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CN105154498A - Glp-1类似物的半重组制备法 - Google Patents

Glp-1类似物的半重组制备法 Download PDF

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CN105154498A CN201510459093.9A CN201510459093A CN105154498A CN 105154498 A CN105154498 A CN 105154498A CN 201510459093 A CN201510459093 A CN 201510459093A CN 105154498 A CN105154498 A CN 105154498A
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Abstract

本发明涉及结合使用重组表达技术和化学肽合成法产生在N端部分含非蛋白氨基酸的GLP-1类似物和衍生物的半重组方法。

Description

GLP-1类似物的半重组制备法
本申请为分案申请，原申请的申请日为2008年12月22日，申请号为200880124022.1(PCT/EP2008/068211)，发明名称为“GLP-1类似物的半重组制备法”。
发明领域
本发明涉及结合使用重组表达技术和化学肽合成法用于制备在N端部分含有非蛋白氨基酸(non-proteogenicaminoacid)的GLP-1类似物和衍生物的半重组方法。
发明背景
人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是37个氨基酸残基的胃肠激素，参与血液葡萄糖代谢、胃肠分泌和代谢及食物摄取的调节。GLP-1来源于前胰高血糖素原，尤其是在回肠末端中、在胰腺中和在脑中的L细胞内合成的前胰高血糖素原。GLP-1以葡萄糖依赖性方式刺激胰岛素分泌，刺激胰岛素生物合成，促进β细胞拯救，减少胰高血糖素分泌、胃排空和食物摄取。人GLP-1被水解成GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)-酰胺，这两者均为促胰岛素剂(insulinotropicagent)。给予2型糖尿病患者药理剂量的GLP-1表明显著提升循环胰岛素水平，并且降低血浆胰高血糖素水平。GLP-1的作用受胰腺、心脏、肾、中枢神经系统和胃肠道中的GLP-1受体介导。因此，预期GLP-1将在糖尿病的治疗中变得非常重要。
然而，天然的人GLP-1被血浆酶二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解成为起GLP-1受体拮抗剂作用的截短GLP-1(9-36)酰胺代谢物而快速失活。这就为肽提供了短的循环半寿期。
对于许多糖尿病患者，尤其患有所谓“恐针症”即非常害怕自我注射的2型糖尿病的部分患者而言，这种短的循环半寿期是个问题。在2型糖尿病部分患者中，大多数用口服降血糖药来治疗。由于预期GLP-1化合物将成为注射用药品，因此对于这些临床上非常有前景的化合物的广泛使用而言，注射恐惧可能成为严重障碍。
因此，为了提供较长的体内作用持续时间，已采用了多种不同的手段和方法来修饰GLP-1化合物的结构。因此，例如正在进行大量努力以开发对DPP-IV介导的水解较不敏感的GLP-1化合物的类似物和衍生物，以降低DPP-IV的降解速度。WO2006/097538、WO2006/097536、WO2006/037810、WO2006/005667、WO2005/058958、WO2005/027978、WO98/08871和US2001/0011071描述了各种GLP-1类似物和衍生物，包括包含非蛋白氨基酸(即非天然氨基酸)的GLP类似物，它们可针对DPP-IV的水解提供一定的保护作用。
只含有蛋白氨基酸(即天然氨基酸)的多肽，例如天然GLP-1，可以采用重组技术或通过化学合成法产生。然而，还含有非蛋白氨基酸的多肽，例如N端突出端的GLP-1类似物，目前无法通过重组表达技术以实用的方式制备，而一般是通过化学合成法制备。最广泛使用的肽合成方法是固相肽合成法，其中使用聚合物作为固相支持体，逐步掺入适当保护的氨基酸。
固相肽合成法(SPPS)在一些肽的制备中可能非常有效，但是受保护氨基酸的使用与过量反应物的连续使用相结合，使得该方法相对昂贵。另外，固相多肽合成中每个氨基酸延长都需要充分的洗涤操作。通常，掺入一个氨基酸涉及多达10次用NMP、DMF或DCM等这类溶剂的洗涤步骤。
当采用SPPS合成多肽如促胰岛素剂、GLP-1类似物、GLP-1的截短类似物和GLP-1的衍生物时，合成期间二级结构的形成常常导致各个合成步骤的效率降低。因此，常常以低纯度和收率生产出较大的肽或含有某些氨基酸序列的肽。杂质常常是在最终序列中失去一个或多个氨基酸的缺失肽。这些杂质可能非常难以与所需要的肽相分离，导致产物被缺失肽污染。
本发明的目的是提供通过在N端部分包含非蛋白氨基酸来产生DPP-IV保护性的GLP-1类似物和衍生物的有效而又经济的方法。所述方法结合了采用重组技术有效益成本地产生截短GLP-1前体分子的优势与包含非蛋白氨基酸的N端突出端(N-terminalextension)的化学合成法。实现了GLP-1类似物或衍生物生产成本的大幅降低。非常需要花费较少的GLP-1类似物和衍生物，用于使可获得治疗的患者数最大化，以及拓展其生物利用度比皮下注射低的备选递送途径(例如经皮和肺递送)的优势。
发明概述
在本发明最大的方面，本发明涉及通过在N端部分包含一个或多个非蛋白氨基酸而产生DPP-IV保护性的GLP-1类似物和衍生物的方法。
因此，在一个方面，本发明涉及用于制备包含一个或多个非蛋白氨基酸的GLP-1类似物和衍生物的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)对包含编码所述GLP-1类似物或衍生物的前体分子的核苷酸序列的宿主细胞在用于表达所述前体分子的适当条件下进行培养，
(ii)从液体培养基中分离出表达的前体分子，
(iii)将包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与表达的前体分子偶联，
(iv)通过本领域已知的合适方法分离出所得到的GLP-1类似物或衍生物。
附图详述
图1表示酵母质粒pSA273。该质粒含有表达盒，该表达盒包含在酿酒酵母(S.cerevisiae)TPI基因转录启动子和转录终止子之间的插入质粒的EcoRI-XbaI片段。表达盒编码由MFα1*前导序列原(pre-proleader)、用于二元加工(dibasicprocessing)内肽酶Kex2的Lys-Arg切割位点和GLP-1前体(R34)GLP-1(11-37)组成的融合产物。
图2表示编码GLP-1前体的NcoI-XbaIDNA片段。由该DNA片段编码的GLP-1前体氨基酸序列用粗体字注明。a)(R34)GLP-1(11-37)；b)Ext1-(E22，R26，R34)GLP-1(8-37)K38-Ext2和c)Ext1-(E22，R26，R34，K37)GLP-1(8-37)-Ext2；d)(R34)GLP-1(9-37)。
图3表示编码GLP-1前体的NcoI-XbaI的DNA片段和最优化前导序列。(34R)GLP-1(11-37)作为非限制性实例表示。大写字母表示不同的序列。由该DNA片段编码的最优化氨基酸序列以粗体字标明。‘KR’表示具有最小Kex2p切割位点LysArg的构建体。
图4表示作为实例的(34R)GLP-1(11-37)前导序列最优化。P1至P6的最优化：(A-F)。脯氨酸的掺入：(H、I)。带电荷氨基酸掺入P7至P11中：(M-Z、K5-7、L2-4)。用DAPase进行下游加工的构建体：(G、J、K、L)。收率以相对于具有MFα*-前导序列和单一LysArgKex2p切割位点的(34R)GLP-1(11-37)的百分比给出。
发明详述
本发明的发明人研发出一种经济有效的方法，用于制备在N端部分包含一个或多个非蛋白氨基酸的GLP-1类似物和衍生物。因此发现，可以例如通过使GLP-1类似物的前体与突出片段的羧酸衍生物(其任选被活化)反应，使用非蛋白氨基酸或含有一个或多个非蛋白氨基酸的肽在N端有效地延伸重组产生的只含蛋白氨基酸的GLP-1前体分子。
更准确地讲，本发明提供用于制备在包括第7、8、9和/或10位在内的N端含有一个或多个非蛋白氨基酸的GLP-1类似物和衍生物的半重组方法。另外，提供用于通过酰化使GLP-1类似物前体分子中的赖氨酸残基的ε-N衍生化的有效方法。因此，本发明将采用重组技术有成本效益地产生GLP-1类似物和衍生物与化学合成法的灵活性结合起来。
在本说明书中，下列术语具有规定的含义：
