CN105555305A - 用于生产膜抗原的一般化模块的突变体细菌 - Google Patents

Abstract

通过灭活至少一种含有LytM？催化结构域的蛋白，诸如无法分类的流感嗜血杆菌的NT013、NT017和NT022，制备革兰氏阴性细菌菌株。得自这些菌株的小泡可用于疫苗接种。

Description

用于生产膜抗原的一般化模块的突变体细菌

本申请要求PCT 申请 PCT/EP2013/058459 (于2013年4月24日提交)的权益，它们二者的整个内容为所有目的在此通过引用并入本文。

技术领域

本发明属于得自革兰氏阴性细菌的小泡的领域，所述小泡具体地用在免疫原性组合物（例如疫苗）中使用。

背景技术

由于细胞被膜的膨胀（turgour）压力，革兰氏阴性细菌可以在生长过程中从它们的外膜自发地释放小泡。这样的小泡的形成可以通过某些细菌组分的破坏而促进，例如参考文献1和2 破坏大肠杆菌（E.coli）Tol-Pal系统以提供在生长过程中向培养基中释放小泡的菌株。小泡还可以通过完整细菌的破坏而产生。已知的小泡生产方法包括使用去污剂处理(例如用脱氧胆酸盐)的方法[3 和 4]、无去污剂方法[5]或超声处理 [6]等。

这些小泡(其通常可以被称作疱（bleb）和外膜小泡(OMV)) 富含在免疫原性的细胞表面结合的抗原、周质抗原和分泌抗原中，且已经被用作疫苗，例如针对脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis）血清群 B [7]。它们特别适合用于该用途，因为所述小泡含有充当佐剂的化合物，从而引起针对抗原的强免疫应答。这样，与纯化的抗原蛋白或其它细菌组分相比，所述小泡对于免疫系统而言是天然细菌的更接近的模仿物。但是，由于所述小泡衍生自细菌，它们通常需要处理以除去反应原性细菌组分如内毒素。这可以通过去污剂处理等实现[8]。

本发明的一个目的是，提供另外的和改善的组分，其用于制备这些小泡，且尤其是可以用作疫苗的小泡。本发明的一个具体目的是，提供适合用于生产所述小泡的革兰氏阴性细菌。例如，所述细菌可以适合提供高小泡收率、具有改变的蛋白含量和/或组合物的小泡、以及具有改善的交叉保护效力的小泡。

具体地，关于流感嗜血杆菌（Haemophilus influenza），仍然需要提供保护免于广谱流感嗜血杆菌菌株的疫苗。流感嗜血杆菌是一种易变的微生物，其具有提高的适合新小生境（niche）和造成广谱疾病的能力。适合性、毒力和定居因子可以变化，以便允许所述微生物适合不同的组织和宿主。因此，潜在抗原易受高选择压力，且所以可能在不同菌株之间具有序列变异性。

本发明公开内容

革兰氏阴性细菌与外部介质由两个连续的膜结构层隔开。这些结构（被称作细胞质膜和外膜 (OM)），其在结构上和在功能上存在差异。外膜在病原性细菌与它们各自的宿主的相互作用中起重要作用。结果，表面暴露的细菌分子代表宿主免疫应答的重要靶标，从而使得外膜组分在提供疫苗、诊断和治疗剂中成为有吸引力的候选物。

本发明描述了，编码共同具有LytM 催化结构域的多肽的一个或多个基因的突变或缺失会导致细菌细胞分裂和细菌表型的剧烈变化。发明人还已经证实，所述突变或缺失会导致小泡（被称作OMV或外膜小泡）的释放，而相同的野生型 NTHi菌株通常不会释放OMV。

发明人已经制备了革兰氏阴性细菌，其中含有LytM 催化结构域的蛋白的正常表达被破坏(即所述蛋白被灭活)，且已经观察到，这些细菌具有在小泡的制备中可以有利的性能。这些性能包括增加的形成小泡和存在于得到的小泡中的蛋白的性质和/或量的变化的趋势。已知在大肠杆菌中含有LytM 结构域的分裂机制的2个组分(EnvC和NlpD) 是负责细胞分离的细胞壁水解酶(酰胺酶) (AmiA、AmiB和AmiC)的直接调节剂[9]。还已知的是，大肠杆菌中的LytM 金属蛋白酶是子代细胞分离所绝对需要的。

在一个特别优选的实施方案中，描述了通过缺失NT013和/或NT022 不仅会影响细菌细胞分裂，而且还存在外膜小泡(OMV)在通常不会释放OMV的NTHI菌株中的惊人产生和释放。

具体地，已经在无法分类的（non-typeable）流感嗜血杆菌(NTHi)中证实，NT013的缺失会造成小泡释放的增加以及得到的小泡的蛋白含量和/或组合物的变化，例如当与没有缺失的NHTi 相比时，如在下面更详细地证实的。

NT017在NTHi 中的缺失会造成得到的小泡的蛋白含量和/或组合物的变化，例如当与没有缺失的NHTi 相比时，如在下面更详细地证实的。

NT022在NTHi 中的缺失会造成小泡释放的增加，以及得到的小泡的蛋白含量和/或组合物的变化，例如当与没有缺失的NHTi 相比时，如在下面更详细地证实的。

突变细菌的生长速率可以与野生型生长速率相当，不同于已知的TolR 突变体的生长速率。

因此，本发明提供了其中至少一种含有LytM催化结构域的蛋白被灭活的革兰氏阴性细菌和从所述细菌制备小泡的方法。本发明还提供了从该细菌得到的或可得到的小泡以及包含这些小泡的免疫原性组合物。所述免疫原性组合物具体地可以用作疫苗。

因而，本发明提供了一种革兰氏阴性细菌，其中至少一种含有LytM 催化结构域的蛋白被灭活。在一个实施方案中，这样产生的细菌：其与其中含有LytM 催化结构域的蛋白有活性的相同细菌相比，在培养基中生长的过程中向培养基中释放更大量的小泡和/或具有不同的蛋白组合物的小泡。任选地，不表达至少一种含有LytM 催化结构域的蛋白。

本发明还提供了一种革兰氏阴性细菌，其中一种或多种含有LytM 催化结构域的蛋白具有修饰，使得在培养基中生长的过程中，所述细菌与缺少所述修饰的相同细菌相比向培养基中释放更大量的小泡和/或具有与缺少所述修饰的相同细菌不同的蛋白含量和/或组合物的小泡。

具体地，本发明还提供了一种NTHi细菌，其中一种或多种本发明的抗原(例如NT013、NT017和NT022)已经被敲除[10]。用于生产敲除的细菌的技术是已知的，并且已经报道了从NTHi菌株敲除基因，即在参考文献11中。

本发明还提供了一种NTHI 细菌，其中一种或多种本发明的抗原(例如NT013、NT017和NT022) 具有抑制其活性的突变。编码所述抗原的基因将具有改变编码的氨基酸序列或消除其表达的突变。突变可能涉及缺失、置换和/或插入其中任何可能涉及的一个或多个氨基酸。

一个实施方案提供了编码本发明的抗原(例如NT013、NT017和NT022)的一个或多个基因的缺失。

在一个实施方案中，本发明提供了编码具有LytM 催化结构域的多肽的NTHI 基因。一般而言，将金属蛋白酶鉴别为在它们的催化结构域中含有HxH和HxxxD 氨基酸结构域。优选地，这一个或多个基因编码NT013、NT022或NT017中的任一个。

优选的实施方案提供了这样的NTHI菌株：其中缺失编码NT013或NT022或NT017中的任一个的一个或多个基因。例如，缺失的基因可以被抗生素抗性盒（诸如红霉素抗性盒）置换。已经发现，所有上述多肽共同具有LytM 催化结构域，且都是金属蛋白酶。

还已经发现，NT013和NT022中的LytM 结构域是保守的。NT013 催化活性部位由在C-端部分处的下述氨基酸基序-HKGD-和-HLH-代表。NT022 催化活性部位由在 C-端处的下述氨基酸基序-NKGID-和-KLH-代表。

本发明还提供了一种制备革兰氏阴性细菌的方法，其包括以下步骤：修饰编码一种或多种含有LytM 催化结构域的蛋白的基因，使得所述修饰造成所述细菌当在培养基中生长时向培养基中释放比起始细菌更大量的小泡和/或具有与起始细菌不同的蛋白含量和/或组合物的小泡。所述突变步骤可以灭活(例如突变或删除)所述基因。

对于制备包括NTHi 抗原(例如本发明的抗原(例如NT013、NT017和NT022))且可以用作免疫原的细菌外膜小泡而言，本发明的突变体细菌是特别有用的。

还提供了一种用于生产本发明的过度产生OMV的NTHi 细菌的方法，所述方法包括通过一个或多个下述过程遗传修饰革兰氏阴性细菌菌株：(a) 工程改造所述菌株以下调一个或多个Tol 基因的表达 ；和 (b) 突变一个或多个编码包含肽聚糖相关位点的蛋白的基因以减弱所述蛋白的肽聚糖结合活性；(c) 突变或缺失一个或多个编码共同具有LytM 催化结构域的多肽的基因。在一个特别优选的实施方案中，NTHi 可能不表达有活性的NT013、NT022 基因和/或Tol 基因[11]、[10]中的任一个。在一个实施方案中，所述修饰是一个或多个编码共同具有LytM 催化结构域的多肽的基因的突变或缺失。

本发明还提供了从本发明的细菌分离的或可分离的小泡，例如使用本文中提及的任何方法。这些小泡可用作疫苗的组分。

本发明还提供了一种用于制备革兰氏阴性细菌（例如NTHi 小泡）的方法，所述方法包括以下步骤：处理本发明的革兰氏阴性细菌（例如NTHi 细菌），使得它的外膜形成小泡。

本发明还提供了一种用于制备革兰氏阴性细菌（例如NTHi 小泡）的方法，所述方法包括以下步骤：在使得它的外膜自发地脱落小泡的条件下培养本发明的革兰氏阴性细菌（例如NTHi 细菌）。

本发明还提供了一种用于制备小泡的方法，所述方法包括以下步骤：将小泡与包含本发明的细菌的培养基分离，所述细菌已经在允许所述细菌向培养基中释放小泡的条件下生长。通过该方法制备的小泡可以用作药物组合物（包括疫苗）的组分。

本发明还提供了包含本发明的细菌的培养基，所述细菌已经在允许所述细菌向培养基中释放小泡的条件下生长。可以从该培养基纯化小泡。

本发明还提供了包含小泡的组合物，所述小泡在培养本发明的细菌的过程中释放进培养基中。该组合物不包含任何活的和/或完整的细菌。该组合物和/或它的组分可以用于疫苗制备。

包含本发明的小泡的药物组合物可以用在医学中，例如用在治疗或预防感染的方法中和用在提高抗体应答的方法中。

本发明还提供了包含小泡的组合物，其中所述小泡存在于滤液中，所述滤液可在穿过0.22µm过滤器过滤已经在其中培养本发明的细菌的培养基以后得到。该组合物和/或它的组分可以用于疫苗制备。

含有LytM 结构域的蛋白

根据本发明，在革兰氏阴性细菌中修饰一种或多种含有LytM 结构域的蛋白。通常，这是灭活(例如通过突变或缺失)。这可能造成所述细菌与其中含有LytM 催化结构域的蛋白有活性的相同细菌相比在培养基中生长的过程中释放(i) 更大量的小泡和/或(ii) 具有不同的蛋白含量和/或组合物的小泡。可以做出多种修饰。

溶葡萄球菌酶-型(LytM)肽酶的金属蛋白酶广泛分布，存在于细菌噬菌体中、革兰氏阳性细菌中和革兰氏阴性细菌中。含有催化性LytM 结构域的金属蛋白酶属于M23 肽酶家族 [12]，该结构域首次在得自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的分泌的自溶素中鉴别[13]。

基于与已知的含有LytM 结构域的蛋白（诸如大肠杆菌的EnvC、NlpD和YebA，无荚膜的(无法分类的) 流感嗜血杆菌的NT013、NT017或NT022）的LytM 结构域的序列同一性，通常可以鉴别LytM 结构域并由此鉴别含有LytM 结构域的蛋白。

LytM 结构域因而通常与本文中提及的任意LytM 结构域的序列具有至少30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性。含有LytM 结构域的蛋白含有LytM 结构域。下面提供了LytM 结构域和含有LytM 结构域的蛋白的示例性序列。

抗原 NT013被注解为含有TPR重复的蛋白，且也被注解为 细胞色素 c 成熟血红素 裂合酶亚基CcmH2。它已经在菌株 86-028NP中作为NTHI0532释放。NT013 已经被注解为属于金属蛋白酶蛋白家族，且它具有LytM 催化结构域。

NT013 抗原具有天然的42 个N-端氨基酸序列 (SEQ ID NO: 1的氨基酸1-42)。SEQ ID NO:85代表不具有天然的42 个N-端氨基酸序列的NT013 抗原。

