CN105181844A - 一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼含量和有关物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼含量和有关物质的方法，本发明采用了反相高效液相色谱法，通过制备供试液和对照液，并且分别量取供试液及对照溶液10μl，注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算并折干，即完成了甲苯磺酸索拉非尼含量和其他物质的测试，本发明的优点在于：本发明填补了目前甲苯磺酸索拉非尼含量和有关物质的测试分析方法尚无的空缺，通过乙腈-三氟乙酸水溶液体系能够将甲苯磺酸索拉非尼和其杂质能够达到分离，本发明可以满足研发和生产的需求，能够有效的对甲苯磺酸索拉非尼原料药中的有关物质进行更为严格有效的控制。

Description

一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼含量和有关物质的方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼含量和有关物质的方法。

背景技术

甲苯磺酸索拉非尼，英文名SorafenibTosylate；索拉非尼是一种多激酶抑制剂，具有双重抗肿瘤活性，可抑制肿瘤增殖和血管生成。在人肿瘤移植动物模型（包括：肝细胞癌，肾癌、乳癌、结肠癌、胰腺癌和肺癌模型）的临床前研究中，索拉非尼表现出广泛的抗肿瘤活性，并诱导肿瘤细胞凋亡，有效抑制肿瘤的生长。甲苯磺酸索拉非尼片是德国拜耳公司研制的一种新型抗癌药物，最早于2005年12月20日在美国获准上市，目前已在世界50多个国家被批准用于治疗晚期肾细胞癌。本品已于2006年9月12日获国家食品药品监督管理局批准进口中国，规格为200mg。

目前已有很多文献报道甲苯磺酸索拉非尼的含量测定方法，对于甲苯磺酸索拉非尼原料药的有关物质分析方法还鲜有研究。2007年公开的发明专利“制备4-{4-[({[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基}羰基)氨基]苯氧基}-N-甲基吡啶-2-甲酰胺的方法”（公开号101052619，公开日2007年10月10日），提及了4-{4-[({[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基}羰基)氨基]苯氧基}-N-甲基吡啶-2-甲酰胺甲苯磺酸盐制备后的HPLC纯度检测方法，磷酸盐缓冲液-乙醇/乙腈=4/6体系下，进行线性梯度洗脱。但对于甲苯磺酸索拉非尼一些其它已知杂质，该方法不能达到分离和进行有效控制。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼含量和有关物质的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼含量的方法，其创新点在于：所述色谱条件为：选用以十八烷基键合硅胶为填充剂，柱长250mm，检测波长235nm，柱温40℃，流速1.0ml/min；采用的检测器为紫外检测器；采用反相高效液相色谱法按等度进行洗脱，所述流动相为三氟乙酸水溶液与极性有机溶剂，所述三氟乙酸水溶液为A相，所述极性有机溶剂为B相，所述流动相中Ｂ相的有机溶剂为乙腈。

进一步的，所述A相三氟乙酸水溶液中的三氟乙酸的浓度为0.1～1%。

进一步的，所述B相与A相混合体积比例为45～55%。

进一步的，所述测定甲苯磺酸索拉非尼含量的具体操作步骤如下：

（1）选取14mg甲苯磺酸索拉非尼，精密称重，放置于100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试液；

（2）另取甲苯磺酸索拉非尼14mg，精密称重，放置于100ml量瓶中，配制成含索拉非尼浓度为0.1mg/ml，作为对照液；

（3）分别量取供试液及对照溶液10μl，注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算并折干，即得。

本发明另一个目的是公开一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼有关物质的方法，其创新点在于：所述色谱条件为：选用以十八烷基键合硅胶为填充剂，柱长250mm，检测波长235nm，柱温40℃，流速1.0ml/min；采用的检测器为紫外检测器；采用反相高效液相色谱法按梯度进行洗脱，所述流动相为三氟乙酸水溶液与极性有机溶剂，所述三氟乙酸水溶液为A相，所述极性有机溶剂为B相，所述流动相中Ｂ相的有机溶剂为乙腈。

