CN105272984B - 吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种吡唑并[3,4‑d]嘧啶‑4‑酮衍生物或其立体异构体或其盐，具有如下式(1)或式(2)结构：

Description

吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或可药用的盐及其制备方法，以及至少包括一种所述化合物或其盐作为活性成分的药学制剂，以及在预防和治疗高尿酸血症疾病中的应用，属于医药领域。

背景技术

痛风是人体嘌呤代谢异常所致的一组综合征，高尿酸血症是其病变发展中的一个阶段。根据发病原因，可将其分为原发性痛风和继发性痛风两种类型。

原发性痛风有明显的家族遗传倾向，好发于中老年人，发病高峰为30～50岁，约95％为男性，5％女性常为绝经期后发病。原发性痛风的病因主要包括两个方面：

(1)遗传因素临床所见，痛风有明显的家族遗传倾向，痛风患者亲属合并无症状高尿酸血症的检出率明显高于非痛风患者。痛风与其他具有遗传倾向的代谢性疾病(肥胖、高血压、高脂血症、糖尿病等)关系密切。已查明导致尿酸生成过多的嘌呤代谢中，引起酶的活性改变有酶基因突变的遗传基础。

(2)环境因素暴饮暴食、酗酒、食入富含嘌呤食物过多是痛风性关节炎急性发作的常见原因。社会经济状况的改善，肥胖、高血压等代谢疾病患病率增加，也使痛风的患病率增加。

继发性痛风除因先天性肾小管功能异常和慢性肾功能衰竭所致继发性痛风起病缓慢外，多起病较急。继发性痛风的病因主要包括以下三个方面：

(1)引起体内尿酸生成过多的病因如白血病、淋巴瘤进展期，尤其是化疗后，真性红细胞计数增多症等。严重外伤、挤压伤、大手术后。

(2)引起肾脏尿酸排出减少的病因如重症高血压、子痫致肾血流量减少，影响尿酸的滤过；任何原因引起的肾功能衰竭；先天性肾小管功能异常、范可综合征、巴特综合征等；影响肾小管分泌尿酸的代谢异常，如乙醇中毒、饥饿过度、酮症酸中毒、乳酸酸中毒等可引起血液中有机酸含量增多，抑制肾小管尿酸的分泌；一些药物可引起高尿酸血症，如乙胺丁醇。

(3)影响血液尿酸浓度变化的因素长期用利尿剂治疗、重度肾前性脱水，使血液浓缩、增加血液尿酸浓度。

原发性痛风临床表现有明显的家族遗传倾向，根据病情进展特征，痛风病程可分为以下4期：无症状高尿酸血症期；急性发作期；无症状的间歇期；慢性期。主要临床表现有以下几方面：

(1)无症状性高尿酸血症的发生常十分隐袭，初期为间断出现，逐渐呈持续性，多于体检或因其他病就诊时无意发现。

(2)急性痛风性关节炎此为痛风最具有特征且多见的症状，起病急骤，在数小时之内受累关节即可出现明显的红肿、热痛，常于夜间发作，因关节剧痛而醒，关节局部因疼痛不能触摸，甚至不能盖床单，活动受限。以足部第一跖趾为最好发部位，其次为手足的其他小关节、踝、膝、腕、肘、肩关节。初期多为单关节病变，两侧交替发生，后期可为多关节病变，同时或先后出现。暴饮暴食、饮酒过量、劳累、感染、外伤、手术、创伤、关节周围受压，鞋履不适等均可为诱发因素。急性发作症状多持续一周余，然后逐渐缓解。关节局部红肿消退后，可有皮肤发痒、脱皮、色素沉着。发作期全身症状可有发热、乏力、心率加快、头痛等。

(3)痛风间歇期痛风间歇期是指两次急性痛风性关节炎发作的间期，短则数周，长则数十年。偶尔一些患者第1次急性关节炎后再无发作，多数为由长至短。间歇期病情相对平稳，亦称为静止状态。部分患者可有原受累关节活动后不适，休息后可缓解。仍可有高尿酸血症，受饮食及治疗情况影响，血尿酸水平不稳定。

(4)慢性砂砾性痛风长期高尿酸血症未能纠正，尿酸盐结晶可广泛沉积于关节软骨、滑膜、韧带、皮下、肾脏，逐渐形成尿酸盐结石，重则影响沉积组织的生理功能。其中部分已形成的结石尿酸得到控制后，尚能消融，缩小，甚至完全消失，此为痛风性结石较为特殊的转归。