抗原 NT017已经被注解为 86-026NP菌株中的存活蛋白SurA-样蛋白NTHI0915。

NT017 抗原具有天然的20个N-端氨基酸序列 (SEQ ID NO: 3的氨基酸1-20)。SEQID NO:86代表不具有天然的42 个N-端氨基酸序列的NT017 抗原。

抗原 NT022 已经被注解为得自菌株 NP86-028的NTHI0830，且被鉴别为可能的外膜抗原性脂蛋白B。它已经从Fi176菌株克隆和表达。还已经发现它含有LytM 催化结构域并且是表面暴露和分泌的。

NT022 抗原具有天然的18 个N-端氨基酸序列 (SEQ ID NO: 5的氨基酸1-18)。SEQ ID NO:87代表不具有天然的18个N-端氨基酸序列的NT022 抗原。

在不同的革兰氏阴性细菌中发现了含有LytM 结构域的蛋白的同系物，且例子在下表中阐明:

LytM 结构域可以含有基序 HxxxD (SEQ ID NO:13)和/或HxH，例如HKGVD (SEQID NO: 14)、HRGVD (SEQ ID NO: 15)、HTGID (SEQ ID NO: 16)、HLH。其它具体基序包括NKGVD (SEQ ID NO: 17)、TKGID (SEQ ID NO: 18)、NKGID (SEQ ID NO: 19)、QLH、RLH、KLH、WKGVF (SEQ ID NO: 20)、WRGLV (SEQ ID NO: 21)、WKGMV (SEQ ID NO: 22)、GLY、SLY、ALY。

NTHi 抗原（即蛋白）在上面通过参考得自文献的命名惯例来定义，例如“NTHI” 编号(得自菌株 86-028NP的基因组)。在参考文献 14 (特别是表1)中更详细地解释了这样的惯例。因而，在指定菌株的公开序列数据库中可以容易地找到在本文中提及的任意抗原（即蛋白）的示例性氨基酸和核苷酸序列 (连同另外的信息，诸如功能注解)，但是本发明不限于得自86-028NP菌株的序列。几种其它NTHI菌株的基因组序列是可得到的(再次，参见参考文献14的表1)。标准检索和比对技术可以用于在这些(或其它)另外的基因组序列中的任一个中鉴别本文给出的任何特定序列的同系物。此外，可得到的序列可以用于设计引物，所述引物用于从其它物种和菌株扩增同源序列。因而，本发明不限于这些特定物种和菌株或其中存在示例序列的菌株，而是包括得自其它革兰氏阴性菌株（例如NTHI菌株）的这样的变体和同系物，以及其中存在这样的变体和同系物以及非天然变体的物种和菌株的用途。一般而言，特别的SEQ ID NO的合适变体包括它的等位基因变体、它的多晶型形式、它的同系物、它的直系同源物、它的旁系同源物、它的突变体等。在本发明的实施方案中，含有LytM结构域的蛋白是NTHi的NT013、NT022或NT017的同系物、直系同源物或旁系同源物。

因而，例如，与本文中的SEQ ID NO 相比，与本发明一起使用（即在形成本发明的过程中经过修饰）的多肽或蛋白可以包括一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)氨基酸置换，诸如保守置换(即用另一个具有有关侧链的氨基酸置换一个氨基酸)。遗传编码的氨基酸通常分成4个家族：(1)酸性的，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性的，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同地归类为芳族氨基酸。一般而言，在这些家族内的单个氨基酸的置换对生物学活性不具有重大影响。相对于SEQID NO序列，所述多肽（即蛋白）还可以包括一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)单个氨基酸缺失。相对于SEQ ID NO序列，所述多肽还可以包括一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)插入(例如1、2、3、4或5个氨基酸中的每一种)。

类似地，与本发明一起使用的多肽（即在形成本发明的过程中经过修饰）可以包含这样的氨基酸序列，其：

(a) 与在序列表中公开的序列相同(即100%同一性)；

(b) 与在序列表中公开的序列具有序列同一性 (例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多)；

(c) 与(a)或(b)的序列相比，具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个(或更多个)单个氨基酸改变(缺失、插入、置换)，所述改变可以是在分开的位置，或者可以是连续的；和/或

(d) 当用逐对比对算法与得自序列表的特别的序列比对时，从N-端向C-端的x个氨基酸的每个移动窗口(使得对于延伸到p个氨基酸的比对(其中p＞x)，存在p-x+1个这样的窗口)具有至少x·y个相同的比对氨基酸，其中：x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200；y选自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99；并且如果x·y不是整数，则四舍五入至最接近的整数。优选的逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法 [15]，其中使用缺省参数(如缺口开放罚分＝10.0，缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62评分矩阵)。用EMBOSS包中的needle工具会方便地实施这种算法 [16]。

在组(c)内，缺失或置换可以是在N-端和/或C-端，或者可以在两个末端之间。因此，截短是缺失的一个例子。截短可以涉及在N-端和/或C-端处缺失多达40个(或更多个)氨基酸。N-端截短可以除去前导肽例如以促进在异源宿主中的重组表达。C-端截短可以除去锚序列例如以促进在异源宿主中的重组表达。

一般而言，当抗原包含与得自序列表的序列（诸如NTHI序列）不同的序列时(例如当它包含与其具有<100%序列同一性的序列表时，或者当它包含其片段时)，在每种单独情况下优选的是，所述抗原可以引起识别得自序列表的各个NTHI序列的抗体。

在一些实施方案中，所述含有LytM的蛋白选自NTHi的NT013和NT022或其同系物、直系同源物或旁系同源物。

在一些实施方案中，所述含有LytM的蛋白是 NTHi的NT017或其同系物、直系同源物或旁系同源物。

细菌

本发明的革兰氏阴性细菌通常是无荚膜的(无法分类的) 流感嗜血杆菌菌株 (NTHi)。但是，它可以是不同的革兰氏阴性细菌，包括脑膜炎奈瑟氏球菌(特别是血清群 B)和百日咳鲍特氏菌（B. pertussis）。在一些实施方案中，本发明的革兰氏阴性细菌不是无荚膜的(无法分类的) 流感嗜血杆菌菌株。

用在本发明中的示例性物种包括在埃希氏菌属（Escherichia）、志贺氏菌属（Shigella）、奈瑟氏球菌属（ Neisseria）、莫拉菌属（ Moraxella）、博德特氏菌属（Bordetella）、疏螺旋体属（ Borrelia）、布鲁杆菌属（ Brucella）、衣原体属（ Chlamydia）、嗜血菌属（ Haemophilus）、军团菌属（ Legionella）、假单胞菌属（ Pseudomonas）、耶尔森氏菌属（ Yersinia）、螺杆菌属（ Helicobacter）、沙门氏菌属（ Salmonella）、弧菌属（Vibrio）、弯曲杆菌属（ Campylobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）等中的任何属中的种。具体地，所述细菌可以是志贺氏菌属种（诸如痢疾志贺氏菌（S.dysenteriae）、弗氏志贺氏菌（S.flexneri）、鲍氏志贺氏菌（ S.boydii）或索氏志贺氏菌（S.sonnei））。 可选地，它可以是奈瑟氏球菌属种，例如非病原性物种诸如N.bacilliformis、灰烬奈瑟氏球菌（N.cinerea）、长奈瑟氏球菌（N.elongata）、浅黄奈瑟氏球菌（N.flavescens）、乳糖奈瑟氏球菌（N.lactamica）、猕猴奈瑟氏球菌（N.macacae）、粘液奈瑟氏球菌（N.mucosa）、多糖奈瑟氏球菌（N.polysaccharea）、干燥奈瑟氏球菌（N.sicca ）或微黄奈瑟氏球菌（N.subflava），尤其是乳糖奈瑟氏球菌（N.lactamica）。可选地，可以使用奈瑟氏球菌属的病原性物种，例如淋病奈瑟氏球菌（N.gonorrhoeae）或脑膜炎奈瑟氏球菌（脑膜炎奈瑟氏球菌）。在其它实施例中，所述细菌可以是百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis）、布氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）、马尔他布鲁杆菌（ Brucella melitensis）、羊布鲁杆菌（Brucella ovis）、鹦鹉热衣原体（ Chlamydia psittaci）、砂眼衣原体（ Chlamydiatrachomatis）、粘膜炎莫拉菌（ Moraxella catarrhalis）、流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）（包括无法分类的菌株）、嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）、铜绿假单胞菌（ Pseudomonas aeruginosa）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（ Yersinia enterocolitica）、幽门螺杆菌（ Helicobacter pylori）、肠沙门氏菌（ Salmonella enterica）（包括斑疹伤寒（typhi）和鼠伤寒（typhimurium）血清变型 以及 副伤寒（paratyphi）和肠炎（enteritidis）血清变型）、霍乱弧菌、空肠弯曲杆菌、肺炎克雷伯氏菌、变形菌属（Proteus）（例如奇异变形菌）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、沙雷氏菌属（Serratia）（例如粘质沙雷氏菌）、欧文氏菌属（Erwinia）、巴斯德氏菌属（ Pasteurella）、鼠疫耶尔森氏菌（ Yersiniapesti）、大肠杆菌（ E. coli ）等。 还可以使用光合的革兰氏阴性细菌。通常，所述细菌是感受态菌株。该特征会促进所述细菌的遗传修饰。

基于它们的形状，可以将革兰氏阴性细菌定义为球菌、杆菌或球杆菌，所述细菌因而可以是革兰氏阴性的球菌、杆菌或球杆菌。

所述革兰氏阴性细菌任选地是变形杆菌，例如属于选自α变形杆菌、β变形杆菌、γ变形杆菌、δ变形杆菌、ε变形杆菌或Acidithiobacillia的类别。所述革兰氏阴性细菌任选地不属于选自α变形杆菌、β变形杆菌、γ变形杆菌、δ变形杆菌、ε变形杆菌或Acidithiobacillia的类别。

在一些实施方案中，所述细菌寄居于人类。在一些实施方案中，所述细菌在人类中是病原性的。

在一些实施方案中，所述细菌当在正常培养条件下培养时产生小泡。在其它实施方案中，所述细菌当在正常培养条件下培养时不产生小泡。

在一些实施方案中，所述细菌不属于柄杆菌属（Caulobacter），例如不是新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）。在一些实施方案中，所述细菌不属于埃希氏菌属，例如不是大肠杆菌。在一些实施方案中，所述细菌不属于螺杆菌属，例如不是幽门螺杆菌。在一些实施方案中，所述细菌不属于奈瑟氏球菌属，例如不是淋病奈瑟氏球菌或不是脑膜炎奈瑟氏球菌。在一些实施方案中，所述细菌不属于耶尔森氏菌属，例如不是鼠疫耶尔森氏菌。在一些实施方案中，所述细菌不属于耶尔森氏菌，例如不是鼠疫耶尔森氏菌。在一些实施方案中，所述细菌不是H somni。

在一些实施方案中，所述细菌是在类别 β变形杆菌 中，且所述含有LytM的蛋白选自NT013、NT017和NT022，任选地选自NTNi的NT017和NT022 或其同系物、直系同源物或旁系同源物。

在一些实施方案中，所述细菌是革兰氏阴性球杆菌，且所述含有LytM的蛋白选自NT013、NT017和NT022，任选地选自NTNi的NT013和NT017 或其同系物、直系同源物或旁系同源物。

在一些实施方案中，所述细菌是革兰氏阴性球菌，且所述含有LytM的蛋白选自NT013、NT017和NT022，任选地选自NTNi的NT017和NT022 或其同系物、直系同源物或旁系同源物。

当所述细菌是脑膜炎奈瑟氏球菌时，所述含有LytM的蛋白可以例如选自NMB1483、NMB0315和NMB1333。

当所述细菌是百日咳鲍特氏菌时，所述含有LytM的蛋白可以例如选自BP1721、BP2956、BP0608、BP2919、BP3015和BP1017。

其它突变

除了具有被破坏的含有LytM 催化结构域的蛋白以外，本发明的革兰氏阴性细菌可以有利地包括一个或多个相对于野生型菌株的其它变化。这些变化可以用于例如从所述细菌除去在人疫苗中有毒或不希望的组分。

所述细菌还可以含有用于生产小泡的其它改进。具体地，所述细菌通常包含这样的基因组：其中存在一个或多个序列，使得与不含所述序列的相同细菌相比，所述细菌产生更大量的小泡。通过给小泡生产菌株添加或删除所述序列，并确定对小泡生产的影响，可以鉴别增加小泡生产的序列。例子包括任意Tol 基因的灭活或缺失[10,11]。

