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KR20210079235A - Whep 도메인 융합에 의한 목적 단백질의 수용성 증진 방법 - Google Patents

Whep 도메인 융합에 의한 목적 단백질의 수용성 증진 방법 Download PDF

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KR20210079235A
KR20210079235A KR1020200180321A KR20200180321A KR20210079235A KR 20210079235 A KR20210079235 A KR 20210079235A KR 1020200180321 A KR1020200180321 A KR 1020200180321A KR 20200180321 A KR20200180321 A KR 20200180321A KR 20210079235 A KR20210079235 A KR 20210079235A
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KR1020200180321A
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성백린
이진희
김영석
정유철
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명은 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 융합 단백질에 관한것이다. 보다 상세하게는, hEPRS(Glutamyl-prolyl-tRNA synthetase from human)의 WHEP 도메인(EPRS 단백질의 중간 부분에 위치한 WHEP 도메인 TRS-1, TRS-2, TRS-3와 세 도메인을 연결하는 링커를 포함함)이다. 본 발명에 따른 hEPRS의 WHEP 도메인은 목적 단백질의 대장균에서의 발현을 위해 융합 단백질로 사용될 때, 목적 단백질의 수용성이 향상되었다.

Description

WHEP 도메인 융합에 의한 목적 단백질의 수용성 증진 방법 {METHOD FOR ENHANCING SOLUBLE EXPRESSION OF TARGET PROTEINS BY USING FUSION PROTEIN OF WHEP DOMAIN}
본 발명은 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 융합 단백질 에 관한 것이다. 보다 상세하게는, hEPRS(Glutamyl-prolyl-tRNA synthetase from human)의 WHEP 도메인(EPRS 단백질의 중간 부분에 위치한 WHEP 도메인 TRS-1, TRS-2, TRS-3와 세 도메인을 연결하는 링커를 포함함)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 hEPRS의 WHEP 도메인은 목적 단백질의 대장균에서의 발현을 위해 융합 단백질로 사용될 때, 목적 단백질의 수용성이 향상되었다.
생명공학 기술에 의해 생산되는 단백질에는 일반적으로 면역 조절 및 효소 저해제 및 호르몬 같은 의약 및 연구용 단백질과 진단용 단백질이나 반응 첨가 효소와 같은 산업용 단백질로 대별될 수 있으며, 이 두 가지 단백질들을 중심으로 생산 공정 기술 개발 및 산업화가 추진되고 있다. 특히 재조합 미생물 기술을 이용하여 유용한 재조합 단백질을 생산할 때, 유전정보가 잘 알려져 있으며 다양한 벡터 시스템을 구축하고 있고, 비교적 값싼 배지에서 빠르게 고농도로 배양할 수 있는 장점을 갖는 대장균이 연구 또는 상업적 목적으로 다양하게 사용되고 있다.
대장균에서 재조합 단백질을 생산함에 있어, 강력한 유도성(inducible) 프로모터를 갖춘 다양한 발현벡터가 개발되어 외래단백질의 생산에 이용되어 왔다. 그러나 숙주세포로 대장균을 이용하는 경우 제조하고자 하는 단백질이 대장균 내의 단백질 분해효소에 의해 분해되어 수율이 낮아지는 경우가 많으며, 특히 분자량이 10kDa 이하의 작은 크기의 폴리펩타이드의 발현에서 이러한 경향이 심한 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 일반적으로 대장균은 단백질의 전사(transcription)와 전이(translation)가 거의 동시에 일어나기 때문에 재조합 단백질의 과다 발현시 불용성 응집체(inclusion body)를 형성하는 경우가 많으며, 응집체로 발현된 폴리펩타이드의 경우 접힘(folding) 중간체가 분자 상호간의 다이설파이드 결합(intermolecular disulfide bond) 또는 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해 숙주세포의 다른 단백질 불순물들[샤페론(chaperon), 라이보좀(ribosome), 초기인자 등]과 비선택적으로 결합함으로써 목적 폴리펩타이드의 응집체 내 순도가 떨어지는 단점이 있다. 또한 이렇게 발현된 단백질을 활성형으로 만들기 위해서는 구아니딘-하이드로클로라이드(Guanidine hychloride)나 우레아(urea) 같은 변성체를 사용하여 용해시킨 후 희석하는 재접힘(refolding) 과정을 거쳐야하는데 이때 단백질이 활성형으로 접히지 않는 등 생산 수율이 감소하는 문제점이 있다 (Marston FA et al., Biochem J 240(1):1-12, 1986).