(5)皮下痛风石结节由尿酸盐结晶沉积于皮下形成，好发于耳轮、关节周边(趾、指间关节，膝关节，肘关节，腕关节等)，结节大小不等，芝麻大小至1～2厘米大结节，边界不规则，质硬，表浅部位呈黄白色。与周边组织界限分明的结节，无触痛，但如合并细菌感染，可有周边组织红肿、压痛，多有破溃口。针刺取出结石成分或破溃分泌物镜检为尿酸盐结晶。

(6)慢性痛风性关节炎反复多次急性关节炎发作引起的关节组织纤维化及痛风石在关节软骨、滑膜、韧带的沉积，使病变关节逐渐破坏变形，失去运动功能。趾、指间关节，踝、膝、腕关节易受累。

(7)慢性痛风性肾病和肾结石尿酸盐结晶在肾脏的沉积有2种形式，包括尿酸分泌排泄不足引起的肾小管外尿酸盐沉积(髓质间质、肾小管内尿酸浓度正常)及肾小管内尿酸浓度过高不能及时排出而滞留的肾小管内尿酸盐沉积。慢性尿酸性肾病可在这两种尿酸肾内沉积形式的基础上发生，多数继反复发作的急性痛风性关节炎之后，少数可在仅有长期高尿酸血症的基础上发生。

继发性痛风的临床表现为在发生高尿酸血症前多为继发病的临床特征。除因先天性肾小管功能异常和慢性肾功能衰竭所致继发性痛风起病缓慢外，多起病较急。以高尿酸血症和大量尿酸盐在肾小管内沉积引起急性肾功能衰竭为多见，血尿酸浓度可>1mmol/L，尿尿酸明显增多，尿沉渣中可见大量尿酸盐结晶，偶可见镜下或肉眼血尿。患者可有尿痛、腰背痛、恶心、呕吐、少尿或无尿等症状。

痛风的治疗包括两个方面，即消炎止痛和降低血尿酸两个方面，前者为标，后者为本，急则治标，达到标本兼治的目的，因此，相应的药物包括以下两类：

一、消炎止痛类药物

(1)秋水仙碱为秋水仙球茎中提取的一种生物碱，有阻止细胞有丝分裂的作用，可抑制炎性细胞的趋化和减少炎症因子释放，对于急性发作的痛风关节炎具有独特的抗炎消肿效用，可在短短数小时内缓解症状。

(2)非甾体抗炎药该类药物品种较多，不仅可口服、局部外用，也可使用栓剂，主要通过抑制组织对尿酸沉积的炎性反应减轻痛风急性关节炎发作时的局部软组织红肿、热痛及全身反应，对血清尿酸水平多无影响。

(3)肾上腺糖皮质激素在急性痛风关节炎发作症状特别严重，或对秋水仙碱不耐受者，可用中小剂量泼尼松、地塞米松，以减轻组织的炎性反应。

二.降尿酸药物

体内尿酸的生成与嘌呤代谢有关，在嘌呤代谢的最后步骤中，次黄嘌呤在黄嘌呤氧化还原酶(XOR)的作用下生成黄嘌呤，再进一步生成尿酸，抑制该酶的活性可以有效的减少尿酸的生成。降尿酸药物主要通过抑制体内尿酸生成和促进血液中尿酸的排出发挥降尿酸效果，主要药物有以下几种：

(1)丙磺舒该药可抑制肾小管对尿酸盐的再吸收，从而增加尿酸从肾脏的排出，适用于血尿酸高，尿尿酸排量<3.6mmol/d(<600mg/d)的痛风患者。

(2)苯溴马隆(痛风利仙)为苯丙呋喃类衍生物，通过抑制近端肾小管对尿酸的重吸收而促进尿酸的排泄，不阻挠嘌呤核苷酸的代谢。主要通过胃肠道排出(肝内代谢，胆汁排出)，适用于尿尿酸排量<3.6mmol/d的痛风患者，也可用于肌苷轻度升高的早期肾功能不全的痛风患者。