例如，可以存在另外的修饰，例如在lpxL1、lgtB、porA、frpB、synX、lgtA、mltA和/或lst中的一个或多个中的敲除。

在一些实施方案中，细菌可以包括在参考文献17和18-20中公开的敲除和/或超表达（hyper-expression）突变中的一个或多个。合适的用于修饰的基因包括：(a) Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB [18]；(b) CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；(c) ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；和 (d) CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB和/或SynC。

细菌可以具有下述特征中的一个或多个或全部：(i) 下调的或敲除的LgtB和/或GalE以截短 LOS；(ii) 上调的TbpA；(iii) 上调的NhhA；(iv) 上调的Omp85；(v) 上调的LbpA；(vi) 上调的NspA；(vii) 敲除的PorA；(viii) 下调的或敲除的FrpB；(ix) 下调的或敲除的Opa；(x) 下调的或敲除的Opc；(xii) 缺失的cps基因复合物。截短的LOS可以是不包括唾液酸基-乳糖-N-新四糖表位的LOS，例如它可能是半乳糖-缺陷型 LOS。LOS可以不具有α链。

这样的突变具体地已经描述在脑膜炎奈瑟氏球菌中。

另外的抗原

任选地，所述细菌包含这样的基因组：其中存在一个或多个序列，使得与不含所述序列的相同细菌相比，所述细菌产生包含一种或多种另外抗原的小泡。这些另外抗原通常不存在于呈它的对应野生型菌株形式的细菌中。例如，所述另外抗原可以是得自细菌的一种或多种蛋白抗原，所述细菌选自脑膜炎奈瑟氏球菌 (特别是血清群 B)、病原性大肠杆菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）和无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）。其它合适的细菌包括炭疽芽孢杆菌（Bacillusanthracis）、志贺氏菌属（ Shigella）、衣原体属（ Chlamydia）、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、麻风分枝杆菌（ Mycobacterium leprae）、溃疡分枝杆菌（ Mycobacterium ulcerans）、链球菌属（ Streptococcus）、假单胞菌属（ Pseudomonas）、志贺氏菌属（ Shigella）、弯曲杆菌属（ Campylobacter）、沙门氏菌属（Salmonella ）(例如鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）)、耶尔森氏菌属 (例如鼠疫耶尔森氏菌)、普氏立克次氏体（Rickettsia prowazekii）、奈瑟氏球菌属、肉毒梭菌（Clostridiumbotulinum）和螺杆菌属（Helicobacter）。类似地，所述另外抗原可以是一种或多种病毒蛋白抗原，诸如得自腺病毒科（Adenoviridae）、细小RNA病毒科（ Picornaviridae）、疱疹病毒科（ Herpesviridae）、嗜肝病毒科（ Hepadnaviridae）、黄病毒科（ Flaviviridae）、逆转录病毒科（ Retroviridae）、正粘病毒科（ Orthomyxoviridae）、副粘病毒科（Paramyxoviridae）、乳多空病毒科（ Papovaviridae）、弹状病毒科（ Rhabdoviridae ）或披膜病毒科（Togaviridae）的病毒的抗原，例如，得自HIV或流感的抗原。所述另外抗原可以是得自任何病原体的一种或多种蛋白抗原。所述另外抗原还可以是得自癌细胞的一种或多种抗原，例如一种或多种癌蛋白。因此，得自细菌的小泡可以用作递送系统用于将所述另外抗原呈递给免疫系统。因此，存在于基因组中的一个或多个序列能够指导所述另外抗原在小泡中的表达。所述序列可以整合进细菌染色体中，或它们可以存在于未整合的基因组元件（例如质粒）中。例如，有效的是，将所述序列包括在一个或多个表达载体内，使得可能控制在细菌中的表达。例如，每个序列可以是在合适的表达盒中。通常，所述序列将包括编码另外抗原的基因以及在小泡中的有效表达所需的任何调节序列(即 启动子、信号序列、伴侣蛋白、分泌途径机制等)。技术人员知道在革兰氏阴性细菌（特别是大肠杆菌）中表达这样的异源基因的方法以及如何指导该表达使得异源蛋白存在于小泡中 (参见例如参考文献21、22、23等)。 例如，所述蛋白可以与适当的前导肽融合进行周质区室化。当蛋白以此方式靶向周质时，可能有用的是在作为疫苗施用之前破坏小泡，例如使用超声处理和/或去污剂。这有助于从小泡释放蛋白，同时保留其它小泡组分的佐剂性。类似地，所述蛋白可以与“脂质化框”前面的前导序列融合以便作为脂蛋白区室化在内膜和/或外膜中。当蛋白以此方式靶向膜时，它通常朝向小泡的内侧或外侧。该朝向可以通过内源性 “翻转（flip/flop）” 机制的作用而改变，例如在奈瑟氏球菌属种中。所述蛋白还可以与跨膜区域融合和/或与内源性膜蛋白（例如孔蛋白）融合以实现抗原在外膜中的区室化。还可以如下优化表达效率：修饰序列中的密码子选择以匹配革兰氏阴性细菌的偏好 (参考文献 24)。

突变体的制备

可以使用常规诱变技术从野生型或其它开始菌株方便地制备本发明的革兰氏阴性细菌。可以以不同的方式实现含有LytM 结构域的蛋白或基因的修饰(例如灭活)，例如通过它的启动子中的缺失或突变 、通过它的起始密码子的缺失或突变、通过未成熟终止密码子的引入、通过整个或部分(例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%)编码区的缺失、通过敲除等。同基因的敲除突变体是优选的。敲除突变可以位于所述基因的编码区中，或可以位于它的转录控制区内(例如在它的启动子内)。敲除突变会使编码 抗原的mRNA的水平降低至<野生型细菌产生的水平的1%，优选地<0.5%，更优选地<0.1%，且最优选地达到0%。在得到的革兰氏阴性细菌中，编码期望的基因的mRNA不存在和/或它的翻译被抑制 (例如通常达到小于野生型水平的1% ，优选地<0.5%，更优选地<0.1%，且最优选地达到0%)。

本发明的革兰氏阴性细菌可以含有在灭活基因中或替代灭活基因的标记基因，例如抗生素（ 例如红霉素）抗性标记。这可以使用同源重组实现。还可以使用未标记的缺失(即没有引入标记基因的缺失)。

在一些实施方案中，至少一种含有LytM 结构域的蛋白被灭活，例如使得它不执行它的正常功能，或在降低的水平执行它的功能。这可以通过表达的蛋白的量的减少和/或表达的蛋白的活性的降低来实现。因此可能存在编码所述蛋白的基因的灭活 (例如通过突变或缺失)。在一个实施方案中，所述含有LytM 结构域的蛋白以小于未修饰的蛋白的表达水平的90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、1%的水平表达。所述含有LytM 结构域的蛋白可以不表达。在一个实施方案中，表达的含有LytM 结构域的蛋白的活性小于未修饰的蛋白的活性的90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、1%)。所述含有LytM 结构域的蛋白可以是无功能的。

在一些实施方案中，可以在LytM 结构域中造成突变和/或缺失。可以选择如上面所定义的使得LytM 结构域和/或含有LytM 结构域的蛋白没有功能或具有减小的功能的突变和/或缺失。

可选地，所述缺失或突变可以减小含有LytM 结构域的蛋白的活性或功能。所述缺失或突变可以是在LytM 结构域中或所述蛋白的其它地方。例如，所述缺失或突变可以产生缺少一个或超过一个结构域的表达的蛋白(例如其缺少LytM 结构域)。制备革兰氏阴性菌株（例如适合用于小泡制备）的方法之后可以跟着培养得到的经修饰的细菌以提供细菌培养物的步骤。

用于培养革兰氏阴性细菌的培养条件是本领域众所周知的。例如，可以使用有机氮源 (诸如氨基酸混合物，例如含有Ala、Arg、Asn、Asp；可以使用酪蛋白氨基酸)、甘油 作为碳源等培养它们。L-天冬氨酸在培养基中的包含是特别有用的，且可以充当氮和碳源。

用于生产小泡的方法

本发明还提供了用于制备本发明的小泡的方法和通过这些方法得到的或可得到的小泡。所述方法包括从细菌的培养物得到小泡的步骤。所述小泡可以如下得到：破坏细菌的外膜或者从细菌的外膜起泡以从其形成小泡。因而，术语“小泡”通常是指OMV、疱、微泡 (MV[25])和‘天然OMV’(‘NOMV’ [26])。它通常还可以指去污剂提取的OMV(DOMV)和突变体衍生的OMV (m-OMV)。 术语“膜抗原的一般化模块”可以用于从突变体细菌得到的小泡。

因而通过在允许释放小泡的条件下培养适当的细菌例如本发明的细菌可以得到小泡，且从本发明的细菌制备小泡的方法因而可以包括或另外包括在允许释放小泡的条件下培养适当的细菌例如本发明的细菌。

疱(包括MV) 是天然存在的膜小泡，其在细菌生长过程中自发地形成和释放进培养基中。优选地，本发明的小泡是疱，因为自发地释放的疱与培养基的分离比包括外膜的故意破坏(例如通过去污剂处理或超声处理)的方法更方便。此外，它们基本上不具有内膜和细胞质污染。通过电子显微术，这些小泡通常具有35-120nm或20-100nm的直径，例如50nm直径，且可以从培养基中纯化。所述纯化理想地包括从活细菌和/或完整细菌分离小泡，例如通过基于尺寸的过滤，其中使用过滤器诸如0.22µm过滤器，其允许小泡穿过，但是其不允许完整细菌穿过，或通过使用低速离心来沉淀细胞同时将小泡留在悬浮液中。在参考文献27中描述了包括两阶段尺寸过滤过程的优选方法。

因而，不同于培养基，本发明的含有小泡的组合物通常基本上不含有完整细菌，无论活的还是死的。小泡的尺寸意味着，它们可以通过过滤与完整细菌容易地分离，例如如通常用于过滤除菌那样。尽管小泡会穿过标准的0.22µm 过滤器，这些可以容易地被其它物质阻塞，所以可能有用的是，在使用0.22µm过滤器之前穿过一系列递减孔径的过滤器执行连续的过滤除菌步骤。在先过滤器的例子是具有0.8µm、0.45µm等孔径的那些。

在一些实施方案中，OMV可以从细菌人工地制备，且可以使用去污剂处理 (例如用脱氧胆酸盐或肌氨酰基)或通过非去污剂方式 (例如参见参考文献 [28])制备。用于形成小泡的技术包括，在足够高不会沉淀去污剂的pH用胆汁酸盐 去污剂 (例如石胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、乌索胆酸等的盐，其中脱氧胆酸钠 [29] 和 [30] 对于处理奈瑟氏球菌属而言是优选的)处理细菌[31]。使用技术诸如超声处理、均质化、微流体化、空化、渗透冲击、碾磨、弗氏压碎、掺合等，可以基本上在没有去污剂 存在下 [28]执行其它技术。不使用去污剂或使用低去污剂的方法可以保留有用的抗原诸如NspA [28]。因而，一种方法可以使用含有约0.5%或更低（例如约0.2%、约0.1%、<0.05%或0）脱氧胆酸盐的OMV 提取缓冲液。

一种有用的小泡制备方法描述在参考文献[32]中，且涉及对粗制 OMV的超滤，而不是高速离心。所述方法可以涉及在进行超滤以后的超速离心步骤。

因而小泡可以通过处理适当的革兰氏阴性细菌（例如本发明的细菌）使得它的外膜形成小泡而得到，且从本发明的细菌制备小泡的方法因而可以包括或另外包括处理适当的革兰氏阴性细菌（例如本发明的细菌）使得它的外膜形成小泡。

更大量的小泡的释放

已经证实其中 NT013或NT022被灭活的NHTi 突变体会释放比野生型 NTHi更大量的小泡。

在一个实施方案中，与其中含有LytM 催化结构域的蛋白有活性的相同细菌相比，本发明的细菌可以将更大量的小泡释放进培养基中。这可以是与其中含有LytM 催化结构域的蛋白有活性的相同细菌相比至少10%、20%、50%、100%、150%、200%、250%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%的增加。

换而言之，本发明提供了一种增加从革兰氏阴性细菌生产小泡（例如与其中含有LytM 催化结构域的蛋白有活性的相同细菌相比）的方法，所述方法包括，修饰（例如灭活）所述细菌中的至少一种含有LytM 催化结构域的蛋白。任选地培养所述细菌。

具有不同蛋白组合物的外膜小泡的生产

已经证实其中至少一种含有LytM 催化结构域的蛋白被灭活的NHTi 突变体会产生具有与 野生型 NTHi不同的蛋白组成的小泡。

具体地，与得自野生型 NHTi的小泡相比，得自NT013 突变体的小泡可以具有脂蛋白的量的增加、周质蛋白的量的增加、外膜蛋白的量的减少。

与得自野生型 NHTi的小泡相比，得自NT017 突变体的小泡可以具有细胞质蛋白的量的增加和外膜蛋白的量的减少。

与得自野生型 NHTi的小泡相比，得自NT022 突变体的小泡可以具有脂蛋白的量的增加、周质蛋白的量的增加、外膜蛋白的量的减少。

与得自野生型 NHTi的小泡相比，脂蛋白NT069 (注解为 NTHI1957)和NTHI0353可以以增加的水平存在于NTHi NT013和NT022 突变体小泡中。

