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CN105829529A - 生产o-琥珀酰高丝氨酸的微生物和通过使用其生产o-琥珀酰高丝氨酸的方法 - Google Patents

生产o-琥珀酰高丝氨酸的微生物和通过使用其生产o-琥珀酰高丝氨酸的方法 Download PDF

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CN105829529A CN201480070310.9A CN201480070310A CN105829529A CN 105829529 A CN105829529 A CN 105829529A CN 201480070310 A CN201480070310 A CN 201480070310A CN 105829529 A CN105829529 A CN 105829529A
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Abstract

本发明涉及：多肽；表达该多肽的生产O?琥珀酰高丝氨酸的微生物；和通过使用其生产O?琥珀酰高丝氨酸的方法，所述多肽对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O?琥珀酰转移酶活性。

Description

生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物和通过使用其生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法
技术领域
本发明涉及分离的多肽、表达该多肽的微生物和使用其生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法，所述分离的多肽对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性。
背景技术
已知自然界中存在的大多数微生物利用O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸作为中间体用于生物合成甲硫氨酸。一般而言，由将琥珀酰辅酶A的琥珀酰基缀合至高丝氨酸的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(MetA)生产O-琥珀酰高丝氨酸，并且由将乙酰辅酶A的乙酰基缀合至高丝氨酸的高丝氨酸O-乙酰转移酶(MetX)生产O-乙酰高丝氨酸。即，在中间体间生产O-琥珀酰高丝氨酸中，metA在生产其的微生物的发育中是最重要的基因之一。同时，与MetA不同，MetX已知为没有被反馈抑制并且具有高的酶稳定性。
可以使用具有metB基因缺失的菌株生产O-琥珀酰高丝氨酸，所述metB基因编码甲硫氨酸生物合成途径中的胱硫醚γ合成酶。然而，产O-琥珀酰高丝氨酸菌株需要L-甲硫氨酸。为此，高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的活性通过经历添加至培养基的甲硫氨酸的反馈抑制而被抑制，并且最终，不能获得高浓度的O-琥珀酰高丝氨酸。
因此，许多在先专利已经将它们的研究集中于从反馈控制系统解除metA的反馈抑制。然而，由metA编码的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶具有问题，因为野生型蛋白本身具有低的稳定性并且为了解除反馈抑制引入突变加剧不稳定性。因此，对于具有高生产力的产O-琥珀酰高丝氨酸的菌株的开发而言，去除metA基因的反馈抑制并且确保酶稳定性是必需的。
发明内容
[技术问题]
为了解决上面描述的metA的反馈抑制的现象和酶不稳定性问题，本发明人已经努力开发了具有稳固的酶稳定性同时不受甲硫氨酸反馈抑制的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶，并且就这一点而言，已经筛选了具有活性的新型的酶。作为选择如此筛选的候选基因并在将它们引入埃希氏杆菌属(Escherichia)某种之后在烧瓶中培养的结果，本发明人已经发现了O-琥珀酰高丝氨酸的生产，并且发现了如此选择的基因具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性和对甲硫氨酸的反馈抑制的抗性，从而完成本发明。
[技术方案]
本发明的目标是提供新型的分离的多肽，其对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性。
本发明的另一个目标是提供编码该新型的分离的多肽的多核苷酸。
本发明的进一步的目标是提供生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物，其表达该新型的分离的多肽。
本发明的进一步的目标是提供使用上面的微生物生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法。
[发明的有益效果]
生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物——其包括新型的分离的多肽，该多肽对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性——可以对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且以高产量生产O-琥珀酰高丝氨酸，并且因而可以有效地用于以高产量生产L-甲硫氨酸，其使用O-琥珀酰高丝氨酸作为前体。
[实施本发明的最佳模式]
为了实现上面的目标，在一方面，本发明提供了对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的新型的分离的多肽。