(3)别嘌醇为黄嘌呤氧化酶抑制剂，可抑制次黄嘌呤转变为黄嘌呤再转为尿酸，从而减少了尿酸的合成。适用于自身尿酸生成过多的原发或继发痛风患者。

在常用的降尿酸药物中，以别嘌醇最为常用，虽然新型降尿酸药物非布索坦已经上市，但是别嘌醇由于疗效肯定、价格低廉，仍然为目前临床使用最广泛的降尿酸药物。

然而，别嘌醇的疗效相对偏弱，而且安全性较差，因而，开发疗效更优、安全性更佳的别嘌醇衍生物满足巨大的、急迫的临床需求仍然具有非常重要的意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其立体异构体或其盐，其与别嘌醇相比，降尿酸活性更高、安全性更高。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其立体异构体或其盐，具有如下式(1)或式(2)结构：

其中，

G选自芳基、烷基氧基芳基、烷基羰基氧基芳基、烷基羰基氧基烷基芳基、杂芳基、烷基氧基杂芳基、烷基羰基氧基杂芳基或者烷基羰基氧基烷基杂芳基，所述芳基或杂芳基或官能团中的芳基或杂芳基中的H任选被一个或多个烷基、芳基烷基、联苯基烷基、芳基酰基、杂芳基烷基、杂芳基酰基、氨基磺酰基、卤素取代，其中芳基、杂芳基、氨基、联苯基任选进一步被一个或多个烷基、卤素、四唑基取代；

所述杂芳基选自吡啶基、呋喃基、嘌呤基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹嗪基、咪唑基、吲唑基、二氢吲哚基、吲哚基、苯并噻二唑基、异苯并呋喃基、异苯并二氢吡喃基、异二氢吲哚基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基，异噁唑基、二氮杂萘基、噁二唑、噁唑基、吩嗪基、吩噻嗪基、酞嗪基、蝶啶基、喹喔啉基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、噻二唑基、噻唑基、硫代苯并二氢吡喃基、噻吩基、三唑基、异噻苯并二氢吡喃基、苯并咪唑基、苯并二氧六环基、苯并二氧杂环庚三烯基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并噻唑基、苯并噁二唑、苯并噁嗪基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并吗啉基、苯并硒杂二唑基、苯并噻吩基、咔唑基、苯并二氢吡喃基或咪唑并[1,2-a]吡啶基；

所述卤素指氟、氯、溴或碘。

作为本发明优选方案，所述吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其立体异构体或其盐：

其中，

G选自苯基、C1-C5烷基氧基苯基、C1-C5烷基羰基氧基苯基、C1-C5烷基羰基氧基C1-C5烷基芳基、杂芳基、C1-C5烷基氧基杂芳基、C1-C5烷基羰基氧基杂芳基或者C1-C5烷基羰基氧基C1-C5烷基杂芳基，所述的苯基或者杂芳基或官能团中的苯基或杂芳基中的H任选被一个或多个C1-C5烷基、苯基C1-C5烷基、联苯基C1-C5烷基、苯基酰基、杂芳基烷基、杂芳基酰基、氨基磺酰基或卤素取代，其中所述苯基C1-C5烷基中的苯基、杂芳基酰基中的杂芳基、氨基磺酰基中的氨基、联苯基C1-C5烷基中的联苯基任选进一步被一个或多个烷基、卤素、四唑基取代；

所述杂芳基选自吡啶基、呋喃基、嘌呤基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡咯基、喹啉基、喹嗪基、咪唑基、吲唑基、二氢吲哚基、吲哚基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基，异噁唑基、噁唑基、吩嗪基、四唑基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并吗啉基、苯并硒杂二唑基、苯并吡咯基或苯并噻吩基；

所述卤素选自氟、氯或溴。

作为本发明进一步优选方案，所述吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其立体异构体或其盐：

其中，

G选自苯基、C1-C5烷基氧基苯基、C1-C5烷基羰基氧基苯基或者C1-C5烷基羰基氧基C1-C5烷基杂芳基，所述C1-C5烷基氧基苯基或C1-C5烷基羰基氧基苯基中的苯基，或者所述C1-C5烷基羰基氧基C1-C5烷基杂芳基中的杂芳基中的H任选被一个或多个甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、苯基甲酰基、杂芳基酰基、联苯基甲基或氨基磺酰基取代，其中苯基、联苯基、氨基和杂芳基任选进一步被一个或多个甲基、乙基、正丙基、异丙基、卤素、四唑基取代；

所述杂芳基选自呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、吡咯基、苯并吡咯基、咪唑基、苯并咪唑基、吡唑基、苯并吡唑基、吡啶基或嘧啶基；

所述卤素选自氟、氯或溴。

作为本发明更进一步优选方案，所述吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其立体异构体或其盐：

其中，

所述G为

本发明所述吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其立体异构体或其盐能以立体异构体的形式存在，包括所有的几何异构体、光学异构体及其混合物。所述吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其立体异构体或其盐也可以含有一个或多个不对称碳原子，并且因此可以显示出光学异构和/或非对映异构现象。可以使用常规技术，例如色谱或分步结晶等，分离对映异构体。所需要的光学异构体也可以通过合适的光学活性的起始原料，在不会造成外消旋或差向(立体)异构化的条件下的反应(即‘手性池’方法)，通过合适的起始原料与‘手性助剂’的反应，通过衍生化(即拆分，包括动态拆分)，接着通过常规的方式例如色谱分离出对映衍生物，或通过在对本领域人员已知的条件下与合适的手性试剂或手性催化剂反应，得到或者反应后分离出对应异构体，所有的立体异构体和其混合物都被包括在本发明的范围内。

本发明的化合物也可显示出互变异构现象，所有的互变异构形式和其混合物也被包括在本发明的范围内。

本发明所述吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其立体异构体或其盐优选如下化合物：

本发明还提供一种吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其立体异构体或其盐的制备方法，在合适的溶剂中，式(3)化合物或者式(4)化合物与式(5)化合物在存在/不存在活化剂的条件下反应而得到的，

其中G如前面所定义。

式(3)或者(4)的化合物可以参考International Journal of Pharmaceutics,Volume64,Issue1,1990,P75-87所述的方法合成。

本发明还提供另一种吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其立体异构体或其盐的制备方法，在合适的溶剂中，式(3’)化合物或者式(4’)化合物与式(5’)化合物在存在/不存在活化剂的条件下反应，

其中G’选自：

所述活化剂选自氯化亚砜、草酰氯、二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、对硝基苯酚或烯丙醇中的一种或两种以上。

在制备过程中，所述式(5)、式(3’)、式(4’)化合物可在活化剂作用下将羧酸活化为酰氯、活泼酰胺或者活泼酯。

具体地说，所述式(5)、式(3’)、式(4’)化合物中的羧酸与氯化亚砜或草酰氯反应生成酰氯，或者与活泼的碳二亚胺，例如二环己基碳二亚胺，即DCC，或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，即EDC反应活化，或者与醇或酚形成活泼酯，例如与对硝基苯酚或烯丙醇反应。

式(5)和(5’)化合物中部分是商品化的化合物，可以直接使用，另一部分需要通过将已经商品化的试剂通过简单的衍生化生成羧酸，包括但不限于将羧酸衍生物水解为羧酸，或者与含有两个羧基的有机酸酐反应生成羧酸。

所述合适的溶剂可以是例如乙腈、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、乙酸甲酯或其混合物。

采用本发明所述的制备方法得到表1所示优选的化合物。

表1 本发明所述优选化合物的合成

本发明还提供了上述吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其立体异构体或其盐在制备预防和治疗高尿酸血症疾病药物中的应用。

本发明所述吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其立体异构体或其盐可以用于制备各种给药途径的制剂，包括乳剂、溶液、混悬剂、气雾剂以及干粉制剂的形式进行局部给药(如对皮肤或对肺和/或气道)；或以片剂、胶囊、糖浆、散剂或颗粒如经口服进行全身给药；或以溶液或混悬液的形式进行肠胃外给药；或进行皮下给药；或以栓剂的形式经直肠给药；或透皮给药。

本发明所述的吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其立体异构体或其盐，与别嘌醇相比具有更优的降尿酸效果及更佳的安全性。

具体实施方式

用下面的非限制性实施例进一步说明部分本说明化合物及其制备方法，同时这些实施例所用的某些原料的制备过程以后面的制备实施例说明。

为了描述的方便，下面各实施例中的原料、中间体或者产物中涉及到互变异构体时，均以其中的一种互变异构体的结构式或者化学名称代表，而不应当理解为仅存在某一种互变异构体的形式。

实施例1 A1-1的制备

1.1 1-羟甲基-5-氢-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮的制备

取1,5-二氢-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮20g，加入到1000ml0.2mol/l的甲醛溶液中，用氢氧化钠水溶液调pH至7，室温反应24小时，抽滤，滤饼用水洗涤10ml×10次，真空70℃干燥至恒重，得白色粉末状固体21.8g，产率90％。