与得自野生型 NHTi的小泡相比，周质丝氨酸蛋白酶 HhoA 可以以增加的水平存在于NTHi NT013 突变体小泡中和/或以降低的水平存在于NTHi NT017和NT022 突变体小泡中。

与得自野生型 NHTi的小泡相比，外膜蛋白NTHI1668可以以增加的水平存在于NTHi NT013、NT017和NT022 突变体小泡中。外膜蛋白P2（其是一种丰富的和可变的蛋白）以降低的水平存在于NTHi NT013、NT017和NT022 突变体小泡中，且外膜蛋白P5的水平也与得自野生型 NHTi的小泡相比发生变化。认为P2和P5（它们在小泡中高度富含）的存在会促进血清中针对嗜血菌属 OMV产生的交叉反应性的缺失，且这样P2和/或总P2+P5的减少可能是有利的，例如在生产具有改善的交叉反应性的小泡中。

因而，与其中含有LytM 催化结构域的蛋白有活性的相同细菌相比，本发明的小泡可以含有蛋白总量、脂蛋白的量、周质蛋白的量、外膜蛋白的量和/或细胞质蛋白的量的差异(例如，例如至少10%、20%、50%、100%、150%、200%、250%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%的增加或减少)。

因而，与得自其中含有LytM 催化结构域的蛋白有活性的相同细菌的小泡相比，本发明的小泡可以含有一种或多种蛋白（例如外膜蛋白）的量的差异(例如，例如至少10%、20%、50%、100%、150%、200%、250%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%的增加或减少)，所述蛋白选自(i) NHTi P2、(ii) NHTi P5和(iii) 总NHTi P2 + NHTi P5。NTHi P2和P5是被提及的，但是如果小泡得自不同的革兰氏阴性细菌，那么该细菌中的P2或P5同系物、直系同源物或旁系同源物可能增加或减少。

本发明因而提供了一种例如与其中含有LytM 催化结构域的蛋白有活性的相同细菌相比改变得自革兰氏阴性细菌的小泡中的蛋白总量、脂蛋白的量、周质蛋白的量、外膜蛋白的量和/或细胞质蛋白的量的方法，所述方法包括修饰（例如灭活）所述细菌中的至少一种含有LytM 催化结构域的蛋白。任选地培养所述细菌。任选地，所述外膜蛋白是P2和/或P5。所述改变可以如上面所定义。

免疫原性组合物和药物

本发明的免疫原性组合物可以用作疫苗。根据本发明的疫苗可以是预防性的(即用于预防感染)或治疗性的(即用于治疗感染)，但是通常是预防性的。

组合物因而可以是药学上可接受的。它们经常包括除了抗原以外的组分，例如它们通常包括一种或更多种药用载体和/或赋形剂。这样的组分的彻底讨论可在参考文献33中得到。

因此，本发明提供了一种药物组合物，其包含(a) 本发明的小泡 和(b) 药学上可接受的载体。所述组合物适合用于药物用途。本发明还提供了一种用于制备这样的组合物的方法，所述方法包括将本发明的小泡与药学上可接受的载体混合的步骤。所述药物组合物优选地是免疫原性组合物。

药学上可接受的载体可以是其本身不会诱导对接受所述组合物的患者有害的抗体产生且其可以没有不适当毒性地施用的任何物质。药学上可接受的载体可以包括液体诸如水、盐水、甘油和乙醇。辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等(例如稳定剂、防腐剂)也可以存在于这样的媒介物中。合适载体的彻底讨论可在参考文献[33]中得到。

通常将组合物以含水形式施用给哺乳动物。但是，在施用之前，所述组合物可以已经处于非含水形式。例如，尽管一些疫苗以含水形式制备，然后也以含水形式填充和分布和施用，将其它疫苗在制备过程中冻干并在使用时重构成含水形式。因此，可以干燥本发明的组合物，诸如冻干的制剂。

所述组合物可以包含防腐剂诸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。但是，优选的是，所述疫苗应当基本上不含有(即小于5µg/ml) 汞材料，例如不含硫柳汞。不含汞的疫苗是更优选的。不含防腐剂的疫苗是特别优选的。

为了改善热稳定性，组合物可以包含温度保护剂。下面提供了这样的试剂的其它细节。

为了控制张力，优选的是，包含生理盐如钠盐。氯化钠(NaCl)是优选的，其可以以1-20 mg/ml存在，例如约10±2 mg/ml NaCl。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸二钠、氯化镁、氯化钙等。

组合物通常具有200 mOsm/kg至400 mOsm/kg的渗透压，优选240-360 mOsm/kg，且更优选地落入290-310 mOsm/kg的范围内。

组合物可以包含一种或多种缓冲剂。典型缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂； 硼酸盐缓冲剂； 琥珀酸盐缓冲剂； 组氨酸缓冲剂(特别是对于氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。 通常包括在5-20 mM范围内的缓冲剂。

组合物的pH通常为5.0-8.1，更通常为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。

所述组合物优选地为无菌的。所述组合物优选地为无热原的，例如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，且优选每剂量<0.1EU。所述组合物优选地不含谷蛋白。

所述组合物可以包含用于单次免疫的物质，或者可以包含用于多次免疫的物质(即‘多剂量’试剂盒)。多剂量配置优选地包含防腐剂。作为在多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，可以将所述组合物包含于容器中，所述容器具有用于取出物质的无菌接头。

通常以约0.5 ml的剂量体积施用人疫苗，但是可以将一半剂量(即约0.25 ml)施用给儿童。

本发明的免疫原性组合物还可以包含一种或多种免疫调节剂。优选地，一种或多种免疫调节剂包括一种或多种佐剂。所述佐剂可以包括在下面进一步讨论的TH1佐剂和/或TH2佐剂。

可以在本发明的组合物中使用的佐剂包括、但不限于：

● 矿物盐，诸如铝盐和钙盐，包括氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)和硫酸盐等[例如参见参考文献 [34]的第8 和 9章]；

● 水包油乳剂，诸如角鲨烯-水乳剂，包括MF59 (5% 角鲨烯、0.5% 吐温 80和0.5%Span 85，使用微流态化仪配制成亚微米颗粒) (参考文献 34的第 10章；也参见参考文献[35]-[37]，和参考文献 [38]的第12章]、完全弗氏佐剂 (CFA)和不完全弗氏佐剂 (IFA)；

● 皂苷制剂[参考文献 34的第22 章]，诸如QS21 [39]和ISCOM[参考文献 34的第23章]；

● 病毒体和病毒样颗粒(VLP)[40-46]；

● 细菌或微生物衍生物，诸如肠道细菌脂多糖 (LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物[47]、[48]、免疫刺激性的寡核苷酸 [49-54]，诸如IC-31™ [55] (包含26-聚体序列 5'-(IC)₁₃-3' (SEQ ID NO: 23)的脱氧核苷酸 和包含11-聚体氨基酸序列 KLKLLLLLKLK (SEQID NO: 24)的聚阳离子聚合物肽以及ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物[56-65]；

● 人免疫调节剂，包括细胞因子，诸如白介素 (例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12 [66、67]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞 集落刺激因子和肿瘤坏死因子；

● 生物粘着剂和粘膜粘着剂，诸如壳聚糖及其衍生物，酯化的透明质酸微球 [68]或粘膜粘着剂，诸如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、多糖和羧甲纤维素的交联衍生物[69]；

● 从可生物降解的和无毒的材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯等)形成的微粒 (即具有约100nm至约150μm直径、更优选地约200nm至约30μm直径和最优选地约500nm至约10μm直径的颗粒)；

● 脂质体[参考文献 34的第13 和 14章，参考文献 70-72]；

● 聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯 [73]；

● PCPP 制剂 [74和75]；

● 胞壁酰基肽，包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺 (thr-MDP)、N-乙酰基-降胞壁酰基-l-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺 (n或-MDP)和N-乙酰基胞壁酰基-l-丙氨酰基-d-异谷氨酰基-l-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)；和

● 咪唑并喹诺酮 化合物，包括咪喹莫特（Imiquamod）和它的同系物(例如“瑞喹莫德3M”) [76和77]。

本发明的免疫原性组合物和疫苗还可以包含以上鉴定的一种或多种佐剂各个方面的组合。例如，可将以下佐剂组合物用于本发明中：(1) 皂苷和水包油乳剂 [78]；(2) 皂苷 (例如QS21) + 无毒的LPS衍生物(例如3dMPL) [77]；(3) 皂苷 (例如QS21) + 无毒的LPS衍生物(例如3dMPL) +胆固醇； (4) 皂苷 (例如QS21) + 3dMPL + IL-12 (任选地 +甾醇) [80]；(5) 3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合 [81]；(6) SAF，其含有10% 角鲨烷、0.4% 吐温80™、5%普流尼克-嵌段共聚物L121和thr-MDP，要么微流态化为亚微米乳剂，要么涡旋以产生较大粒度的乳剂，(7) Ribi^TM佐剂系统(RAS)（Ribi Immunochem），其含有2% 角鲨烯、0.2% 吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选地MPL + CWS (Detox™)；和(8)一种或多种矿物盐(诸如铝盐)+LPS的无毒衍生物(诸如3dMPL)。

充当免疫刺激剂的其它物质公开于参考文献 34的第7章。

氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂的应用是特别优选的，且抗原通常吸附于这些盐。磷酸钙是另一种优选的佐剂。其它优选的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，诸如CpG和明矾，或瑞喹莫德和明矾。可以使用磷酸铝和3dMPL的组合(已经报道这在肺炎球菌免疫中是有效的[82])。MF59 佐剂的应用是优选的，特别是在IM (肌肉内)或IP(腹膜内)免疫接种的情况下。

本发明的组合物可以引起细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答。该免疫应答优选地诱导持久的(例如中和)抗体和在暴露于NTHI以后可以快速地做出应答的细胞介导的免疫。

通常认为两类T细胞（CD4和CD8细胞）是启动和/或增强细胞介导的免疫和体液免疫所必需的。CD8 T细胞可以表达CD8共受体，且通常被称作细胞毒性的T淋巴细胞(CTL)。CD8 T细胞能够识别在MHC I类分子上展示的抗原或与其相互作用。

CD4 T细胞可以表达CD4共受体，且通常被称作T辅助细胞。CD4 T细胞能够识别与MHC II类分子结合的抗原肽。与MHC II类分子相互作用后，CD4细胞可以分泌诸如细胞因子等因子。这些分泌的细胞因子可以激活B细胞、细胞毒性的T细胞、巨噬细胞和参与免疫应答的其它细胞。辅助T细胞或CD4+细胞可以进一步分为两个在功能上不同的子集：即在它们的细胞因子和效应子功能方面不同的TH1表型和TH2表型。

活化的TH1细胞会增强细胞免疫(包括抗原特异性的CTL生成的增加)，并因此在对细胞内感染做出响应时具有特定价值。活化的TH1细胞可以分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β中的一种或多种。TH1免疫应答可以通过激活巨噬细胞、NK(自然杀伤)细胞和CD8细胞毒性T细胞(CTL)而导致局部炎症反应。通过用IL-12刺激B和T细胞的生长，TH1免疫应答也可以用于放大免疫应答。TH1刺激的B细胞可以分泌IgG2a。

活化的TH2细胞会增加抗体生成，并因此在对细胞外感染做出响应时具有价值。活化的TH2细胞可以分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫应答可以导致IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞的产生用于将来的保护。

增强的免疫应答可以包括增强的TH1免疫应答和TH2免疫应答中的一种或多种。

TH1免疫应答可以包括以下一种或多种：CTL的增加，与TH1免疫应答有关的一种或多种细胞因子(诸如IL-2、IFN-γ和TNF-β）的增加，活化的巨噬细胞的增加，NK活性的增加，或IgG2a生成的增加。优选地，增强的TH1免疫应答包括IgG2a生成的增加。

可以使用TH1佐剂引发TH1免疫应答。相对于不用佐剂的抗原的免疫接种，TH1佐剂通常引起增加的IgG2a生成水平。适用于本发明中的TH1佐剂可以包括例如皂苷制剂、病毒体和病毒样颗粒、肠道细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、免疫刺激性的寡核苷酸。免疫刺激性的寡核苷酸（诸如含有CpG基序的寡核苷酸）是用于本发明中的优选TH1佐剂。

TH2免疫应答可以包括以下一种或多种：与TH2免疫应答有关的一种或多种细胞因子(诸如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10）的增加，或IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞生成的增加。优选地，增强的TH2免疫应答包括IgG1生成的增加。

