CN105254718A - 一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用 - Google Patents
一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105254718A CN105254718A CN201510688999.8A CN201510688999A CN105254718A CN 105254718 A CN105254718 A CN 105254718A CN 201510688999 A CN201510688999 A CN 201510688999A CN 105254718 A CN105254718 A CN 105254718A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- coding sequence
- peptide
- bovine lactoferrin
- pcr
- lfcinb
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 101800004361 Lactoferricin-B Proteins 0.000 title description 2
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 101000798100 Bos taurus Lactotransferrin Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 229940072440 bovine lactoferrin Drugs 0.000 claims abstract description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 claims abstract description 26
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 7
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims abstract description 6
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 11
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 4
- 101100480489 Arabidopsis thaliana TAAC gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 11
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 abstract description 10
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 abstract description 10
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 abstract description 7
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 abstract description 5
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 abstract description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 abstract description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 abstract description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 abstract description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 abstract 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 abstract 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 abstract 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 abstract 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-MBOVONDJSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-propan-2-ylsulfanyloxane-3,4,5-triol Chemical compound CC(C)SC1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-MBOVONDJSA-N 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000004385 Sulfurtransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000984 Sulfurtransferases Proteins 0.000 description 1
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- DTQFKZRVARUELC-GEMLJDPKSA-N [S].OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O Chemical compound [S].OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O DTQFKZRVARUELC-GEMLJDPKSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用，该方法选取氨基酸编码序列NO.1为目标蛋白，然后将氨基酸序列NO.1，转化成核苷酸编码序列NO.2，并在苷酸编码序列NO.2设计并人工合成两条反相互补的寡核苷酸链上下游引物，在上下两条引物的5’端分别引入限制性酶切位点？EcoR？I和？Xho？I，PCR扩增获得抗菌肽基因片段，分别构建重组表达载体，转化大肠杆菌后诱导表达，超声裂解菌体，SDS-PAGE凝胶电泳检测，融合蛋白GST-LfcinB成功表达，融合蛋白经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化后，经羟胺剪切缓冲液切割融合蛋白，释放抗菌肽。通过琼脂扩散法抑菌实验检测其对大肠杆菌和金色葡萄球菌都具有明显的抑菌活性。克服了牛乳铁蛋白肽分子量较小容易被蛋白酶水解，造成产量低。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体涉及一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用。