如本文所使用的，术语“高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性”指的是在甲硫氨酸生物合成期间将高丝氨酸转化为O-琥珀酰高丝氨酸的活性。
如本文所使用的，术语“反馈抑制”指的是在甲硫氨酸生物合成期间高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的活性受甲硫氨酸的抑制。
本发明的多肽的特征在于其具有SEQIDNO:29的氨基酸序列，该氨基酸序列具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性，并且对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性。与上述多肽共享80％或更多，特别地90％或更多，更特别地95％或更多，和甚至更特别地97％或更多的序列同源性的任何多肽也在本发明的范围内，只要如本发明中建议的，该多肽具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性并且对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性。同源性可以使用BLAST——其是参考算法——测定，或者使用Pearson的FASTA测定[MethodsEnzymol.,183,63(1990)，下文]。基于BLAST算法，已经开发了称为BLASTN和BLASTX的程序[www.ncbi.nlm.nih.gov，下文]。
在另一方面，本发明提供了编码上述多肽的分离的多核苷酸。具体而言，多肽可以由SEQIDNO:36的多核苷酸序列编码，由于密码子简并性，与上述序列具有至少80％，特别地90％或更多，更特别地95％或更多，和甚至更特别地97％或更多的序列同源性的那些多核苷酸也在本发明的范围内，但是不限于此。
在仍另一方面，本发明提供了以可操作方式包括该多核苷酸的载体。
如本文所使用的，术语“载体”指的是包括编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，其中感兴趣的蛋白质可操作地连接至适合的调控序列，使得感兴趣的蛋白质可以在适合的宿主中表达。调控序列可以包括能够起始转录的启动子、用于调控转录的任何操纵基因序列、编码适合的mRNA核糖体结合结构域的序列、和调控转录和翻译终止的序列。载体在转化入适合的宿主之后，可以独立于宿主基因组复制或起作用，或者可以整合入宿主基因组本身。
本发明中使用的载体可不被具体地限制，只要载体在宿主中是可复制的，并且可以使用本领域中已知的任何载体。
在仍另一方面，本发明提供了表达多肽的产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物，所述多肽对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性。
如本文所使用的，术语“产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物”可以指可以生产O-琥珀酰高丝氨酸并且在细胞内和细胞外储存它的微生物。
生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物包括原核和真核微生物菌株，例如，属于埃希氏杆菌属、欧文氏菌属(genusErwinia)、沙雷氏菌属(genusSerratia)、普罗维登斯菌属(genusProvidencia)、棒状杆菌属(genusCorynebacterium)和短杆菌属(genusBrevibacterium)的微生物菌株，但不限于此。具体而言，微生物可以是属于埃希氏杆菌属的微生物，例如，大肠杆菌(Escherichiacoli)。
可以使用生产L-赖氨酸、L-苏氨酸或L-异亮氨酸的微生物菌株，和特别地使用产L-苏氨酸的菌株制备产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物。由于产L-苏氨酸的菌株是能够合成作为O-琥珀酰高丝氨酸的前体的L-苏氨酸和高丝氨酸的菌株，因此大量的甲硫氨酸前体，即O-琥珀酰高丝氨酸，可以使用该菌株合成。
在本发明中，多肽的表达可以通过以可操作方式转化有包含编码该多肽的基因的重组载体或者通过将编码该多肽的多核苷酸插入染色体实现，但是方法不限于此。
如本文所使用的，术语“转化”指的是以下过程：将包括编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞，从而能够实现由多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达。对于转化的多核苷酸而言，它是否插入宿主细胞的染色体并且位于其中或者位于染色体的外面是无所谓的，只要它可以在宿主细胞中表达。多核苷酸可以以任何形式插入，只要它可以被引入宿主细胞并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，所述表达盒是包括自主表达所需要的所有必需元件的多核苷酸构建体。表达盒可以常规地包括可操作地连接至基因的开放阅读框(“ORF”，下文)的启动子、转录中止信号、核糖体结合结构域和翻译中止信号。本发明中使用的启动子可以不被具体地限制，只要它可以以高频率起始在宿主细胞中编码靶蛋白的多核苷酸的转录，并且可以使用本领域中已知的任何启动子。特别地，可以使用T7启动子、trc启动子、tac启动子和CJ1启动子(韩国专利号0620092)等。
在本发明的示例性实施方式中，可以进一步缺失或减弱微生物中编码胱硫醚γ合成酶的metB基因。
在本发明的示例性实施方式中，可以进一步缺失或减弱微生物中编码高丝氨酸激酶的thrB基因和编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因。
额外地，在示例性实施方式中，微生物可以是埃希氏杆菌属某种，其中磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶和天冬氨酸-半醛脱氢酶被进一步增强。