本文使用的术语“多肽”和“肽”是指由通过肽键连接的至少两个组分氨基酸组成的化合物。组分氨基酸可选自由遗传密码编码的氨基酸，这些氨基酸可以是并非由遗传密码编码的天然氨基酸，也可以是合成氨基酸。非遗传密码编码的天然氨基酸例如γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包含通过化学合成法制备的氨基酸，即由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、β-丙氨酸、3-氨基甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸。
22种蛋白氨基酸是：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。
因此，非蛋白氨基酸是可以通过肽键掺入肽中但不是蛋白氨基酸的部分。非蛋白氨基酸的实例有但不限于γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-氨基酸，例如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成非蛋白氨基酸包括通过化学合成法制备的氨基酸，即由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、3-氨基甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、脱-氨基-组氨酸、氨基酸的β类似物(例如β-丙氨酸等)、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸、α-甲基脯氨酸(α-methylprolin)、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸和4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-C]吡啶-6-甲酸B-(1，2，4-三唑-1-基)-丙氨酸(alanin)。
本文提及多肽使用的术语“DPP-IV保护性的(DPP-IVprotected)”是指为了赋予所述化合物抗血浆肽酶二肽基肽酶-4(DPP-IV)抗性而经过化学修饰的多肽。已知血浆中的DPP-IV酶参与诸如GLP-1、GLP-2、毒蜥外泌肽4(Exendin-4)等若干肽激素的降解。因此，为了降低DPP-IV的降解速度，进行了大量努力以研发对由DPP-IV引起的水解作用敏感的多肽的类似物和衍生物。在一个实施方案中，DPP-IV保护性肽比GLP-1(7-37)对DPP-IV更有抗性。
肽对由DPP-IV引起的降解的抗性通过下列降解测定法测定：
在100μL0.1M三乙胺-HCl缓冲液(pH7.4)中，将等分量的肽(5nmol)与相当于5mU酶活性的1μL纯化的DPP-IV在37℃下孵育10-180分钟。通过加入5μL10％三氟乙酸来终止酶促反应，使用HPLC分析法分离并定量测定肽降解产物。用于进行该项分析的一种方法是：按照Siegel等，Regul.Pept.1999；79：93-102和Mentlein等，Eur.J.Biochem.1993；214：829-35，将混合物加到VydacC18widepore(30nm孔，5μm颗粒)250x4.6mm柱中，以1ml/分钟的流速，用乙腈/0.1％三氟乙酸(0％乙腈3分钟，0-24％乙腈17分钟，24-48％乙腈1分钟)进行线性分级梯度洗脱。肽及其降解产物可通过在220nm(肽键)或280nm(芳族氨基酸)下的吸光度进行监测，通过其峰面积相对于标准品的积分进行定量。在导致小于10％的肽被水解的孵育时间内，估算二肽基肽酶DPP-IV对肽的水解速度。
在其最大的意义上，本文使用的术语“GLP-1类似物”是指肽的胰高血糖素家族分子的类似物或毒蜥外泌肽家族的类似物。肽的胰高血糖素家族由前胰高血糖素原基因编码，包括3个具有高同源性程度的小肽，即胰高血糖素(1-29)、GLP-1(1-37)和GLP-2(1-33)。毒蜥外泌肽是在蜥蜴中表达的肽，像GLP-1一样，是促胰岛素的。毒蜥外泌肽的实例为毒蜥外泌肽3和毒蜥外泌肽4。
本文提及多肽所使用的术语“类似物”是指修饰肽，其中肽的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代和/或其中一个或多个氨基酸残基从肽中缺失和/或其中一个或多个氨基酸残基被添加入肽中。氨基酸残基的这类添加或缺失可发生在肽的N端和/或在肽的C端。因此本发明的GLP-1类似物是本发明GLP-1(1-37)的类似物，其中肽的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代和/或其中一个或多个氨基酸残基从肽中缺失和/或其中一个或多个氨基酸残基被添加入肽中。
对于本发明的目的，任何氨基酸取代、缺失和/或添加都是指作为SEQIDNO：1包括在本文中的人GLP-1(7-37)的序列。然而，在序列表中氨基酸残基编号总是从第一位开始，而对于本发明的目的，按照本领域的成规，我们需要用第7位氨基酸残基开始，并给它指定数字7。因此，一般而言，在本文中任何提及GLP-1(7-37)序列的位置编号时，是指以第7位的His开始并以第37位的Gly结束的序列。
一个简单的体系常用来描述GLP-1类似物：例如[Arg34]GLP-1(7-37)Lys表明其中天然存在的34位的赖氨酸被精氨酸取代且其中赖氨酸被添加至C端的GLP-1(7-37)类似物。另一个实例[Arg34]GLP-1(11-37)表明其中天然存在的34位的赖氨酸被精氨酸取代且7、8、9和10位的氨基酸不存在的GLP-1类似物。
术语“与......相应的位置”当在本文中用来表征修饰的GLP-1(7-37)序列时，是指在天然GLP-1(7-37)序列(具有SEQIDNO：1的序列)中的相应位置。相应位置易于通过例如简单书写和目测推算出来。在备选方法中，可以应用标准蛋白质或肽比对程序，例如Needleman-Wunsch比对法中的“比对”。该算法参见Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，JournalofMolecularBiology，48：443-453，比对程序参见Myers和W.Miller的“OptimalAlignmentsinLinearSpace”CABIOS(生物科学中的计算机应用(computerapplicationsinthebiosciences))(1988)4：11-17。对于比对，可以采用默认评分矩阵(defaultscoringmatrix)BLOSUM50和默认同一性矩阵(defaultidentitymatrix)，空位上第一残基的罚分可设定为-12，空位上另外的残基的罚分设为-2。
本文使用的与肽有关的术语“衍生物”是指其中至少一个取代基与未修饰肽或其类似物连接的化学修饰的肽或其类似物，即被共价修饰的肽。典型的修饰物为酰胺、糖、烷基、酰基、酯等。GLP-1(7-37)的衍生物的实例为Nε26-(γ-Glu(Nα-十六酰基)))-[Arg34，Lys26])GLP-1(7-37)。
对于未指明旋光异构体的所有氨基酸都理解为是指L-异构体。
在本发明的实施方案中，与人GLP-1(7-37)相比，GLP-1类似物中最多17个氨基酸被修饰(取代、缺失、添加或其任何组合)。在本发明的实施方案中，GLP-1类似物中最多15个氨基酸被修饰。在本发明的实施方案中，GLP-1类似物中最多10个氨基酸被修饰。在本发明的实施方案中，GLP-1类似物中最多8个氨基酸被修饰。在本发明的实施方案中，GLP-1类似物中最多7个氨基酸被修饰。在本发明的实施方案中，GLP-1类似物中最多6个氨基酸被修饰。在本发明的实施方案中，GLP-1类似物中最多5个氨基酸被修饰。在本发明的实施方案中，GLP-1类似物中最多4个氨基酸被修饰。在本发明的实施方案中，GLP-1类似物中最多3个氨基酸被修饰。在本发明的实施方案中，GLP-1类似物中最多2个氨基酸被修饰。在本发明的实施方案中，GLP-1类似物中1个氨基酸被修饰。
在一个实施方案中，GLP-1类似物是促胰岛素剂。
在一个实施方案中，GLP-1类似物是GLP-1激动剂。
本文使用的术语“GLP-1激动剂”是指完全或部分激活人GLP-1受体的任何胰高血糖素样肽。在一个优选的实施方案中，“GLP-1激动剂”是与GLP-1受体结合的任何胰高血糖素样肽，其优选具有低于1μM的亲和常数(KD)或功效(EC50)，例如低于100nM，正如按本领域已知方法测定的一样(参见例如WO98/08871)，并具有促胰岛素活性，其中促胰岛素活性可以通过本领域普通技术人员已知的体内或体外测定法测量。例如，可以给予动物GLP-1激动剂，并测定随时间变化的胰岛素浓度。
在本发明的一个方面，包括在本发明药物组合物中的GLP-1类似物是GLP-1的类似物，其中该类似物包含至少一个非蛋白肽。