¹H-NMR(400MHz，d⁶DMSO)：δ12.41(s，1H)，8.18(s，1H)，8.14(d，1H)，6.37(s，2H)，2.32(s，1H)。

1.2 2-甲基-2-(4-(4-氯苯甲酰基)苯氧基)丙酸制备

将36g2-甲基-2-(4-(4-氯苯甲酰基)苯氧基)丙酸异丙酯溶解于15ml甲醇中，然后加入3mol/L的氢氧化钠溶液35ml，回流反应2小时后，在冰水浴下以1mol/L的盐酸调pH为2，过滤，水洗涤3次，干燥后得白色固体29g，产率91.7％。

¹H-NMR(400MHz，d⁶DMSO)：δ13.21(s，1H)，δ7.60-7.70(m，4H)，7.50-7.60(d，2H)，6.76-6.79(d，2H)，1.59(s，6H)。

1.3 2-甲基-2-(4-(4-氯苯甲酰基)苯氧基)丙酰氯制备

向15.6g的1.2步骤的产物酸中加入5ml氯化亚砜及1滴DMF，然后在70℃下反应2小时后，减压蒸干得淡黄色固体16.9g，不经纯化直接用于下一步反应中。

1.4 A1-1的制备

向盛有8.3g的1-羟甲基-5-氢-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮的三口烧瓶中加入100ml四氢呋喃，搅拌10分钟后，在冰水浴冷却下加入16.8g的上一步酰氯，然后滴加入6ml三乙胺，撤去冰水浴后，先于室温下反应1小时，再于50℃下反应1小时后停止反应。

¹H-NMR(400MHz，d⁶DMSO)：δ12.41(s，1H)，8.18(s，1H)，8.14(d，1H)，δ7.60-7.70(m，4H)，7.50-7.60(d，2H)，6.76-6.79(d，2H),6.37(s，2H)，1.59(s，6H)。

ESI-MS:m/z:467、468、469、470(M+H)。

实施例2 化合物A2-1的制备

将14.2g的对-[(二丙氨基)磺酰基]苯甲酸、8.3g的1-羟甲基-5-氢-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮及10.3g的N,N-二环己基碳二亚胺混合后加入100ml四氢呋喃中，室温搅拌60分钟，TLC监测反应完毕，停止反应，过滤，滤饼以四氢呋喃洗涤3次x10ml后，蒸干得粗品23.0g，然后以无水乙醇重结晶得17g白色固体，产率78％。

¹H-NMR(400MHz，d⁶DMSO)：δ12.48(s，1H)，8.22-8.26(d，2H)，8.09-8.11(d，2H)，7.93-7.95(d，2H)，6.54(s，2H)，3.01-3.05(t，4H)，1.42-1.45(m，4H)，0.77-0.86(m，6H)。

ESI-MS：m/z434、435、436(M+1)。

实施例3 化合物A3-1的制备

3.1 1-羟甲基-5-氢-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮丁二酸单酯的制备

于100ml反应瓶中加入7.8g的丁二酸酐、4.8g的1-羟甲基-5-氢-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮及60ml吡啶中，室温搅拌96小时，停止反应，将反应液倾入150ml4mol/L的HCl中，搅拌4小时析出大量白色固体，抽滤，滤饼水洗、干燥得白色粉末状固体4.3g，产率54％。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ12.36(s，1H)，11.48(s，1H)，8.04(s，1H)，7.97(s，1H)，6.28(s，2H)，2.64(s，2H)，2.53(s，2H)。

3.2 化合物A3-1的制备

将2.26g3.1步骤的中间体羧酸、2.12g的3,5-二溴-4-羟苯基-2-乙基-3-苯骈呋喃基-甲酮及2.69g的N,N-二环己基碳二亚胺混合后加入30ml DMF，室温搅拌反应2小时后停止反应，将反应体系过滤，然后向滤液中加入400ml乙酸乙酯，以饱和食盐水洗涤3次后，柱层析得2.13g的白色目标产物。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：11.51(s，1H)，8.20(s，1H)，8.06(s，1H)，8.01(s，2H)，7.50-7.52(d，1H)，7.38-7.40(m，1H)，7.30-7.34(m，1H)，723-7.27(m，1H)，6.39(s，2H)，3.09(m，2H)，2.88-2.90(m，4H)，1.34-1.36(t，3H)。

