM Tris-HCl pH 8.3，150mM氯化钠，0.05％聚山梨酯20，10％甘油，0.1％BSA，在超纯水中配制。在测定缓冲液中稀释二聚体Siglec-8(通过大小排阻层析去除杂质单体和寡聚体Siglec-8)，自15nM至1.88pM，2倍稀释。捕捉抗体至大约120RU的变化。进行6分钟高效注射，接着是120分钟解离。用50mM甘氨酸pH 1.5再生流动室。以空参照室和多次测定缓冲液注射作为双重空白，并用1:1全局拟合参数分析结果。
测定鼠2E2和嵌合2E2抗体的亲合力，分别是28pM和16pM(表8)。人源化抗体的亲合力，HEKA是17pM而HEKF是21pM，指示人源化成功保留并增强结合活性。
表8：小鼠，嵌合和人源化抗体的亲合力测定
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(pM)
小鼠2E2 5.56E+05 1.54E-05 28
嵌合2E2 8.51E+05 1.32E-05 16
HEKA 6.38E+05 1.11E-05 17
HEKF 6.78E+05 1.40E-05 21
还通过生物层干涉法(ForteBio)进行抗体亲和力测定。在ForteBio Octet Red384上测量小鼠，嵌合和人源化抗Siglec-8抗体Fab片段对人Siglec-8蛋白质的结合。在测定缓冲液中以1000的RPM于25℃进行测定法。自储备溶液(Biacore BR-10670,ForteBio18-132)在超纯水中配制含1x ForteBio Kinetics缓冲液的HBS缓冲液。在测定缓冲液中稀释Fab片段(用Thermo-Pierce固定化木瓜蛋白酶遵照制造商的说明书消化抗体)，自50nM至1.56nM，2倍稀释。在测定缓冲液中以100nM在抗人捕捉传感器上固定化带Fc标签的Siglec-8蛋白质3分钟至以nm计大约1.2的变化。进行2分钟结合，接着是10分钟解离。以空参照AHC传感器作为空白，并在ForteBio分析软件中用1:1全局拟合参数分析结果。
测定鼠2E2和嵌合2E2Fab片段的亲和力，分别是536pM和585pM(表9)。人源化抗体的亲和力，HEKA是464pM而HEKF是592pM，指示人源化成功保留这两种人源化抗体的结合活性。HEKA在此测定法中具有比小鼠和嵌合2E2要高的对Siglec-8的单价亲和力。人源化抗体变体，HEKAmut和HEKFmut的亲和力也在皮摩尔范围中，KD分别是902pM和1160pM。
表9：小鼠，嵌合和人源化抗体的亲和力测定
抗体 kon(1/Ms) kdis(1/s) KD(pM)
小鼠2E2 1.14E+06 6.12E-04 536
嵌合2E2 9.51E+05 5.56E-04 585
HEKA 1.04E+06 4.82E-04 464
HEKF 9.20E+05 5.45E-04 592
HEKAmut 7.26E+05 6.55E-04 902
HEKFmut 4.45E+05 5.16E-04 1160
人源化候选抗体的溶解性
使用离心过滤装置(Amicon 30K 4mL，4000g 5min-第一次浓缩；Amicon Ultra0.5mL 3K，14000g-后续浓缩)序贯浓缩已纯化的嵌合和候选抗体，并在每个步骤测量浓度。在没有沉淀的情况下所有样品浓缩总共多至21-24倍，并通过ELISA测试，显示无一丧失结合Siglec-8的效力。抗体在高至至少25mg/mL的浓度没有沉淀的倾向。具体而言，溶解度，ch2E2是至少18mg/mL，HEKA是至少25mg/mL，HEKF是至少8mg/mL，HEKAmut是至少29mg/mL，而HEKFmut是至少17mg/mL。
人源化候选抗体的聚集
在分析之前过滤样品以去除任何盐或蛋白质沉淀，并再次测量浓度。然后在HPLC系统中以0.4mL/min将它们注射入大小排阻柱中，并通过多角度光散射分析以测定绝对分子量，并检测聚集。所有变体显示没有聚集的迹象，平均分子量范围为134.9-138.2kDa，这是IgG单体在此分析中的预期范围(表10)。
所有样品均是单分散的(Mw/Mn<1.05)。然而，分布分析图显示糖基化变体(ch2C4，HEKA和HEKFMut)的存在。分布分析图还显示所有样品中约105-120kDa种类的存在，这可能是分解的抗体或低糖基化变体。质量回收为82.9-102.8％(计算质量对注射质量)，这指示较好的蛋白质回收，而且样品看来没有粘在柱上或含有会被保护柱保留的不溶性聚集体。总之，数据指示分析的任何抗Siglec-8抗体样品中没有显著聚集(表10)。
表10：嵌合和人源化变体抗体的聚集分析
Figure BDA0001014201170000921
人源化候选抗体的冻融稳定性
使已纯化的嵌合ch2C4抗体，人源化HEKA和HEKF抗体，和人源化HEKAmut和HEKFmut抗体变体经受-20℃达60分钟，于室温融化，并以每种候选的EC80浓度用于ELISA测定法。HEKA在此测定法中显示最高的稳定性(图6)。
非岩藻糖基化抗体的ADCC活性
材料
RBC裂解缓冲液(10X RBC裂解缓冲液)：稀释至1X，如制造商(eBioscience，00-4300-54)指导的。
PBS：不含Ca2+/Mg2+的DPBS(Hyclone,SH30028.02)。
完全RPMI：无菌过滤的含10％FBS的RPMI-1640(Invitrogen)。
96孔U底板(Falcon,353077)。
LDH测定法：CytoTox 96非放射性细胞毒性测定法(Promega,G1780)
FIX缓冲液：含1-4％低聚甲醛的PBS。通过在PBS(Electron Microscopy Diatom,50-980-488)中稀释自16％低聚甲醛(EM级,无甲醇)制备。
方法