进一步的，所述A相三氟乙酸水溶液中的三氟乙酸的浓度为0.1～1%。

进一步的，所述A相与B相的体积比按照梯度程序进行设置。

进一步的，所述测定甲苯磺酸索拉非尼有关物质的具体操作步骤如下：

（4）取14mg甲苯磺酸索拉非尼，精密称重，放置于10ml量瓶中，加入混合溶剂，所述混合溶剂为水、乙腈和乙醇的混合，所述水、乙腈和乙醇的混合体积比为250:450:300，通过超声，使甲苯磺酸索拉非尼充分溶解，摇匀，作为供试品溶液；

（5）精密量取供试品溶液1ml，放置于100ml量瓶中，用步骤（4）中的混合溶剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取步骤（5）第一阶段获得的溶液1ml，放置于10ml量瓶中，选用步骤（4）中的混合溶剂进行稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

（6）取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高为满量程的10～20%；

（7）精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

本发明的有益效果如下：本发明采用了反相高效液相色谱法，通过制备供试液和对照液，并且分别量取供试液及对照溶液10μl，注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算并折干，即完成了甲苯磺酸索拉非尼含量和其他物质的测试，本发明填补了目前甲苯磺酸索拉非尼含量和有关物质的的测试分析方法尚无的空缺，通过乙腈-三氟乙酸水溶液体系能够将甲苯磺酸索拉非尼和其杂质能够达到分离，本发明可以满足研发和生产的需求，能够有效的对甲苯磺酸索拉非尼原料药中的有关物质进行更为严格有效的控制。

附图说明

图1甲苯磺酸索拉非尼含量系统适应性。

图2甲苯磺酸索拉非尼有关物质系统适应性。

图3为实施例1的色谱图。

图4为实施例2的色谱图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

实施例1

高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼含量的具体操作步骤如下：

（1）选取14mg甲苯磺酸索拉非尼，精密称重，放置于100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试液；

（2）另取甲苯磺酸索拉非尼14mg，配置成含索拉菲尼浓度为0.1mg/ml，作为对照液；

（3）分别量取供试液及对照溶液10μl，注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算并折干，即得。

实施例2

高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼有关物质的具体操作步骤如下：

（4）取14mg甲苯磺酸索拉非尼，精密称重，放置于10ml量瓶中，加入混合溶剂，所述混合溶剂为水、乙腈和乙醇的混合，所述水、乙腈和乙醇的混合体积比为250:450:300，通过超声，使甲苯磺酸索拉非尼充分溶解，摇匀，作为供试品溶液；

（5）精密量取供试品溶液1ml，放置于100ml量瓶中，用步骤（4）中的混合溶剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取步骤（5）第一阶段获得的溶液1ml，放置于10ml量瓶中，选用步骤（4）中的混合溶剂进行稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

（6）取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高为满量程的10～20%；

（7）精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

洗脱方法为按照梯度程序进行洗脱，具体如下表所示：

对甲苯磺酸索拉非尼含量测定方法的以下项目进行了验证：

1、系统适应性用甲苯磺酸索拉非尼来分析此色谱条件是否符合要求。由图1可见此条件下各个杂质与主峰以及杂质之间分离度符合要求，峰纯度和单点阈值均符合要求。

、标准曲线配制各浓度梯度的供试液，分别精密量取10μl，注入色谱仪，记录色谱图。以浓度（μg/ml）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制回归曲线，计算回归系数。由结果可见，本品的含量测定于甲苯磺酸索拉非尼浓度50.23-150.7μg/ml的浓度范围内有良好线性。

、重复性取样品6份，分别精密称定，按高效液相色谱法含量测定方法进行测定，考察测定方法的重复性。由结果可见，本品含量测定高效液相色谱法的重复性良好。

、回收率取甲苯磺酸索拉非尼约14mg，共9份，精密称定，置200ml的量瓶中，另取甲苯磺酸索拉非尼对照品8mg、10mg、12mg各三份置上述量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为80%、100%、120%供试品溶液。照含量测定的高效液相色谱法测定，计算测得量和回收率。由结果可见，本品高效液相色谱法含量测定的回收率良好。