본 발명자들은 WHEP 도메인의 융합 단백질로서의 수용성 증진 능력을 확인하는 연구를 진행하였다. 우선적으로, 하나의 WHEP 도메인만을 갖는 TRS-1, TRS-2와, 3개의 WHEP 도메인 (TRS-1, TRS-2, TRS-3) 및 링커를 포함하는 다중 WHEP 도메인 (multiple WHEP domain; EPRS라고 칭함)을 제작하였다. 그리고 세 종류의 융합 단 백질들의 목적 단백질 수용성 증진 능력을 확인해 보았다. 세 융합 단백질들 중 다중 WHEP 도메인의 수용성 증진 능력이 가장 월등함을 확인하게 되었고 본 발명을 완성하게 되었다.
기존에 알려진 대장균에서 수용성 발현이 어려운 단백질들을 발현하 기 위하여, 융합 단백질로 TRS-1, TRS-2, EPRS을 사용하고 목적 단백질로 Green Fluorescent Protein (GFP)를 사용하여 수용성을 비교하였다. 확인 결과, hEPRS의 WHEP 도메인을 포함하는 융합 단백질 중에서는 EPRS가 수용성 상승에 가장 크게 기여하는 것으로 확인되었다. EPRS에 의한 수용성 증진 효과는 다른 목적 단백질인 Interferon beta (IFN-b), Tev protease, Heat-labile enterotoxin subunit B (LTB) 을 사용하여 추가적으로 확인되었다.
본 발명의 목적은 WHEP 도메인을 융합파트너로 이용하여 목적 단백질의 수용성 및 접힘을 향상시킬 수 있는 펩타이드, 재조합 단백질 생산용 발현벡터 또는 유전자 구조체(gene construct)를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 목적단백질의 수용성을 유의적으로 증가시킬 수 있는 WHEP 도메인의 구성을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환 되거나 또는 유전자 구조체(gene construct)가 삽입된 재조합 미생물 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명에 따르면 사람 유래 글루타밀-프롤릴 tRNA 합성효소(hEPRS, human Glutamyl-prolyltRNA synthetase)로부터 분리한 도메인의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드가 제공된다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 도메인은 TRS-1(서열번호 1) 및 TRS-2(서열번호 2)을 포함하며, 가장 바람직하게는 상기 도메인은 TRS-1(서열번호 1) 및 TRS-2(서열번호 2)을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 펩타이드는 상기 도메인 각각의 서열을 연결하기 위해 링커(Linker) 서열을 더 포함할 수 있으며, 상기 링커 서열은 서열번호 3으로 표시될 수 있다.
또한, 상기 펩타이드는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 태그(tag) 서열을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있으며, 상기 항원은 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2), 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA), 호흡기세포융합바이러스(RSV, Respiratory Syncytial Virus) 및 니파바이러스(Nipha virus)로 이루어진 군에서 1종 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따르면, 상기 항원은 호흡기세포융합바이러스(RSV, Respiratory Syncytial Virus이다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5`-말단에 결합된 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 발현벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포가 제공되며, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)일 수 있다.
본 발명은 수용성 목적 단백질의 생산 방법을 제공하며, 해당 방법은 (A) 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 결합된 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계; (B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계: 및 (C) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 목적 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 WHEP 도메인을 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법은 목적 단백질의 수용성 및 발현율을 향상시켜, 다양한 목적 단백질의 의료용 및 산업용으로 개발 및 생산하는데 유용하다.
도 1은 TRS-1, TRS-2, EPRS를 융합 단백질로 사용하도록 디자인한 발현용 플라스미드. Multiple cloning site (MCS)로 목적 단백질을 삽입하고, 정제를 위한 histidine tag (6X His), 융합 단백질과 목적 단백질의 절단을 위한 Tev protease recognition site (TEV site)를 포함한다.
도 2는 EPRS에 의한 GFP의 수용성 발현 향상 및 활성을 측정한 이미지이다.
도 3은 EPRS에 의한 Interferon-beta (IFN-b)의 수용성 발현 향상 및 활성 측정한 이미지이다.
도 4는 EPRS에 의한 Tev protease의 수용성 발현 향상 및 활성 측정한 이미지이다.