在本发明中，基因的序列可以从数据库获得，比如美国国家生物技术信息中心(NCBI)。
如本文所使用的，术语“缺失”指的是在染色体内从对应于起始密码子的核苷酸序列到对应于终止密码子的核苷酸序列去除靶基因的核苷酸序列区域的一部分或全部的类型，或者去除其调控区域的核苷酸序列区域的一部分或全部的类型。
如本文所使用的，术语“减弱”指的是去除或降低微生物菌株中由对应的多核苷酸编码的至少一种酶的细胞内活性。例如，可以通过修饰基因的表达调控序列或5’-UTR的核苷酸序列减弱蛋白质的表达，或者可以通过在对应基因的ORF区中替换起始密码子或引入突变减弱蛋白质的活性。
如本文所使用的，术语“增强”指的是增加由对应的多核苷酸编码的酶的细胞内活性。可以通过基因的过表达或通过引入多核苷酸序列自身的修饰实现酶的细胞内活性的增强。
多核苷酸的过表达可以是通过替换表达调控序列的修饰或通过突变、替换起始密码子、将多核苷酸额外地插入染色体或通过使用载体的引入增加拷贝数的修饰、或其组合。
表达调控序列是控制可操作地连接至其的多核苷酸的表达的序列，例如，启动子、终止子、增强子、沉默子、SD序列等。由TTG或GTG组成的起始密码子可以替换为ATG以增加对应基因的酶活性，或者通过以相反方式替换降低对应基因的酶活性。多核苷酸可以是通过插入染色体内的特定位点而具有增加的拷贝数的多核苷酸。特定位点可以包括，例如，转座子或基因区间。额外地，多核苷酸可以是被插入表达载体的多核苷酸，该表达载体又被引入宿主细胞，从而具有增加的拷贝数。
在另一方面，本发明提供了生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法，其包括在培养基中培养上述微生物以生产O-琥珀酰高丝氨酸，和从微生物或培养基中获得O-琥珀酰高丝氨酸。
培养上面制备的生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物菌株可以根据本领域中已知的适合的培养基或培养条件进行。培养方法可以容易地由本领域普通技术人员根据待选择的菌株调节以便使用。特别地，培养可以是分批培养、连续培养和补料培养，但不限于此。例如，在参考文献(JamesM.Lee,“BiochemicalEngineering”,Prentice-HallInternationalEditions,pp138-176)中公开了这些不同的培养方法。
用于培养的培养基必须适当地满足具体菌株的要求。例如，参考文献(AmericanSocietyforBacteriology,“ManualofMethodsforGeneralBacteriology”,WashingtonD.C.,USA,1981)中公开了用于不同微生物的培养基的实例。培养基可以包含各种碳源、氮源和痕量元素。培养基中包含的碳源的实例可以包括糖类，比如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；脂肪，比如豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，比如软脂酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，比如甘油和乙醇；和有机酸，比如乙酸。这些碳源可以单独或组合使用。培养基中包含的氮源的实例可以包括有机氮源，比如蛋白胨、酵母提取物、肉汁(meatgravy)、麦芽提取物、玉米浆(CSL)和豆粉；和无机氮源，比如脲、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独或组合使用。作为磷源，培养基可以包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐。另外，培养基可以包含金属，比如硫酸镁和硫酸铁。而且，可以包含氨基酸、维生素和适合的前体等。这些培养基或前体可以以分批培养或连续培养的形式加入到培养基中。
另外，培养基的pH可以通过在培养期间以适合的方式添加化合物来调节，所述化合物比如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸。另外，在培养期间可以使用消泡剂比如脂肪酸聚乙二醇酯防止气泡形成。另外，可以将氧气或含有氧气的气体(例如空气)加入到培养基中以维持培养中的需氧条件。培养温度可以在20℃到45℃的范围内，并且特别地25℃到40℃的范围内。可以继续培养直到获得期望量的O-琥珀酰高丝氨酸产物，并且特别地持续10小时到160小时。
由本发明的方法生产的O-琥珀酰高丝氨酸可以通过胱硫醚γ合成酶或者O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶转化为甲硫氨酸。另外，通过将本发明的方法生产的O-琥珀酰-L-高丝氨酸与CH3SH反应，除了L-甲硫氨酸之外，还可以获得副产物琥珀酸。
在仍另一方面，本发明涉及对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的多肽的用途，其中该多肽具有SEQIDNO:29的氨基酸序列。本发明的新型的分离的多肽确认为对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且能够以高产量生产O-琥珀酰高丝氨酸，并且因而该多肽可用于生产O-琥珀酰高丝氨酸。
具体实施方式
在下文中，将参照下面的实施例对本发明进行更详细地描述。但是这些实施例仅出于说明性的目的，并且本发明不意欲由这些实施例限制。
实施例1：基于产苏氨酸的菌株的亲株的制备
(1)metB基因的缺失
为了表征metX基因的底物特异性和活性，菌株可以积聚高丝氨酸并且具有利用酰基高丝氨酸的缺失。该菌株基于FTR2533(KCCM10541)——在国际专利公布号WO05/075625中公开的产苏氨酸的菌株——构建。