在本发明的一个方面，GLP-1类似物选自Aib8，22，35GLP-1(7-37)、Aib8，35GLP-1(7-37)、Aib8，22GLP-1(7-37)、Aib8，22，35Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35Aeg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35Arg26Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Arg26Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22Arg26Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35Arg34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Arg34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22Arg34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35Ala37Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Ala37Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22Ala37Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35Lys37GLP-1(7-37)、Aib8，35Lys37GLP-1(7-37)和Aib8，22Lys37GLP-1(7-38)。
在本发明的一个方面，GLP-1类似物选自
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺，
[脱氨基His7，Arg34]GLP-1-(7-37)，
[Aib8，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)酰胺，
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys，
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys，
[脱氨基His7，Arg26，Arg34，]GLP-1-(7-37)-Lys，
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[脱氨基His7，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)，
[脱氨基His7，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)，
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Glu30，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)，
[Aib8，Lys20，Arg26，Glu30，Thr(O-苄基)33，]GLP-1-(7-37)酰胺，
[Aib8，Glu22，Arg26，Lys30]GLP-1-(7-37)，
[Aib8，Glu22，Arg26，Lys31]GLP-1-(7-37)，
[Aib8，Lys20，Arg26，2-萘基丙氨酸28，Glu30，]GLP-1(7-37)酰胺，
[Aib8，Glu22，Arg26，Arg34，]GLP-1-(7-37)-Lys，
[Aib8，Lys20，Arg26，2-萘基丙氨酸12，Glu30，]GLP-1-(7-37)酰胺，
[Aib8，Glu22，Arg26，Lys31，Arg34]GLP-1-(7-37)，
[Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)，
[Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)-酰胺，
[Aib8，Lys18，Arg26，Arg34]GLP-1(7-37)，
[Aib8，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[Aib8，Lys26]GLP-1(7-37)酰胺，
[Aib8，Arg34]GLP-1-(7-34)，
[Aib8，Arg34]GLP-1-(7-35)，
[Aib8，Lys33，Arg34]GLP-1-(7-34)，
[Aib8，Arg34]GLP-1-(7-36)酰胺，
[Aib8，Lys26，Arg34]GLP-1-(7-36)酰胺，
[Aib8，Glu22，Arg26，Arg34]GLP-1-(7-37)Lys，
[Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30，Pro37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[Aib8，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[脱氨基His7，Arg22，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[Aib8，Glu22，Arg26，Glu30，Pro37]GLP-1-(7-37)Lys，
[Aib8，Glu22，Arg26，Glu30，Pro37]GLP-1-((7-37)Lys，
[Aib8，Arg26，Arg34]GLP-1-(7-37)。
在又一个实施方案中，包括在本发明药物组合物中的GLP-1类似物是GLP-2的类似物，其中该类似物包含至少一个非蛋白肽。
在又一个实施方案中，GLP-1类似物是毒蜥外泌肽4或毒蜥外泌肽3的类似物，其中该类似物包含至少一个非蛋白肽。毒蜥外泌肽及其类似物的实例参见WO97/46584、US5424286和WO01/04156。US5424286描述了用于刺激胰岛素随毒蜥外泌肽释放的方法。所公开的毒蜥外泌肽包括HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGX(SEQIDNO.12)，其中X-P或Y，其中毒蜥外泌肽3为HSDGTFITSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQIDNO.13)，毒蜥外泌肽4(1-39)为HGEGTFITSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQIDNO.2)。WO97/46584描述了毒蜥外泌肽的截短形式。所公开的肽增加胰岛素的分泌和生物合成，但却降低胰高血糖素的分泌和生物合成。WO01/04156描述了毒蜥外泌肽4类似物和衍生物以及这些分子的制备法。
本文使用的术语“毒蜥外泌肽4肽”是指毒蜥外泌肽4(1-39)(SEQIDNO.2)、毒蜥外泌肽4(1-39)类似物、毒蜥外泌肽4(1-39)衍生物或毒蜥外泌肽4(1-39)类似物的衍生物、其促胰岛素片段、其促胰岛素类似物和其促胰岛素衍生物。毒蜥外泌肽4的促胰岛素片段是其中整个序列可存在于毒蜥外泌肽4序列(SEQIDNO.2)中并且其中至少一个末端氨基酸缺失的促胰岛素剂。毒蜥外泌肽4(1-39)的促胰岛素片段的实例为毒蜥外泌肽4(1-38)和毒蜥外泌肽4(1-31)。
某一化合物的促胰岛素性质可以通过本领域众所周知的体内或体外测定法来测定。例如，可将化合物给予动物，并监测随时间变化的胰岛素浓度。毒蜥外泌肽4(1-39)的促胰岛素类似物是指其中一个或多个氨基酸残基与其它氨基酸残基交换和/或从其中缺失一个或多个氨基酸残基和/或向其中添加一个或多个氨基酸残基的相应分子，前提条件是所述类似物或是促胰岛素剂或是促胰岛素化合物的前药。毒蜥外泌肽4(1-39)的促胰岛素类似物的实例是Ser2Asp3-毒蜥外泌肽4(1-39)，其中2位和3位上的氨基酸残基分别被丝氨酸和天冬氨酸置换(这种特定的类似物本领域亦称毒蜥外泌肽3)。毒蜥外泌肽4(1-39)的促胰岛素衍生物及其类似物是本领域技术人员所认为的是这些肽的衍生物，即具有至少一个不存在于母体肽分子中的取代基，前提条件是所述衍生物或是促胰岛素剂或是促胰岛素化合物的前药。取代基的实例为酰胺、糖、烷基、酯和亲脂取代基。毒蜥外泌肽4(1-39)的促胰岛素衍生物及其类似物的实例是Tyr31-毒蜥外泌肽4(1-31)-酰胺。
本文使用的术语“稳定的毒蜥外泌肽4化合物”是指化学修饰的毒蜥外泌肽4(1-39)，即当用常规方法测量时，在人体中具有至少10小时的体内血浆清除半寿期酰化毒蜥外泌肽3或酰化毒蜥外泌肽4类似物。
未注明旋光异构体的所有氨基酸都要理解为是指L-异构体。
本文使用的术语“促胰岛素剂”是指作为人GLP-1受体的激动剂的化合物，即在含有人GLP-1受体的合适培养基(一种所述培养基见下文)中刺激cAMP形成的化合物。从如下所述的剂量反应曲线计算EC50值来确定促胰岛素剂的功效。