背景技术
近年来从世界范围来看由于抗生素的过度使用，造成细菌性感染和疾病呈上升趋势负面效应越来越大，耐药性菌株的不断出现也越来越引起人们忧虑，因此寻找、发现和生产新的抗生素的替代品已列入人们的议事日程。跨入新世纪以来，抗菌肽(Antibacterlalpeptides)是生物体内经诱导产生的一类具有生物学活性的小分子多肤,存在于多种生物体中,是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分。由于自身的优点已日益引起人们的关注，并已成为研究的热点，其中牛乳铁蛋白肽(LactoferricinB)，不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等生物学功能，因此被认为是一种新型的抗菌药物和极具开发潜力的婴幼儿食品﹑饲料添加剂。
最初，日本研究人员发现天然牛乳铁蛋白的降解后，其抗菌活性比牛乳铁蛋白强400多倍，分离提取后发现活性物质为牛乳铁蛋白肽。然而从天然来源中分离牛乳铁蛋白肽产量低、费时长、工艺复杂，成本昂贵。此后，商业上用的牛乳铁蛋白肽是从牛奶中分离提取牛乳铁蛋白，再经过生物酶降解产物，产生牛乳铁蛋白肽。由于所原来降解牛乳铁蛋白的生物酶价格昂贵，因此这种方法生产的牛乳铁蛋白肽成本仍然较高。而人工合成牛乳铁蛋白肽及其衍生物费用更高，无法大规模生产。目前我国从新西兰进口的牛乳铁蛋白每吨价格为35万美元。尽管如此，随着生物技术的发展，牛乳铁蛋白已在欧洲和日本被进行商业化生产，用于制造母乳化婴儿配方奶粉或其它功能性食品。因此利用基因工程技术将牛乳铁蛋白肽基因转入其它生物中表达，为解决牛乳铁蛋白肽来源不足提供了新的途径。
基因工程表达法将是大量生产抗菌肽的理想途径。基因工程生产抗菌肽的表达系统主要是毕赤酵母和大肠杆菌,常选用表达宿主偏爱的密码子人工合成基因并进行克隆表达。原核表达系统是最早采用的表达系统,也是目前应用的较为经典的表达系统。该系统主要是将目的基因连接到载体上,再对其进行克隆,之后转化至细菌,通过诱导表达、纯化获得目的蛋白。该表达系统的优点体现在短时间内能获得目的蛋白,而且成本较低。但是，抗菌肽的大量分泌会对宿主产生有害作用，因此，目前主要通过重组蛋白技术将目的基因同谷胱甘肽硫转移酶，硫氧还蛋白，绿色荧光蛋白，外壳蛋白，类弹性蛋白，酮类固醇异构酶，小分子泛素样修饰蛋白等融合表达，降低了抗菌肽对宿主细胞的毒性。本研究选择谷胱甘肽巯基转移酶(GlutathioneS-transferase，GST)作为融合标签，尝试利用大肠杆菌表达系统制备牛乳铁蛋白肽(LfcinB)抗菌肽。
发明内容
本发明目的在于，提供一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用，该方法选取氨基酸编码序列NO.1为目标蛋白，然后将氨基酸序列NO.1，转化成核苷酸编码序列NO.2，并在苷酸编码序列NO.2设计并人工合成两条反相互补的寡核苷酸链上下游引物，在上下两条引物的5’端分别引入限制性酶切位点EcoRI和XhoI，PCR扩增获得抗菌肽基因片段，分别构建重组表达载体，转化大肠杆菌后诱导表达。超声裂解菌体，十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，融合蛋白GST-LfcinB成功表达。融合蛋白经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化后，经羟胺剪切缓冲液切割融合蛋白，释放抗菌肽。通过琼脂扩散法抑菌实验检测其对大肠杆菌和金色葡萄球菌都具有明显的抑菌活性。克服了牛乳铁蛋白肽分子量较小而且容易被蛋白酶水解，往往造成产量低，难以产业化。本发明所述方法，大大提高了抗菌肽的产量。
本发明所述的一种牛乳铁蛋白肽的制备方法，按下列步骤进行：
a、抗菌肽LfcinB基因的合成：
根据牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB，选取氨基酸编码序列NO.1：Ac-FKCRRWQWRMKKLGAP-NH为目标蛋白，然后将氨基酸序列NO.1，转化成核苷酸编码序列NO.2：上游5’-TCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTC-3’下游5’-GAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCA-3’，再将核苷酸编码序列NO.2，设计并人工合成两条反相互补的寡核苷酸链上下游引物，在上下两条引物的5’端分别引入限制性酶切位点EcoRI和XhoI，即得上游引物：5’-GATCCTTCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTCTAAC；下游引物：5’-TCGAGTTAGAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCATTGAAG，再将选取的氨基酸编码序列NO.1目标蛋白上游引入羟胺切割蛋白位点天冬酰胺—甘氨酸；
PCR扩增目的抗菌肽基因：
PCR反应体系：超纯水40μL，10×PCR含Mg2 +缓冲液5μL，2.5mmol/LdNTPs1μL，上游引物1.5μL，下游引物1.5μL，Taq酶1μL，共计50μL；
反应程序为：温度94℃保持5分钟后，温度94℃反应30秒，温度55℃反应30秒，温度72℃反应30秒，共进行30循环后，温度72℃保持10分钟；
PCR扩增产物经PCR纯化试剂盒纯化后，温度-20℃保存备用；
b、抗菌肽LfcinB基因重组载体的构建：
将步骤a中PCR产物与表达载体pGEX-4T-1用EcoRI和XhoI进行双酶切反应，反应体系为载体pGEX-4T-142μL，EcoRI1.5μL，XhoI1.5μL，10×FastDigest缓冲液5μL，Total50μL分别混匀，温度37℃水浴20min；
连接产物转化到BL21大肠杆菌中，在含有抗生素氨苄青霉素的LB固体平板上挑选转化子，分别接种于含50μg/mL氨苄青霉素的4mLLB液体培养基中，温度37℃，220rpm振荡培养8-10h，提取质粒后，PCR鉴定，并命名为pGEX-4T-1LfcinB；
c、重组抗菌肽LfcinB基因的诱导表达：
重组菌pGEX-4T-1LfcinB经终浓度为1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导后，经十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，与阴性对照相比，重组菌有明显浓集的目的蛋白表达条带，检测目的蛋白，即得牛乳铁蛋白肽。
所述方法获得的牛乳铁蛋白肽在制备抑制大肠杆菌和金色葡萄球菌中的应用。