为了测试抗Siglec-8抗体对嗜曙红细胞的ADCC和凋亡活性，将新鲜外周血白细胞(PBL)与嵌合和小鼠2E2抗体一起温育。低岩藻糖嵌合2E2IgG1抗体显示最有力的嗜曙红细胞杀伤且具有比岩藻糖基化嵌合2E2IgG1显著要高的效力，与低岩藻糖形式的抗体的ADCC活性更高一致(图7)。
为了在总外周血白细胞中评估抗Siglec-8抗体活性，通过标准方法自收获少于24小时收集的捐献者血液获得PBL，并在完全RPMI培养基中重悬浮。对细胞计数，在完全RPMI培养基中调整至10x 106/mL，并以100μL/孔在无菌96孔U底板中分配。以0.0001ng/mL至10μg/mL的浓度添加抗Siglec-8抗体。将板以200g离心1分钟，并在增湿37℃，5％CO2温箱中温育＞4小时。通过流式细胞术评估细胞群以评估嗜曙红细胞和嗜碱性细胞消减，例如使用表11中所示试剂，并通过流式细胞术评估。可以使用CCR3阳性，CD16阴性颗粒细胞(高侧散射)的去除来检测嗜曙红细胞的消减。可以例如通过分析CCR3阳性低侧散射细胞来测定嗜碱性细胞计数。
表11：试剂
Figure BDA0001014201170000931
为了评估抗Siglec-8抗体在已纯化的嗜曙红细胞中诱导凋亡的能力，使用自收获起少于24小时自血液样品或等同血液产品收集的新鲜血沉棕黄层。遵循制造商的说明书(Miltenyi嗜曙红细胞分离试剂盒，130-092-010)进行嗜曙红细胞的纯化。在完全RPMI培养基中以1x 106/mL重悬浮已纯化的嗜曙红细胞，并在IL-5(以约1ng/mL至约50ng/mL的浓度)存在或缺失下培养过夜。次日，通过重复清洗板或烧瓶来收获培养的嗜曙红细胞。将细胞以200-400g离心少于10分钟，并在完全RPMI培养基中以1x 106/mL重悬浮。将嗜曙红细胞以100μL/孔在无菌96孔U底板中分配。将100uL在完全RPMI培养基中制备的2X试剂添加至每个孔，并如上文所述制备稀释液。将板以200g离心1分钟，并在增湿37℃，5％CO2温箱中温育≥4小时。依照制造商的说明书实施膜联蛋白V染色，并通过流式细胞术分析凋亡和坏死细胞。
为了评估抗Siglec-8抗体在分离的肥大细胞上的ADCC和凋亡活性，依照已发表的方案(Guhl et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,2011,75:382-384；Kulka et al.,InCurrent Protocols in Immunology,2001,(John Wiley&Sons,Inc.))自人组织分离人肥大细胞，或者自人造血干细胞分化人肥大细胞，例如如Yokoi et al.,J Allergy ClinImmunol.,2008,121:499-505所述。以1x 106/mL在完全RPMI培养基中在无菌96孔U底板中重悬浮已纯化的肥大细胞，并在抗Siglec-8抗体(以范围介于0.0001ng/ml和10μg/ml之间的浓度)存在或缺失下温育30分钟。在有或无已纯化的天然杀伤(NK)细胞或新鲜PBL的情况下将样品再温育4至16小时以诱导ADCC。使用荧光缀合的检测肥大细胞(CD117和FcεR1)和膜联蛋白V和7AAD(区分活的和死的或正在死去的细胞)的抗体通过流式细胞术分析通过凋亡或ADCC的细胞杀伤。依照制造商的说明书实施膜联蛋白V和7AAD染色。
在体外人源化抗体的嗜曙红细胞消减活性的评估
对人源化抗体评估它们在体外诱导Siglec-8介导的自正常人血液消减嗜曙红细胞的能力，与鼠2E2抗体比较。
在完全RPMI培养基[(补充有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(Invitrogen,产品目录号A10491-01))]中重悬浮在收获后少于24小时收集的来自人捐献者血液的外周血白细胞(PBL)。在补充有50ng/ml重组人IL-5(R&D Systems,产品目录号205-IL-025)的完全RPMI培养基中将细胞调整至107每mL，并以100μL/孔在无菌96孔U底板中分配。以范围为0.1pg/mL至10μg/mL(即1pg/mL，10pg/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，0.1μg/mL，1μg/mL，和10μg/mL)的浓度添加抗Siglec-8抗体以测定剂量响应和提供最大嗜曙红细胞消减50％的浓度(EC50)。将板以200g离心1分钟，并在增湿37℃，5％CO2温箱中温育16小时。PBL与抗Siglec-8抗体一起在IL-5存在下温育16小时使嗜曙红细胞对Siglec-8介导的凋亡敏化。通过流式细胞术评估细胞群以评估嗜曙红细胞消减。通过CCR3阳性颗粒(高侧散射)细胞的去除来检测嗜曙红细胞消减。
除HEKAmut IgG1抗体以外，每一种测试的人源化抗体对于人嗜曙红细胞消减显示与小鼠2E2抗体相比等同或升高的效力(即更低的EC50)(表12)。抗体对于消减人嗜曙红细胞的效力不依赖于同种型，因为HEKA IgG1抗体和HEKA IgG4抗体显示相似的效力。
表12：人源化抗Siglec-8抗体在体外消减嗜曙红细胞的效力
抗体 同种型 嗜曙红细胞消减的均值EC<sub>50</sub>(ng/ml)
2E2 IgG1 6.8
HEKA IgG1 4.3
HEKA IgG4 3.9
HEKAmut IgG1 43.3
HEKF IgG1 6.7
HEKFmut IgG1 6.9
均值EC50指示来自2项独立测定法的嗜曙红细胞消减需要的均值半最大抗体浓度。
活性同种型的抗Siglec-8抗体能够在体外和在体内诱导ADCC介导的人肥大细胞 杀伤。