도 5는 EPRS에 의한 multimeric protein의 수용성 발현 향상을 확인한 이미지이다. 그 외에, multimeric 단백질을 대장균 내에서 발현하여, EPRS에 의한 단백질의 수용성 발현율 증가 효과를 추가적으로 확인하였다. Heat-labile enterotoxin은 pentamer를 이루는 단백질로, 마찬가지로 대장균에서 수용성으로 발현이 어려운 것으로 알려져 있다. 이 단백질은 EPRS와 융합하여 발현 확인한 결과, direct form보다 EPRS가 융합된 form이 훨씬 더 수용성 발현율을 증가시키는 것을 확인하였다.
도 6은 WHEP 도메인과 ERS의 융합 형태를 보여주는 모식도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 COVID-19의 RBD와 S1과의 EPRS 융합 발현을 확인한 이미지이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 RSV F-bacterioferritin과의 EPRS 융합 발현을 확인한 이미지이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 LTB-JEVED3와의 EPRS 융합 발현을 확인한 이미지이다.
도 10은 TEV protease를 처리한 EPRS-LTB의 크기배제 크로마토그래피를 나타낸다.
도 11은 EPRS-LTB-JEVED3의 크기배제 크로마토그래피를 나타낸다.
도 12는 TEV protease를 처리한 EPRS-LTB-JEVED3의 크기배제 크로마토그래피를 나타낸다.
이하, 본 발명의 도면을 참조하여 실시예를 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
본 발명에서 "벡터(vector)"란, DNA 재조합 실험에 있어서 목적하는 DNA 단편을 숙주균 등에 도입시켜 주고 증식할 수 있는 DNA를 지칭하며, 클로닝 운반체 (cloning vehicle)라고도 하는데, 벡터(vector) DNA는 제한효소 등으로 절단하여 개환하고, 여기에 목적으로 하는 DNA 단편을 삽입하여 연결해 숙주균에 도입시킨다. 목적으로 하는 DNA 단편을 연결한 벡터 DNA는 숙주균이 증식됨에 따라 복제하여 균의 분열과 더불어 각 낭세포로 분배되어 목적으로 하는 DNA 단편을 대대로 유지하여 이어져 나가며, 예를 들어, 플라스미드(plasmid), 파지 염색체를 사용할 수 있다.
상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본 발명에 포함된다.
본 발명에서 "형질전환(transformation)"이란, 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미한다.
상기 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예컨대, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.), PEG 등의 화학적 처리 방법, 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있다.
상기 형질전환체 배양 시의 배양조건은 숙주세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양 시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.
본 발명에서 숙주세포는 당업계에서 통상적으로 이용되는 숙주세포를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균을 이용할 수 있다.
[실시예 1]
실시예 1-1. 단백질 발현 벡터의 제작
단백질 발현 벡터로 pGE-LysRS 발현 벡터를 사용하였다(Choi SI et al., Protein solubility and folding enhancement by interaction with RNA, PLoS ONE (2008), 3:e2677). pGE-LysRS는 T7 promoter에 의해 발현이 조절되고, LysRS 유전자를 Nde1과 MCS(Kpn1-BamH1-EcoRV-Sal1-Hind3)에 있는 절단 위치 중 하나를 사용하여 잘라 내고, 그 위치에 TRS-1, TRS-2, 또는 EPRS를 삽입하여 pGE-TRS-1, pGE-TRS-2, pGE-EPRS 발현 벡터를 만들었다. 그리고, 각 발현 벡터의 C-말단 위치 에 목적 단백질을 삽입하여, TRS-1, TRS-2, EPRS가 융합된 목적 단백질 발현 벡터를 만들었다 (도 1). 목적 단백질로는 GFP, IFN-b, Tev 프로테아제, LTB가 사용되었다. 이렇게 하여 만들어진 발현 벡터는 pGE-GFP, pGE-TRS-1-GFP, pGE-TRS-2- GFP, pGE-EPRS-GFP, pGE-IFN-b, pGE-EPRS-IFN-b, pGE-Tev, pGE-EPRS-Tev, pGE-LTB, pGE-EPRS-LTB 이다.