本发明所述的一种牛乳铁蛋白肽的制备方法，该方法获得的牛乳铁蛋白肽经谷光甘肽琼酯糖凝胶—4B(GlutathioneSepharose4B)亲和层析凝胶纯化融合蛋白结果：
大量培养诱导重组表达菌pGEX-4T-1LfcinB，收集后高压破碎菌体，离心后分别取上清液和沉淀样品，三羟甲基甘氨酸—十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)检测，结果显示上清液和沉淀都有表达，主要表达在上清液，上清液经0.45μm滤膜过滤除杂后，经谷光甘肽琼酯糖凝胶—4B(GlutathioneSepharose4B)凝胶亲和层析纯化，用20％Tricine-SDS-PAGE胶电泳检测到一条与预测分子量大小一致的条带。
本发明所述的一种牛乳铁蛋白肽的制备方法，该方法中氨基酸序列No1：Ac-FKCRRWQWRMKKLGAP-NH2；牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB，核苷酸编码序列NO.2：上游5’-TCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTC-3’下游5’-GAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCA-3’。其制备方法，构建牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB氨基酸的核苷酸序列的表达载体，并将表达载体转化到宿主细胞中，形成可以表达LfcinB抗菌肽的重组细胞；培养重组细胞，使其可以表达LfcinB抗菌肽；分离细胞裂解后，用蛋白酶切除去标签，产物具有抗菌活性。
附图说明
图1为本发明LfcinB抗菌肽基因的PCR扩增结果图；
图2为本发明LfcinB抗菌肽基因重组质粒的PCR鉴定图；
图3为本发明LfcinB抗菌肽基因重组质粒的双酶切鉴定图；
图4为本发明重组LfcinB抗菌肽基因诱导表达图；
图5为本发明亲和层析凝胶纯化LfcinB抗菌肽融合蛋白图；
图6为本发明LfcinB抗菌肽融合蛋白对金色葡萄球菌的抑制效果图；
图7为本发明LfcinB抗菌肽融合蛋白对大肠杆菌的抑制效果图。
具体实施方式：
实施例
a、抗菌肽LfcinB基因的合成：
根据牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB，选取氨基酸编码序列NO.1：Ac-FKCRRWQWRMKKLGAP-NH为目标蛋白，然后将氨基酸序列NO.1，转化成核苷酸编码序列NO.2：上游5’-TCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTC-3’下游5’-GAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCA-3’，再将核苷酸编码序列NO.2，设计并人工合成两条反相互补的寡核苷酸链上下游引物，在上下两条引物的5’端分别引入限制性酶切位点EcoRI和XhoI，即得上游引物：5’-GATCCTTCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTCTAAC；下游引物：5’-TCGAGTTAGAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCATTGAAG，再将选取的氨基酸编码序列NO.1目标蛋白上游引入羟胺切割蛋白位点天冬酰胺—甘氨酸；
PCR扩增目的抗菌肽基因：
PCR反应体系：超纯水40μL，10×PCR含Mg2 +缓冲液5μL，2.5mmol/LdNTPs1μL，上游引物1.5μL，下游引物1.5μL，Taq酶1μL，共计50μL；
反应程序为：温度94℃保持5分钟后，温度94℃反应30秒，温度55℃反应30秒，温度72℃反应30秒，共进行30循环后，温度72℃保持10分钟；
PCR扩增产物经PCR纯化试剂盒纯化后，温度-20℃保存备用；
b、抗菌肽LfcinB基因重组载体的构建：
将步骤a中PCR产物与表达载体pGEX-4T-1用EcoRI和XhoI进行双酶切反应，反应体系为载体pGEX-4T-142μL，EcoRI1.5μL，XhoI1.5μL，10×FastDigest缓冲液5μL，Total50μL分别混匀，温度37℃水浴20min；
连接产物转化到BL21大肠杆菌中，在含有抗生素氨苄青霉素的LB固体平板上挑选转化子，分别接种于含50μg/mL氨苄青霉素的4mLLB液体培养基中，温度37℃，220rpm振荡培养8-10h，提取质粒后，PCR鉴定，并命名为pGEX-4T-1LfcinB；
c、重组抗菌肽LfcinB基因的诱导表达：
重组菌pGEX-4T-1LfcinB经终浓度为1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，经十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶电泳检测，与阴性对照相比，重组菌有明显浓集的目的蛋白表达条带，检测目的蛋白，即得牛乳铁蛋白肽。
谷光甘肽琼酯糖凝胶—4B(GlutathioneSepharose4B)亲和层析凝胶纯化融合蛋白结果：
大量培养诱导重组表达菌pGEX-4T-1LfcinB，收集后高压破碎菌体，离心后分别取上清液和沉淀样品，三羟甲基甘氨酸—十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)胶电泳检测，结果显示上清液和沉淀都有表达，主要表达在上清液，上清液经0.45μm滤膜过滤除杂后，经谷光甘肽琼酯糖凝胶—4B(GlutathioneSepharose4B)凝胶亲和层析纯化，用20％三羟甲基甘氨酸—十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)胶电泳检测到一条与预测分子量大小一致的条带。
抗菌肽的抗菌效果：
将纯化后的凝胶从胶上切下来，溶解在0.01％的醋酸缓冲液中，取上清液，采用琼脂扩散法检测抑菌活性，结果表明：通过本发明所述方法获得的牛乳铁蛋白肽对大肠杆菌和金色葡萄球菌有明显的抑菌活性，图6，图7。
名称：一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用
申请人：中国科学院新疆理化技术研究所
牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB，氨基酸编码序列NO.1：Ac-FKCRRWQWRMKKLGAP-NH2。
牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB，核苷酸编码序列NO.2：上游5’-TCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTC-3’下游5’-GAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCA-3’。
Claims (2)
1.一种牛乳铁蛋白肽的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、抗菌肽LfcinB基因的合成：