可以使用TH2佐剂引发TH2免疫应答。相对于不用佐剂的抗原免疫接种，TH2佐剂通常引起增加的IgG1生成水平。适用于本发明中的TH2佐剂包括例如，含矿物质的组合物、油乳剂和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。含矿物质的组合物（如铝盐）是用于本发明中的优选TH2佐剂。

优选地，本发明包括包含TH1佐剂和TH2佐剂的组合的组合物。优选地，这样的组合物会引起增强的TH1和增强的TH2应答，即，IgG1和IgG2a的生成相对于不用佐剂的免疫接种的增加。还更优选地，相对于使用单一佐剂的免疫接种(即，相对于只用TH1佐剂的免疫接种或只用TH2佐剂的免疫接种)，包含TH1和TH2佐剂的组合的组合物会引起增加的TH1免疫应答和/或增加的TH2免疫应答。

所述免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2免疫应答中的一种或两种。优选地，免疫应答提供增强的TH1应答和增强的TH2应答中的一种或两种。

增强的免疫应答可以是全身免疫应答和粘膜免疫应答中的一种或两种。优选地，所述免疫应答提供增强的全身免疫应答和增强的粘膜免疫应答中的一种或两种。优选地，粘膜免疫应答为TH2免疫应答。优选地，粘膜免疫应答包括IgA生成的增加。

细菌感染可以影响身体的多个区域，所以可以将本发明的组合物制备成不同的形式。例如，可以将所述组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂。也可以制备适合在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式(例如冻干的组合物或喷雾冷冻干燥的组合物)。可以制备所述组合物用于局部施用，例如作为软膏剂、乳膏剂或粉末。可以制备所述组合物用于口服施用，例如作为片剂或胶囊剂、作为喷雾剂或作为糖浆剂(任选地经过调味)。可以制备所述组合物用于采用细粉或喷雾进行肺施用，例如作为吸入剂。可以将所述组合物制备为栓剂或子宫托。可以制备所述组合物用于鼻、耳或眼施用，例如作为滴剂。所述组合物可以呈试剂盒形式，设计成在即将施用给患者之前重构合并的组合物。这样的试剂盒可以包含一种或多种液体形式的抗原以及一种或多种冻干的抗原。

当在使用前即时制备组合物(例如，以冻干形式提供组分)并以试剂盒形式提供时，该试剂盒可以包含两个小瓶，或者它可以包含一个已填充的注射器和一个小瓶，所述注射器的内容物用于在注射前再次激活所述小瓶的内容物。

用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫学上有效量的抗原以及需要的任意其它组分。“免疫学上有效量”是指，在单次剂量中或作为一系列剂量的一部分施用给个体的对治疗或预防而言有效的量。该量随以下因素而变化：待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类群（例如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗的制剂、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素。预见到，所述量将落入通过常规测试可以确定的相对宽范围内。如果在组合物中包含超过一种抗原，那么两种抗原可以以彼此相同的剂量或以不同的剂量存在。

如上所述，组合物可以包含温度保护剂，且该组分可能在含佐剂的组合物(特别是含有矿物质佐剂诸如铝盐的那些)中是特别有用的。如在参考文献[83]中所述，可以将液体温度保护剂加入水性疫苗组合物中以降低其冰点，例如将冰点降低至0℃以下。因此，可以将组合物储存在0℃以下但在其冰点以上以便抑制热分解。温度保护剂还允许冷冻组合物，同时保护矿物盐佐剂免于在冷冻和融化后凝聚或沉降，并且还可以在高温（例如40℃以上）保护组合物。可以混合起始水性疫苗和液体温度保护剂，使得该液体温度保护剂形成最终混合物的1-80体积％。合适的温度保护剂应该是人施用安全的、易混溶的/可溶于水的，并且不应损害组合物的其它组分(例如抗原和佐剂)。例子包括甘油、丙二醇和/或聚乙二醇(PEG)。合适PEG可以具有200-20,000 Da的平均分子量。在一个优选的实施方案中，聚乙二醇可以具有约300 Da (‘PEG-300’)的平均分子量。

由于小泡的微粒性质，最终的疫苗产品可能是具有混浊外观的悬浮液。该外观意味着，微生物污染不可容易地看到，所以所述疫苗可以含有抗菌剂。当将所述疫苗包装在多剂量容器中时，这是特别重要的。用于包含的优选抗菌剂是2-苯氧乙醇和硫柳汞。但是，优选的是，不使用含贡防腐剂(例如硫柳汞)，且优选的是，所述组合物含有小于约25 ng/ml的汞。更优选地，所述组合物是无汞的。

使用小泡疫苗(例如用于脑膜炎球菌)的先前工作提供了关于施用小泡的制药、剂量学和制剂指导。本发明的组合物中的小泡的浓度通常是在10-500 µg/ml之间，优选25-200 µg/ml之间，且更优选约50 µg/ml或约100 µg/ml (以小泡中的总蛋白的方式表达)。较低剂量对于血清转化而言可以是有效的。因而，本发明的组合物中的小泡的浓度可以是在1ng/ml至10 μg/ml、或1 ng/ml至1 μg/ml、或0.5 μg/ml 至 50 μg/ml的范围内。0.5 ml的剂量体积对于注射而言是通常的。

所述组合物可以与其它免疫调节剂联合施用。

免疫

本发明也提供了一种用于在哺乳动物中引起免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：施用有效量的本发明的组合物。所述免疫应答优选地是保护性的，且优选地涉及抗体和/或细胞介导的免疫。所述方法可以引起加强应答。

本发明还提供了用在医学中或用作药物的本发明的组合物，所述药物例如用于提高哺乳动物中的免疫应答(例如作为免疫原性组合物或作为疫苗)。

所述免疫应答可以针对革兰氏阴性细菌。

本发明还提供了本发明的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于提高哺乳动物中的免疫应答或用于预防哺乳动物中的疾病，和本发明的小泡在制备药物中的用途，所述药物用于提高哺乳动物中的免疫应答或用于预防哺乳动物中的疾病。

通过用这些用途和方法提高哺乳动物中的免疫应答，可以保护哺乳动物免于细菌（例如革兰氏阴性细菌诸如流感嗜血杆菌）感染。

本发明对各种不同血清型的流感嗜血杆菌是有效的，但是在保护免于由无法分类的流感嗜血杆菌 (NTHI)感染引起的疾病中可以是特别有用的。根据本发明，感染可以与选自例如中耳炎 (包括急性中耳炎)、支气管炎、结膜炎、鼻窦炎、泌尿道感染、肺炎、菌血症、脓毒性关节炎、会厌炎、肺炎、积脓、心包炎、蜂窝织炎、骨髓炎、下呼吸道感染或脑膜炎的疾病或病症有关。本发明通过引起免疫应答（其阻止细菌从咽喉经由咽鼓管移动至中耳然后在中耳处寄居），对于治疗或预防中耳的炎症而言或对于治疗或预防 COPD 疾病而言是特别有用的。

本发明还提供了包含第一组分和第二组分的试剂盒，其中第一组分和第二组分都不是如上所述的本发明组合物，但是其中可以组合所述第一组分和第二组分以提供如上所述的本发明组合物。所述试剂盒可以进一步包括含有以下一种或多种的第三组分：说明书、注射器或其它递送装置、佐剂或药学上可接受的配制溶液。

本发明还提供了一种预填充了本发明的免疫原性组合物的递送装置。

所述哺乳动物优选地是人，例如人患者。在所述疫苗用于预防用途的情况下，人优选地是儿童(例如幼儿或婴儿)或青少年；在所述疫苗用于治疗用途的情况下，人优选地是青少年或成年人。意图用于儿童的疫苗还可以施用给成年人，例如以评估安全性、剂量、免疫原性等。哺乳动物(例如人，例如患者) 可能处于来自疾病本身的风险中，或可能是怀孕的雌性，例如妇女(“母源免疫”)。

检查治疗性处理的效力的一种方式包括，在施用本发明的组合物以后，监测细菌（例如流感嗜血杆菌）感染。一种检查预防性处理的效力的方法包括，在施用所述组合物以后，监测针对所述组合物中抗原的全身免疫应答(诸如监测IgG1和IgG2a产生水平)和/或粘膜免疫应答(诸如监测IgA产生水平)。可以如下确定本发明的组合物的免疫原性：将它们施用给测试受试者 (例如12-16 个月龄的儿童 ，或动物模型诸如毛丝鼠模型 [84]) ，然后确定标准参数，包括 IgG的ELISA 滴度(GMT)。这些免疫应答通常在施用所述组合物以后约4 周确定，并与在施用所述组合物以前确定的值进行对比。在施用超过一剂组合物的情况下，可以进行超过一次施用后确定。通常，在免疫接种之后但是在攻击之前确定抗原特异性的血清抗体应答，而在免疫接种之后和在攻击之后确定抗原特异性的粘膜抗体应答。

还可以用所述疫苗组合物通过在细菌（例如流感嗜血杆菌）感染的动物模型（例如，豚鼠毛丝鼠或小鼠）中的免疫接种研究在体内确定疫苗组合物的效力。一种这样的模型描述在参考文献[85]中。

用于在体内确定本发明的疫苗组合物的效力的其它有用的动物模型描述在参考文献 [86]中。

本发明的组合物通常直接施用给患者。通过胃肠外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或注射至组织的间质间隙)，或通过粘膜，诸如通过直肠、口服(例如片剂、喷雾剂)、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜施用，可以实现直接递送。

本发明可以用于引起全身免疫和/或粘膜免疫，优选地用于引起增强的全身免疫和/或粘膜免疫。

优选地，增强的全身免疫和/或粘膜免疫表现为增强的TH1和/或TH2免疫应答。优选地，所述增强的免疫应答包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA的产生的增加。

可以通过单剂量方案或多剂量方案进行给药。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可以通过相同或不同的途径施用多个剂量，例如胃肠外激发和粘膜加强，粘膜激发和胃肠外加强等。通常间隔至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)施用多剂量。

根据本发明制备的疫苗可以用于治疗儿童和成年人。因此，人患者可以是小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。 接受疫苗的优选患者是老年人(例如≥50岁，≥60岁，优选≥65岁)、年轻人(如≤5岁)、 住院患者、健康护理工作者、武装部队和军事人员、孕妇、慢性病患者或免疫缺陷患者。 但是，所述疫苗不仅适用于这些群体，可以用于更广泛的群体。

可以将通过本发明生产的疫苗与其它疫苗基本上同时(例如在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间)施用给患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、联合的B型流感嗜血杆菌疫苗、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌的联合疫苗(诸如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞体病毒疫苗等基本上同时施用。

粘膜免疫

本发明提供了用于粘膜免疫的本发明的组合物。本发明还提供了一种用于提高哺乳动物中的免疫应答的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的这样的免疫原性组合物的步骤。所述组合物优选地经由粘膜层施用(至粘膜表面)，例如它可以鼻内施用。

细菌的ADP-核糖基化毒素和/或其脱毒衍生物可以存在，其可以例如从大肠杆菌热不稳定的肠毒素 (“LT”)衍生出。所述衍生物可以在它的A亚基中具有脱毒突变，例如它可以是LT-K63或LT-R72。具体地，它可以是 LT-K63。在其它实施方案中，它不是LT-K63。

本发明的组合物和LT-K63 佐剂的鼻内施用是优选的。这可以减小鼻咽、肺和血液中的流感嗜血杆菌细菌负载，并增加受感染的哺乳动物的存活率。

本发明的组合物的其它抗原组分

本发明还提供了这样的组合物：其进一步包含至少一种无法分类的流感嗜血杆菌抗原或至少一种其它无法分类的流感嗜血杆菌抗原。

本发明还提供了这样的组合物：其进一步包含至少一种不是无法分类的流感嗜血杆菌抗原的抗原。

具体地，本发明还提供了这样的组合物：其包含一种或多种本发明的多肽和一种或多种下述其它抗原：

- 得自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群 A、B、C、W135和/或Y的抗原。

- 得自肺炎链球菌的糖或多肽抗原[例如[87]、[88]、[89]。

- 得自甲型肝炎病毒（诸如灭活的病毒）的抗原[例如[90]、[91]。

- 得自乙型肝炎病毒的抗原，诸如表面抗原和/或核心抗原 [例如91、[92]。

- 白喉抗原，诸如白喉类毒素 [例如参考文献 [93]的第3 章]或CRM₁₉₇ 突变体[例如[94]。

- 破伤风抗原，诸如破伤风类毒素 [例如参考文献 93的第4 章]。

- 得自百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis）的抗原，诸如得自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血细胞凝集素(FHA)，任选地也与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3组合[例如参考文献 [95] 和 [96]。

- 全细胞百日咳抗原

- 得自流感嗜血杆菌B的糖抗原 [例如[97]。

- 脊髓灰质炎抗原 [例如[98]、[99] 诸如IPV。

- 麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原 [例如参考文献 93的第9、10和11章]。

- 流感抗原 [例如参考文献 93的第19 章]，诸如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。

- 得自粘膜炎莫拉菌的抗原[例如[100]。

- 得自无乳链球菌(B群链球菌)的蛋白抗原 [例如[101]、[102]。

- 得自无乳链球菌(B群链球菌)的糖抗原。

- 得自酿脓链球菌(A群链球菌)的抗原[例如102、[103]、[104]。

- 得自金黄色葡萄球菌的抗原[例如[105]。

- 得自呼吸道合胞体病毒的抗原，例如重组蛋白F。

- 包含白喉 (D)、破伤风 (T)、百日咳 (无细胞组分) (Pa)、乙型肝炎 (rDNA) (HBV)、骨髓灰质炎 (灭活的) (IPV)和流感嗜血杆菌b型 (Hib) 缀合物疫苗 (吸附的)的疫苗组合物，例如吸附无细胞百日咳、白喉、破伤风联合疫苗（Infanrix-hexa）

所述组合物可以包含这些其它抗原中的一种或多种。与RSV 疫苗和/或与含有DTPa的疫苗的组合是特别重要的。

在必要时，可以将毒蛋白抗原脱毒(例如通过化学和/或遗传方式将百日咳毒素脱毒 [96])。

在所述组合物包含白喉抗原的情况下，还优选地包括破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，在包括破伤风抗原的情况下，还优选地包括白喉和百日咳抗原。类似地，在包括百日咳抗原的情况下，还优选地包括白喉和破伤风抗原。因此，DTP组合是优选的。

糖抗原优选地呈缀合物的形式。所述缀合物的载体蛋白包括白喉毒素、破伤风毒素、脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白[106]、合成肽[107]、[108]、热激蛋白[109]、[110]、百日咳蛋白[111]、[112]、得自流感嗜血杆菌的蛋白D[113]、细胞因子[114]、淋巴因子 [114]、链球菌蛋白、激素 [114]、生长因子 [114]、得自难辨梭菌的毒素A或B[115]、铁摄取蛋白[116]等。一种优选的载体蛋白是白喉毒素的CRM197突变体[117]。

所述组合物中的抗原通常以每种至少1µg/ml的浓度存在。一般而言，任意给定抗原的浓度足以引起针对该抗原的免疫应答。

作为在本发明的免疫原性组合物中使用蛋白抗原的替代方案，可以使用编码抗原的核酸(优选DNA，例如以质粒的形式)。

优选地将抗原吸附至铝盐上。

一般方面

术语“包含”包括“包括”以及“由...组成”，例如，“包含”X的组合物可以排它地由X组成，或者可以包含其它物质，例如X+Y。

关于数值x的术语“约”是任选的，且是指例如x±10%。

词语“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上不含有”Y的组合物可以完全地不含有Y。 在必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中省略。

对两个氨基酸序列之间的序列同一性百分比的提及表示，当进行比对时，所比较的两个序列中相同的氨基酸的百分比。使用本领域已知的软件程序，例如在参考文献[118]的7.7.18部分中描述的那些，可以进行该比对并确定同源性或序列同一性百分比。通过Smith-Waterman同源性检索算法确定优选比对，所述算法使用仿射缺口检索，其中缺口开放罚分为12，缺口延伸罚分为2，BLOSUM矩阵为62。Smith-Waterman同源性检索算法是众所周知的，且公开在参考文献[119]中。

附图说明

图1：NTHi LytM因子的表达和亚细胞定位. (A) 使用针对NT013、NT017和NT022产生的特异性抗血清，对不同细胞间隔提取物进行蛋白质印迹分析。1 - 重组蛋白，2 - 总提取物WT，3 总提取物KO，4 - 外膜蛋白WT，5 - 外膜蛋白KO，6 - 周质级分 WT，7 - 周质级分 KO，8 - 上清液，WT 9 - 上清液 KO。红色箭头指示特异性信号。如预期的，用突变株没有观察到特异性反应性；但是，抗血清与也存在于敲除的菌株中的未表征的其它非特异性带交叉反应。(B) 对Hi176 野生型菌株和176ΔNT022 突变体的免疫荧光显微术分析证实蛋白NT022的表面定位。细菌是红色，且LytM因子呈绿色。(C) NTHi中的LytM 蛋白定位的模型。

图2：NTHi Hi176 野生型和LytM 突变体的表型表征.在 37℃生长 16h的液体静置培养物的聚集表型(A)和CFU/毫升 (B)。在两种不同的OD进行CFU计数。176ΔNT017菌株具有与亲本菌株类似的生长速率和 CFU，而176ΔNT013和176ΔNT022 突变体表现出降低的生长速率生长和更低的CFU。(C) 显示176ΔNT013和176ΔNT022菌株的细菌聚集的共焦成像，细菌被染成红色，Dapi 被染成蓝色。

图3：在LytM 突变体上的共焦和电子显微术. (A) Hi176 wt、176ΔNT013和176ΔNT022的共焦成像，将细菌染成红色(抗总细菌)和蓝色(DAPI)。(B) 176 wt、176ΔNT013和176ΔNT022的扫描电子显微术。突变体176ΔNT017与野生型菌株相比没有表现出任何差异(数据未显示)。

图4：LytM 突变体中的隔膜形成. 在 Hi176 wt和LytM 突变体上的透射电子显微术。红色箭头指示突变体176ΔNT013和176ΔNT022中的受损的隔膜形成。

图5：突变体176ΔNT013和176ΔNT022 释放比野生型菌株更多的OMV。Hi176WT、176ΔNT013和176ΔNT022 突变体和它们各自的OMV制剂制剂的透射电子显微术。红色箭头指示从细菌表面释放的OMV。

图6：OMV的分析. 从野生型、176ΔNT013和176ΔNT022菌株制备的OMV的考马斯染色的SDS page凝胶 (A)。在选择的带上进行质谱法鉴定 (B)。使用稳定地表达NF-κB-萤光素酶报告盒和TLR2 (C)或TLR4/MD2/CD14 (D)的HEK293 细胞的萤光素酶测定。通过测量在与连续稀释的OMV一起温育 6 小时以后NF-κB诱导的萤光素酶活性，评估TLR 受体的刺激。在用从野生型和突变株纯化的OMV的不同稀释液刺激的hPBMC (O.N.) 中测量IL-6和TNFα水平(E-F)。

图7: 在OMV中发现的蛋白的分析。

图8: 在OMV中的脂蛋白。得自WT、ΔtolR、Δ17的OMV具有类似的脂蛋白量，而Δ13和Δ22 突变体富含脂蛋白，尤其是NTHI1957和NTHI 0353 脂蛋白。

图9：在OMV中的周质蛋白。主要周质蛋白是周质丝氨酸蛋白酶do HhoA。对于从 Δ13衍生出的小泡，这是特别真实的。与从WT产生的OMV相比，从ΔtolR和Δ22 衍生出的OMV富含周质蛋白。与从WT产生的OMV相比，从Δ17衍生出的OMV含有小量周质蛋白。

图10：在OMV中的外膜蛋白。从每类OMV，最丰富的外膜蛋白是 nt099 (外膜蛋白P2)和nt092 (外膜蛋白P5)。就从Δ13和 Δ22衍生出的OMV而言，观察到的外膜蛋白量的主要下降是由于P2的减少。

图11：在OMV中的蛋白的相对量。与野生型菌株相比，在由突变株产生的OMV中发现的蛋白nt067、nt014、nt022和nt016的相对量。

图12：MC58 Δ1483和野生型细菌的DAPI染色。

图13：MC58 Δ1483和野生型细菌的TEM (A)和SEM (B) 分析。

图14：由MC58 Δ1483和野生型细菌产生的小泡的蛋白分析。

图15：BP1721 敲除的和野生型细菌的DAPI染色。

图16：NlpD同系物的多重比对。

图17：YebA同系物的多重比对。

图18：EnvC同系物的多重比对。

图19：由Bp W28 9G/129K ∆NlpD和野生型细菌产生的小泡的蛋白分析。

具体实施方式

针对3种LytM 金属蛋白酶：NTHI0532 (NT013)、NTHI0915 (NT017)和NTHI0830(NT022)，制备单敲除的无法分类的流感嗜血杆菌 (NTHi) 突变体。这些突变体表现出造成外膜小泡 (OMV)的释放的增加的细胞表面缺陷。此外，证实了这些蛋白参与细菌细胞分裂和发病机制。具体地，NT013和NT022是肽聚糖切割和细胞分裂的基础。NT017 对NTHi 寄生和宿主免疫逃避具有强影响。

方法

细菌菌株和生长条件

将NTHi菌株 176 用于该研究。它作为得自中耳的分离物是芬兰中耳炎组群研究的一部分。在5% CO₂下在 37℃温育的巧克力琼脂polivitex (BioMerieux)上培养NTHi。使用补充了10 μg/mL的每种氯化血红素 (Fluka Biochemika)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD,Sigma)的脑心浸液 (BHI) 液体培养基 (Difco Laboratories)作为流体生长培养基。使用大肠杆菌菌株 DH5α、HK100和BL21 (DE3) (Invitrogen)进行LytM 蛋白的克隆和表达。将它们在 37℃在Luria Bertani (LB)培养基中培养，且在必要时补充100 μg/mL 氨苄青霉素。

细胞培养物

在该研究中使用的组织培养细胞是Chang 上皮细胞(Wong-Kilbourne 衍生物，克隆1-5c-4，人结膜，ATCC® CCL-20.2™) 和HEK293 (人肾，ATCC® CRL1573™)。将Chang 细胞维持在补充了25 mM Hepes、15 mM L-谷氨酰胺、抗生素和10% (体积/体积) 热灭活胎牛血清 (FCS, Invitrogen Corporation)的Dulbecco氏改良伊格尔培养基 (D-MEM; Gibco)中。在5% CO₂下在 37℃培养它们。

在含有4.5 g/ml 葡萄糖的DMEM 中培养稳定地表达TLR2或TLR4/MD2/CD14和NF-κB-萤光素酶报告盒的HEK293 细胞，所述DMEM 补充了10%热灭活的FBS、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素、2 mM 谷氨酰胺、5 µg/ml 嘌呤霉素、250 µg/ml 潮霉素 (且对于HEK293-TLR4 细胞，添加10 µg/ml 杀稻瘟素)。

编码LytM 蛋白的基因的克隆

通过聚合酶不完全引物延伸 (PIPE) 方法 (119)，将LytM 基因克隆进 pET15b+ 载体(Novagen)中。简而言之，通过PCR从HI176 基因组DNA扩增编码每种蛋白的序列，从而除去信号肽。PCR产生不完全延伸产物的混合物；通过引物设计，将短重叠序列引入在这些不完全延伸混合物的末端，这允许互补链对合和产生杂合的载体-插入片段组合。然后用载体-插入片段杂合体转化大肠杆菌 HK100 细胞 [120]。选择单个氨苄青霉素抗性的菌落，并通过PCR检查重组质粒的存在。将得自阳性克隆的质粒分离，并亚克隆进感受态大肠杆菌BL21(DE3) 细胞中。

重组蛋白的表达和纯化

为了蛋白纯化，将表达NTHI0532、NTHI0915和NTHI0830的大肠杆菌 BL21(DE3)菌株的一个单独菌落接种在LB + 氨苄青霉素中，并在 37℃培养过夜，在新鲜LB培养基中稀释，并在 30℃生长至0.6-0.8的OD。通过添加1 mM 异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷 (IPTG;Sigma)保持 4 小时，诱导蛋白过表达。通过Ni^2+-缀合的螯合快速流 Sepharose 4B树脂(Pharmacia)上的亲和色谱法，纯化重组的6 x His-融合蛋白。通过使用考马斯蓝的SDS-PAGE 电泳染色，检查纯度。使用双辛丁酸 (BCA) 测定 (Thermo Scientific)，确定蛋白浓度。

敲除突变体的构建

通过红霉素 抗性盒对每个完整基因的等位基因替换，构建NTHI0532、NTHI0915和NTHI0830的缺失突变体。使用下面列出的引物，通过PCR扩增所述3个基因的上游和下游区域，并克隆进Stratagene pSC-A TOPO 载体中。从pIM13 质粒纯化红霉素抗性盒。装配含有上游区域、抗性盒和下游区域的构建体。将得到的质粒线性化，并用于使用MIV方案 [121]转化176 个NTHi菌株。通过PCR、蛋白质印迹和基因座测序，证实得到的敲除的菌株。

多克隆抗血清的制备

将各4只CD1小鼠的组免疫以产生多克隆抗血清；将10 μg 纯化的蛋白用于每只小鼠。在有铝存在下腹膜内地施用重组蛋白。施用第二(第21天)和第三(第35天)加强剂量。在第49天采集血液样品。

根据内部动物伦理委员会和制度指南进行处理。

细胞分级分离和蛋白质印迹分析

在5% CO₂下在 37℃将嗜血菌属菌株在BHI中培养至对数中期。

使用得自Epicentre的PeriPreps Periplasting 试剂盒，纯化全细胞裂解物和周质级分。按照Carlone 等人描述的快速程序[122]，基于十二烷基肌氨酸-不溶解性来回收外膜蛋白(OMP)。

为了制备培养物上清液，在 4℃在 13000 g收获细菌 10 分钟。将1 ml 培养物上清液穿过0.22 mm过滤器过滤，并用50% TCA的体积在 4℃沉淀1h。

在 13000 g离心 30 分钟以后，将得到的沉淀物用70% 乙醇洗涤一次，并再悬浮于1X 样品加载缓冲液中。

根据生产商的说明书 (Invitrogen)，使用NuPAGE Gel System，通过SDS-PAGE 电泳分离每个细胞级分的蛋白，并通过考马斯蓝染色显影，或者转移到硝酸纤维素膜上进行蛋白质印迹分析。

根据标准程序进行蛋白质印迹。用针对重组NTHI0532、NTHI0915和NTHI0830产生的多克隆小鼠抗血清(1:1000稀释)和与辣根过氧化物酶 (DAKO)缀合的抗-小鼠抗血清（作为第二抗体），鉴别不同的LytM蛋白。按照生产商的说明书，用Super SignalChemiluminescent Substrate (Pierce) 和用Opti 4CN Substrate Kit (Bio-Rad)使条带显影。

共焦显微术

使用共焦成像检查LytM 蛋白在NTHi表面上的存在。使用敲除突变体作为阴性对照。将细菌培养至指数期，并在4% 低聚甲醛 (Sigma)中固定。多次洗涤以后，将细菌在polylisine包被的载玻片上铺开，并用PBS + 3% 牛血清 白蛋白(BSA) (Sigma)在室温封闭30 分钟。将样品洗涤，并与特异性抗血清 (1:1000)一起在室温温育15 分钟。将LytM 抗血清用完整的KO 细菌预吸附以使交叉反应性最小化。将细菌用PBS洗涤几次，并与AlexaFluor 488 山羊抗-小鼠IgG (1:400) (Molecular Probes)一起温育。将标记的样品用含有DAPI的ProLong®Gold 抗衰退剂 (Molecular Probes)固定，并用ZeissLSM710 共焦显微镜分析。

扫描和透射电子显微术

在176wt和敲除的菌株上进行电子显微术以观察细菌形态的缺陷。将细菌培养至指数期，用PBS洗涤，并在含有2.5% 戊二醛和2.5% 低聚甲醛的二甲基胂酸盐蔗糖缓冲液中固定过夜。然后将样品在二甲基胂酸盐缓冲液中在1% OsO4和0.15% 钌红中后固定（postfix），用1% 乙酸双氧铀封闭，并用丙酮的系列稀释物脱水。

对于SEM，然后将样品通过临界点方法使用CO₂ 在Balzers Union CPD 020（在Balzers MED 010 单元中用金溅射包被）中干燥，并用JEOL JSM 5200 电子显微镜观察。对于TEM，将样品固定，并如上所述脱水，然后包埋在基于Epon的树脂中。将薄切片用ReichertUltracut 超薄切片机用金刚石刀切割，收集在火棉胶铜载网上，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，并用 JEOL 1200 EX II 电子显微镜观察。

外膜小泡的制备

从WT和突变株分离天然外膜小泡(OMV)，将所述细菌在200 ml BHI 培养物中培养至指数期。然后将细菌离心，并将上清液过滤和在4℃放置过夜，加入蛋白酶抑制剂和EDTA。将上清液在最大 200000 X g超速离心3 小时，并将含有OMV的最终沉淀物再悬浮于PBS中。

质谱法

将SDS-PAGE 考马斯染色的条带切离并在50 mM NH₄HCO₃ 50% 乙腈中脱色。干燥步骤以后，将条带在5 mM NH₄HCO₃ 中用12.5 ng/ml 胰蛋白酶在凝胶中在 37℃消化过夜。通过加入0.1% 终浓度的三氟乙酸 (TFA)来停止反应，并对样品进行MALDI-TOF 质谱法分析。将1 µl 消化溶液点在PAC靶标(Prespotted AnchorChip 96,设置为Proteomics, BrukerDaltonics) 上，并在室温风干。将斑点用0.6 µl 70% (体积/体积) 乙醇、0.1% (体积/体积) TFA的溶液洗涤。使用预先点在靶标上的标准品，在外部校准肽质谱图。使用MALDI-TOF/TOF 质谱仪UltraFlex (Bruker Daltonics, Bremen, GmbH)，进行肽分子质量确定。以反射器模式在 25 kV的加速度电压记录在 337 nm (N2激光) 通过激光解吸产生的离子。一般而言，积累大约200个单独波谱用于改善信噪比，并通过FlexAnalysis (2.4版,Bruker Daltonics)进行分析。使用针对流感嗜血杆菌 86-028NP 数据库的MASCOT 检索使用下述参数执行肽质量指纹：(i) 1作为允许的错过切割的数目，(ii) 甲硫氨酸氧化作为可变修饰，(iii) 75 ppm 作为肽耐受性。如MASCOT评分和概率系统所定义的，仅考虑显著命中。

反应原性测定

对于萤光素酶测定，在没有选择抗生素存在下将HEK293-TLR2和HEK293-TLR4 细胞 接种进microclear 96-孔底板内的90 µl 完全培养基中。温育过夜以后，将细胞用不同浓度的OMV (10 µl/孔，从1 mg/ml 开始，在 PBS中 1:2稀释)一式两份地刺激6 h。然后，将培养基抛弃，并将细胞用20 µl Passive Lysis Buffer (Promega)在室温裂解20 分钟。通过加入100 µl/孔的Luciferase Assay Substrate (Promega) ，使用LMax II384 微量培养板读数器 (Molecular Devices)测量萤光素酶水平。将得自每个样品的原光单位(RLU)除以对照样品 (PBS)的RLU，并表达为诱导倍数 (FI)。

使用聚蔗糖 (Amersham Biosciences) 密度梯度离心，从健康供体的血沉棕黄层分离出PBMC(外周血单核细胞)。将细胞接种进microclear 96-孔底板内的180 µl 补充了10%的热灭活的FBS、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素、2 mM 谷氨酰胺的RPMI (GIBCO)中。将细胞用不同浓度的OMV ( (20µl/孔)，从1 mg/ml 开始，在 PBS中 1:2稀释)刺激过夜。 按照生产商的说明书，使用Mesoscale Assay Human-Proinflammatory 7-点 (MSDTechnology)检测炎症性细胞因子。

结果

NTHi的NT013、NT017和NT022表现出与许多以前表征的由其它革兰氏阴性细菌表达的LytM-蛋白的显著同源性。具体地，已知参与细胞分裂过程的大肠杆菌蛋白（ 诸如YebA、EnvC和NlpD）分别表现出与NT013的49%的氨基酸同一性，与NT017的40%的氨基酸同一性，和与NT022的43%的氨基酸同一性。LytM 催化结构域是NTHi和大肠杆菌蛋白之间的最保守区域，实际上，对于该特定结构域，同源性百分比增长至79%。

LytM 蛋白在NTHi 隔室上不同地分布

为了验证LytM 蛋白NT013、NT017和NT022的表达和亚细胞定位，在NTHi176菌株中制备了编码三种LytM 蛋白的基因的单独缺失突变体。使用针对每种LytM 重组蛋白产生的特异性抗血清进行免疫印迹法，以确定在周质级分、外膜级分和上清液级分中的表达水平。

如在 图1A中所示，在外膜蛋白提取物中检测到NT013 ，在周质级分中检测到NT017 ，而在所有级分中发现了NT022。作为对照，没有抗血清识别在得自各个敲除突变株的细胞制剂中与NT013、NT017和NT022对应的53 kDa、46 kDa和42.5 kDa 处的特定条带(图1A)。

令人惊奇地，针对NT013染色的细菌的共焦免疫荧光显微术没有揭示在细菌表面上的蛋白的特异性信号，从而指示NT013可能与外膜的内层有关，因为通过蛋白质印迹分析发现它存在于外膜级分中。如预期的，NT017（其存在于细胞质周围级分中），共焦显微术分析为阴性的，且证实NT022 暴露于细菌表面上(图1B)。有趣的是，抗原似乎转移到细菌表面上靠近分裂隔膜的特定区域（foci）(图1B)。 在图1C中图解了蛋白定位的模型。

176ΔNT013和176ΔNT022 表现出异常的细胞形态和严重的细胞分离缺陷

为了研究 NTHi LytM 蛋白NT013和NT022是否在细胞分离中起作用，将单个同基因敲除突变体(176ΔNT013和176ΔNT022) 在固体或液体培养基上培养，并与野生型菌株进行对比。如通过光学显微术观察到的，这些没有显示菌落形态学的差异。为了评价突变的影响，将敲除的菌株在 37℃在液体BHI中培养。WT和突变体的生长速率没有显著差异，但是在176ΔNT013和176ΔNT022的液体培养物中观察到聚集的表型(图2A)，并通过共焦成像进行确认(图2C)。还通过将培养物系列稀释物铺板在琼脂巧克力平板上，在两种不同的OD测量细菌 菌落的数目。每毫升176ΔNT013和176ΔNT022的菌落形成单位 (CFU)远远低于野生型Hi176和176ΔNT017，实际上，从176ΔNT013和176ΔNT022衍生出的CFU 分别仅为亲本菌株的约10%和1%(图2B)。

为了验证细菌 聚集表型是否是由于细胞分离的失败，我们使用了共焦和扫描电子显微术，其清楚地表明，176ΔNT013和176ΔNT022 突变体在尺寸和形态方面不同于野生型(图3A和3B)。

具体地，176ΔNT013 细胞的长度大致是野生型菌株的4倍，并且在中央部分弯曲。另一方面，176ΔNT022 突变体形成较长链(直到0.1 mm)，而对于176ΔNT017而言没有观察到明显的形态学差异。当在不同菌株(Hi162)中制备LytM 突变体时，观察到相同表型，从而指示这样的决定簇的普遍存在的功能性质。

该结果指示，NT013和NT022涉及细菌分离，尽管它们不是NTHi 细胞生长所必需的。

176ΔNT013和176ΔNT022 突变体释放外膜小泡

在细菌细胞表面的透射电子显微术 (TEM)中观察到176ΔNT013和176ΔNT022 突变体的缺陷隔膜形成(图4)。 此外，突出显示了疱在这两种突变体的表面上的排它形成(图5)。

认为这种膜起泡是由于革兰氏阴性细菌天然地分泌的外膜小泡 (OMV)的过度产生。从这两种突变体和从Hi176菌株纯化天然OMV以验证特性和定量OMV 释放。OMV的分离揭示，两种突变株产生比野生型菌株更多的小泡(图5)。OMV 制剂的TEM 分析证实了具有20-100 nm的表观直径的小泡的存在 (图5)。将LytM 突变体中的OMV 过度产生量化，并表现出相对于WT的4倍增加 (用于蛋白定量的Lowry方法)。

外膜小泡的蛋白组合物

为了对比从每种菌株提取的OMV的蛋白组合物，将样品在SDS-page凝胶上电泳，并进行考马斯蓝染色(图6A)。蛋白图样在野生型和突变株之间是类似的，尽管几个条带显示不同的强度。如预期的，质谱法分析将这些条带与许多已知的表面决定簇（包括HMW1和2、HtrA、P2、P5和OMP26）关联(图6B)。与已知的TolR 突变体以及野生型进行对比。

基于选定条带的质谱法，对从突变株纯化的OMV分析它们的蛋白含量，并与从野生型菌株纯化的OMV进行对比。

根据它们在细胞内的定位，将嗜血菌蛋白分成5类，并测量来自存在于OMV中的每一类的蛋白的量。在野生型和突变体之间观察到差异，这提示OMV 形成的不同机制(参见图7)。NT013和NT022 突变体OMV 表现出增加的脂蛋白量和减少的外膜蛋白量。定量每一类内的各种蛋白的量。脂蛋白、周质蛋白和外膜蛋白类别的结果分别图示在图8、图9和图10 中。

一种差异是在突变株中的外膜免疫显性蛋白(蛋白2和蛋白5)的量的减小(参见图10和下表)。具体地，在野生型中，这些 P2和P5的量是总量的约56%，在ΔNT013中，它下降至31%，且在ΔNT022中，它下降至23%。P2和P5是非常丰富的和可变的蛋白，并且它们的存在是在血清中针对嗜血菌属 OMV产生的交叉反应性缺乏的关键原因之一。因此，具有降低的P2和P5 浓度的突变体OMV可以用于改善交叉反应性。