通过FRT-一步-PCR缺失方法(PNAS(2000)vol97:P6640-6645)缺失产苏氨酸的菌株——FTR2533(KCCM10541)菌株——中的编码胱硫醚合成酶的metB基因。通过PCR使用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的引物，以及pKD3载体(PNAS(2000)vol97:P6640-6645)作为模板构建缺失盒。PCR在下列条件下进行30个循环：在94℃下变性30s、在55℃下退火30s和在72℃下聚合1min。
<SEQIDNO:1>
5’ttactctggtgcctgacatttcaccgacaaagcccagggaacttcatcacgtgtaggctggagctgcttc3’
<SEQIDNO:2>
5’ttaccccttgtttgcagcccggaagccattttccaggtcggcaattaaatcatatgaatatcctccttag3’
得到的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中电泳，并且纯化从其获得的1.2kbpDNA带。回收的DNA片段电穿孔入FTR2533菌株，其已经转化有pKD46载体(PNAS(2000)vol97:P6640-6645)。
为了电穿孔，转化有pKD46载体的FTR2533菌株在含有100μg/L的氨苄青霉素和5mML-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD600达到0.6。生成物使用无菌蒸馏水洗涤两次，并且然后使用10％甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2500V下进行。
将回收的菌株平板接种在含有25μg/L氯霉素的LB平板培养基上，37℃下培养过夜，并且选择对氯霉素显示抗性的菌株。选择的菌株使用相同的引物同时使用菌株作为模板经历PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在1.2kb的基因带确认metB基因的缺失。将如此确认的菌株又转化有pCP20载体(PNAS(2000)vol97:P6640-6645)并且在LB培养基中培养，并且具有150bp的减小大小的metB基因缺失的最终菌株——其在1.0％琼脂糖凝胶中确认——又通过在相同的条件下进行PCR构建，并且确认了氯霉素标记从菌株中去除。如此构建的菌株命名为“CJMA1”。
(2)thrB基因的缺失
如metB基因缺失的情况一样，使用FRT-一步-PCR缺失方法在如此构建的CJMA1菌株中缺失编码高丝氨酸激酶的thrB基因。
通过PCR使用SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物，以及pKD4载体(PNAS(2000)vol97:P6640-6645)作为模板构建thrB缺失盒。PCR在下列条件下进行30个循环：在94℃下变性30s、在55℃下退火30s和在72℃下延伸1min。
<SEQIDNO:3>
aaagaatatgccgatcggttcgggcttaggctccagtgcctgttcggtgggtgtaggctggagctgcttc
<SEQIDNO:4>
agacaaccgacatcgctttcaacattggcgaccggagccgggaaggcaaacatatgaatatcctccttag
得到的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中电泳，并且纯化从其获得的1.6kbpDNA带。回收的DNA片段电穿孔入CJMA1菌株，其已经转化有pKD46。将回收的菌株平板接种在含有50μg/L卡那霉素的LB平板培养基上，37℃下培养过夜，并且选择对卡那霉素显示抗性的菌株。选择的菌株使用SEQIDNO:3和4的引物在相同的条件下经历PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在1.6kb的基因带确认thrB基因的缺失。将如此确认的菌株又转化有pCP20载体并且在LB培养基中培养，并且具有150bp的减小大小的thrB基因缺失的最终菌株——其在1.0％琼脂糖凝胶中确认——又通过在相同的条件下进行PCR构建，并且确认了卡那霉素标记从菌株中去除。如此构建的菌株命名为“CJMA2”。
(3)metA基因的缺失
为了表征在CJMA2菌株中源自青紫色素杆菌(ChromobacteriumViolaceum)的metX基因的底物特异性和活性，基于CJMA2菌株使染色体上的原始metA基因缺失，其中在FTR2533(KCCM10541)菌株中，metB和thrB基因被缺失。通过FRT-一步-PCR缺失方法使metA基因缺失。
通过PCR使用SEQIDNO:5和6的引物，以及pKD3载体(PNAS(2000)vol97:P6640-6645)作为模板构建metA缺失盒。PCR在下列条件下进行30个循环：在94℃下变性30s、在55℃下退火30s和在72℃下延伸1min。
<SEQIDNO:5>
caatttcttgcgtgaagaaaacgtctttgtgatgacaacttctcgtgcgtgtgtaggctggagctgcttc
<SEQIDNO:6>
aatccagcgttggattcatgtgccgtagatcgtatggcgtgatctggtagcatatgaatatcctccttag
得到的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中电泳，并且纯化从其获得的1.2kbpDNA带。回收的DNA片段电穿孔入CJMA2菌株，其已经转化有pKD46。将回收的菌株平板接种在含有氯霉素的LB平板培养基上，37℃下培养过夜，并且选择对氯霉素显示抗性的菌株。