根据牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB，选取氨基酸编码序列NO.1：Ac-FKCRRWQWRMKKLGAP-NH为目标蛋白，然后将氨基酸序列NO.1，转化成核苷酸编码序列NO.2：上游5’-TCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTC-3’下游5’-GAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCA-3’，再将核苷酸编码序列NO.2，设计并人工合成两条反相互补的寡核苷酸链上下游引物，在上下两条引物的5’端分别引入限制性酶切位点EcoRI和XhoI，即得上游引物：5’-GATCCTTCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTCTAAC；下游引物：5’-TCGAGTTAGAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCATTGAAG，引入酶切位点后，氨基酸编码序列NO.1目标蛋白上游引入羟胺切割蛋白位点天冬酰胺—甘氨酸；
PCR扩增目的抗菌肽基因：
PCR反应体系：超纯水40μL，10×PCR含Mg2 +缓冲液5μL，2.5mmol/LdNTPs1μL，上游引物1.5μL，下游引物1.5μL，Taq酶1μL，共计50μL；
反应程序为：温度94℃保持5分钟后，温度94℃反应30秒，温度55℃反应30秒，温度72℃反应30秒，共进行30循环后，温度72℃保持10分钟；
PCR扩增产物经PCR纯化试剂盒纯化后，温度-20℃保存备用；
b、抗菌肽LfcinB基因重组载体的构建：
将步骤a中PCR产物与表达载体pGEX-4T-1用EcoRI和XhoI进行双酶切反应，反应体系为载体pGEX-4T-142μL，EcoRI1.5μL，XhoI1.5μL，10×FastDigest缓冲液5μL，Total50μL分别混匀，温度37℃水浴20min；
连接产物转化到BL21大肠杆菌中，在含有抗生素氨苄青霉素的LB固体平板上挑选转化子，分别接种于含50μg/mL氨苄青霉素的4mLLB液体培养基中，温度37℃，220rpm振荡培养8-10h，提取质粒后，PCR鉴定，并命名为pGEX-4T-1LfcinB；
c、重组抗菌肽LfcinB基因的诱导表达：
重组菌pGEX-4T-1LfcinB经终浓度为1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导后，经十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，与阴性对照相比，重组菌有明显浓集的目的蛋白表达条带，检测目的蛋白，即得牛乳铁蛋白肽。
2.一种如权利要求1所述方法获得的牛乳铁蛋白肽在制备抑制大肠杆菌和金色葡萄球菌中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510688999.8A CN105254718A (zh) | 2015-10-21 | 2015-10-21 | 一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510688999.8A CN105254718A (zh) | 2015-10-21 | 2015-10-21 | 一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105254718A true CN105254718A (zh) | 2016-01-20 |
Family
ID=55094695
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510688999.8A Pending CN105254718A (zh) | 2015-10-21 | 2015-10-21 | 一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105254718A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106377762A (zh) * | 2016-08-24 | 2017-02-08 | 方雅悯 | 一种牛乳铁蛋白及其酶解物在护胃保肝产品中的应用 |
| CN106755042A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-31 | 华东理工大学 | 一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法 |
| CN114014939A (zh) * | 2021-11-23 | 2022-02-08 | 华侨大学 | 一种牛乳铁蛋白肽融合蛋白、编码基因和保鲜剂及其在水果保鲜中的应用 |
| CN117024604A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-11-10 | 广西福莱明生物制药有限公司 | 一种重组生物防御融合蛋白及其应用 |
| CN118146346A (zh) * | 2024-05-09 | 2024-06-07 | 杭州岛屿星晴生物技术有限公司 | 一种仿生胎脂蛋白肽的制备方法及其产品和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101812459A (zh) * | 2010-03-26 | 2010-08-25 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸及其原核表达方法 |
-
2015
- 2015-10-21 CN CN201510688999.8A patent/CN105254718A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101812459A (zh) * | 2010-03-26 | 2010-08-25 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸及其原核表达方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HILDE ULVATNE等: "Bactericidal Kinetics of 3 lactoferricins against staphylococcus aureus and escherichia coli", 《SCAND J INFECT DIS》 * |
| 吴建军 等: "LfcinB突变基因在大肠杆菌中的融合表达活性测定", 《生物技术通讯》 * |