使表达克隆的人GLP-1受体的幼仓鼠肾(BHK)细胞(BHK-467-12A)在加有100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、5％胎牛血清和0.5mg/ml遗传霉素G-418(LifeTechnologies)的DMEM培养基中生长。将细胞在磷酸缓冲盐溶液中洗涤两次后，用Versene收获。通过用Ultraturrax在缓冲液1(20mMHEPES-Na、10mMEDTA，pH7.4)中匀浆，由细胞制备质膜。匀浆液在4℃下以48,000xg离心15分钟。通过在缓冲液2(20mMHEPES-Na、0.1mMEDTA，pH7.4)中匀浆，使沉淀悬浮，然后在4℃下以48,000xg离心15分钟。洗涤操作重复多一次。将最终的沉淀悬浮于缓冲液2中，立即用于测定或保存在-80℃下。
通过测量在响应促胰岛素剂刺激时的环腺苷酸(cAMP)，来进行功能性受体测定。通过AlphaScreenTMcAMP试剂盒(PerkinElmerLifeSciences)对所形成的cAMP进行定量测定。孵育在含总体积为50μL缓冲液3(50mMTris-HCl、5mMHEPES、10mMMgCl2，pH7.4)的96孔微量滴定板一半区域中进行，并使用以下添加物：1mMATP、1μMGTP、0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.01％吐温-20、0.1％BSA、6μg膜制备物、15μg/ml接纳珠、20μg/ml与6nM生物素-cAMP预孵育的供体珠。在缓冲液3中使要测定激动剂活性的化合物溶解并稀释。新鲜制备GTP用于每次实验。在室温下，将滴定板在黑暗中慢慢振荡孵育3小时，随后在FusionTM仪(PerkinElmerLifeSciences)中计数。绘制各个化合物的浓度-反应曲线，应用四参数逻辑斯谛模型与Prismv.4.0(GraphPad，Carlsbad，CA)估算EC50值。
本文使用的术语“半重组”是指包括以下步骤的方法：通过重组方法即从宿主细胞培养物中制备第一肽片段(例如GLP-1类似物的第一片段)，随后使肽的第二片段与肽的第一片段偶联，其中第二片段用化学方法，即在溶液中或在树脂上应用固相肽化学法制备。片段的偶联可以用化学方法或酶促方法进行。
本文使用的术语“分离表达的前体分子”是指任何类型的分离，包括重组产生的化合物的分离，也包括分解宿主细胞或透化处理宿主细胞。
因此，本发明涉及用于制备在N端部分包含一个或多个非蛋白氨基酸的GLP-1类似物或衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)对包含编码所述GLP-1类似物或衍生物的前体分子的核苷酸序列的宿主细胞在用于表达所述前体分子的适当条件下进行培养，
(ii)从液体培养基中分离出表达的前体分子，
(iii)将包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与表达的前体分子偶联，
(iv)通过本领域已知的合适方法分离出所得到的GLP-1类似物或衍生物。
在本文中，术语“GLP-1类似物的前体分子”要理解为是在N端氨基酸突出端添加之前衍生自GLP-1、GLP-2、毒蜥外泌肽3或毒蜥外泌肽4肽即GLP-1类似物序列的肽。实例包括但不限于人GLP-1(11-37)或其类似物、人GLP-1(9-37)或其类似物和人GLP-1(8-37)或其类似物。
因此，在一个方面，本发明GLP-1类似物的前体分子包含衍生自如SEQIDNO：1所示的GLP-1(7-37)序列的GLP-1肽。
毒蜥外泌肽4是自大毒蜥(Gilamonsterlizard)(钝尾毒蜥(Helodermasuspectum)和珠毒蜥(Helodermahorridum))毒液分离的39个氨基酸残基的肽。该肽在重叠区与GLP-1(7-37)有52％同源性。毒蜥外泌肽4是有效的GLP-1受体激动剂，并且还被证实当注射至狗体内时，刺激胰岛素释放，随后降低血液葡萄糖水平。
因此，由于在重叠区与GLP-1(7-37)共有52％同源性，因此在某些实施方案中，本发明GLP-1类似物的前体分子可衍生自SEQIDNO：2所示的毒蜥外泌肽4肽。
因此，在进一步的方面，GLP-1类似物的前体分子可包含以下通式的氨基酸序列：
Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45(SEQIDNO：3)
其中
Xaa16为Val或Leu；
Xaa18为Ser、Lys或Arg；
Xaa19为Tyr或Gln；
Xaa20为Leu或Met；
Xaa22为Gly或Glu；
Xaa23为Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa25为Ala或Val；
Xaa26为Lys、Glu或Arg；
Xaa27为Glu或Leu；
Xaa30为Ala、Glu或Arg；
Xaa33为Val、Lys或Arg；
Xaa34为Lys、Glu、Asn、His或Arg；
Xaa35为Gly；
Xaa36为Arg、Gly或Lys；
Xaa37为Gly、Ala、Glu、Pro、Lys，或不存在；
Xaa38为Lys、Ser，或不存在；
Xaa39为Ser、Lys，或不存在；
Xaa40为Gly，或不存在；
Xaa41为Ala，或不存在；
Xaa42为Pro，或不存在；
Xaa43为Pro，或不存在；
Xaa44为Pro，或不存在；
Xaa45为Ser，或不存在；
条件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44或Xaa45不存在，则下游每个氨基酸残基也不存在。
在本发明的进一步方面，GLP-1类似物的前体分子选自包含以下通式的氨基酸序列的前体分子：
Xaa9-Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45(SEQIDNO：4)
其中
Xaa9为Glu或Asp；
Xaa10为Gly或Ala；
Xaa16为Val或Leu；
Xaa18为Ser、Lys或Arg；
Xaa19为Tyr或Gln；
Xaa20为Leu或Met；
Xaa22为Gly或Glu；
Xaa23为Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa25为Ala或Val；
Xaa26为Lys、Glu或Arg；
Xaa27为Glu或Leu；
Xaa30为Ala、Glu或Arg；
Xaa33为Val、Lys或Arg；
Xaa34为Lys、Glu、Asn、His或Arg；
Xaa35为Gly；
Xaa36为Arg、Gly或Lys；
Xaa37为Gly、Ala、Glu、Pro、Lys，或不存在；
Xaa38为Lys、Ser，或不存在；
Xaa39为Ser、Lys，或不存在；
Xaa40为Gly，或不存在；
Xaa41为Ala，或不存在；
Xaa42为Pro，或不存在；
Xaa43为Pro，或不存在；
Xaa44为Pro，或不存在；
Xaa45为Ser，或不存在；
条件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44或Xaa45不存在，则下游每个氨基酸残基也不存在。
在本发明的进一步方面，GLP-1类似物的前体分子选自包含以下通式的氨基酸序列的前体分子：
Xaa8-Xaa9-Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45(SEQIDNO：5)
其中
Xaa8为Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Lys；
Xaa9为Glu或Asp；
Xaa10为Gly或Ala；
Xaa16为Val或Leu；
Xaa18为Ser、Lys或Arg；
Xaa19为Tyr或Gln；
Xaa20为Leu或Met；
Xaa22为Gly或Glu；
Xaa23为Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa25为Ala或Val；
Xaa26为Lys、Glu或Arg；
Xaa27为Glu或Leu；
Xaa30为Ala、Glu或Arg；
Xaa33为Val、Lys或Arg；
Xaa34为Lys、Glu、Asn、His或Arg；
Xaa35为Gly；
Xaa36为Arg、Gly或Lys；
Xaa37为Gly、Ala、Glu、Pro、Lys，或不存在；
Xaa38为Lys、Ser，或不存在；
Xaa39为Ser、Lys，或不存在；
Xaa40为Gly，或不存在；
Xaa41为Ala，或不存在；
Xaa42为Pro，或不存在；
Xaa43为Pro，或不存在；
Xaa44为Pro，或不存在；
Xaa45为Ser，或不存在；
条件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44或Xaa45不存在，则下游每个氨基酸残基也不存在。
通过应用本领域技术人员已知的通用方法和原理，通过重组DNA技术，在用于前体分子表达的合适条件下，对包含GLP-1类似物前体分子的编码核苷酸序列的合适宿主细胞进行培养，可制备本发明的GLP-1类似物前体分子。