选择的菌株使用SEQIDNO:5和6的引物在相同的条件下经历PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在1.1kb的基因带确认metA基因的缺失。如此确认的菌株又转化有pCP20载体并且在LB培养基中培养，并且具有100bp的减小大小的thrB基因缺失的最终菌株——其在1.0％琼脂糖凝胶中确认——通过在相同的条件下进行PCR构建，并且确认了氯霉素标记从菌株中去除。如此构建的菌株命名为“CJM2”。
CJM2菌株可以在菌株中积聚过量的高丝氨酸，并且可以根据被引入的质粒的metX底物特异性生产O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸。
实施例2：选择具有新型O-琥珀酰转移酶活性的多肽
为了确保metA基因的反馈控制的解除和稳定性，在KEGG网站(//www.genome.jp/kegg/)中选择命名为metX的10种类型的直向同源物，并且将其克隆入pCL1920_PCJ1载体。将实施例1中制备的CJM2菌株转化有10种不同类型的载体。
如此获得的10种不同种类的菌株经历使用在下面的实施例5-(2)中描述的烧瓶培养方法的烧瓶评价。CJM2是可以积聚高丝氨酸的菌株。当将高丝氨酸琥珀酰转移酶基因引入pCL1920时，O-琥珀酰高丝氨酸可以作为终产物获得，然而当将高丝氨酸乙酰转移酶基因引入pCL1920时，O-乙酰高丝氨酸可以作为终产物获得。就这一点而言，基因——其为编码高丝氨酸琥珀酰转移酶的metX基因——在已经评价的10种不同类型中获得。基因是青紫色素杆菌源的metX基因，其具有以高产量生产O-琥珀酰高丝氨酸的特性(SEQIDNO:29的氨基酸序列，和SEQIDNO:36的核苷酸序列)，并且本发明人已经确认上述活性是先前从未报道过的新型活性。
实施例3：质粒构建
3-1.表达源自野生型大肠杆菌的metA基因的质粒的构建
使用购自美国菌种保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC)的大肠杆菌W3110(登录号：ATCC9637)的染色体作为模板，连同SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的引物进行PCR，以扩增编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因。
PCR中使用的引物是基于在美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)的GenBank(NIHGenBank)中登记的大肠杆菌染色体(NC_000913)的核苷酸序列制备的，并且SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的引物分别具有EcoRV限制酶切位点和HindIII限制酶切位点。
<SEQIDNO:7>
5’AATTGATATCATGCCGATTCGTGTGCCGG3’
<SEQIDNO:8>
5’AATTAAGCTTTTAATCCAGCGTTGGATTCATGTG3’
PCR通过在94℃下变性3min；在94℃下变性30s、在56℃下退火30s和在68℃下聚合2min，30个循环；和在68℃下聚合10min进行。
在分别使用EcoRV和HindIII处理后，克隆包含如此获得的PCR产物和CJ1启动子(韩国专利号0620092)的pCL1920质粒。使用克隆的质粒转化大肠杆菌DH5α，并且通过从含有壮观霉素(50μg/mL)的LB平板选择转化的大肠杆菌DH5α来获得质粒。如此获得的质粒命名为pCL_Pcj1_metA(wt)。
3-2.表达具有反馈抗性的metA基因的质粒的构建
基于作为模板的在实施例3-1中制备的pCL_Pcj1_metA(wt)，使用定点诱变试剂盒(Stratagene,USA)构建对甲硫氨酸具有反馈抗性的metA基因(metA#11)。
具体而言，根据国际专利公布号WO2008/127240中的公开内容，使用SEQIDNO:9和SEQIDNO:10的引物，将第29位氨基酸——丝氨酸——替换为脯氨酸(S29P)；使用SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的引物，将第114位氨基酸——谷氨酸——替换为甘氨酸(E114G)；并且使用SEQIDNO:13和SEQIDNO:14的引物，将第140位氨基酸——苯丙氨酸——替换为丝氨酸(F140S)。使用的引物的核苷酸序列如下显示。
<SEQIDNO:9>
5’ATGACAACTTCTCGTGCGCCTGGTCAGGAAATTCG3’
<SEQIDNO:10>
5’CGAATTTCCTGACCAGGCGCACGAGAAGTTGTCAT3’
<SEQIDNO:11>
5’CGCCGCTGGGCCTGGTGGGGTTTAATGATGTCGCT3’
<SEQIDNO:12>
5’AGCGACATCATTAAACCCCACCAGGCCCAGCGGCG3’
<SEQIDNO:13>
5’CACGTCACCTCGACGCTGAGTGTCTGCTGGGCGGT3’
<SEQIDNO:14>
5’ACCGCCCAGCAGACACTCAGCGTCGAGGTGACGTG3’
包含metA(#11)基因的质粒——其通过连续引入而引入有全部三个种类的修饰——被构建并且命名为pCL_Pcj1_metA#11。
3-3.表达源自耐辐射球菌(Deinococcusradiodurans)的metX基因的质粒的构建
使用购自美国菌种保藏中心(ATCC)的耐辐射球菌(登录号：ATCCBAA-816D)的染色体作为模板，连同SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的引物进行PCR，以扩增编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的metX基因。