为了生成具有有力的Fc受体介导的ADCC活性的人源化抗Siglec-8抗体，自岩藻糖基转移酶-8缺陷的CHO细胞系(Lonza,Potelligent CHOK1SV细胞)表达HEKA IgG1抗体以生成具有缺乏α1,6-岩藻糖的碳水化合物的抗体(即非岩藻糖基化的抗体)。如实施例3中所述，生成与HEKA IgG1抗体识别不同Siglec-8胞外区的鼠IgG2a同种型的鼠单克隆抗Siglec-8抗体(即1C3抗体)。嵌合1H10抗体含有小鼠单克隆抗体1H10的V区和人IgG1卡帕恒定区。自在10μM几夫碱(Kifunensine)存在下培养的人293TS细胞系表达嵌合1H10抗体以生成低岩藻糖抗体，并通过蛋白A亲和层析来纯化。
在体外评估非岩藻糖基化的HEKA IgG1和嵌合1H10低岩藻糖抗体诱导NK细胞介导的针对人肥大细胞的ADCC活性的能力。通过灌洗移植有人造血干细胞的免疫缺陷性NSGS小鼠的腹腔来分离原代人肥大细胞。将肥大细胞与10μg/ml非岩藻糖基化的HEKA IgG1抗体，嵌合1H10低岩藻糖抗体，HEKA IgG4抗体或同种型对照人IgG1抗体，及与已纯化的人CD56+CD16+NK效应细胞一起温育48小时，效应细胞对靶细胞(E:T)比为10.75:1。使用CytoTox 96细胞毒性测定法试剂盒(Promega,产品目录号G1780)通过LDH释放测定ADCC活性。非岩藻糖基化的HEKA IgG1抗体和嵌合1H10低岩藻糖抗体在48小时后诱导显著的ADCC介导的人肥大细胞杀伤(图8A)。由非岩藻糖基化的或低岩藻糖的抗Siglec-8抗体诱导的LDH释放是使用裂解溶液(Promega,产品目录号G1821)诱导的最大LDH释放的38-53％。
在人Siglec-8在肥大细胞，嗜曙红细胞和嗜碱性细胞的表面上选择性表达的转基因小鼠模型中评估抗Siglec-8抗体在体内消减Siglec-8阳性肥大细胞的能力。通过腹膜内注射100μg HEKA IgG4抗体，HEKA IgG1非岩藻糖基化的人源化抗体，鼠1C3抗体(鼠IgG2a同种型)或人IgG1同种型对照抗体处理小鼠两次。相隔48小时施用两次腹膜内注射，并在第二次注射后48小时通过灌洗腹膜来分离腹膜肥大细胞。非岩藻糖基化的HEKA IgG1抗体和鼠1C3抗体施用导致显著的腹膜肥大细胞消减。与之对比，HEKA IgG4抗体不显示显著的肥大细胞消减，指示体内肥大细胞消减要求活性同种型(图8B)。这些结果证明活性同种型(鼠IgG2a同种型或人IgG1非岩藻糖基化的同种型)的针对Siglec-8胞外域的不同区域的两种不同抗Siglec-8抗体能在体内消减Siglec-8阳性肥大细胞。
这些结果是出乎意料的，因为Siglec-8已有记载快速内在化，因此不适合诱导ADCC活性。参见O’Reilly et al.,Trends Pharmacol Sci.,2009,30(5):240-248。
人源化抗Siglec-8在体内抑制IgE诱导的由人肥大细胞介导的被动皮肤过敏反应
在移植人造血干细胞(HSC)后能够生成丰富人肥大细胞的免疫缺陷性小鼠已有记载(Tanaka et al.,J Immunol.,2012,188(12):6145-55)。称作NSGS(The JacksonLaboratory)的小鼠品系是非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷(NOD SCID)小鼠具有IL-2受体伽马链基因删除(NSG小鼠)的衍生物。另外对NSGS小鼠进行3种人细胞因子(干细胞因子[SCF]，IL-3，和GM-CSF)的转基因以推动人造血干细胞移植。在NSGS小鼠移植后，人CD34+细胞生成人嗜曙红细胞和数目增多的人肥大细胞。移植NSGS小鼠中的这两种细胞类型均以与自人外周血和组织分离的对应细胞类型上的水平相当的水平表达Siglec-8。如此，这些小鼠为评估在体内抗Siglec-8抗体对人细胞的活性提供一种诱人的模型。
为了评估抗Siglec-8抗体在体内对肥大细胞活性的影响，在人源化NSGS小鼠中建立一种IgE介导的耳肿胀模型。在此模型中，如下诱导被动皮肤过敏(PCA)(一种I型超敏感性反应)，即将特定单克隆抗半抗原IgE(抗NP IgE)注射入一只耳中，24小时后系统注射缀合有半抗原的牛血清清蛋白(NP-BSA)。使用具有人ε恒定区的嵌合抗NP IgE来确保生成针对半抗原的人肥大细胞特异性响应，并通过耳厚度的变化来测量立即和晚期水肿应答。
在测定法之前8-12周给NSGS小鼠移植人CD34+HSC。在小鼠中以100ng的剂量皮内注射具有人恒定区的嵌合单克隆抗NP IgE入右耳中以敏化人但非小鼠皮肤肥大细胞，并皮内注射PBS入左耳中。24小时后，通过静脉内注射0.5mg NP-BSA来诱导PCA。在用抗NP IgE敏化前24小时或敏化后2小时通过静脉内注射对小鼠给药0.1mg抗Siglec-8抗体(即HEKAIgG4抗体)或人IgG4同种型对照抗体。在晚至诱导后4小时和诱导后24小时的时间点测量耳厚度以分别测定早期和晚期耳肿胀响应。
HEKA IgG4抗体在此PCA体内模型中预防或抑制早期和晚期皮肤变应性反应二者(图9)。在此模型中，早期反应依赖于肥大细胞脱粒和组胺释放，而晚期反应依赖于肥大细胞分泌从头合成的介质，包括细胞因子，以及嗜曙红细胞和嗜碱性细胞浸润。HEKA IgG4抗体还在人源化NSGS小鼠中在用抗NP IgE敏化前24小时或敏化后2小时给药时预防或抑制PCA应答(图9)。在这些实验过程期间没有观察到抗体处理的不利反应。
实施例3：鼠抗Siglec-8抗体的生成和表征。
Siglec-8的胞外区由三个免疫球蛋白样域构成：一个独特的结合配体的N端V-set结构域(结构域1)，接着是两个C-set结构域(结构域2和3)。抗体1C3是针对重组人Siglec-8(SEQ ID NO:74)胞外域生成的具有IgG2a重链和卡帕轻链的鼠单克隆抗体。单克隆抗体1H10和4F11是针对重组人Siglec-8(SEQ ID NO:74)胞外域生成的鼠IgG1重链和卡帕轻链抗体。见表13。这些抗体是自针对结合来自人(SEQ ID NO:74)和非人灵长类(SEQ ID NO:118)的重组Siglec-8序列的抗体的杂交瘤筛选鉴定的。
表13：来自鼠1C3，1H10，和4F11抗体的HVR的氨基酸序列
Figure BDA0001014201170000971
Figure BDA0001014201170000981
为了鉴定包含抗Siglec-8抗体的表位的区域，自CHO细胞表达并纯化含有融合至人Ig-Fc的每一个Siglec-8胞外域的融合蛋白。在用于测定抗体结合的ELISA测定法中使用含有人结构域1(SEQ ID NO:115)，结构域1和2(SEQ ID NO:116)，或结构域1，2，和3(SEQ IDNO:117)的融合蛋白。在一些实验中，评估抗体对人Siglec-8的特异性，与含有来自绿狒狒(Papio anubis)的Siglec-8胞外域1，2，和3(SEQ ID NO:118)(National Center forBiotechnology Information参照序列XP_009193370.1)的融合蛋白比较。
对于抗体结合测定法，将ELISA板(MaxiSorp；Nunc)用0.2μg/ml融合蛋白于4℃包被过夜，并用含2％BSA的PBS于室温封闭1小时。添加1μg/ml抗体，并将板于室温温育2小时。清洗板后，添加辣根过氧化物酶缀合的二抗，并将板温育1小时。对于人源化抗体的二抗是抗人H+L HRP(Jackson ImmunoResearch,产品目录号709-035-149)，或者对于小鼠抗体的二抗是抗小鼠H+L HRP(Jackson ImmunoResearch,产品目录号715-035-151)。将板用TMB底物(Sigma,产品目录号T0440-1L)显色。
鼠2E2抗体和HEKA IgG1抗体结合结构域1融合蛋白，指示这两种抗体的表位位于N端配体结合结构域中(表14)。相反，鼠1C3抗体结合结构域1和结构域2融合蛋白但没有展现对结构域1融合蛋白的可检测结合，指示这种抗体的表位在结构域2中(表14)。
表14：抗Siglec-8抗体对人Siglec-8中的表位的结合
Figure BDA0001014201170000982
鼠4F11和1H10抗体结合人Siglec-8和来自绿狒狒(Papio anubis)的预测Siglec-8蛋白质序列(National Center for Biotechnology Information参照序列XP_009193370.1)。在结构域融合蛋白的ELISA筛选中和在还原性SDS-PAGE凝胶的Western印迹上，4F11识别人Siglec-8结构域1中的线性表位，而1H10识别包括人Siglec-8结构域3中的序列的线性表位。1C3不识别人Siglec-8结构域2中的变性序列，指示它识别构象表位。在50ng/ml IL-5存在下，抗体4F11和1H10显示有力消减来自人外周血白细胞的嗜曙红细胞，EC50分别是5.9和41ng/ml(表15)。对人Siglec-8特异性的鼠1C3抗体和鼠2E2抗体不与狒狒Siglec-8交叉反应。
表15：抗Siglec-8抗体对人或狒狒Siglec-8中的表位的结合和抗体对人嗜曙红细胞的消减活性
Figure BDA0001014201170000991
均值EC50指示来自2项独立测定法的嗜曙红细胞消减需要的均值半最大抗体浓度。
通过流式细胞术测定抗体对人和狒狒嗜曙红细胞的结合。用饱和量的抗Siglec-8单克隆抗体2E2，1C3，和1H10或小鼠IgG1同种型对照抗体标记人或狒狒外周血白细胞制备物。通过抗小鼠IgG H+L AlexaFluor 647二抗显现抗Siglec-8抗体。嗜曙红细胞是使用针对CD49d和CD16的灵长类交叉反应性单克隆抗体连同高颗粒散射一起鉴定的。鼠1H10抗体结合狒狒和人嗜曙红细胞，而小鼠2E2和1C3抗体结合人嗜曙红细胞但不与狒狒嗜曙红细胞交叉反应(图10)。这些结果是出乎意料的，因为其它结合人Siglec-8的单克隆小鼠抗Siglec-8抗体显示出不识别非人灵长类Siglec-8。参见Hudson et al.,J.Clin.Immunol.,2011,31(6):1045-53。
序列
小鼠2E2重链可变域的氨基酸序列
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:1)
2E2 RHA重链可变域的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：2)
2E2 RHB重链可变域的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：3)
2E2 RHC重链可变域的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：4)
2E2 RHD重链可变域的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWLSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：5)
2E2 RHE重链可变域的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：6)
2E2 RHF重链可变域的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：7)
2E2 RHG重链可变域的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRFSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：8)