编码GLP-1类似物的前体分子的核酸序列可通过本领域熟知的已确立的标准方法以合成方法制备，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，随后核酸序列经纯化、退火、连接并克隆至合适的载体上。
可采用例如众所周知的聚合酶链式反应(PCR)对编码GLP-1类似物的前体分子的核酸序列进行克隆。
将编码GLP-1类似物的前体分子的核酸序列插入重组表达载体中，所述载体可以是可方便地进行重组DNA方法的任何载体。载体的选择常常取决于其要引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制与染色体复制无关，例如质粒。或者，载体可为这样一种载体，即当导入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组并与其所整合的染色体一起复制。
对于胞外产物，根据所述多肽的类型，通过过滤、柱层析法或沉淀法例如微量过滤、超滤、等电点沉淀法分离出上清液的蛋白质组分，通过各种层析法例如离子交换层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析法等进行纯化。对于胞内或周质产物，自培养基分离出来的细胞经分解或透化，并提取以回收产物多肽或其前体。
编码GLP-1类似物的前体分子的DNA序列可适当地为基因组来源或cDNA来源，其例如按照标准技术(参见例如Sambrook，J，Fritsch，EF和Maniatis，T，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork，1989)，通过制备基因组或cDNA文库，使用合成寡核苷酸探针进行杂交来筛选编码全部或部分所述肽的DNA序列而获得。编码多肽的DNA序列还可通过已确立的标准方法以合成法制备，例如Beaucage和Caruthers描述的磷酰胺(phosphoamidite)方法(Beaucage和Caruthers，TetrahedronLetters22(1981)，1859-1869)或Matthes等人描述的方法(Matthes等，EMBOJournal3(1984)，801-805)。DNA序列还可以使用例如以下文献描述的特异性引物，通过聚合酶链式反应制备：US4,683,202或Saiki等，Science239(1988)，487-491。
还可以将编码GLP-1类似物的前体分子的DNA序列插入可方便地进行重组DNA方法的任何载体中，载体的选择常常取决于其要引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制与染色体复制无关，例如质粒。或者，载体可为这样一种载体，即当导入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组并与其所整合的染色体一起复制。
载体优选为其中编码GLP-1类似物的前体分子的DNA序列与DNA转录所需的其它区段(例如启动子)有效连接的表达载体。启动子可以是在所选宿主细胞中具有转录活性的任何DNA序列，并且可衍生自与宿主细胞同源或异源的蛋白质的编码基因。在各种宿主细胞中指导编码本发明肽的DNA转录的合适启动子的实例是本领域众所周知的，参见例如Sambrook等，同上。
如有必要，编码GLP-1类似物的前体分子的DNA序列还可与合适的终止子、聚腺苷酸化信号、转录增强子序列和翻译增强子序列有效连接。本发明的重组载体还可进一步包含使载体能够在所述宿主细胞复制的DNA序列。
载体还可包含选择标记，例如其产物补充宿主细胞缺陷的基因或赋予诸如氨苄西林、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤等药物抗性的基因。对于大批生产，选择标记优选不是抗生素抗性的，例如当载体用于大批生产时，优选切除载体中的抗生素抗性基因。用于从载体中去除抗生素抗性基因的方法是本领域已知的，参见例如US6,358,705，其通过引用结合到本文中。
为了将本发明GLP-1类似物的前体分子引入宿主细胞的分泌途径，在重组载体中可提供分泌信号序列(亦称前导序列、前序列原(preprosequence)或前序列(presequence))。将分泌信号序列在正确读框中与编码肽的DNA序列连接。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列的5′端。分泌信号序列可为与肽正常连接的序列或可以来自编码另一分泌蛋白的基因。
用来将编码GLP-1类似物的前体分子的DNA序列分别、启动子与任选终止子和/或分泌信号序列连接并将其插入含有复制所需信息的合适载体的方法为本领域技术人员所熟知(参见例如Sambrook等，同上)。
DNA序列或重组载体所导入的宿主细胞可以是能够产生GLP-1类似物的前体分子的任何细胞，包括但不限于哺乳动物宿主细胞、鸟类宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、细菌宿主细胞、真菌宿主细胞和酵母宿主细胞。本领域众所周知和使用的合适宿主细胞的实例包括但不限于酿酒酵母、毕赤酵母(Pichiapastoris)和其它酵母；大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)或哺乳动物BHK或CHO细胞系。
将外源核酸导入宿主的方法是本领域众所周知的，将随所使用的宿主细胞而变化。当在合适条件下培养时，GLP-1前体分子由宿主细胞合成，随后可从培养基收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)，或直接从产生该分子的宿主细胞中收集(如果不分泌的话)。
在一个实施方案中，GLP-1前体分子在酵母细胞中产生。酵母表达宿主是本领域众所周知的，包括但不限于酿酒酵母、白假丝酵母(Candidaalbicans)和麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguillerimondii)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)和巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和亚罗解脂酵母(Yarrowialipolytica)。
在一个实施方案中，GLP-1前体分子在细菌系统中产生。细菌表达宿主是本领域众所周知的，包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳脂链球菌(Streptococcuscremoris)和Streptococcuslividans。
在一个实施方案中，GLP-1前体分子在丝状真菌中表达。丝状真菌宿主是本领域众所周知的，包括但不限于脉胞菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、米曲霉(Aspergillusoryzea)和黑曲霉(Aspergillusniger)。
在一个实施方案中，GLP-1前体分子在昆虫细胞中产生。已开发出埃及伊蚊(Aedesaegypti)、苜蓿丫纹夜蛾(Autographacalifornica)、家蚕(Bombyxmori)、黑腹果蝇(Drosophilamelangaster)、草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusiani)的表达系统。蛋白质表达领域技术人员了解并可获得这些细胞系的每一种。
在一个实施方案中，GLP-1前体分子在其它高等真核细胞中产生。这些细胞包括但不限于鸟类细胞和植物细胞，例如莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)。
在一个实施方案中，GLP-1前体分子在哺乳动物宿主细胞系中产生。这些实例包括但不限于幼仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和COS细胞。更具体的实例包括但不限于由SV40(COS-7，ATCCCRL1651)转化的猴肾CV1系；人胚肾系(293)；人肝细胞(HepG2，HB8065)。
由本领域技术人员选择合适的宿主细胞。
用来培养宿主细胞的培养基可以是任何适于宿主细胞生长的常用培养基，例如极限培养基或含有合适补充成分的复合培养基。合适的培养基可获自供应商，或可按照已公开的配方(例如参见美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)目录)配制。
然后，可通过常规方法从液体培养基或固体培养基中分离出由细胞产生的GLP-1类似物的前体分子，包括通过离心或过滤从培养基中分离出宿主细胞。
如上所述，本发明的一个方面，为了赋予化合物更大的抗血浆肽酶二肽基肽酶-4(DPP-IV)抗性，将包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与所表达的GLP-1类似物前体分子偶联。