PCR中使用的引物是基于在美国国立卫生研究院的GenBank(NIHGenBank)中登记的染色体(AE000513)的核苷酸序列制备的，并且SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的引物分别具有EcoRV限制酶切位点和HindIII限制酶切位点。
<SEQIDNO:15>
5’AATTGATATCATGACCGCCGTGCTCGC3’
<SEQIDNO:16>
5’AATTAAGCTTTCAACTCCTGAGAAACGCCCC3’
PCR通过在94℃下变性3min；在94℃下变性30s、在56℃下退火30s和在68℃下聚合5min，30个循环；和在68℃下聚合7min进行。
在分别使用EcoRV和HindIII处理后，克隆包含如此获得的PCR产物和CJ1启动子(韩国专利号0620092)的pCL1920质粒。使用克隆的质粒转化大肠杆菌DH5α，并且通过从含有壮观霉素(50μg/mL)的LB平板选择转化的大肠杆菌DH5α来获得质粒。如此获得的质粒命名为pCL_Pcj1_drametX。
3-4.表达源自青紫色素杆菌的metX基因的质粒的构建
使用购自美国菌种保藏中心(ATCC)的青紫色素杆菌(登录号：ATCC12472)的染色体作为模板，连同SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的引物进行PCR，以扩增源自青紫色素杆菌的metX基因。
PCR中使用的引物是基于在美国国立卫生研究院的GenBank(NIHGenBank)中登记的青紫色素杆菌染色体(NC_005085)的核苷酸序列制备的，并且SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的引物分别具有EcoRV限制酶切位点和HindIII限制酶切位点。
<SEQIDNO:17>
5’aattgatatcATGACCGACACCAACTGTTCGG3’
<SEQIDNO:18>
5’aattaagcttTCATGCGTTCACCTCCTTGGC3’
PCR通过在94℃下变性3min；在94℃下变性30s、在56℃下退火30s和在68℃下聚合2min，30个循环；和在68℃下聚合10min进行。
在分别使用EcoRV和HindIII处理后，克隆包含如此获得的PCR产物和CJ1启动子(韩国专利号0620092)的pCL1920质粒。使用克隆的质粒转化大肠杆菌DH5α，并且通过从含有壮观霉素(50μg/mL)的LB平板选择转化的大肠杆菌DH5α来获得质粒。如此获得的质粒命名为pCL_Pcj1_cvimetX。
3-5.构建用于增强生物合成基因的2拷贝菌株的载体
(1)用于ppc插入的pSG76c载体的构建
在本实施例中，构建了pSG76c-2ppc，其是用于插入包含编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因的大肠杆菌染色体DNA的载体。
ppc基因的核苷酸序列信息是基于NIHGenBank数据库(NCBI登记号gi:89110074)获得的，并且基于该信息合成引物(SEQIDNO:19和SEQIDNO:20)——其包括从ppc基因的位置-200的ppcORF，以及EcoRI-和SacI限制酶切位点——和引物(SEQIDNO:21和SEQIDNO:22)——其包括SacI和KpnI限制酶切位点。
<SEQIDNO:19>
5’gccggaattctgtcggatgcgatacttgcgc3’
<SEQIDNO:20>
5’gaaggagctcagaaaaccctcgcgcaaaag3’
<SEQIDNO:21>
5’gccggagctctgtcggatgcgatacttgcgc3’
<SEQIDNO:22>
5’gaagggtaccagaaaaccctcgcgcaaaag3’
使用大肠杆菌W3110的染色体作为模板，连同SEQIDNO:19与20和SEQIDNO:21与22的引物进行PCR。PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)被用作聚合酶，并且通过在94℃下变性3min；在94℃下变性30s、在56℃下退火30s和在68℃下聚合5min，30个循环；和在68℃下聚合7min进行PCR。结果，获得了包含EcoRI-与SacI限制酶切位点和SacI-与KpnI限制酶切位点的具有大约3.1kb大小的扩增的ppc基因。
在使用EcoRI和SacI，以及SacI和KpnI处理通过PCR获得的ppc基因的末端后，将得到的ppc基因连接至pSG76c载体(JBacteriol.1997Jul；179(13):4426-8)，该载体已经使用EcoRI和KpnI处理，并且最终构建了将ppc基因的两个拷贝克隆入其中的pSG76c-2ppc重组载体。
(2)用于aspC插入的pSG76c载体的构建
在本实施例中，构建了pSG76c-2aspC，其是用于插入包含编码天冬氨酸转氨酶的aspC基因的大肠杆菌染色体DNA的载体。
aspC基因的核苷酸序列信息是基于NIHGenBank数据库(NCBI登记号gi:85674274)获得的，并且基于该信息合成引物(SEQIDNO:23和SEQIDNO:24)——其包括从aspC基因的位置-200的aspCORF和SacI限制酶切位点。
<SEQIDNO:23>
5’tccgagctcataagcgtagcgcatcaggca3’
<SEQIDNO:24>
5’tccgagctcgtccacctatgttgactacat3’
使用大肠杆菌W3110的染色体作为模板，连同SEQIDNO:23和24的寡核苷酸的引物进行PCR。PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)被用作聚合酶，并且通过在94℃下变性3min；在94℃下变性30s、在56℃下退火30s和在68℃下聚合2min，30个循环；和在68℃下聚合7min进行PCR。结果，获得了包含BamHI限制酶切位点的具有大约1.5kb大小的扩增的aspC基因。