| 王亮 等: "抗菌肽牛乳铁蛋白衍生肽在毕赤酵母中的表达及活性鉴定", 《生物技术通报》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106377762A (zh) * | 2016-08-24 | 2017-02-08 | 方雅悯 | 一种牛乳铁蛋白及其酶解物在护胃保肝产品中的应用 |
| CN106755042A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-31 | 华东理工大学 | 一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法 |
| CN106755042B (zh) * | 2016-12-29 | 2020-10-09 | 华东理工大学 | 一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法 |
| CN114014939A (zh) * | 2021-11-23 | 2022-02-08 | 华侨大学 | 一种牛乳铁蛋白肽融合蛋白、编码基因和保鲜剂及其在水果保鲜中的应用 |
| CN117024604A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-11-10 | 广西福莱明生物制药有限公司 | 一种重组生物防御融合蛋白及其应用 |
| CN117024604B (zh) * | 2023-08-09 | 2024-03-29 | 广西福莱明生物制药有限公司 | 一种重组生物防御融合蛋白及其应用 |
| CN118146346A (zh) * | 2024-05-09 | 2024-06-07 | 杭州岛屿星晴生物技术有限公司 | 一种仿生胎脂蛋白肽的制备方法及其产品和应用 |
| CN118146346B (zh) * | 2024-05-09 | 2024-08-06 | 杭州岛屿星晴生物技术有限公司 | 一种仿生胎脂蛋白肽的制备方法及其产品和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10428364B2 (en) | Enzymatic method for preparing rebaudioside M | |
| Ferrer-Miralles et al. | General introduction: recombinant protein production and purification of insoluble proteins | |
| CN105254718A (zh) | 一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用 | |
| Tian et al. | A cost-effective ELP-intein coupling system for recombinant protein purification from plant production platform | |
| CN101418290A (zh) | 一种高效的elp融合蛋白酶及其制备和应用 | |
| CN113528574B (zh) | 信号肽相关序列及其在蛋白质合成中的应用 | |
| CN101906165B (zh) | 两种鱼类抗菌肽基因的串联表达产物及其表达方法 | |
| US11952604B2 (en) | Enzymatic method for preparing Rebaudioside J | |
| CN107236755A (zh) | 利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素ad的方法及其制备方法 | |
| Škrlec et al. | Engineering recombinant Lactococcus lactis as a delivery vehicle for BPC-157 peptide with antioxidant activities | |
| Ferrer-Miralles et al. | Recombinant protein production and purification of insoluble proteins | |
| CN105566484B (zh) | 一种新型重组穿孔素蛋白及其制备方法和应用 | |
| JP2018514231A (ja) | 増殖とタンパク質生成との分離 | |
| CN102061303A (zh) | 两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物及其制备方法 | |
| CN102276729A (zh) | 抗菌肽lf-th及其大肠杆菌重组制备方法 | |
| CN106755042A (zh) | 一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法 | |
| CN103397038B (zh) | 一种人白细胞介素-38的生产方法 | |
| CN104789513B (zh) | 一种制备活性短肽的大肠杆菌菌株 | |
| CN104725485A (zh) | 一种重组活性肽及其同步制备方法 | |
| RU2580031C2 (ru) | ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pET-His8-TrxL-Acip1, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli BL21(DE3)/pET-His8-TrxL-Acip1 ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА АЦИПЕНСИНА-1 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОГО ПЕПТИДА | |
| CN108771028B (zh) | 一种动物饲料添加剂及其制备方法与应用 | |
| CN101948865B (zh) | 一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒及其构建方法 | |
| WO2012128661A1 (ru) | Гибридный белок, штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка и способ получения безметионинового интерферона альфа-2ь человека из этого гибридного белка | |
| KR101840535B1 (ko) | 재조합 레반슈크라제 발현 벡터 | |
| KR20210079235A (ko) | Whep 도메인 융합에 의한 목적 단백질의 수용성 증진 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160120 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |