CN105861598A

CN105861598A - 一种酶法再生atp的方法及其应用

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Publication number: CN105861598A
Application number: CN201610268246.6A
Authority: CN
Inventors: 刘珊珊; 于铁妹; 秦永发
Original assignee: Shenzhen Gute Xinsheng Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Gute Xinsheng Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2016-04-27
Filing date: 2016-04-27
Publication date: 2016-08-17

Abstract

本发明公开了一种酶法再生ATP的方法包括以下步骤：(1)制备并获得ATP再生酶；(2)反应液中ATP的再生；(3)分离产物和ATP再生酶。根据本发明的再生ATP的方法，其具有如下有益效果：(1)采用新型Ppk、Adk、Pap三种ATP再生酶，酶促反应中消耗的ATP可被循环再生，大大降低ATP使用量，再生过程简单高效，反应容易控制，稳定性高。(2)反应需添加的底物多聚磷酸或其盐价格低廉，污染小。(3)酶促反应不需要添加高价的ATP起始反应，添加ADP或者廉价的AMP。(4)建立了ATP再生酶回收体系，适用于工业化大规模生产。

Description

一种酶法再生ATP的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种酶法再生ATP的方法及其应用。

背景技术

三磷酸腺苷(ATP)由一个腺苷(A)和三个磷酸基团(Pi)组成，分子量为507，分子式C₁₀H₁₆N₅O₁₃P₃。它是生物能量的转换器和贮存器，在涉及能量的酶促反应中，起着不可替代的重要作用。ATP分子呈A-Pi～Pi～Pi结构，远离腺苷的两个磷酸键由～表示，为高能磷酸键。在反应过程中，ATP分子的高能磷酸键可断裂释放大量能量：当一个高能磷酸键断裂时，ATP分子转化为二磷酸腺苷(ADP)，释放能量30.5kJ/mol；当第二个高能磷酸键断裂时，ADP分子转化为腺苷酸(AMP)，可再释放能量27.6kJ/mol。在大部分酶促反应中，ATP通过水解为ADP供能，但在实际生产中，反应体系中的ADP会继续水解产生AMP。

由于目前ATP成本偏高，在工业生产中直接使用ATP进行酶促反应收益甚微。另外，ATP的大量添加导致反应过程出现沉淀物，同时增加了后期产物的纯化难度。因此，能够在反应生产中投入的少量ATP，通过建立稳定、有效的ATP再生体系，使ATP在反应过程中循环利用是目前利用ATP进行工业化生产的研究方向。

ATP在生物体内主要通过的底物水平磷酸化、氧化磷酸化和光合磷酸化等方法再生，进行催化作用的酶系通常比较复杂，需要在含有活性酶系的活性细胞或者活性细胞器内进行。工业上ATP再生常用的方法是利用酵母菌的糖酵解途径，进行底物水平磷酸化方式再生ATP。此方法虽然再生效果良好，但是经酵母细胞酶系催化再生ATP的反应过程复杂，参与催化反应的酶众多，反应过程不易控制，产品批次间质量差异较大。同时酵母酶系质量常因供应的厂家不同、批次不同、甚至季节不同而有很大差异。另外反应过程需要加入大量的酵母细胞酶液，引入了许多蛋白、色素等杂质给后期纯化带来一定困难。近年来，ATP再生的研究重点转向使用单一酶或较简单的酶系，获得高效稳定的再生效果。其中，乙酸激酶、氨激酶、丙酮酸激酶等酶均可有效再生ATP。但是，这些酶所利用的底物价值昂贵，如丙酮酸激酶所利用的磷酸烯醇式丙酮酸，且生成的副产物有一定的生物毒性和污染性，如乙酸激酶、氨激酶催化反应的产物为分别为乙酸和氨气，因此较难在工业生产中大量使用。

有研究表明，在某些细菌体内存在利用多聚磷酸或其盐再生ATP的酶系。该酶系包括多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1，Ppk)、腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3，Adk)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(EC 2.7.4.-，Pap)，本发明统称三种酶为“ATP再生酶”。其中，Ppk催化ADP与多聚磷酸或其盐反应生成ATP，Adk催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP，Pap则催化AMP与多聚磷酸或其盐反应生成ADP，三种酶的合理组合均可用于合成ATP(参见图1)。另外，Ppk酶有Ppk1和Ppk2两种不同形式，Ppk1在多聚磷酸或其盐聚合度较高时有ATP再生作用，而Ppk2可利用低聚合度的多聚磷酸或其盐再生ATP，两种Ppk酶均可用于ATP再生。使用Ppk、Adk和Pap酶组合的方式再生反应中的ATP，反应底物价格低廉，产物污染相对较小，且对反应用酶的影响较小，因此，可以开发用于工业化生产。