5、溶液稳定性取本品含量测定的供试液，分别于0、1、2、4、6、8、12、24小时进样，考察本品含量测定液相法的溶液稳定性，由结果可见，本品含量测定的高效液相色谱法溶液于24小时内稳定。

、中间精密度以重复性结果为中间精密度数据组1，另行实验结果为中间精密度数据组2。考察本品含量测定高效液相色谱法的中间精密度，由结果可见，本品含量测定高效液相色谱法的中间精密度良好。

对甲苯磺酸索拉非尼有关物质检查方法的以下项目进行了验证：

1、系统适用性实验在上述确定的色谱条件下，再分别用甲苯磺酸索拉非尼和其杂质，杂质出峰顺序为对甲苯磺酸、吡啶酰胺苯基醚、SLFN-SM1、PAPE-氨基甲酸乙酯、PAPE-尿素、PAPE-氨基甲酸异丙酯、CTF-苯胺、SLFN-I12、脱氯化合物、CTF-氨基甲酸乙酯、2-氯-3-TF-化合物、索拉非尼、CTF-尿素，混合物来分析此色谱条件是否符合要求。由图2可见此条件下各个杂质与主峰以及杂质之间分离度符合要求，峰纯度和单点阈值均符合要求。

、专属性取本品适量，分别于各苛性条件下进行破坏，考察破坏产物与主成分峰的分离情况。

酸破坏：取甲苯磺酸索拉非尼14mg，精密称定，置10ml量瓶中，加1mol/L盐酸0.5ml，放置36小时，加1mol/L氢氧化钠溶液中和，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

碱破坏：取甲苯磺酸索拉非尼14mg，精密称定，置10ml量瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，放置36小时，加1mol/L盐酸中和，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

氧化破坏：取甲苯磺酸索拉非尼14mg，精密称定，置10ml量瓶中，加30%双氧水0.5ml，放置36小时，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

高温破坏：取甲苯磺酸索拉非尼14mg，精密称定，置坩埚中，置150℃烘箱中放置8小时，转移至10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

光照破坏：取甲苯磺酸索拉非尼14mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。在4500±500LUX光照强度下放置48h。

取各破坏条件下的样品，照有关物质的液相条件进样，记录色谱图，结果可见，本品于各破坏条件下生成的杂质峰均能与主成分峰分离良好。本品在各破坏条件下所生成的杂质均不大，且降解的杂质峰均在检测波长235nm附近有较大吸收。

、中间体的响应值及标准曲线取本品合成中间吡啶酰胺苯基醚、副反应产物PAPE-氨基甲酸乙酯、副反应产物PAPE-尿素、甲苯磺酸索拉非尼分别配制成梯度浓度的供试液（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）、（7）。取分别吸取各供试液10μl，注入色谱仪，记录色谱图。以浓度（μg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制回归曲线，计算回归系数。由以上结果可见，本品与各步中间体在0.201～9.514μg/ml范围内均呈良好线性，各中间体与甲苯磺酸索拉非尼的响应因子基本一致。

中间体1低浓度标准曲线

甲苯磺酸索拉非尼低浓度标准曲线

副反应产物1低浓度标准曲线

副反应产物2标准曲线

4、溶液稳定性取本品有关物质测定的供试液，分别于0、1、2、4、6、8、12、24小时进样，考察本品有关物质检查液相法的溶液稳定性，由结果可见，本溶液于24小时内稳定。

5、耐用性由于本品的色谱条件为梯度洗脱，并规定了相应的色谱柱型号、柱温、流动相比例，故我们将这些条件作相应的微调，考察色谱条件的耐用性。

由图可见，结果表明，使用同品牌不同批次色谱柱条件下，本品各色谱参数结果无明显变化，证明本品对同品牌不同批次色谱柱耐用性良好；但使用不同品牌色谱柱时，主峰与前一个杂质分离度较差，提示色谱条件需要规定色谱柱品牌型号；在不同检测波长下，本品主成分归一化含量结果有明显变化，提示本品的主峰与杂质峰的面积比对波长变化较敏感，影响杂质校正因子及定量，因此测定波长需要规定在235nm；在不同流速条件下，本品各色谱参数无明显变化，证明本品对不同流速耐用性良好；缓冲液pH变化时出峰时间也有明显变化。

、定量限和检测限取本品对照品适量，精密称定，加流动相配成甲苯磺酸索拉非尼溶液后，再精密量取供试液适量，逐级稀释，进样考察，结果显示本品定量限为0.4ng/ml，检测限为0.15ng/ml。

甲苯磺酸索拉非尼原料药在治疗晚期肾细胞癌的治疗上，有着重要的作用。目前含量和有关物质分析方法尚无文献报道，我们通过大量实验，摸索出的检测方法，经过了严格的方法验证。可以满足了研发和生产的需求，为甲苯磺酸索拉非尼药物的早日上市提供了必要的支持。

上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。

Claims (8)

1.一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼含量的方法，其特征在于：所述色谱条件为：选用以十八烷基键合硅胶为填充剂，柱长250mm，检测波长235nm，柱温40℃，流速1.0ml/min；采用的检测器为紫外检测器；采用反相高效液相色谱法按等度进行洗脱，所述流动相为三氟乙酸水溶液与极性有机溶剂，所述三氟乙酸水溶液为A相，所述极性有机溶剂为B相，所述流动相中Ｂ相的有机溶剂为乙腈。

2.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼含量的方法，其特征在于：所述A相三氟乙酸水溶液中的三氟乙酸的浓度为0.1～1%。

3.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼含量的方法，其特征在于：所述B相与A相混合体积比例为45～55%。

4.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼含量的方法，其特征在于：所述测定甲苯磺酸索拉非尼含量的具体操作步骤如下：

（1）称取14mg甲苯磺酸索拉非尼，精密称重，放置于100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试液；

（2）另取甲苯磺酸索拉非尼14mg，精密称重，放置于100ml量瓶中，配制成含索拉非尼浓度为0.1mg/ml，作为对照液；

（3）分别量取供试液及对照溶液10μl，注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算并折干，即得。

5.一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼有关物质的方法，其特征在于：所述色谱条件为：选用以十八烷基键合硅胶为填充剂，柱长250mm，检测波长235nm，柱温40℃，流速1.0ml/min；采用的检测器为紫外检测器；采用反相高效液相色谱法按梯度进行洗脱，所述流动相为三氟乙酸水溶液与极性有机溶剂，所述三氟乙酸水溶液为A相，所述极性有机溶剂为B相，所述流动相中Ｂ相的有机溶剂为乙腈。

6.根据权利要求5所述的一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼有关物质的方法，其特征在于：所述A相三氟乙酸水溶液中的三氟乙酸的浓度为0.1～1%。

7.根据权利要求5所述的一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼含量的方法，其特征在于：所述A相与B相的体积比按照梯度程序进行设置。

8.根据权利要求5所述的一种高效液相色谱法测定甲苯磺酸索拉非尼含量的方法，其特征在于：所述测定甲苯磺酸索拉非尼有关物质的具体操作步骤如下：

（4）取14mg甲苯磺酸索拉非尼，精密称重，放置于10ml量瓶中，加入混合溶剂，所述混合溶剂为水、乙腈和乙醇的混合，所述水、乙腈和乙醇的混合体积比为250:450:300，通过超声，使甲苯磺酸索拉非尼充分溶解，摇匀，作为供试品溶液；

（5）精密量取供试品溶液1ml，放置于100ml量瓶中，用步骤（4）中的混合溶剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取步骤（5）第一阶段获得的溶液1ml，放置于10ml量瓶中，选用步骤（4）中的混合溶剂进行稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

（6）取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高为满量程的10～20%；

（7）精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。