这类非蛋白氨基酸可选自γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-氨基酸例如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺、D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、3-氨基甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、脱-氨基-组氨酸、β-丙氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸、(1-氨基环辛基)甲酸、α-甲基脯氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸和4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-C]吡啶-6-甲酸β-(1，2，4-三唑-1-基)-丙氨酸。虽然脱氨基-组氨酸不含氨基，但为了易于分类和命名，在本文中亦称非蛋白氨基酸。
在本发明的一个方面，包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的长度为1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸或4个氨基酸。
在本发明的一个方面，包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的长度为1个氨基酸、2个氨基酸或4个氨基酸。
在本发明的一个方面，包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的长度为1个氨基酸或2个氨基酸。
在本发明的一个方面，包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的长度为2个氨基酸。
在本发明的一个方面，包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的长度为1个氨基酸。
预期并非所有N端氨基酸突出端的氨基酸都必为非蛋白氨基酸。因此，在某些方面，N端氨基酸突出端包含1、2、3或4个非蛋白氨基酸。
在本发明的一个方面，包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有以下通式
Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10
其中
Xaa7选自L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸和4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-C]吡啶-6-甲酸β-(1，2，4-三唑-1-基)-丙氨酸；
Xaa8选自Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸和α-甲基脯氨酸；
Xaa9选自Glu、Asp、γ，γ-二甲基Glu、β，β-二甲基Glu和β，β-二甲基Asp，和
Xaa10选自Gly、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸和(1-氨基环辛基)甲酸。
采用参考文献描述的合适反应条件，在溶液中或在树脂(例如2-氯三苯甲基氯树脂)上，例如通过基于Fmoc的策略，使用适当保护的结构单元(buildingblock)，可有效地制备序列Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10的游离羧酸(OrganicSynthesisonsolidPhase(固相有机合成)，FlorencioZaragozaWiley-VCHVerlagGmbH，D-69469Weinheim，2000；NovabiochemCatalog，MerckBiosciences2006/2007和FmocSolidPhasePeptideSynthesis(Fmoc固相肽合成)，W.C.Chah和P.D.White编辑，OxfordUniversityPress，2000，ISBN0-19-963724-5)。该序列中的氨基酸可以是经保护或未保护的。序列Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10的N端突出肽(extensionpeptide)可被激活为活化酰化剂(activatedacylatingagent)。术语“活化”酰化剂是指采用通用技术活化的酰化剂，例如参见“Amidebondformationandpeptidecoupling(酰胺键形成和肽偶联)”[Tetrahedron61(46)，10827-10852(2005)]。
活化酯的实例包括但不限于使用常用的碳二亚胺类活化的酰基氯、酰基溴、酰基氟、对称酐、混合酐、羧酸，碳二亚胺类例如但不限于二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)。此外，包括但不限于使用前述碳二亚胺和例如但不限于以下添加物活化的羧酸：N-羟基苯并三唑(N-hydroxybenzotriazol，HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑、6-氯-N-羟基苯并三唑(HOAt)、3-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(DhbtOH)等。还包括但不限于用以下脲盐或盐激活的羧酸，例如但不限于六氟磷酸O-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基脲(HBTU)、四氟硼酸O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲(TBTU)、六氟磷酸2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲铵(HCTU)、(四氟硼酸2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲铵)(TCTU)、六氟磷酸2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(HATU)、六氟磷酸1-苯并三唑基氧基三-(二甲基氨基)(BOP)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基(PYBOP)。采用参考文献所述反应条件的其它活化酯包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、五氟苯酚酯(PfP-酯)、2，4-二硝基苯酯、4-硝基苯酯、3-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HODhbt)和羰基二咪唑(CDI)、N-乙基-5-苯基异唑-3’-磺酸酯(NEPIS)，优选N-羟基琥珀酰亚胺酯或HOBt酯或其衍生物(OrganicSynthesisonsolidPhase(固相有机合成)，FlorencioZaragozaWiley-VCHVerlagGmbH，D-69469Weinheim，2000；NovabiochemCatalog，MerckBiosciences2006/2007和FmocSolidPhasePeptideSynthesis(Fmoc固相肽合成)，W.C.Chan和P.D.White主编，OxfordUniversityPress，2000，ISBN0-19-963724-5)。
具有通式Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10的N端突出肽的一个实例是：
其中R1和R2各自选自例如但不限于以下保护基：氨基甲酸酯，其包括但不限于9H-芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)和苄基氨基甲酸酯基(benzylcarbarmate)(Cbz)；酰胺，其包括但不限于苯甲酰胺；酰亚胺，其包括但不限于N-邻苯二甲酰亚胺；以及烷基，其包括但不限于1-金刚烷基(1-Adoc)和三苯基甲基(Trt)。在一个优选的实施方案中，R1选自9H-芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)和苄基氨基甲酸酯基(Cbz)，R2选自叔丁氧基羰基(Boc)和三苯基甲基(Trt)。R3独立选自例如但不限于以下的保护基：酯，其包括但不限于甲基、乙基、叔丁基、苄基和9H-芴-9-基甲基(Fm)。在一个优选的实施方案中R3为叔丁基或苄基。
被相应的N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的序列Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10的N端突出肽的实例为：
其中R1、R2和R3各自选自例如上述保护基。
在本发明的进一步方面，包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有以下通式：
Xaa7-Xaa8
其中
Xaa7选自L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸；1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-C]吡啶-6-甲酸β-(1，2，4-三唑-1-基)-丙氨酸；和
Xaa8选自Gly、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸和α-甲基脯氨酸。
采用上述合适的反应条件，使用适当保护的结构单元，可在树脂(例如2-氯三苯甲基氯树脂)上，例如通过基于Fmoc的策略有效地制备序列Xaa7-Xaa8的游离羧酸，或者可在溶液中制备。该序列中的氨基酸可以是经保护或未保护的。
序列Xaa7-Xaa8的N端突出肽可被活化成上述活化酰化剂。
具有式Xaa7-Xaa8的N端突出肽的实例为：
其中R1和R2各自选自上述保护基。
活化成相应的N-羟基琥珀酰亚胺酯的具有序列Xaa7-Xaa8的N端突出肽的实例为：
其中R1和R2各自选自上述保护基。
在本发明再进一步的方面，包含一个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有下式：
Xaa7
其中
Xaa7选自D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸和4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-C]吡啶-6-甲酸β-(1，2，4-三唑-1-基)-丙氨酸。
采用上述合适的反应条件，使用适当保护的结构单元，可有效地在树脂(例如2-氯三苯甲基氯树脂)上制备Xaa7的游离羧酸，又或者可以在溶液中制备。氨基酸可以是经保护或未保护的。
N端突出端Xaa7中的氨基酸可被活化成上述活化酰化剂。
式Xaa7氨基酸的实例为：
其中R2为上述保护基或氢。
活化成相应的N-羟基琥珀酰亚胺酯的式Xaa7氨基酸的实例为：
在本发明的进一步方面，按照本发明制备的GLP-1类似物是以下GLP-1类似物：其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有如上定义的通式Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10；
并且所述GLP-1类似物的前体分子具有如上定义的通式
Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45。
在本发明的进一步方面，按照本发明制备的GLP-1类似物是以下GLP-1类似物：其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有如上定义的通式
Xaa7-Xaa8；
并且所述GLP-1类似物的前体分子具有如上定义的通式
Xaa9-Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45。
在本发明的再进一步的方面，按照本发明制备的GLP-1类似物是以下GLP-1类似物：其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有如上定义的通式
Xaa7；
并且所述GLP-1类似物的前体分子具有如上定义的通式
Xaa8-Xaa9-Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45。
由于在所采用的反应条件下可能发生大量可能的副反应，因此将额外氨基酸类似物偶联在未保护的多肽片段(例如GLP-1类似物前体分子)上并不是件不重要的任务。亲电子试剂像例如N-羟基琥珀酰亚胺酯等活化酯一般可与存在于多肽中的亲核试剂反应。这类亲核试剂可为硫醇类、胺类、咪唑类、酚羟基类、醇类和胍类。官能团上的酰化速率将取决于各个基团的固有反应性，而且还取决于多肽的一级结构、二级结构、三级结构甚至四级结构。因此常常难以预测多肽中不同氨基酸部分的相对反应性。在未保护多肽上的实际反应将产生产物的混合物。然而在一些情况下，多肽中各个基团的相对反应性可能部分受控于进行反应的条件。因此，反应混合物中pH的改变可导致一些基团的反应性发生改变。同样，在溶剂中由非质子溶剂改为质子溶剂可导致一些基团的反应性发生改变。
在本发明的方法中，在某些有益的实施方案中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与GLP-1前体分子的偶联可发生在溶剂中，所述溶剂包括选自以下的有机极性溶剂：1-甲基-吡咯烷-2-酮、乙腈(acetonitril)、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基-甲酰胺。
在其它有益的实施方案中，N端氨基酸突出端的偶联可发生在含水溶剂混合物中，例如可包含有机极性溶剂的含水溶剂混合物，例如选自以下的溶剂：1-甲基-吡咯烷-2-酮、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基-甲酰胺。
此外，研究发现，在有益的实施方案中，本发明N端氨基酸突出端的偶联可发生在含水溶剂混合物中，其中反应混合物的pH介于6和12之间，例如7和10之间。在进一步的实施方案中，反应混合物的pH范围为7-8、8-9、9-10或10-12。
如上文所述，在包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端中的氨基酸可包含一个或多个保护基。因此，预期本发明的方法还进一步包括从包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端中脱去一个或多个这些保护基的一个或多个步骤。文献中全面描述了这类脱保护步骤。
本发明的方法可包括用酰化剂使表达的前体分子或GLP-1类似物的至少一个赖氨酸残基的ε-氨基进一步酰化的步骤，所述GLP-1类似物由使N端突出分子与表达的前体分子偶联而获得。
在某些实施方案中，在使包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与GLP-1类似物前体分子偶联之前进行这一步骤可能是有利的。因此在某些实施方案中，用于本发明方法的GLP-1类似物前体分子可用酰化剂酰化，任选在例如赖氨酸残基的ε-氨基上活化。
因此，在本发明的一个方面涉及用于制备在N端部分包含一个或多个非蛋白氨基酸的GLP-1类似物或衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)对包含编码所述GLP-1类似物的前体分子的核苷酸序列的宿主细胞在用于表达所述前体分子的适当条件下进行培养，
(ii)从液体培养基中分离出表达的前体分子，
(iii)任选用任选被活化的酰化剂使表达的前体分子中至少一个赖氨酸残基的ε-氨基酰化，得到前体分子衍生物，并且任选分离所述前体分子衍生物，
(iv)将包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与表达的前体分子或前体分子衍生物偶联，
(v)通过合适的方法分离所得到的GLP-1类似物或衍生物。
本发明的方法可任选另外包括用如上所述的氨基保护剂对至少一个赖氨酸残基的ε-氨基进行选择性保护的步骤。
在某些实施方案中，在使包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与GLP-1类似物前体分子偶联之前进行该保护步骤可以是有利的。因此，可将所得到的用于本发明所述实施方案的方法的赖氨酸受保护的GLP-1类似物前体分子衍生物，与包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端偶联。在所述的N端氨基酸突出端与赖氨酸受保护的GLP-1类似物前体分子偶联后，任何赖氨酸的ε胺基上的保护基都可用常规技术脱去，所得到的赖氨酸的ε-氨基可任选用任选被活化的酰化剂酰化。
因此，在一个方面，本发明涉及制备在N端部分包含一个或多个非蛋白氨基酸的GLP-1类似物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)对包含编码所述促胰岛素肽的前体分子的核苷酸序列的宿主细胞在用于表达所述前体分子的适当条件下进行培养，
(ii)从液体培养基中分离出表达的前体分子，
(iii)用保护剂保护表达的前体分子中至少一个赖氨酸残基的ε-氨基，得到受保护的前体分子，并任选分离所述受保护的前体分子，
(iv)使包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与受保护的前体分子偶联，得到受保护的GLP-1类似物，并任选分离所述受保护的GLP-1类似物，