실시예 1-2. 단백질 발현 및 SDS-PAGE를 통한 정제 양상 확인
제조된 단백질 발현 벡터를 BL21(DE3)-pLysS 또는 SHuffle® T7 competent cell에 형질전환 시켜 배양하였다. 모든 형질전환 된 대장균은 50 ug/ml 의 암피실린이 포함된 LB 배지에서 배양하였으며, pLysS가 포함된 대장균은 34 ug/ml의 클로람페니콜이 추가되어 있는 배지에서 배양하였다. 배양 온도는 단백질 마다 다르며, 16 - 37℃의 조건에서 배양하였다. 대장균의 OD600 값이 0.5 이상이 되면, T7 프로모터를 활성화 시키기 위해서 IPTG를 0 uM ~ 1 mM 수준으로 넣어주고, 단백질이 충분히 생산될 수 있도록, IPTG를 넣어 준 이후부터 16 - 37℃에서는 3시간, 25℃에서는 5시간, 16 - 24℃에서는 16시간 정도를 배양하였다. 충분히 배양된 대장균은 원심분리하여 상등액을 제거한 후에 보관하였다. 그 다음, LB 배지의 5 ml에 해당되는 대장균 수확물에 PBS 0.3 ml을 넣고 초음파분쇄를 하여, 용해물(lysate)을 만들었다. 그리고 용해물을 원심분리 하여 수용성 분획(soluble fraction)과 불용성 분획(pellet fraction)으로 나누었고, 총 용해물, 수용성 분획, 불용성 분획을 구분하여 SDS-PAGE로 분석하였다.
실시예 1-3. 단백질 발현 및 정제
제조된 pGE-GFP, pGE-TRS-1-GFP, pGE-TRS-2-GFP, pGE-EPRS-GFP, pGE-IFN-b, pGE-EPRS-IFN-b, pGE-Tev, pGE-EPRS-Tev 발현 벡터를 BL21(DE3)-pLysS 수용성 세포(competent cell)에 형질전환시켜 배양하였다. 모든 형질전환된 대장균은 50 ug/ml의 암피실린과 34 ug/ml의 클로람페니콜이 포함된 LB에서 배양하였다. 대장균의 OD600 값이 0.5 이상이 되면, T7 프로모터를 활성화시키기 위해서 IPTG를 1 mM 수준으로 넣어 주고, 단백질이 충분히 생산될 수 있도록, IPTG 를 넣어준 이후부터 30℃에서 6시간 정도를 배양하였다. 충분히 배양된 대장균은 원심분리하여 상등액을 제거한 후에 보관하였다.
수확된 대장균에 수확물에 PBS를 넣고 초음파 분쇄를 하여, 용해물을 만들었다. 그리고 용해물을 원심분리를 하여 수용성 분획만을 얻어낸 다음, Ni2+-크로마토그래피법을 이용해 정제하였고, 정제된 단백질은 PBS에 투석 (dialysis)을 하고, Centriprep을 활용해 농축시켰다.
실시예 1-4. GFP 활성 측정
단위 세포당 만들어진 GFP 단백질의 활성을 측정하기 위한 실험을 진행하였다. 단백질 발현 완료 후 원심분리하여 상등액이 제거된 대장균 배양체를 PBS를 넣고 초음파 분쇄하여 용해물을 만들었다. 그 후 용해물을 원심분리하여 수용성 분획만을 얻어낸 다음 분광 광도계로 형광을 측정하여 GFP의 실제 활성을 측정하였다 (도 2).
Green fluorescent protein (GFP)는 대장균 내에서 단독 발현 시 불용성으로 만들어 지는 단백질로 알려져 있다. 융합 단백질이 없이 단독 발현된 direct GFP와 TRS-1, TRS-2, EPRS가 융합된 융합 단백질들을 대장균에서 발현 후 발현 양상을 확인한 결과, 모든 융합 단백질들에서 direct GFP보다 수용성 발현율이 증가되는 양상을 보였고, 특히 EPRS가 융합된 GFP의 수용성 발현율이 매우 높게 증가하는 결과를 확인하였다.
배양 용량 당 발현된 GFP의 활성을 측정한 결과, TRS-2가 융합된 GFP는 direct GFP와 유사한 수준의 형광 활성을 보였으며, TRS-1, EPRS가 융합된 GFP는 더 높은 수준의 형광 활성을 나타내었다.
이를 통해 TRS-1, TRS-2, EPRS에 의해 목적 단백질인 GFP의 수용성 발현량이 증가함을 확인하였고, 만들어진 단백질들의 활성이 있음을 확인했다.