发明内容

本发明提供了一种酶法再生ATP的方法及其应用，其通过使用Ppk、Adk和Pap三种“ATP再生酶”再生ATP，克服现有技术的上述缺陷。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种酶法再生ATP的方法，包括以下步骤：

(1)制备ATP再生酶：

通过基因工程改造、发酵、纯化获得ATP再生酶，或以自然提取等其它方式获得ATP再生酶。ATP再生酶可以游离酶的形式制成酶液或者干粉；也可进一步固定于固定化载体上，制得固定化ATP再生酶。

(2)反应液中ATP的再生：

在酶促反应体系中，按需求添加ATP、ADP或AMP中的一种、任意两种或三种组合，进行酶促反应。同时，按比例添加三种ATP再生酶的一种、任意两种或三种组合，并添加多聚磷酸或其盐为磷酸供体，进行ATP再生反应。反应体系中还包含镁离子和/或锰离子，钾离子、钠离子、铵离子中的一种或几种，Tris或磷酸根离子。本发明添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体系，也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。

(3)分离产物和ATP再生酶：

固定化的ATP再生酶在反应罐中直接分离。上述分离可通过滤袋分离，也可在反应柱中直接分离。或

游离的ATP再生酶通过滤器中超滤膜分离。其中，过滤器具有进料口、出料口和回流口，内设截留的超滤膜。经过滤器的截留液为回收的酶液，滤出液为分离出酶之后含产物的反应液。

回收的ATP再生酶可重复利用于步骤(2)。

优选地，上述技术方案中，步骤(1)所述的ATP再生酶选自于多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1，Ppk，包括Ppk1酶和Ppk2酶)、腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3，Adk)、多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(EC 2.7.4.-，Pap)中的一种、任意两种或三种组合，即单独使用Ppk、Adk或Pap，或使用Ppk和Adk组合、Adk和Pap组合或Ppk和Pap组合，或Ppk、Adk和Pap三种的组合。更优选的，选自上述三种ATP再生酶中的任意两种或三种组合，即使用Ppk和Adk组合、Adk和Pap组合或Ppk和Pap组合以及Ppk、Adk和Pap三种的组合。

其中，当选用Ppk与Adk两种酶组合时，Ppk与Adk活性比例为(10-0.1)：1；

其中，当选用Ppk与Pap两种酶组合时，Ppk与Pap的活性比例为(10-0.1)：1；

其中，当选用Pap与Adk两种酶组合时，Pap与Adk活性比例为(10-0.1)：1；

其中，当选用Ppk、Pap与Adk三种酶组合时，Ppk、Pap与Adk活性比例为(10-0.1)：(10-0.1)：1。

上述的Ppk、Adk、Pap可以来源于任何生物、或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。Ppk可以是Ppk1酶和/或Ppk2酶。

优选地，上述技术方案中，步骤(1)所述固定化载体选自于高分子载体、无机载体、磁性高分子微球载体中的一种或多种。其中，高分子载体选自于纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明胶、卡拉胶、尼龙或合成高聚物等；无机载体选自于多孔玻璃、氧化硅、硅胶、活性炭或硅藻土等。

优选地，上述技术方案中，所述的固定化ATP再生酶通过下列方式固定于固定化载体：吸附、包埋、共价、结合、交联或其组合。其中，Pap、Adk、Ppk三种酶可分别固定或按比例混合后一起固定。

优选地，上述技术方案中，步骤(2)ATP再生反应条件如下：

反应温度为25-60℃，优选温度为30-50℃；

反应pH为5-10，优选pH为6-9。

酶促反应体系包括：ATP、ADP和AMP中的一种、任意两种或三种组合，三种物质根据酶促反应需求量，按照任意比例添加；

再生反应体系包括：多聚磷酸或其盐，包括镁离子、锰离子中的一种或两种，铵离子、钾离子、钠离子的一种或几种，Tris或磷酸根离子。

优选地，上述技术方案中，本发明添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体系，也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。

优选地，上述技术方案中，本发明添加的多聚磷酸或其盐的摩尔浓度为反应添加的ATP、ADP和AMP摩尔浓度总和的0.01-40倍；镁离子浓度为0.01-0.2M；锰离子浓度为0.01-0.15M；钾离子浓度为0.01-0.5M；钠离子浓度为0.01-0.5M；铵离子浓度为0.005-0.2M；Tris浓度为0.01-0.1M、磷酸盐浓度为0.01-0.1M。

优选地，上述技术方案中，多聚磷酸或其盐选自于多聚磷酸钠、多聚磷酸钾、多聚磷酸铵、六偏磷酸(钠)、四聚磷酸(钠)和三聚磷酸(钠)中的一种或多种；镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁和硝酸镁中的一种或多种；锰离子选自于氯化锰和硫酸锰中的一种或多种；钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和柠檬酸钾中的一种或多种；钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和柠檬酸钠中的一种或多种；铵离子选自于氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和醋酸铵中的一种或多种。

本发明方法步骤(3)中采用的超滤膜选自于醋酸纤维素膜、聚砜膜、聚丙烯腈膜、聚氯乙烯膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜或陶瓷膜。

一种酶法再生ATP的方法的应用，所述方法用于多种依赖ATP的酶促反应，用于合成物质以及无细胞蛋白表达。

优选地，上述技术方案中，所述依赖ATP的酶促反应为转移磷酸根基团的转移酶所参与的酶促反应，以及部分连接酶所参与的酶促反应。

优选地，上述技术方案中，所述转移磷酸根基团的转移酶所参与的酶促反应为酶法合成磷酸肌酸、磷酸精氨酸、6-磷酸己糖、1,6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油、氧化型辅酶II、AMP、CT(D)P、GT(D)P、UT(D)P的反应；所述部分连接酶所参与的酶促反应为酶法合成乙酰辅酶A、肌肽、肠杆菌素、谷氨酰胺及L-茶氨酸的反应。

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

(1)采用新型Ppk、Adk、Pap三种ATP再生酶，酶促反应中消耗的ATP可被循环再生，从而大大降低ATP的使用量。且再生过程简单高效，反应容易控制，稳定性高。

(2)反应需添加的底物多聚磷酸或其盐价格低廉，污染小，且对反应用酶的影响较小。

(3)酶促反应不需要添加高价的ATP起始反应，添加ADP或者廉价的AMP，以及三种物质的任意两种或三种组合均可以正常进行催化反应。

(4)建立了ATP再生酶回收体系，适用于工业化大规模生产。

此外，本发明中所描述的ATP再生体系可应用于多种依赖ATP的酶促反应，尤其是转移磷酸根基团的转移酶(EC 2.7)所参与的酶促反应，例如：磷酸肌酸、磷酸精氨酸、6-磷酸己糖、1,6-磷酸果糖、3-磷酸甘油、氧化型辅酶II、AMP、CT(D)P、GT(D)P、UT(D)P等物质的合成反应，以及部分连接酶(EC 6)所参与的酶促反应，例如：乙酰辅酶A、肌肽、肠菌素、谷氨酰氨和L-茶氨酸等物质的合成反应。上述酶促合成反应所需的催化用酶及底物见下表1。表1所列催化用酶可以来源于任何生物、或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶，可商购获得。

最后，本发明中所描述的ATP再生体系还可应用于无细胞蛋白表达等消耗生物能量的新技术中。

表1.本发明所涉及的酶促反应催化用酶及底物

附图说明

图1为本发明Ppk、Adk、Pap三种酶再生ATP的原理图。

图2为本发明所表达的Ppk、Adk、Pap酶的SDS-PAGE图。

图3为本发明使用游离的ATP再生酶的反应工艺流程图。

图4为本发明使用固定化ATP再生酶的反应工艺流程图。

图5为本发明应用于磷酸肌酸生产的肌酸和磷酸肌酸的浓度变化图。

图6为本发明应用于无细胞表达Adk酶的SDS-PAGE图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。

实施例1Ppk、Adk和Pap酶的制备

本发明方法中的Ppk(包括Ppk1和Ppk2)、Adk和Pap酶可以商购获得，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。