ESI-MS：m/z:+Q1:671、673、675。

实施例4 化合物A4-1的制备

将2.26g3.1步骤的中间体羧酸、4.62g的2-丁基-4-氯-1-[[2'-(1H-四唑-5-基)[1，1′-联苯基]-4-基]甲基]-H-咪唑-5-甲醇单钾盐及2.69g的N,N-二环己基碳二亚胺混合后加入30ml DMF，室温搅拌反应2小时后停止反应，将反应体系过滤，然后向滤液中加入400ml乙酸乙酯，以饱和食盐水洗涤3次后，柱层析得1.09g的白色目标产物。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：11.0(s，1H)，8.04(s，1H)，7.97(s，1H)，7.92-7.94(d，1H)，7.52-7.65(m，2H)，7.43-7.47(m，1H)，7.15-7.17(d，2H)，6.87-6.89(d，2H)，6.28(s，2H)，5.08(s，2H)，4.91(s，2H)，2.42-2.68(m，6H)，1.22-1.34(m，2H)，0.82-0.86(m，3H)。

ESI-MS：m/z:+Q1:405(碎片峰)、671(M-K+2)、693(M-K+Na+1)。

实施例5 针对给予外源性尿酸同时抑制尿酸分解的大鼠模型的药效筛选实验

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级SD大鼠110只，体重150～180克，雄性，动物适应性饲养1周，观察体表体征，自由饮水和采食。所有笼具经过121℃灭菌处理，饲料经辐照灭菌处理，水灭菌处理的纯净水。

1.2试验药品

筛选化合物代号：A1-1、A2-1、A3-1、A4-1(简称“A系列化合物”或者“受试药物”)，

阳性对照药：别嘌醇。

1.3试剂与药品

氧嗪酸钾(Oxonic acid)、尿酸(Uric)、羧甲基纤维素钠(CMC)、尿酸(UA)测定试剂盒。

1.4实验仪器

尿酸(UA)检测采用美国MULTISKAN MK3酶标仪，意大利BASA-18全自动生化分析仪。

1.5分组与给药

将110只雄性SD大鼠随机分成正常对照组、模型组、A1-115mg/kg组、A1-130mg/kg组、A2-115mg/kg、A2-130mg/kg组、A3-130mg/kg组、A3-160mg/kg组、A4-130mg/kg组、A4-160mg/kg组及阳性药别嘌醇30mg/kg组。每组动物10只，采用灌胃给予受试药物。

2、实验方法及操作步骤：

正常对照组不给任何药物，其余各组每天口服给予氧嗪酸钾1.5g/kg+尿酸0.15g/kg(溶于0.5％羧甲基纤维素钠)，每日按时按量灌服1次，共计10天。在实验前和造模10天眼眶取血0.5ml，分离血清，测定血清尿酸含量。造模成功后口服灌胃给予受试药物和别嘌醇4天，分别在给药第4天后2小时，采取大鼠眼眶静脉血1ml，3500RPM，15min，取上清液检测血清尿酸的含量。

3、统计学处理

数据用均数土标准差表示，应用Excel7.0和SPPS13.0for windows软件进行分析，组间比较用q检验，用药前后比较用自身配对t检验，P<0.001表示差异有显著意义。

4、实验结果

表2 A系列化合物对尿酸血症大鼠血清尿酸含量的影响

^*p<0.001与模型组比。

表3 A系列化合物对尿酸血症大鼠体重的影响

通过建立给予外源性尿酸同时抑制尿酸分解的大鼠尿酸血症模型，对A系列化合物进行药物筛选，并与阳性药物别嘌醇的降低血清尿酸作用的比较。

表2结果显示，与模型组相比，别嘌醇、A1-1、A2-1、A3-1、A4-1均有显著的降低大鼠中血清尿酸的作用，且A系列化合物降低血清尿酸的作用优于别嘌醇，并且有剂量效应关系。

表3结果显示，与模型组相比，别嘌醇对大鼠的体重有一定的影响，即别嘌醇组动物的体重增量显著低于模型组，而A系列化合物组的动物体重增量与模型组相当，或略低但差异不显著。

实施例6 针对大量嘌呤物质加尿酸分解酶抑制剂致小鼠高尿酸血症动物模型的药效筛选实验

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级KM小鼠165只，体重20～24克，雄性，动物适应性饲养3天，观察体表体征，自由饮水和采食。所有笼具经过121℃灭菌处理，饲料经辐照灭菌处理，水灭菌处理的纯净水。