실시예 1-5. IFN-beta 활성 측정
대장균에서 발현된 IFN-beta의 활성은 HEK-BlueTM IFN-α/β Cells (InvivoGen)을 이용하여 측정되었다. 실험은 판매자의 protocol에 맞추어 진행하였 으며, 간단히 정리하면 다음과 같다. 96-well plate에 IFN-beta에 의한 signaling pathway를 관찰할 수 있도록 변형된 HEK-Blue?? IFN-α/β Cells 부유액 180 ul와 IFN-beta sample 20 ul을 넣고 37℃ 5% CO2 배양기에서 overnight 배양한다. 다음 날 HEK-BlueTM IFN-α/β Cells에서 반응이 나타난 supernatant 20ul와 QuantiBlueTM solution 180 ul을 섞고, 37℃에서 30분 ~ 3시간 가량 반응시켰다. 반응이 완료되면 620 - 655 nm의 파장에서 spectrophotometer로 레벨을 측정하였다 (도 3).
Interferon beta(IFN-b) 역시 대장균에서 불용성으로 발현되는 단백질로, 융합 단백질이 없는 direct IFN-b는 대장균에서 수용성 발현율이 매우 낮은 특징을 보인다. EPRS를 융합 단백질로 사용하였을 때, 융합 단백질은 높은 수용성 발현율을 보였다.
정제된 IFN-b의 활성을 HEK-BlueTM IFN-α/β Cells (InvivoGen)로 측정하였을 때, CHO cell에서 발현 및 정제된 commercial IFN-b가 가장 활성이 높게 나타났으며, EPRS가 융합된 IFN-b 융합 단백질의 활성이 그 다음으로 높게 나타났다. Direct IFN-b의 경우 가장 낮은 활성을 보였다.
이를 통해, EPRS에 의해 IFN-b의 수용성 및 활성형 발현이 촉진됨을 확인하였다.
실시예 1-6. Tev protease 활성 측정
대장균에서 발현된 Tev 프로테아제의 활성 측정을 위하여 SensoLyte ® 520 TEV Activity Assay Kit *Fluorimetric* 키트를 사용하였다. 실험은 판매자의 프로토콜에 맞추어 진행하였으며, 간단히 정리하면 다음과 같다. 실험용 Tev 프로테아제와 5-FAM/QXL® 520 TEV 기질을 96 well에 넣고, 형광을 1분마다 측정하였다. 이때 측정하는 형광은 Ex/Em = 490/520 nm로 한다. Tev 프로테아제에 의해 기질이 잘려지면서 형광이 증가하게 되는데, 이를 이용하여 Tev 프로테아제의 활성을 측정하였다 (도 4).
Tobacco Etch Virus (TEV)의 프로테아제는 상업적 수요가 높은 단백질로, 대장균 내에서 재조합 단백질로 얻기 어려운 단백질의 일종이다. 융합 단백질이 없을 때, direct Tev 프로테아제는 대장균에서 낮은 수용성 발현율을 보이고, EPRS를 융합하였을 때 수용성 발현율 상승 효과를 나타내었다. 대장균 배양 시 발 현 온도를 낮추었을 때 (20℃ direct Tev 프로테아제와 EPRS-Tev 프로테아제 모두 수용성 발현율이 증가했고, 특히 EPRS-Tev 프로테아제의 경우 90% 이상의 수용성 발현율을 보였다.
정제한 Tev 프로테아제들의 활성을 Tev 프로테아제 활성 분석 키트 (SensoLyte ® 520 TEV Activity Assay Kit) 로 확인한 결과, direct Tev 프로테아제는 동량임에도 활성이 낮게 측정되었고, 가장 가파르게 효소 활성을 보이는 구조 는 EPRS가 융합된 EPRS-TEV였다.
이를 통해, EPRS에 의한 Tev 프로테아제의 수용성 및 활성형 발현을 확인하였다.
[실시예 2]
실시예 2-1. 단백질 발현 및 SDS-PAGE를 통한 수용성 확인
목적단백질로 SARS-CoV-2(COVID-19)의 receptor-binding domain (RBD)와 상대적으로 크기가 큰 spike subunit 1 (S1)을 사용하여 만들어진 벡터는 pGE-EPRS-RBD, pGE-EPRS-S1이다.
제조된 단백질 발현 벡터를 각각 BL21 또는 HMS174 competent cell에 형질전환 시켜 배양하였다. 모든 형질전환 된 대장균은 50 ug/ml의 암피실린이 포함된 LB 배지에서 배양하였다. 대장균의 OD600 값이 0.5 이상이 되면, T7 프로모터를 활성화 시키기 위해서 IPTG를 0.5 mM로 넣어준 뒤, 16℃에서 16시간 정도를 배양하였다. 배양된 대장균은 원심분리하여 상등액을 제거한 후에 -80℃에 보관하였다. 그 다음, LB 배지의 5 ml에 해당되는 대장균 수확물에 lysis buffer[50mM Tris-Cl(pH7.5), 300mM NaCl, 10% glycerol, 2mM beta-mercaptoethanol, 0.1% tween-20] 0.3 ml을 넣고 초음파분쇄하여, 용해물(lysate)을 만들었다. 그리고 용해물을 원심분리 하여 수용성 분획(soluble fraction)과 불용성 분획(pellet fraction)으로 나누었고, 총 용해물, 수용성 분획, 불용성 분획을 구분하여 SDS-PAGE로 분석하였다. RBD와 S1의 크기는 각각 27 kDa과 73 kDa 이며, EPRS와 융합된 크기는 각각 49 kDa과 95 kDa 이다(도 7 참조).