2E2 RHA2重链可变域的氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISIYGAHWIRQPPGKGLEWIGVIWAGGSTNYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：9)
2E2 RHB2重链可变域的氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:10)
2E2 RHE S-G突变体重链可变域的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYGMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:11)
2E2 RHE E-D重链可变域的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:12)
2E2 RHE Y-V重链可变域的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:13)
2E2 RHE三重突变体重链可变域的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:14)
小鼠2E2轻链可变域的氨基酸序列
QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:15)
2E2 RKA轻链可变域的氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:16)
2E2 RKB轻链可变域的氨基酸序列
EIILTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:17)
2E2 RKC轻链可变域的氨基酸序列
EIILTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:18)
2E2 RKD轻链可变域的氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLWIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:19)
2E2 RKE轻链可变域的氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:20)
2E2 RKF轻链可变域的氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:21)
2E2 RKG轻链可变域的氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:22)
2E2 RKA F-Y突变体轻链可变域的氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPYTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:23)
2E2 RKF F-Y突变体轻链可变域的氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPYTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:24)
HEKA IgG1重链和HEKF IgG1重链的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:75)
HEKA卡帕轻链的氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:76)
HEKF卡帕轻链的氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:77)
IgG1重链恒定区的氨基酸序列
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:78)
IgG4重链恒定区的氨基酸序列(IgG4含有S228P突变)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:79)
Ig卡帕轻链恒定区的氨基酸序列
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:80)
鼠2C4和2E2 IgG1重链的氨基酸序列
QVQLKRASGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG(SEQID NO:81)
鼠2C4卡帕轻链的氨基酸序列
EIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ IDNO:82)
鼠2E2卡帕轻链的氨基酸序列
QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ IDNO:83)
嵌合2C4和2E2 IgG1重链的氨基酸序列
QVQLKRASGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:84)
嵌合2C4卡帕轻链的氨基酸序列
EIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:85)
嵌合2E2卡帕轻链的氨基酸序列
QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:86)
HEKA IgG4重链的氨基酸序列(IgG4含有S228P突变)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:87)