1.2试验药品

筛选化合物代号：A1-1、A2-1、A3-1、A4-1(简称“A系列化合物”或者“受试药物”)，

阳性对照药：别嘌醇。

1.3试剂与药品

氧嗪酸钾(Oxonic acid)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、尿酸(UA)测定试剂盒。

1.4实验仪器

尿酸(UA)检测采用美国MULTISKAN MK3酶标仪，意大利BASA-18全自动生化分析仪。

1.5分组与给药

将165只雄性KM小鼠随机分成正常对照组、模型组、A1-140mg/kg组、A1-180mg/kg组、A2-140mg/kg、A2-180mg/kg组、A3-140mg/kg组、A3-180mg/kg组、A4-140mg/kg组、A4-180mg/kg组，阳性药别嘌醇40mg/kg组。每组动物15只。

2、实验方法及操作步骤：

正常对照组不给任何药物，其余各组每天腹腔注射次黄嘌呤500mg/kg和皮下注射尿酸氧化酶抑制剂氧嗪酸钾50mg/kg配合使用，连续7d。在实验前和造模7d后，每组各取2-3只小鼠，去眼球取血0.5ml，分离血清，测定血清尿酸含量，作为小鼠正常血清尿酸值和造模小鼠血清尿酸值。造模成功后灌胃给予受试药物和别嘌醇4天，分别在最后1次给药2小时，去眼球取血0.5ml，4000RPM，20min，取上清液检测血清尿酸的含量。

3、统计学处理

数据用均数土标准差表示，应用Excel7.0和SPPS13.0for windows统计软件进行分析，组间比较用q检验，用药前后比较用自身配对t检验，P<0.001表示差异有显著意义。

4、实验结果

表4 A系化合物对尿酸血症小鼠尿酸含量的影响

^*p<0.001与模型组比。

通过建立大量嘌呤性尿酸同时抑制尿酸分解的小鼠尿酸血症模型，对A系列化合物进行药物筛选，并与阳性药物别嘌醇的降低血清尿酸作用比较。

结果显示，与模型组相比，别嘌醇、A1-1、A2-1、A3-1、A4-1均有显著的降低血清尿酸的作用，且低剂量组与别嘌醇的降尿酸效果相当，而高剂量组降低血清尿酸的作用优于别嘌醇，并且有剂量效应关系(见表4)。

实施例7 针对抑制尿酸分解的大鼠模型药效筛选实验

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级SD大鼠88只，体重180～220克，雄性，动物适应性饲养3天，观察体表体征，自由饮水和采食。所有笼具经过121℃灭菌处理，饲料经辐照灭菌处理，水灭菌处理的纯净水。

1.2试验药品

筛选化合物代号：A1-1、A2-1、A3-1、A4-1(简称“A系列化合物”或者“受试药物”)，

阳性对照药：别嘌醇。

1.3试剂与药品

氧嗪酸钾(Oxonic acid)、尿酸(UA)测定试剂盒。

1.4实验仪器

尿酸(UA)检测采用美国MULTISKAN MK3酶标仪，意大利BASA-18全自动生化分析仪。

1.5分组与给药

将88只雄性SD大鼠随机分成正常对照组、模型组、A1-115mg/kg组、A1-130mg/kg组、A2-115mg/kg组、A2-130mg/kg组、A3-115mg/kg组、A3-130mg/kg组、A4-130mg/kg组、A4-160mg/kg组，阳性药别嘌醇20mg/kg组。每组动物8只。

2、实验方法及操作步骤

正常对照组不给任何药物，其余各组腹腔注射氧嗪酸钾盐300mg/kg，1h后灌胃给予受试药物，给药后2h去眼球取血1ml，离心4000RPM，20min，取血清测定尿酸含量。

3、统计学处理

数据用均数土标准差表示，应用Excel7.0和SPPS13.0for windows统计软件进行分析，组间比较用q检验，用药前后比较用自身配对t检验，P<0.001表示差异有显著意义。

4、实验结果

表5 A系列化合物对尿酸血症大鼠血清尿酸含量的影响

^*p<0.001与模型组比。

通过建立抑制尿酸分解的大、小鼠尿酸血症模型，对A系列化合物进行药物筛选，并与阳性药物别嘌醇的降低血清尿酸作用比较。结果显示，与模型组相比，别嘌醇、A1-1、A2-1、A3-1、A4-1均有显著的降低血清尿酸的作用，且低剂量组与别嘌醇的降尿酸效果相当，而高剂量组降低血清尿酸的作用优于阳性对照药别嘌醇，并且有剂量效应关系(见表5)。

采用上述方法对本发明所述其他化合物进行检测，其结果与上述一致，所述A系列化合物均具有明显的降低血清尿酸的作用。

实施例8 受试样品口服急性毒性实验

受试样品：

受试样品(别嘌醇、A1-1，A2-1，A3-1和A4-1)

配制方法：用0.2％化合物研磨配成混悬液.