목적단백질로 Respiratory syncytial virus(RSV) Fusion(F)와 nanoparticle을 위한 scaffold 단백질로서 bacterioferritin을 사용하여 만들어진 벡터는 pGE-EPRS-RSV F-bacterioferritin이다.
제조된 단백질 발현 벡터를 Shuffle T7 competent cell에 형질전환 시켜 배양하였다. 모든 형질전환 된 대장균은 50 ug/ml의 암피실린이 포함된 LB 배지에서 배양하였다. 대장균의 OD600 값이 0.5 이상이 되면, T7 프로모터를 활성화 시키기 위해서 IPTG를 0.5 mM로 넣어준 뒤, 20℃에서 6시간 정도를 배양하였다. 배양된 대장균은 원심분리하여 상등액을 제거한 후에 -80℃에 보관하였다. 그 다음, LB 배지의 5 ml에 해당되는 대장균 수확물에 lysis buffer[50mM Tris-Cl(pH7.5), 200mM NaCl, 10% glycerol, 0.1% tween-20] 0.3 ml을 넣고 초음파분쇄하여, 용해물(lysate)을 만들었다. 그리고 용해물을 원심분리하여 수용성 분획(soluble fraction)과 불용성 분획(pellet fraction)으로 나누었고, 총 용해물, 수용성 분획, 불용성 분획을 구분하여 SDS-PAGE로 분석하였다. RSV F-bacterioferritin의 크기는 70 kDa 이며, EPRS와 융합된 크기는 92 kDa이다(도 8 참조).
목적단백질로 일본뇌염 바이러스 구조 내 5배축에 pentamer로 존재하며 면역유도에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 envelope protein의 domain III (ED3)와 pentameric scaffold로서 heat-labile toxin B subunit(LTB)를 사용하여 만들어진 벡터는 pGE-EPRS-LTB-JEVED3이다.
제조된 단백질 발현 벡터를 Shuffle T7 competent cell에 형질전환 시켜 배양하였다. 모든 형질전환된 대장균은 50 ug/ml의 암피실린이 포함된 LB 배지에서 배양하였다. 대장균의 OD600 값이 0.5 이상이 되면, T7 프로모터를 활성화 시키기 위해서 IPTG를 1 mM로 넣어준 뒤, 20℃에서 6시간 정도를 배양하였다. 배양된 대장균은 원심분리하여 상등액을 제거한 후에 -80℃에 보관하였다. 그 다음, LB 배지의 5 ml에 해당되는 대장균 수확물에 lysis buffer[50mM Tris-Cl(pH7.5), 300mM NaCl, 10% glycerol] 0.3 ml을 넣고 초음파분쇄 하여, 용해물(lysate)을 만들었다. 그리고 용해물을 원심분리하여 수용성 분획(soluble fraction)과 불용성 분획(pellet fraction)으로 나누었고, 총 용해물, 수용성 분획, 불용성 분획을 구분하여 SDS-PAGE로 분석하였다. LTB-JEVED3의 크기는 24 kDa이며, EPRS와 융합된 크기는 46 kDa 이다(도 9 참조).
실시예 2-2. 단백질의 정제
Shuffle T7 competent cell에 형질 전환된 pGE-EPRS-LTB, pGE-EPRS-LTB-JEVED3 발현 벡터는 50 ug/ml의 암피실린이 포함된 LB 배지에서 배양하였다. 대장균의 OD600값이 0.5 이상이 되면, IPTG를 1mM 수준으로 넣어준 뒤, 20℃에서 6시간 정도를 배양하였다. 충분히 배양된 대장균은 원심분리 하여 상등액을 제거한 후에 -80℃에 보관하였다.