小鼠1C3重链可变结构域的氨基酸序列(标有下划线的残基包含依照Chothia编号 方式的CDR H1和H2)
EVQVVESGGDLVKSGGSLKLSCAASGFPFSSYAMSWVRQTPDKRLEWVAIISSGGSYTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHETAQAAWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:106)
小鼠1H10重链可变域的氨基酸序列(标有下划线的残基包含依照Chothia编号方 式的CDRH1和H2)
EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDYYMYWVKQRPEQGLEWIGRIAPEDGDTEYAPKFQGKATVTADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCTTEGNYYGSSILDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:107)
小鼠4F11重链可变结构域的氨基酸序列(标有下划线的残基包含依照Chothia编 号方式的CDR H1和H2)
QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFRSSWMNWVKQRPGKGLEWIGQIYPGDDYTNYNGKFKGKVTLTADRSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARLGPYGPFADWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:108)
小鼠1C3轻链可变域的氨基酸序列
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLAYGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:109)
小鼠1H10轻链可变结构域的氨基酸序列
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDITNYLNWYQQKPDGTVKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:110)
小鼠4F11轻链可变域的氨基酸序列
QIVLTQSPAIVSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQRPGSSPRLLIYDTSSLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRIESEDAANYYCQQWNSDPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:111)
人Siglec-8结构域1的氨基酸序列
MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRP(SEQID NO:112)
人Siglec-8结构域2的氨基酸序列
DILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVS(SEQ ID NO:113)
人Siglec-8结构域3的氨基酸序列
YPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGG(SEQ ID NO:114)
人Siglec-8结构域1融合蛋白的氨基酸序列
MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:115)
人Siglec-8结构域1和2融合蛋白的氨基酸序列
MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：116)
人Siglec-8结构域1，2，和3融合蛋白的氨基酸序列
MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGGIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：117)
狒狒Siglec-8结构域1，2，和3融合蛋白的氨基酸序列
MEGDRKYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPKDDWTYSDPVHGYWFRAGDRPYQEAPVATNNPDTEVQAETQGRFQLLGDRWSNDCSLSINDARKGDEGSYFFRLERGRMKWSYKSQLNYKAKQLSVFVTALTQRPDILIQGTLESGHPRNLTCSVPWACEQRMPPMISWIGTSVSSLGPITARFSVLTLIPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTRTVQLDVSYPPWNLTVTVFQGDDTASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVDSNPPARLSWTRGSLTLCPSQPWNPGLLELLRVHVKDEGEFTCQAENPRGSQHISLSLSLQNEGTGTARPVSEVTLAAVGGIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：118)
狒狒Siglec-8结构域1，2，和3的氨基酸序列
MEGDRKYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPKDDWTYSDPVHGYWFRAGDRPYQEAPVATNNPDTEVQAETQGRFQLLGDRWSNDCSLSINDARKGDEGSYFFRLERGRMKWSYKSQLNYKAKQLSVFVTALTQRPDILIQGTLESGHPRNLTCSVPWACEQRMPPMISWIGTSVSSLGPITARFSVLTLIPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTRTVQLDVSYPPWNLTVTVFQGDDTASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVDSNPPARLSWTRGSLTLCPSQPWNPGLLELLRVHVKDEGEFTCQAENPRGSQHISLSLSLQNEGTGTARPVSEVTLAAVGG(SEQ ID NO:119)
Figure IDA0001014201220000011
Figure IDA0001014201220000021
Figure IDA0001014201220000031
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Claims (53)

1.一种结合人Siglec-8的人源化抗体，其中该抗体包含重链可变区、轻链可变区和人IgG Fc区，其中该重链可变区由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成，并且其中该轻链可变区由SEQ ID NO:16或21的氨基酸序列组成。
2.权利要求1的抗体，其中该人IgG Fc区包含人IgG1或人IgG4 Fc区。
3.权利要求2的抗体，其中该人IgG4 Fc区包含氨基酸替代S228P，且其中氨基酸残基是依照Kabat中的EU索引编号的。
4.权利要求1的抗体，其中该抗体包含包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链。
5.权利要求1的抗体，其中该抗体包含包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链。
6.权利要求1的抗体，其中该抗体包含包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链。
7.权利要求1、权利要求4或权利要求5的抗体，其中已经工程化改造该抗体以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性。
8.权利要求1的抗体，其中该抗体的重链至少一条是非岩藻糖基化的。
9.权利要求8的抗体，其中该抗体的重链的两条是非岩藻糖基化的。
10.权利要求4的抗体，其中该抗体的重链的至少一条是非岩藻糖基化的。
11.权利要求10的抗体，其中该抗体的重链的两条是非岩藻糖基化的。
12.权利要求5的抗体，其中该抗体的重链的至少一条是非岩藻糖基化的。
13.权利要求12的抗体，其中该抗体的重链的两条是非岩藻糖基化的。
14.一种结合人Siglec-8的人源化抗体，其中该抗体包含：
(a)重链可变区，其由以下组成：
(1)由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成的HC-FR1；
(2)由SEQ ID NO:61的氨基酸序列组成的HVR-H1；
(3)由SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成的HC-FR2；
(4)由SEQ ID NO:62的氨基酸序列组成的HVR-H2；
(5)由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成的HC-FR3；
(6)由SEQ ID NO:63的氨基酸序列组成的HVR-H3；和
(7)由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的HC-FR4；
和
(b)轻链可变区，其由以下组成：
(1)由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成的LC-FR1；
(2)由SEQ ID NO:64的氨基酸序列组成的HVR-L1；
(3)由SEQ ID NO:51的氨基酸序列组成的LC-FR2；
(4)由SEQ ID NO:65的氨基酸序列组成的HVR-L2；
(5)由SEQ ID NO:55的氨基酸序列组成的LC-FR3；
(6)由SEQ ID NO:66的氨基酸序列组成的HVR-L3；和
(7)由SEQ ID NO:60的氨基酸序列组成的LC-FR4。
15.一种结合人Siglec-8的人源化抗体，其中该抗体包含：
(a)重链可变区，其由以下组成：
(1)由SEQ ID NO:26氨基酸序列组成的HC-FR1；
(2)由SEQ ID NO:61的氨基酸序列组成的HVR-H1；
(3)由SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成的HC-FR2；
(4)由SEQ ID NO:62的氨基酸序列组成的HVR-H2；
(5)由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成的HC-FR3；
(6)由SEQ ID NO:63的氨基酸序列组成的HVR-H3；和
(7)由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的HC-FR4；
和
(b)轻链可变区，其由以下组成：
(1)由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成的LC-FR1；
(2)由SEQ ID NO:64的氨基酸序列组成的HVR-L1；
(3)由SEQ ID NO:51的氨基酸序列组成的LC-FR2；
(4)由SEQ ID NO:65的氨基酸序列组成的HVR-L2；
(5)由SEQ ID NO:58的氨基酸序列组成的LC-FR3；
(6)由SEQ ID NO:66的氨基酸序列组成的HVR-L3；和
(7)由SEQ ID NO:60的氨基酸序列组成的LC-FR4。
16.权利要求14或权利要求15的抗体，其中已经工程化改造该抗体以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性。
17.权利要求14或权利要求15的抗体，其中该抗体还包含人IgG1 Fc区，其中该抗体的重链至少一条是非岩藻糖基化的。
18.权利要求17的抗体，其中该抗体的重链的两条是非岩藻糖基化的。
19.一种核酸，其编码权利要求1-18任一项的抗体。
20.一种载体，其包含权利要求19的核酸。
21.权利要求20的载体，其为表达载体。
22.一种宿主细胞，其包含权利要求19的核酸。
23.权利要求22的宿主细胞，其中该宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
24.权利要求23的宿主细胞，其中该宿主细胞是中国仓鼠卵巢CHO细胞。
25.权利要求24的宿主细胞，其中该CHO细胞具有α1,6-岩藻糖基转移酶Fut8敲除。
26.权利要求24的宿主细胞，其中该CHO细胞过表达β1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶IIIGnT-III。
27.权利要求26的宿主细胞，其中该CHO细胞另外过表达高尔基μ-甘露糖苷酶IIManII。
28.一种生成抗体的方法，其包括在生成该抗体的条件下培养权利要求22-27任一项的宿主细胞。
29.权利要求28的方法，其进一步包括回收由该宿主细胞生成的抗体。
30.一种抗Siglec-8抗体，其通过权利要求28或29的方法生成。
31.一种药物组合物，其包含权利要求1-18和30任一项的抗体和药学可接受载剂。
32.一种包含特异性结合人Siglec-8的抗体的组合物，其中该抗体包含重链可变区、轻链可变区和Fc区和连接至该Fc区的N-糖苷连接的碳水化合物链，其中少于50％的该N-糖苷连接的碳水化合物链含有岩藻糖残基，其中该重链可变区由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成，以及其中该轻链可变区由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成。
33.权利要求32的组合物，其中少于10％的该N-糖苷连接的碳水化合物链含有岩藻糖残基。
34.权利要求32或权利要求33的组合物，其中该抗体包含包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链。
35.权利要求32或权利要求33的组合物，其中该抗体包含包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链。
36.权利要求32或权利要求33的组合物，其中该抗体包含包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链。
37.权利要求32或33的组合物，其进一步包含药学可接受载剂。
38.权利要求32或33的组合物，其中该抗体是在中国仓鼠卵巢CHO细胞系中生成的。
39.权利要求38的组合物，其中该CHO细胞系具有α1,6-岩藻糖基转移酶Fut8敲除。
40.权利要求38的组合物，其中该CHO细胞系过表达β1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶IIIGnT-III。
41.权利要求40的组合物，其中该CHO细胞系另外过表达高尔基μ-甘露糖苷酶IIManII。
42.权利要求34的组合物，其中该抗体是在具有α1,6-岩藻糖基转移酶Fut8敲除的中国仓鼠卵巢CHO细胞系中生成的。
43.权利要求35的组合物，其中该抗体是在具有α1,6-岩藻糖基转移酶Fut8敲除的中国仓鼠卵巢CHO细胞系中生成的。
44.权利要求36的组合物，其中该抗体是在具有α1,6-岩藻糖基转移酶Fut8敲除的中国仓鼠卵巢CHO细胞系中生成的。
45.权利要求1-18和30任一项的抗体或权利要求32-44任一项的组合物制备用于在受试者中治疗或预防由表达Siglec-8的细胞介导的疾病的药物的用途，其中该治疗或预防包括对该受试者施用有效量的该抗体或该组合物。
46.权利要求45的用途，其中该疾病为嗜曙红细胞介导疾病。
47.权利要求45的用途，其中该疾病为肥大细胞介导疾病。
48.权利要求45的用途，其中该抗体抑制变应性反应的一种或多种症状。
49.权利要求48的用途，其中该变应性反应为I型超敏感性反应。
50.权利要求45的用途，其中该疾病选自下组：哮喘，变应性鼻炎，鼻息肉病，特应性皮炎，慢性荨麻疹，肥大细胞增多，嗜曙红细胞性白血病，和嗜曙红细胞增多综合征。
51.权利要求45的用途，其中该疾病选自下组：少粒细胞性哮喘，急性或慢性气道超敏感性，嗜曙红细胞性食道炎，丘-施二氏综合征，与细胞因子有关的炎症，与表达Siglec-8的细胞有关的炎症，与表达Siglec-8的细胞有关的恶性肿瘤，物理性荨麻疹，寒冷性荨麻疹，压迫性荨麻疹，大疱性类天疱疮，食物过敏，和变应性支气管肺曲霉病ABPA。
52.权利要求45-51任一项的用途，其中该受试者罹患通过吸入式皮质类固醇、短效β2激动剂、长效β2激动剂或其组合没有得到恰当控制的哮喘。
53.一种试剂盒，其包含权利要求1-18和30任一项的抗体或权利要求32-44任一项的组合物。
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