在下面阐述了与NT017 突变体中的毒力因子有关的蛋白质组学数据的概述：

对得自野生型和突变体的OMV 进行免疫学研究，以确定在OMV 蛋白图样中观察到的差异是否影响LPS或脂蛋白组分的TLR活化。用得自野生型和敲除菌株的OMV的不同稀释液刺激HEK293-hTLR2和HEK293-hTLR4/CD14-MD2 细胞。没有检测到显著差异(图6C/D)。

此外，将相同刺激扩展至人外周血单核细胞 (hPBMC)以测量促炎性细胞因子产生。没有观察到显著差异(图6 E/F)。

在脑膜炎奈瑟氏球菌中的LytM 蛋白敲除

在脑膜炎奈瑟氏球菌 MC58中鉴别出3种LytM 蛋白，为：NMB1483、NMB0315和NMB1333。NMB1483 含有2个LysM 结构域和1个M23 肽酶家族结构域，且是在脑膜炎奈瑟氏球菌 B组中发现的NlpD 同系物。NMB0315也是一种属于M23 肽酶家族的溶葡萄球菌酶-型锌依赖性的金属肽酶，且特征在于含有HXH 基序的保守活性部位。NMB1333 也呈现M23 肽酶家族的典型保守结构域。在脑膜炎奈瑟氏球菌中鉴别出的LytM 蛋白的基因和蛋白序列阐述在SEQID NO: 37-42中。

在脑膜炎奈瑟氏球菌的菌株 MC58中制备了基因NMB1483 (NlpD)的敲除突变体，并将它命名为：MC58∆148。在别处描述了敲除突变体的制备的详细描述 [123]。

使用下述引物集合扩增该基因的编码序列的侧接区域：

用于在MC58中制备缺失突变体的质粒是：pBS-UD1483_Ery。通过染色体等位基因交换，用红霉素抗性盒置换该基因。

通过共焦显微术 分析来分析MC58∆1483菌株，并证实与WT菌株相比可变大小的多种聚集体的存在。对于共焦显微术分析，将细菌在GC 培养基中培养至指数期 (OD₆₀₀0.5)，并在4% 低聚甲醛中固定，然后DAPI染色 (参见图12)。

为了进一步表征细菌细胞形态，进行了TEM (透射电子显微术)和SEM (扫描电子显微术) 分析。对于TEM 分析，还在GC培养基中培养细菌至指数期 (OD₆₀₀ 0.5)。TEM 分析证实细菌聚集体的存在，且与在WT菌株中观察到的双球菌（diplococcic）相比，在MC58∆1483中表现出异常的细胞形态。此外，小泡的存在在突变株中明显可见 (参见图13A)。

对于SEM 分析，还在GC培养基中培养细菌至指数期 (OD₆₀₀ 0.5)。SEM 分析也证实三维细菌聚集体和异常细胞形态在 MC58∆1483 突变体中的存在 (参见图13B)。

还测试了MC58∆1483 突变体的生产 OMV的能力。在第一个实验中，将菌株MC58和MC58∆1483 在50 ml MCDM I (脑膜炎化学成分确定的培养基 I)中培养至稳定期 (OD₆₀₀1.3-1.5)、在250 ml 摇瓶中在 37℃、5% CO₂和185 rpm温育过夜。

对于OMV 分离，将培养物在 4℃ 在 3500 rpm 离心30 分钟，并使用Stericup过滤瓶(0.22 µm 孔径)过滤上清液。

然后将样品在 35’000 rpm (平均96’000 x g)在 4℃ 离心2 h，再用PBS洗涤，并在 35’000 rpm (平均96’000 x g)在 4℃再次离心2 h。除去上清液以后，将沉淀物再悬浮于200-500 µl PBS中。

为了检查制剂的特性和对比由MC58 WT和MC58∆1483 突变株产生的小泡的量，将相同体积的OMV装载用于SDS-PAGE 分析，并将蛋白用考马斯蓝染色。结果显示与 WT菌株相比在MC58∆1483 突变体中的不同蛋白图样。通过Lowry 测定确定的总蛋白定量表明与WT菌株相比突变体的OMV 产生的2倍增加(图14A)。

在第二个实验中，将菌株 MC58和MC58∆1483 在40 ml GC培养基中培养至指数期(OD₆₀₀ 0.5)，在250 ml 摇瓶中在 37℃、5% CO2和185 rpm温育。对于OMV 分离，遵循相同的方案。

来自SDS-PAGE 分析的结果表明OMV 蛋白仅来自MC58∆1483 突变体。当加载相同体积的得自WT菌株的OMV时，没有检测到蛋白。通过Lowry 测定进行的定量也证实OMV在得自WT菌株的制剂中的缺失(图14B)。

制备其它 OMV 制剂，并在指数和静止生长期进行样品的质量-光谱测定法蛋白质组学分析。评价并对比主要4CMenB 疫苗抗原的存在。

百日咳博德特氏菌中的LytM 蛋白敲除

在百日咳博德特氏菌 Tohama I中鉴别出6种假定的肽酶：BP1721、BP2956、BP0608、BP2919、BP3015和BP1017。BP1721和BP2919 都具有Lys-M 结构域 (参与结合peptidoglygan)和Lyt-M 结构域 (溶葡萄球菌酶-型金属肽酶)如得自大肠杆菌的NlpD和得自NTHi的NT022，其它4种蛋白仅具有Lyt-M 结构域。基因座组构没有帮助区分不同的同系物，例外是BP1721，其可以清楚地鉴别为百日咳博德特氏菌中的NlpD 同系物。多重比对表明肽酶催化部位在BP2956和NT013之间、以及在BP0608和NT017之间的高度保守。基因和蛋白序列显示在SEQ ID NO: 47-58中。BP1721是一种NlpD 同系物。BP2956是一种假定的NT013/YebA 同系物。BP0608是一种假定的NT017/EnvC 同系物。

在百日咳博德特氏菌的菌株 W28 9K-129G中制备基因BP1721的敲除突变体(NlpD同系物)。使用下述引物集合扩增该基因的编码序列的侧接区域：

如下得到基因BP1721的缺失：

将卡那霉素抗性盒在BP1721侧接区域之间克隆进自杀载体pSORTP1中。通过接合作用将pSORTP1-BP1721KO构建体引入百日咳鲍特氏菌中。针对庆大霉素抗性(存在于质粒主链上)和卡那霉素抗性(存在于质粒插入物中)，选择在第一个交换事件以后质粒向染色体中的整合。针对链霉素抗性(该质粒赋予对链霉素的敏感性)和卡那霉素抗性，选择在第二个交换事件和卡那霉素盒对BP1721基因的替换以后质粒的缺失。使用在BP1721的侧接区域外部的引物和使用百日咳鲍特氏菌 W29 9K/129G作为对照，通过PCR扩增证实卡那霉素盒对BP1721基因的替换。扩增产物的预期大小是 2189 bp（对于WT菌株）和2574 bp（对于KO菌株）。使用的引物是：BP1721 EXT 5’ FOR: AACCTGGGCTTGAACTCC (SEQ ID NO:63)； BP1721EXT 3’ REV: ACACCAGCCAGGTATTGA (SEQ ID NO:64)。

当在液体培养基中培养细菌时，细胞聚集体（其可能由于改变的细胞分裂机制）已经从培养物可见。然后接着通过共焦显微术分析证实细胞分裂缺陷。对于显微术分析，将50µl 液体培养物用4% 低聚甲醛固定，并用DAPI 染色以使DNA显影。与WT菌株相比，KO菌株清楚地表现出严重的细胞链接表型(参见图15)。

将菌株Bp W28 9G/129K和Bp W28 9G/129K ∆NlpD 在250 ml 摇瓶中在40 mlStainer-Scholte 液体培养基 (补充了400 µg/ml 链霉素)中培养至指数期 (OD₆₀₀ 4.3-4.8)，并在 35℃和180 rpm温育。

对于OMV 分离，将培养物在 4℃ 在 5000 x g离心 45 分钟，并使用Stericup 过滤瓶 (0.22 µm 孔径)将上清液过滤。然后将样品在 96000 x g 在 4℃ 离心2 h，然后用PBS洗涤，并再次在 96000 x g 在 4℃离心2 h。除去上清液以后，将沉淀物再悬浮于200 µl PBS中。

为了检查制剂的特性和对比由Bp W28 9G/129K和Bp W28 9G/129K ∆NlpD菌株产生的小泡的量，将相同体积的OMV (10 µl) 装载用于SDS-PAGE 分析，并将蛋白用SimplyBlue™ SafeStain (Life Technologies)染色。结果显示与 WT菌株相比在突变体中的不同蛋白图样(参见图19)。

在百日咳博德特氏菌的菌株 W28 9K-129G中制备基因BP2956的敲除突变体(假定的NT013/YebA 同系物)。使用下述引物集合扩增该基因的编码序列的侧接区域(粗体)：

如下得到基因BP2956的缺失。将氯霉素抗性盒在BP2956侧接区域之间克隆进自杀载体pSORTP1中。通过接合作用将pSORTP1-BP2956_KO 构建体引入百日咳鲍特氏菌中。针对庆大霉素抗性(存在于质粒主链上)和氯霉素抗性(存在于质粒插入物中)，选择在第一个交换事件以后质粒向染色体中的整合。针对链霉素抗性(该质粒赋予对链霉素的敏感性)和氯霉素 抗性，选择在第二个交换事件和卡那霉素盒对 BP2956基因的替换以后质粒的缺失。针对它们的细胞形态、OMV生产和蛋白质组学表征，分析这些缺失突变株。具体地，评价了百日咳鲍特氏菌最具免疫原性的抗原 (PT、FHA和69K)的存在。最后，针对它们在百日咳鲍特氏菌 生理学和/或发病机制中的功能，在体外分析了这些突变体，并在免疫原性和交叉反应性 研究中测试了产生的OMV。

其它假定的LytM 蛋白同系物的敲除突变体：使用下述引物集合扩增该基因的编码序列的侧接区域(粗体)：

应该理解，仅仅作为示例已经描述了本发明，且可以做出修改，同时仍然在本发明的范围和精神内。

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Claims (16)

1.一种药物组合物，其包含：(a) 得自其中至少一种含有LytM 催化结构域的蛋白被灭活的革兰氏阴性细菌的小泡和(b) 药学上可接受的载体。

2.根据权利要求 1所述的药物组合物，其中所述至少一种含有LytM 催化结构域的蛋白被敲除。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述至少一种含有LytM 催化结构域的蛋白选自NTHi的NT013、NT022和NT017中的任一种或其同系物、直系同源物或旁系同源物。

4.任意前述权利要求所述的药物组合物，其中所述革兰氏阴性细菌选自无法分类的流感嗜血杆菌（H. influenzae）、脑膜炎奈瑟氏球菌（N meningitidis）和百日咳博德特氏菌（B pertussis）。

5.任意前述权利要求所述的药物组合物，其中所述革兰氏阴性细菌是无法分类的流感嗜血杆菌。

6.任意前述权利要求所述的药物组合物，其中所述革兰氏阴性细菌不是无法分类的流感嗜血杆菌。

7.任意前述权利要求所述的药物组合物，其用在医学中使用。

8.权利要求1-6 中任一项所述的药物组合物，其为疫苗。

9.权利要求1-6 中任一项所述的药物组合物，其作为针对革兰氏阴性细菌的免疫剂使用。

10.一种用于预防或治疗哺乳动物中的革兰氏阴性细菌感染的方法，其包括下述步骤：给所述哺乳动物施用有效量的权利要求1-6中任一项所述的组合物。

11.一种用于提高哺乳动物中的抗体应答的方法，其包括：给所述哺乳动物施用权利要求1-9中任一项所述的药物组合物。

12.一种制备权利要求1-9中任一项所述的药物组合物的方法，其包括下述步骤：将小泡与药学上可接受的载体混合，所述小泡得自其中至少一种含有LytM 催化结构域的蛋白被灭活的革兰氏阴性细菌。

13.一种组合物，其包含如在权利要求1-6中的任一项中定义的革兰氏阴性细菌小泡，其不包含任何活细菌和/或完整细菌。

14.一种制备得自其中至少一种含有LytM 催化结构域的蛋白被灭活的革兰氏阴性细菌的小泡的方法，其包括从所述细菌的培养物得到小泡的步骤。

15.如在权利要求1-6中的任一项定义的革兰氏阴性细菌，其在培养基中生长的过程中与其中含有LytM 催化结构域的蛋白有活性的相同细菌相比向培养基中释放更大量的小泡和/或产生具有不同蛋白含量和/或组合物的小泡。

16.一种制备革兰氏阴性细菌的方法，其包括以下步骤：修饰编码一种或多种含有LytM催化结构域的蛋白的基因，使得所述修饰造成所述细菌当在培养基中生长时与起始细菌相比向培养基中释放更大量的小泡和/或具有不同蛋白含量和/或组合物的小泡。