수확된 대장균에 A buffer [50mM Tris-Cl(pH7.5), 300mM NaCl, 10% glycerol, 5mM imidazole]을 넣고 초음파 분쇄를 하여, 용해물을 만들었다. 그리고 용해물을 원심분리 하여 수용성 분획만을 얻어낸 다음, 니켈 크로마토그래피법을 이용하여 정제하였고, 정제된 단백질은 storage buffer [50mM Tris-Cl(pH7.5), 300mM NaCl, 0.1mM EDTA]에 투석(dialysis)하고, amicon을 활용해 농축하였다.
실시예 2-3. 크기배제 크로마토그래피를 통한 오량체 확인
정제된 EPRS-LTB와 EPRS-LTB-JEVED3 단백질이 오량체 구조 형성을 하는지 검증하기 위하여 Superdex200 increase 10/300 column(GE healthcare)를 이용한 크기배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography; SEC)를 진행하였으며, 크기를 알고 있는 마커 단백질로 calibration을 하여 단백질의 사이즈를 측정하였다. 이 때 사용된 버퍼의 조성은 [50mM Tris-Cl(pH7.5), 300mM NaCl]이다. 단백질은 EPRS가 융합된 것과 TEV protease를 처리하여 EPRS와 목적 단백질 사이에 있는 tev cleavage site가 절단되어 EPRS가 제거된 단백질을 모두 검증하였다. 오량체 크기에서 피크(peak)가 뜬 분획은 SDS-PAGE로 다시 한번 검증하였다.
그 결과, 각각의 단백질은 오량체 예측 사이즈에서 피크를 보였으며(도 10 내지 12 참조, 왼쪽패널), 그 피크의 분획을 SDS-PAGE에 DTT가 있는 reduced 상태와 DTT가 없는 non-reduced 상태로 내려보았을 때, 비슷한 사이즈에서 밴드가 나타남을 확인하였다(도 10 내지 12 참조, 오른쪽패널). 오량체를 이루었을 때 각각의 사이즈는 LTB는 약 60 kDa, EPRS-LTB-JEVED3는 약 230 kDa, LTB-JEVED3는 약 125 kDa이다. 따라서, EPRS의 융합으로 대장균에서 목적 단백질의 수용성을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 단백질의 적절한 접힘을 유도함으로써 다량체로의 조립이 가능함을 확인하였다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> METHOD FOR ENHANCING SOLUBLE EXPRESSION OF TARGET PROTEINS BY USING FUSION PROTEIN OF WHEP DOMAIN <130> 1068672 <150> KR 10-2019-0171057 <151> 2019-12-19 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRS1 <400> 1 Leu Tyr Asn Arg Val Ala Val Gln Gly Asp Val Val Arg Glu Leu Lys 1 5 10 15 Ala Lys Lys Ala Pro Lys Glu Asp Val Asp Ala Ala Val Lys Gln Leu 20 25 30 Leu Ser Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Glu Lys Thr Gly Gln Glu Tyr Lys 35 40 45 Pro Gly Asn Pro Pro 50 <210> 2 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRS2 <400> 2 Leu Tyr Asp Glu Val Ala Ala Gln Gly Glu Val Val Arg Lys Leu Lys 1 5 10 15 Ala Glu Lys Ser Pro Lys Ala Lys Ile Asn Glu Ala Val Glu Cys Leu 20 25 30 Leu Ser Leu Lys Ala Gln Tyr Lys Glu Lys Thr Gly Lys Glu Tyr Ile 35 40 45 Pro Gly Gln Pro Pro 50 <210> 3 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRS3 <400> 3 Leu Phe Asp Lys Val Ala Ser Gln Gly Glu Val Val Arg Lys Leu Lys 1 5 10 15 Thr Glu Lys Ala Pro Lys Asp Gln Val Asp Ile Ala Val Gln Glu Leu 20 25 30 Leu Gln Leu Lys Ala Gln Tyr Lys Ser Leu Ile Gly Val Glu Tyr Lys 35 40 45 Pro <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 1 <400> 4 Ala Glu Ile Gly Gln Asn Ile Ser Ser Asn Ser Ser Ala Ser Ile Leu 1 5 10 15 Glu Ser Lys Ser 20 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 2 <400> 5 Leu Ser Gln Ser Ser Asp Ser Ser Pro Thr Arg Asn Ser Glu Pro Ala 1 5 10 15 Gly Leu Glu Thr Pro Glu Ala Lys Val 20 25 <210> 6 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPRS <400> 6 Leu Tyr Asn Arg Val Ala Val Gln Gly Asp Val Val Arg Glu Leu Lys 1 5 10 15 Ala Lys Lys Ala Pro Lys Glu Asp Val Asp Ala Ala Val Lys Gln Leu 20 25 30 Leu Ser Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Glu Lys Thr Gly Gln Glu Tyr Lys 35 40 45 Pro Gly Asn Pro Pro Ala Glu Ile Gly Gln Asn Ile Ser Ser Asn Ser 50 55 60 Ser Ala Ser Ile Leu Glu Ser Lys Ser Leu Tyr Asp Glu Val 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650 <210> 9 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heat-labile toxin B subunit(LTB) <400> 9 Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala 20 25 30 Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Glu Thr Phe 35 40 45 Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala 50 55 60 Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr 65 70 75 80 Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile 85 90 95 Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn 100 <210> 10 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterioferritin <400> 10 Met Lys Gly Asp Thr Lys Val Ile Asn Tyr Leu Asn Lys Leu Leu Gly 1 5 10 15 Asn Glu Leu Val Ala Ile Asn Gln Tyr Phe Leu His Ala Arg Met Phe 20 25 30 Lys Asn Trp Gly Leu Lys Arg Leu Asn Asp Val Glu Tyr His Glu Ser 35 40 45 Ile Asp Glu Met Lys His Ala Asp Arg Tyr Ile Glu Arg Ile Leu Phe 50 55 60 Leu Glu Gly Leu Pro Asn Leu Gln Asp Leu Gly Lys Leu Asn Ile Gly 65 70 75 80 Glu Asp Val Glu Glu Met Leu Arg Ser Asp Leu Ala Leu Glu Leu Asp 85 90 95 Gly Ala Lys Asn Leu Arg Glu Ala Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val His 100 105 110 Asp Tyr Val Ser Arg Asp Met Met Ile Glu Ile Leu Arg Asp Glu Glu 115 120 125 Gly His Ile Asp Trp Leu Glu Thr Glu Leu Asp