受试动物：

ICR小鼠。

体重：18-22g。

动物数：300只。

剂量设置：

预试验显示别嘌醇、A1-1，A2-1，A3-1和A4-1均有一定毒性，1A1-1，A2-1，A3-1在600mg/kg剂量可引起4/4只小鼠死亡，而别嘌醇及A4-1分别在200和400mg/kg剂量下引起4/4只小鼠死亡。在预实验基础上，各受试物正式试验剂量设置如下表：

表6 各受试物正式试验剂量设置

给药途径：

灌胃给药(ig)。

试验方法：

试验室环境：室温24±2℃，相对湿度60～70％。

观察指标：将化合物按上述剂量根据给药容积按等比稀释法配成相应浓度的药物溶液等容ig给药1次，记录小鼠各种中毒症状及死亡情况，死亡动物进行尸检。

观察期：14天。

试验结果：

1、异常反应：

小鼠ig别嘌醇、A1-1、A2-1，A3-1和A4-1五个化合物后12h之内，仅别嘌醇组高剂量给药部分动物出现活动减少，其他组未见异常；给药24内A1-1、A2-1、A3-1、A4-1各剂量组未见动物死亡，别嘌醇部分高剂量组动物死亡；随后各组均有动物陆续出现死亡，给药第6天后各组存活动物未见死亡。死亡动物及存活动物仅见活动减少及消瘦，未见其他明显异常。

2.尸检结果：

死亡动物尸检均可见双侧肾脏颜色变浅，尿潴留，胃内白色内容物(化合物)残留，其他脏器未见明显异常，但A1-1、A2-1，A3-1和A4-1组的脏器异常的比例和程度均明显低于别嘌醇组；存活动物尸检显示，仅别嘌醇组部分动物仍可见肾脏颜色变浅，尿潴留，盲肠增大，肠胀气等症状，而A1-1、A2-1，A3-1和A4-1化合物组存活动物尸检均未见明显脏器异常改变。

小鼠ig化合物的死亡情况及LD₅₀值。

表7 小鼠ig化合物的LD₅₀值(用Bliss法^[1]计算)

#本次试验中采用的别嘌醇对小鼠的LD50与权威文献报道的别嘌醇的LD50值比较接近，文献报道的别嘌醇LD50值为78mg/kg(I.M.Ovcharova,I.M.Zasosova,L.N.Gerchikov,M.E.Shuvalova,E.S.Golovchinskaya,and S.S.Liberman.ALLOPURINOL,ITS SYNTHESIS AND PHARMACOLOGICAL ACTIVITY，Pharmaceutical Chemistry Journal(English translation).Translation of KHFZAN.1973，7(11),735-736)。

小结：化合物A1-1～A4-1的安全性显著优于别嘌醇。

采用相同的方法对本发明所述其他A系列化合物进行检测，其结果显示，其他A系列化合物的安全性也显著优于别嘌醇。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

工业实用性

本发明所述的吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其立体异构体或其盐，与别嘌醇相比具有更优的降尿酸效果及更佳的安全性。

Claims (2)

1.一种式(1)或式(2)所示的吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其盐的制备方法：

其特征在于，在合适的溶剂中，式(3)化合物或者式(4)化合物与式(5)化合物在存在/不存在活化剂的条件下反应而得到，

式(1)、式(2)和式(5)中的G选自：

所述活化剂选自氯化亚砜、草酰氯、二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐中的一种或两种以上；

所述合适的溶剂选自乙腈、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、乙酸甲酯或其混合物。

2.一种式(1’)或式(2’)所示的吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮衍生物或其盐的制备方法：

其特征在于，在合适的溶剂中，式(3’)化合物或者式(4’)化合物与式(5’)化合物在存在/不存在活化剂的条件下反应而得到，

式(1’)、式(2’)和式(5’)中的G’选自：

所述活化剂选自氯化亚砜、草酰氯、二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐中的一种或两种以上；

所述合适的溶剂选自乙腈、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、乙酸甲酯或其混合物。