Ppk1、Ppk2、Adk和Pap酶的制备过程如下：

根据四种酶基因的序列，设计四对扩增引物，由中美泰和生物技术有限公司合成，引物序列如下：

ppk1正义引物：5’-CCATATGGGTCAGGAAAAGCTATACATCG-3’；

ppk1反义引物：5’-CGGATCCTTATTCAGGTTGTTCGAGTGATT-3’；

ppk2正义引物：5’-TACATATGGCCAGCCCGGCGCAGAAG-3’；

ppk2反义引物：5’-TGAATTCAGGCCGGGATATCCAGGTTC-3’；

adk正义引物：5’-CCATATGCGTATCATTCTGCTTGGCGCTCCGG-3’；

adk反义引物：5’-CGGATCCTTAGCCGAGGATTTTTTCCAGATC-3’；

pap正义引物：5’-GCCATGGATACAGAAACGATCGCCAGTGCAG-3’；和

pap反义引物：5’-CGGATCCTTAATCCGTGTCGCGATCCGCTT-3’；

提取大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株(购于天根生化科技有限公司)DNA，以其为模板，通过PCR扩增出ppk1与adk基因片段，并将其分别连接至pET 22b载体(购于Novagene公司)；提取铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株(CICC 10419)DNA，以其为模板，通过PCR扩增出ppk2基因片段，并将其连接至pET22b载体(购于Novagene公司)；提取约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)菌株(CGMCC 1.8030)DNA，以其为模板，通过PCR扩增出pap基因片段，并将其连接至pET22b载体(购于Novagene公司)。4段连接序列经测序正确后，分别转入E.coli BL21(DE3)菌株(购于天根生化科技有限公司)。

将转化后的E.coli BL21(DE3)单克隆接入LB培养基，培养至对数期后，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导5小时后，收集菌体，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选高表达菌株。

将筛选出的高表达菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后接入含5L发酵培养基的发酵罐中，培养至对数生长期后接入含50L发酵培养基的发酵罐中，培养5小时后加入1mM IPTG诱导5小时后，离心收集菌体约1kg。

其中LB培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％NaCl；种子培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％氯化钠；发酵培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、5％磷酸氢二钠、1％磷酸二氢钠、0.01％硫酸镁和1％甘油。

收获的菌体分别经超声或高压匀浆破菌后，离心收集上清。然后加40-60％饱和的硫酸铵，离心收集沉淀。经Tris缓冲液pH 8.0溶解后，使用G25柱(购于通用电气医疗生物科学有限公司)脱盐，再经CM-或DEAE-Sepharose FF(购于通用电气医疗生物科学有限公司)层析可得到初步纯化的游离酶。

图2为所制备酶的SDS-PAGE图，如图所示：泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(购于北京中科瑞泰生物技术有限公司)；泳道2为Ppk1酶，约60kDa；泳道3为Ppk2酶，约45kDa；泳道4为Adk酶，约25kDa；泳道5为Pap酶，约55kDa。

使用现有技术记载的公知的测定酶活性的方法，检测到1mg/ml Ppk1、 Ppk2、Adk和Pap酶液活性分别约为100U、500U、1000U和800U，其中将1μM底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。

实施例2酶促法生产磷酸肌酸偶联ATP再生体系

图3为本发明方法使用游离酶进行酶促反应并偶联ATP再生体系的工艺流程图。参见图3，酶法制备磷酸肌酸同时偶联游离的ATP再生体系的操作步骤如下：

(1)在反应罐中合成磷酸肌酸和再生ATP的反应：

在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物1.5kg肌酸，以及1.0kg ATP、0.5kg磷酸氢二钠、0.38kg氯化钾、0.3kg氯化钠、0.2kg硫酸铵、1.0kg六水氯化镁和2.0kg四聚磷酸钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约7.5，在反应体系中添加500U/L肌酸激酶及500U/L Ppk2酶、500U/L Adk酶开始反应。反应期间控制pH值为7.5，温度为35℃。

图5为每隔1小时高效液相色谱(HPLC)检测肌酸的剩余量及磷酸肌酸的生成量。反应5小时后，磷酸肌酸生成量约为22g/L，约50％以上ATP转化为ADP、AMP。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长210nm，检测温度25℃，检测流速1ml/min，流动相为含有20mM磷酸二氢钾、0.1％TFA和5％乙腈的水溶液。

(2)在过滤器中分离肌酸激酶和ATP再生酶：

通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离肌酸激酶和ATP再生酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量8kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液，含有磷酸肌酸、ATP、ADP、AMP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。

检测到回收的肌酸激酶、Ppk2酶和Adk酶的活性较反应前减少5％-20％不等，可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。

实施例3酶促法生产1,6-二磷酸果糖偶联ATP再生体系(固定化酶)

图4为本发明方法使用固定酶进行酶促反应生产并偶联ATP再生体系的工艺流程图。参见图4，固定酶法制备1,6-二磷酸果糖同时偶联ATP再生体系的操作步骤如下：

(1)催化用酶与ATP再生酶的固定：

催化用酶果糖激酶(FK)和磷酸果糖激酶(PFK)通过商购获得，同实施例1中初步纯化的ATP再生酶Ppk2酶和Pap酶一同以商业化的环氧基固定化载体LX1000EP固定。

将FK、PFK、Ppk2和Pap酶按照活性比1：1：1：1混合配成混合酶液 10L，酶液中各酶活性均约为200U。在恒温搅拌罐中加入LX1000EP湿载体3kg与上述酶液混合，在20℃条件下，150rpm搅拌12小时。过滤收集载体，用0.02M pH 8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，即得固定化混合酶。FK、PFK、Ppk2和Pap酶固定化后，活性降低至原活性的30-40％。

(2)在反应柱中生成1,6-二磷酸果糖：

配制反应液，每50L含有底物0.9kg果糖，以及0.3kgATP、0.2kgAMP、0.15kg Tris、0.1kg氯化铵、0.6kg硫酸镁和1.5kg六偏磷酸钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约7.0，温度升为35-40℃。

将上述步骤(1)中的混合固定酶约3kg装入反应柱，排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以15L/h流速由下而上缓慢泵入通过酶反应柱，反应期间控制温度为37℃。循环反应约6小时后，收集反应液，检测1,6-二磷酸果糖的生成量约为30g/L，70％以上ATP转化为ADP、AMP。

固定化酶循环反应20次以上或者-4℃储存时间一月以上，酶活性降低约10-15％，需按比例补加或更换部分新酶。

实施例4酶促法生产肌肽偶联ATP再生体系

参见图3，酶法制备肌肽同时偶联游离的ATP再生酶再生ATP的操作步骤如下：

(1)在反应罐中合成肌肽和再生ATP的反应：

在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物L-组氨酸1.8kg、β-丙氨酸1.0kg，以及2.0kgAMP、0.6kg磷酸氢二钠、0.38kg氯化钾、0.3kg氯化钠、1.0kg六水氯化镁和5.0kg四聚磷酸钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约7.0，在反应体系中添加800U/L肌肽合成酶及600U/L Adk酶、600U/L Pap酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0，温度为37℃。

反应6小时后，肌肽生成量约为20g/L，约80％以上AMP转化为ADP、ATP。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长210nm，检测温度25℃，检测流速0.8ml/min，流动相为含有80mM磷酸盐缓冲液和15％甲醇的水溶液。

(2)在过滤器中分离肌肽合成酶和ATP再生酶：

通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离肌肽合成酶和ATP再生酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量8kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液，含有肌肽、ATP、ADP、AMP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。

检测到回收的肌肽合成酶、Adk酶和Pap酶的活性较反应前减少10％-20％不等，可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。

实施例5酶促法生产茶氨酸偶联ATP再生体系

参见图3，酶法制备茶氨酸同时偶联游离的ATP再生体系的操作步骤如下：

(1)在反应罐中合成茶氨酸和再生ATP的反应：

在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物1.5kg谷氨酸钠、0.7kg盐酸乙胺，以及1.0kg ATP、0.5kg磷酸氢二钠、1.0kg六水氯化镁、0.5kg一水氯化锰和2.0kg四聚磷酸钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约7.0，在反应体系中添加500U/L茶氨酸合成酶及600U/L Adk酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0，温度为30℃。

反应5小时后，茶氨酸生成量约为14g/L，约95％以上ATP转化为AMP。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长203nm，检测温度30℃，检测流速1ml/min，流动相为含有0.05％TFA和5％乙腈的水溶液。

(2)在过滤器中分离茶氨酸和ATP再生酶：

通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离茶氨酸合成酶和Adk酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量8kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液，含有茶氨酸、AMP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。

检测到回收的茶氨酸合成酶和Adk酶的活性较反应前减少5％-10％不等，可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。

实施例6酶促法生产磷酸肌酸偶联ATP再生体系

参见图3，酶法制备磷酸肌酸同时偶联游离的ATP再生酶再生ATP的操作步骤如下：

(1)在反应罐中合成磷酸肌酸和再生ATP的反应：

在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物0.5kg肌酸，以及0.26kgATP、0.4kgADP、0.7kgAMP、0.14kg磷酸氢二钠、0.07kg氯化钾、0.03kg氯化铵、0.15kg一水氯化锰和2.0kg多聚磷酸铵(按平均聚合度500计算)的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约10.0，在反应体系中添加100U/L肌酸激酶及100U/L Ppk1酶、1000U/L Pap酶开始反应。反应期间控制pH值为10.0，温度为60℃。

反应6小时后，磷酸肌酸生成量约为3g/L，约30％以上ATP转化为ADP、AMP。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。

(2)在过滤器中分离肌酸激酶和ATP再生酶：

通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离肌酸激酶和ATP再生酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量20kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液，含有磷酸肌酸、ATP、ADP、AMP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。

检测到回收的肌酸激酶、Ppk1酶和Pap酶的活性较反应前减少30％-50％不等，可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。

实施例7酶促法生产磷酸肌酸偶联ATP再生体系

(1)在反应罐中合成磷酸肌酸和再生ATP的反应：

在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物2.0kg肌酸，以及0.30kg AMP、1.2kg Tris、2.92kg氯化钠、1.33kg硫酸铵、4.1kg六水氯化镁和21.0kg六偏磷酸钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约5.0，在反应体系中添加800U/L肌酸激酶及1000U/L Ppk2酶、100U/L Adk酶、800U/L Pap酶开始反应。反应期间控制pH值为5.0，温度为25℃。

反应10小时后，磷酸肌酸生成量约为19g/L，约20％以上AMP转化为ADP、ATP。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。

(2)在过滤器中分离肌酸激酶和ATP再生酶：

检测到回收的肌酸激酶、Ppk2酶、Adk酶和Pap酶的活性较反应前减少15％-40％不等，可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。

实施例8酶促法生产磷酸肌酸偶联ATP再生体系

(1)在反应罐中合成磷酸肌酸和再生ATP的反应：

在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物1.8kg肌酸，以及4.0kg ATP、0.6kg Tris、1.05kg氯化铵、2.0kg六水氯化镁和0.4kg多聚磷酸钠(按平均聚合度50计算)的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约6.5，在反应体系中添加100U/L肌酸激酶及300U/L Pap酶开始反应。反应期间控制pH值为6.5，温度为37℃。

反应7小时后，磷酸肌酸生成量约为21g/L，约90％以上ATP转化为ADP。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。

(2)在过滤器中分离肌酸激酶和ATP再生酶：

通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离肌酸激酶和ATP再生酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量20kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液，含有磷酸肌酸、ATP、ADP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。

检测到回收的肌酸激酶和Pap酶的活性较反应前减少10％-20％不等，可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。

实施例9酶促法生产1,6-二磷酸果糖偶联ATP再生体系(固定化酶)

参见图4，固定酶法制备1,6-二磷酸果糖同时偶联ATP再生体系的操作步骤如下：

(1)催化用酶与ATP再生酶的固定：

催化用酶果糖激酶(FK)和磷酸果糖激酶(PFK)通过商购获得，同实施例1中初步纯化的ATP再生酶Adk酶和Pap酶分别以商业化的环氧基固定化载体LX1000EP或含氨基合成高聚物载体LX1000HA固定。

分别将FK、PFK、Adk和Pap酶制成酶液，各3L，4种酶液活性均为200-400U。

在恒温搅拌罐中加入LX1000EP湿载体1kg与FK酶液3L混合，在20℃条件下，150rpm搅拌12小时。过滤收集载体，用0.02M pH 8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，即得固定化FK酶。Adk酶以相同方法固定。

在恒温搅拌罐中加入LX1000HA湿载体1kg与PFK酶液3L混合，在20℃条件下，150rpm搅拌12小时。过滤收集载体，用0.02M pH 8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，即得固定化PFK酶。Pap酶以相同方法固定。

(2)在反应柱中生成1,6-二磷酸果糖：

配制反应液，每50L含有底物1.1kg果糖，以及0.75kgATP、0.25kg磷酸二氢钾、0.2kg氯化钾、0.6kg硫酸镁和1.25kg四聚磷酸钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约8.0，温度升为40-45℃。

将上述步骤(1)中的固定酶混合装入反应柱，共约4kg，排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以10L/h流速由下而上缓慢泵入通过酶反应柱，反应期间控制温度为42℃。循环反应约6小时后，收集反应液，检测1,6-二磷酸果糖的生成量约为36g/L，50％以上ATP转化为ADP、AMP。

实施例10无细胞蛋白表达Adk酶偶联ATP再生体系

无细胞蛋白表达Adk酶同时偶联ATP再生体系的操作步骤如下：

(1)表达载体pIVEX2.4d-adk的构建：

根据adk基因的序列，设计一对扩增引物，由中美泰和生物技术有限公司合成，引物序列如下：

adk正义引物：5’-TCCATGGGTATCATTCTGCTTGGCGCTCCGG-3’；和

adk反义引物：5’-CGGATCCTTAGCCGAGGATTTTTTCCAGATC-3’；

参照实施例1所描述方法，PCR扩增adk基因片段，使用Nco I和BamH I双酶切后，连接至pIVEX2.4d载体(购于Roche公司)，构建成pIVEX2.4d-adk载体，经测序正确。

(2)大肠杆菌无细胞抽提物制备：

将E.coli A19(缺失核酸酶I基因，不降解外源基因)单克隆接入LB培养基，培养至对数生长期后接入含5L发酵培养基的发酵罐中，培养至OD₆₀₀达到3时离心收集菌体。LB培养基及发酵培养基成分参见实施例1。

用S30缓冲液重悬菌体，4℃离心洗涤3次，收集菌体，保存于-80℃。S30缓冲液成分为：14mM醋酸镁、60mM醋酸钾、1mM二硫苏糖醇(DTT)及10mM Tris(pH值8.1)。

称量菌体重量，每10克菌体加入100ml S30缓冲液重溶，同时加入1mM DTT。在75kPa压力下高压均质破碎菌体，再加入1mM DTT，4℃离心收集上清。在恒温摇床中100rpm、37℃孵育30分钟，制得大肠杆菌无细胞抽提物。

(3)使用无细胞抽提物表达蛋白偶联ATP再生体系

在100μl蛋白表达体系中，加入20μl步骤(2)所述大肠杆菌无细胞抽提物，加入15μg/ml步骤(1)所述表达载体pIVEX2.4d-adk，加入15mM醋酸镁、50mM醋酸铵、50mM HEPES-氢氧化钾(pH值7.5)、2％PEG8000、2mM DTT、0.33mM NAD⁺、0.27mM辅酶A、4mM草酸、1U/μl T7 RNA聚合酶、10mM ATP、1mM GTP、1mM CTP、1mM UTP以及20种氨基酸各2mM，同时加入1U/μl Adk酶、1U/μl Pap酶以及10mM四聚磷酸盐用作ATP再生。在恒温摇床中200rpm、30℃反应6小时。

图6为所表达Adk酶的SDS-PAGE图，如图所示：泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(购于北京中科瑞泰生物技术有限公司)；泳道2为无细胞表达的Adk酶，约25kDa。

对比例1酶促法生产磷酸肌酸

酶法制备磷酸肌酸的操作步骤如下：

在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物1.5kg肌酸，以及6.0kg ATP、0.5kg磷酸氢二钠、0.38kg氯化钾、0.3kg氯化钠、0.2kg硫酸铵和1.0kg六水氯化镁的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约7.5，在反应体系中添加500U/L肌酸激酶开始反应。反应期间控制pH值为7.5，温度为35℃。

反应5小时后，磷酸肌酸生成量约为15g/L，约90％以上ATP转化为ADP、AMP。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。

对比实施例2可以看出：没有偶联适合酶法生产的ATP再生系统，反应体系需要的ATP量大大增加，且反应生成的产物量明显减少，从而加大了生产成本。

对比例2酶促法生产磷酸肌酸偶联单一ATP再生酶体系

酶法制备磷酸肌酸并偶联单一ATP再生酶体系的操作步骤如下：

在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物1.5kg肌酸，以及1.0kg ATP、0.5kg磷酸氢二钠、0.38kg氯化钾、0.3kg氯化钠、0.2kg硫酸铵、1.0kg六水氯化镁和2.0kg四聚磷酸钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约7.5，在反应体系中添加500U/L肌酸激酶及2500U/L Ppk2酶开始反应。反应期间控制pH值为7.5，温度为35℃。

反应6小时后，磷酸肌酸生成量约为20g/L，约90％以上ATP转化为ADP、AMP。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。

对比实施例2及对比例1可以看出：偶联一种ATP再生酶的体系的再生效果没有偶联两种或者三种ATP再生酶组合体系的效果好：反应总体需要的酶量需要增加，且生成产物量有所减少，反应时间增长。但是此方法的优点在于可以降低ATP的使用量，使反应中的ATP部分得到再生，从而降低生产成本。本发明采用新型Ppk、Adk、Pap三种ATP再生酶，酶促反应中消耗的ATP可被循环再生，从而大大降低ATP用量，且再生过程简单高效，反应容易控制，稳定性高；其次，反应需添加的底物多聚磷酸或其盐价格低廉，污染小，且对反应用酶的影响较小；再次，酶促反应不需要添加高价的ATP起始反应，添加ADP或者廉价的AMP，以及三种物质的任意两种或三种组合均可以正常进行催化反应；最后，建立了ATP再生酶回收体系，适用于工业化大规模生产。

本发明中所描述的ATP再生体系还可应用于多种依赖ATP的酶促反应。还还可应用于无细胞蛋白合成等消耗生物能量的新技术中。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims

1.一种酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备并获得ATP再生酶：

通过基因工程改造、发酵、纯化或自然提取来获得ATP再生酶；该ATP再生酶是以游离酶的形式制成酶液或干粉，或是以固定化酶形式固定于固定化载体上；

(2)反应液中ATP的再生：

添加ATP、ADP和AMP的一种或多种组合，进行酶促反应；

添加ATP再生酶；

添加多聚磷酸或其盐为磷酸供体，进行ATP再生反应；

(3)分离产物和ATP再生酶：

固定化的ATP再生酶在反应罐中直接分离；或

游离的ATP再生酶通过滤器中超滤膜分离；经过滤器的截留液为回收的ATP再生酶，滤出液为分离出酶之后含产物的反应液。

2.根据权利要求1所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

(4)回收的ATP再生酶重复利用于步骤(2)。

3.根据权利要求1所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述ATP再生酶选自于多聚磷酸激酶(Ppk)、腺苷酸激酶(Adk)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(Pap)的一种或多种组合。

4.根据权利要求3所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，当选用Ppk和Adk两种酶组合时，Ppk与Adk活性比例为(10-0.1)：1；当选用Ppk和Pap两种酶组合时，Ppk与Pap的活性比例为(10-0.1)：1；当选用Pap和Adk两种酶组合时，Pap与Adk活性比例为(10-0.1)：1；当选用Ppk、Pap和Adk三种酶组合时，Ppk、Pap与Adk活性比例为(10-0.1)：(10-0.1)：1。

5.根据权利要求3所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述固定化ATP再生酶通过吸附、包埋、共价、结合和交联的一种或多种方式固定于固定化载体；三种ATP再生酶可分别固定或按比例混合后一起固定。

6.根据权利要求1所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述步骤(2)中ATP再生反应条件如下：

反应温度为25-60℃；

反应pH为5-10；

酶促反应体系包括：ATP、ADP和AMP中的一种或多种组合，三种物质根据需求按任意比例添加；

再生反应体系包括：多聚磷酸或其盐，镁离子和/或锰离子，铵离子、钾离子和钠离子的一种或多种，Tris或磷酸根离子。

7.根据权利要求6所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，多聚磷酸或其盐的摩尔浓度为反应添加的ATP、ADP和AMP的一种或多种的摩尔浓度总和的0.01-40倍；镁离子浓度为0.01-0.2M；锰离子浓度为0.01-0.15M；钾离子浓度为0.01-0.5M；钠离子浓度为0.01-0.5M；铵离子浓度为0.005-0.2M；Tris浓度为0.01-0.1M、磷酸盐浓度为0.01-0.1M。

8.根据权利要求1-7任一权利要求所述的酶法再生ATP的方法的应用，其特征在于，所述方法用于多种依赖ATP的酶促反应，用于合成物质以及无细胞表达蛋白。

9.根据权利要求8所述的酶法再生ATP的方法的应用，其特征在于，所述依赖ATP的酶促反应为转移磷酸根基团的转移酶所参与的酶促反应，以及部分连接酶所参与的酶促反应。

10.根据权利要求9所述的酶法再生ATP的方法的应用，其特征在于，所述转移磷酸根基团的转移酶所参与的酶促反应为酶法合成磷酸肌酸、磷酸精氨酸、6-磷酸己糖、1,6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油、氧化型辅酶II、AMP、CT(D)P、GT(D)P及UT(D)P的反应；所述部分连接酶所参与的酶促反应为酶法合成乙酰辅酶A、肌肽、肠杆菌素、谷氨酰胺及L-茶氨酸的反应。