Leu Ile Gln Lys Met 130 135 140 Gly Leu Gln Asn Tyr Leu Gln Ala Gln Ile Arg Glu Glu Gly 145 150 155 <210> 11 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV F <400> 11 Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser 1 5 10 15 Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile 20 25 30 Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp 35 40 45 Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala 50 55 60 Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn 65 70 75 80 Arg Ala Arg Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Phe Leu 85 90 95 Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val 100 105 110 Cys Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala 115 120 125 Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser 130 135 140 Val Leu Thr Phe Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln 145 150 155 160 Leu Leu Pro Ile Leu Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu 165 170 175 Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr 180 185 190 Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr 195 200 205 Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile 210 215 220 Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg 225 230 235 240 Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Cys Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala 245 250 255 Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp 260 265 270 Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser 275 280 285 Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala 290 295 300 Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser 305 310 315 320 Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu 325 330 335 Ile Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys 340 345 350 Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu 355 360 365 Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn 370 375 380 Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val 385 390 395 400 Ser Asn Lys Gly Met Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr 405 410 415 Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile 420 425 430 Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala 435 440 445 Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile 450 455 460 Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu 465 470 <210> 12 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> JEV Envelope domain III(ED3) <400> 12 Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys 1 5 10 15 Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr 20 25 30 Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser 35 40 45 Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe 50 55 60 Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Val Leu Val Glu Met Glu Pro 65 70 75 80 Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile 85 90 95 Asn His His Trp His Lys Ala Gly 100

Claims (13)

  1. 사람 유래 글루타밀-프롤릴 tRNA 합성효소(hEPRS, human Glutamyl-prolyltRNA synthetase)로부터 분리한 도메인의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 도메인은 TRS-1(서열번호 1) 및 TRS-2(서열번호 2)을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 도메인은, TRS-3(서열번호 3)을 더 포함하는, 펩타이드.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 상기 도메인 각각의 서열을 연결하기 위한 링커(Linker) 서열을 더 포함하는 펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 링커 서열은 서열번호 4 또는 5로 표시되는 것인, 펩타이드.
  6. 제1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 태그(tag) 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  8. 제7 항에 있어서,
    상기 항원은 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2), 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA), 호흡기세포융합바이러스(RSV, Respiratory Syncytial Virus) 및 니파바이러스(Nipha virus)로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  9. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5`-말단에 결합된 제1항
    내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 발현벡터.
  11. 제10 항에 따른 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
  12. 제11 항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  13. (A) 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드의5'-말단에 결합된 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
    (B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계: 및
    (C) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 목적 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함하는 수용성 목적 단백질의 생산 방법.
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