在使用BamHI处理通过PCR获得的aspC基因的末端后，将得到的aspC基因连接至pSG76c载体(JBacteriol.1997Jul；179(13):4426-8)，该载体已经使用BamHI处理，并且最终构建了将aspC基因的两个拷贝克隆入其中的pSG76c-2aspC重组载体。
(3)用于asd插入的pSG76c载体的构建
在本实施例中，构建了pSG76c-2asd，其是用于插入包含编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的asd基因的大肠杆菌染色体DNA的载体。
asd基因的核苷酸序列信息是基于NIHGenBank数据库(NCBI登记号gi:89110578)获得的，并且基于该信息合成引物(SEQIDNO:25和SEQIDNO:26)——其包括从asd基因的位置-200的asdORF，以及EcoRI和XbaI限制酶切位点——和引物(SEQIDNO:27和SEQIDNO:28)——其包括XbaI-和EcoRI限制酶切位点。
<SEQIDNO:25>
5’ccggaattcccaggagagcaataagca3’
<SEQIDNO:26>
5’ctagtctagatgctctatttaactcccg3’
<SEQIDNO:27>
5’ctagtctagaccaggagagcaataagca3’
<SEQIDNO:28>
5’ccggaattctgctctatttaactcccg3’
使用大肠杆菌W3110的染色体作为模板，连同SEQIDNO:25与26和SEQIDNO:27与28的寡核苷酸的引物进行PCR。PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)被用作聚合酶，并且PCR进行30个由在96℃下变性30s、在50℃下退火30s和在68℃下聚合2min组成的循环。结果，获得了包含EcoRI-与XbaI限制酶切位点和XbaI-与EcoRI限制酶切位点的具有大约1.5kb大小的扩增的asd基因。
在使用EcoRI和XbaI处理通过PCR获得的asd基因的末端后，将得到的asd基因连接至pSG76c载体，该载体已经使用EcoRI处理，并且最终构建了将asd基因的两个拷贝克隆入其中的pSG76c-2asd重组载体。
实施例4：基于野生型的亲株的构建
(1)ppc、aspC和asd基因的增强
购自美国菌种保藏中心(ATCC)的大肠杆菌W3110(登录号：ATCC9637)转化有在实施例3-5中制备的pSG76c-2ppc、pSG76c-2aspC、pSG76c-2asd载体，将其平板接种在LB-Cm(10g/L的酵母提取物、5g/L的NaCl、10g/L的胰胨、25μg/L的氯霉素和15g/L的琼脂)平板培养基上，并且选择对氯霉素显示抗性的菌落。选择的转化体是其中pSG76c-2ppc载体首先插入基因组的ppc部分的菌株。
如此获得的菌株——其中插入了ppc基因的2个拷贝——转化有表达I-SceI的pST76-AsceP载体，该I-SceI是消化在pSG76c载体中存在的I-SceI部分的限制酶，并且将其平板接种在LB-Ap(10g/L的酵母提取物、5g/L的NaCl、10g/L的胰胨、100μg/L的氨苄青霉素和15g/L的琼脂)平板培养基上，并且选择在30℃下生长的菌株。
如此生长的菌株可以处于以下状态：其中ppc基因被扩增以具有2个拷贝或可以恢复以具有单拷贝。在使用SEQIDNO:30和SEQIDNO:31的引物进行PCR后，在1％琼脂糖凝胶电泳中选择具有6.5kb的增大的基因大小的具有ppc基因的2个拷贝的菌株。作为上述过程的结果，移除pSG76c载体的同时，ppc基因变得进一步插入。
根据上面描述的方法，使用pSG76c-2aspC和pSG76c-2asd载体连续地构建具有ppc、asd和aspC基因的扩增拷贝的W3110菌株。在该过程期间，具有aspC基因的2个拷贝的菌株构建是在使用SEQIDNO:32和SEQIDNO:33的引物进行PCR后，通过在1％琼脂糖凝胶电泳中鉴定具有3.2kb的增大的大小的基因来确认的，而具有asd基因的2个拷贝的菌株构建是在使用SEQIDNO:34和SEQIDNO:35的引物进行PCR后，通过在1％琼脂糖凝胶电泳中鉴定具有3.2kb的增大的大小的基因来确认的。如此构建的菌株命名为CJW2。
<SEQIDNO:30>
CTGGCTCAATTAATCAGGCTC
<SEQIDNO:31>
CGAGGGTGTTAGAACAGAAGT
<SEQIDNO:32>
TGGTGAACTACTTTGAAGTGG
<SEQIDNO:33>
TGCGGCACGAGCGCCTTATCC
<SEQIDNO:34>
GCTCGTAGGCTAAGAAATGCC
<SEQIDNO:35>
CAGGTAAGGCTGTGAATACTC
(2)metB、thrB和metA基因的缺失
使用CJW2菌株以与实施例3-1相同的方式构建具有metB、thrB和metA基因缺失的菌株，并且该菌株命名为CJW2H。CJW2H菌株是可以在菌株内过度地积聚高丝氨酸并且生产O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸——取决于正引入的质粒的metX底物特异性——的菌株。
实施例5：实验菌株的构建
(1)菌株的构建
分别在实施例1-(3)和4-(2)中构建的大肠杆菌菌株CJM2和CJW2H被制备为感受态细胞，并且经由电穿孔分别引入有在实施例3-1、3-2、3-3和3-4中构建的四种不同种类的质粒：pCL_Pcj1_metA(wt)、pCL_Pcj1_metA#11、pCL_Pcj1_drametX和pCL_Pcj1_cvimetX。
(2)烧瓶培养实验
然后，进行烧瓶测试以比较甲硫氨酸前体的种类和由每个菌株——其分别引入有四个种类的质粒——生产的产量。烧瓶测试进行如下：每个菌株划线接种在LB平板上，在31℃培养箱中培养16小时，并且将单菌落接种入3mL的LB培养基中，并且以200rpm的速率在31℃培养箱中培养16小时。
向250mL烧瓶添加25mL的表1中显示的产甲硫氨酸前体的培养基，并且然后分别添加有500μL每种先前制备的培养液。然后，烧瓶以200rpm的速率在31℃培养箱中培育40小时，并且比较在引入有每种质粒的每种菌株中获得的甲硫氨酸前体的种类和量。结果显示在下面的表2和3中。
[表1]
组成 浓度(每升)
葡萄糖 70g
硫酸铵 25g
KH2PO4 1g
MgSO4·7H2O 0.5g
FeSO4·7H2O 5mg
MnSO4·8H2O 5mg
ZnSO4 5mg
碳酸钙 30g
酵母提取物 2g
甲硫氨酸 0.3g
苏氨酸 1.5g
[表2]
[表3]
结果，根据表2和3，确认CJM2pCL_Pcj1_metA(wt)、CJM2pCL_Pcj1_metA#11、CJW2HpCL_Pcj1_metA(wt)和CJW2HpCL_Pcj1_metA#11菌株——其分别地包含大肠杆菌野生型metA基因和metA#11基因，这两种基因具有反馈抗性——生产O-琥珀酰高丝氨酸，然而CJM2pCL_Pcj1_drametX和CJW2HpCL_Pcj1_drametX菌株——其分别地包含源自耐辐射球菌的metX基因——生产O-乙酰高丝氨酸。
在源自青紫色素杆菌的metX基因的情况中，该基因与metA基因相比具有与其它metX同源基因(直向同源物)高的同源性。然而，关于底物特异性，与一般报道的metX基因不同，该基因是生产琥珀酰高丝氨酸的高丝氨酸琥珀酰转移酶。
另外，在当引入大肠杆菌野生型metA(wt)基因的情况中，由于以0.3g/L的浓度添加至培养基的甲硫氨酸的反馈抑制的现象，O-琥珀酰高丝氨酸产生大约1g/L，然而，在当引入源自青紫色素杆菌的metX基因的情况中，甚至利用野生型自身而没有任何引入的基因修饰，O-琥珀酰高丝氨酸产生，而没有添加至培养基的甲硫氨酸的反馈抑制的现象。
引入有pCL_Pcj1_cvimetX(CJM2pCL_Pcj1_cvimetX)的CJM2菌株在2013年6月20日以登录号KCCM11433P保藏于由布达佩斯条约认可为国际保藏机构的韩国微生物保藏中心(KCCM)，所述韩国微生物保藏中心位于韩国首尔的361-221,Hongje-1-dong,Seodaemun-gu，其是韩国培养物保藏协会(KoreanFederationofCultureCollection)(KFCC)的子公司。
(3)大型发酵罐培养实验
为了大规模生产O-琥珀酰高丝氨酸——甲硫氨酸前体，使用CJM2pCL_Pcj1_cvimetX和CJW2HpCL_Pcj1_cvimetX菌株，在5L发酵罐中进行培养。
将含有壮观霉素抗生素的LB平板培养基接种有CJM2pCL_Pcj1_cvimetX和CJW2HpCL_Pcj1_cvimetX菌株，并且在31℃下培养过夜。然后，将单菌落接种入含有壮观霉素的10mLLB培养基中，在31℃下培养5小时，并且将2mL的培养物再接种入含有200mL的种子培养基(seedmedium)的1000mL三角瓶中。随后，生成物以200rpm的速率在31℃培养箱中培养3小时至10小时，并且将255mL的种子培养物接种入5L发酵罐的1.7L的主要培养基中以通过补料分批方法消耗1.3L的种子培养基，并且培养50小时至100小时。
培养基组分的细节显示在下面的表4中。经由HPLC分析如此培养的发酵液的浓度以及结果显示在下面的表5中。
[表4]
[表5]
如上面的表5中所示，确认CJM2pCL_Pcj1_cvimetX菌株——其中基于产苏氨酸的菌株作为亲株引入源自青紫色素杆菌的metX基因——以高水平积聚O-琥珀酰高丝氨酸。
本领域普通技术人员将认识到，本发明可以以其它具体的形式体现而不背离其精神或基本特征。描述的实施方式在所有方面都仅被视为说明性的而非限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求书而不是由上面的说明书指示。在权利要求书的等价意义和范围内的所有变化都包括在本发明的范围内。

Claims (8)

1.一种分离的多肽，其对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性，其中所述多肽具有由SEQIDNO:29表示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的多肽的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有由SEQIDNO:36表示的核苷酸序列。
3.产O-琥珀酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属某种微生物，其表达对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的多肽，其中所述多肽具有由SEQIDNO:29表示的氨基酸序列。
4.权利要求3所述的埃希氏杆菌属某种微生物，其中所述埃希氏杆菌属某种微生物是大肠杆菌。
5.权利要求3所述的埃希氏杆菌属某种微生物，其中编码胱硫醚γ合成酶的metB基因被进一步缺失或减弱。
6.权利要求3所述的埃希氏杆菌属某种微生物，其中编码高丝氨酸激酶的thrB基因或编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因被进一步缺失或减弱。
7.权利要求3所述的埃希氏杆菌属某种微生物，其中磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶和天冬氨酸-半醛脱氢酶被进一步增强。
8.生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法，包括：
(a)在培养基中培养权利要求3-7中任一项所述的微生物；和
(b)从所述微生物或所述培养基中获得O-琥珀酰高丝氨酸。
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