(v)使ε氨基保护基脱保护，并任选分离所得到的GLP-1类似物，
(vi)任选用任选被活化的酰化剂使GLP-1类似物中的至少一个赖氨酸残基的ε-氨基酰化，得到前体分子衍生物，
(vii)通过本领域已知的合适方法分离出所得到的GLP-1类似物或衍生物。
在本发明的一个方面，用于赖氨酸残基的ε-氨基酰化的酰化剂是以下通式的羧酸类似物：
A-OH、A-C-D-OH、A-B-C-OH或A-B-C-D-OH
其中一端游离羧酸，例如A-OH、A-C-D-OH、A-B-C-OH或A-B-C-D-OH的-OH基团，任选被活化，且其中所包含的其它任何游离羧酸任选被合适的保护基保护，保护基例如选自但不限于叔丁基、苄基或烯丙基，
其中
A选自：
其中，n选自14、15、16、17、18和19；p选自10、11、12、13和14，d选自0、1、2、3、4和5；m选自11、12、13、14、15、16、17；k选自0、1、2、3、4、5、11和27，m选自0、1、2、3、4、5和6，R1选自9H-芴-基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苄基氨基甲酸酯(Cbz)-
B选自
其中x选自0、1、2、3和4；y选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，
C选自
其中b和e各自独立选自0、1和2，c和f各自独立选自0、1和2，前提条件是当c为0时，b为1或2，或者当c为1或2时，b为0，且当f为0时，e为1或2，或当f为1或2时，e为0，且D选自
并且其中k选自0、1、2、3、4、5、11和27，m选自0、1、2、3、4、5和6。
在本发明的一个方面，用于赖氨酸部分ε-N酰化的片段A-OH、A-C-D-OH、A-B-C-OH或A-B-C-D-OH是羧酸衍生物，其被活化成上述活化酰化剂。
在本发明的一个方面，例如在片段A-OH、A-C-D-OH、A-B-C-OH或A-B-C-D-OH的片段A或C中包含羧酸的游离化学官能团被选自但不限于以下合适的保护基保护：叔丁基、苄基或烯丙基。
当本文所使用的术语“包含”与肽和/或关于化学官能团(例如羧酸)的酰化剂有关时，应当是指存在于肽或酰化剂中的化学官能团。
采用参考文献所描述的反应条件，使用适当保护的结构单元，通过基于Fmoc的策略在树脂(例如2-氯三苯甲基氯树脂)上有效地制备羧酸衍生物：FmocSolidPhasePeptideSynthesis(Fmoc固相肽合成)，W.C.Chan和P.D.White编辑，OxfordUniversityPress，2000，ISBN0-19-963724-5。
片段A-B-C-D-OH的实例为：
相应的活化类似物可为N-羟基琥珀酰亚胺酯：
片段A-B-C-D-的实例：
片段A-C-D-的实例：
片段A-B-C-的实例：
在所有具体提及的片段A-OH、A-C-D-OH、A-B-C-OH或A-B-C-D-OH中，任何包含的游离羧酸可任选被选自但不限于叔丁基、苄基或烯丙基的合适的保护基保护。
在所有具体提及的片段A-OH、A-C-D-OH、A-B-C-OH或A-B-C-D-OH中，不论是否规定手性中心，都可为独立于同一片段其它手性中心的R异构体或S异构体。
在一个实施方案中，当存在一个或多个手性中心时，该片段可是是异构体的混合物的形式。
在另一个实施方案中，当存在一个或多个手性中心时，该片段可以是纯的异构体的形式，其中每个手性中心或为R或为S。
在另一个实施方案中，手性如本发明具体提及的片段中所描述的一样。
在本发明的一个方面，赖氨酸氨基酸残基的ε胺保护基可以选自但不限于下列实例：
在本发明的方法中，在某些有益的实施方案中酰化步骤可发生在溶剂中，包括选自以下的有机极性溶剂：1-甲基-吡咯烷-2-酮、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基-甲酰胺。
在进一步的实施方案中，酰化步骤可发生在含水溶剂混合物中，例如包含有机极性溶剂的含水溶剂混合物。这类有机极性溶剂可有利地选自1-甲基-吡咯烷-2-酮、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基-甲酰胺。
在进一步的实施方案中，酰化步骤可发生在水溶液中。
在某些实施方案中，1-甲基-吡咯烷-2-酮、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜和N，N-二甲基甲酰胺或N-甲基-甲酰胺的量可以是这样的量以使得所述溶剂的量小于80％(体积/体积)，例如小于50％(体积/体积)。在其它方面，1-甲基-吡咯烷-2-酮、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺或N-甲基-甲酰胺的量的范围为约40-80％(体积/体积)，包括40-45％、45-50％、50-60％、60-70％和70-80％(体积/体积)的范围。此外预期酰化剂可作为固体加入反应混合物中。
在有益的实施方案中，其中发生酰化步骤的含水溶剂反应混合物的pH值介于9和13之间，例如介于10和12之间，包括介于10.5和11.5之间。在进一步的实施方案中，反应混合物中的pH的范围为9-10、10-11、11-12或12-13。
用于本发明的酰化剂可包含一个或多个保护基。因此，预期本发明的方法还进一步包括一个或多个以下步骤：一经与GLP-1类似物前体分子偶联，便从酰化剂上脱去一个或多个这些保护基。文献中全面描述了这类脱保护步骤。
在宿主细胞中进行有效的异源蛋白表达通常需要以肽原(pro-peptide)(即具有分泌信号序列(亦称前导序列、前序列原或前序列)的多肽)形式表达蛋白质。然而，该前导序列在所需要的多肽中通常是不需要的，因此在某些方面，本发明的方法可包括从GLP-1类似物前体分子中脱去N端和/或C端肽原突出端的另外的步骤。
本发明的方法包括通过合适的方法，例如本领域已知的标准纯化方法，分离所得到的GLP-1类似物或衍生物的步骤。
同样属于本发明范围的是，在某些实施方案中由本发明的方法产生的GLP-1类似物或衍生物可用白蛋白结合部分衍生化，或可以聚乙二醇化。
本发明的前导序列可为图4中所列举的最优化形式。
本文使用的术语“白蛋白结合部分”是指与人血清白蛋白非共价结合的残基。与治疗性多肽连接的白蛋白结合残基对人血清白蛋白的亲和力通常低于10μM，优选低于1μM。已知多种白蛋白结合残基是具有末端酸性基团、含有4-40个碳原子的直链和支链亲脂部分。
本发明的实施方案
1.一种用于制备在N端部分包含一个或多个非蛋白氨基酸的GLP-1类似物或衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)对包含编码所述GLP-1类似物的前体分子的核苷酸序列的宿主细胞在用于表达所述前体分子的适当条件下进行培养，
(ii)从液体培养基中分离出表达的前体分子，
(iii)将包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与表达的前体分子偶联，
(iv)通过合适的方法分离所得到的GLP-1类似物或衍生物。
2.一种用于制备在N端部分包含一个或多个非蛋白氨基酸的GLP-1类似物或衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)对包含编码所述GLP-1类似物的前体分子的核苷酸序列的宿主细胞在用于表达所述前体分子的适当条件下进行培养，
ii)从液体培养基中分离出表达的前体分子，
iii)对前体分子的赖氨酸基团进行保护，
iv)使包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与受保护的前体分子偶联，得到受保护的GLP-1类似物，
v)使所述受保护的GLP-1类似物的赖氨酸基团脱保护，
vi)通过合适的方法分离所得到的GLP-1类似物或衍生物。
3.实施方案1或2的方法，其中在用于偶联步骤之前对N端氨基酸突出端进行保护，在所述偶联步骤中将包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与受保护的前体分子偶联，受保护的GLP-1类似物在N端突出端偶联之后再脱保护。
4.一种用于制备在N端部分包含一个或多个非蛋白氨基酸的GLP-1类似物或衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)对包含编码所述GLP-1类似物的前体分子的核苷酸序列的宿主细胞在用于表达所述前体分子的适当条件下进行培养，
ii)从液体培养基中分离出表达的前体分子，
iii)使受保护的包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与表达的前体分子偶联，
iv)使受保护的GLP-1类似物或衍生物的任何保护基脱保护，
v)通过合适的方法分离所得到的GLP-1类似物或衍生物。
5.一种用于制备在N端部分包含一个或多个非蛋白氨基酸的GLP-1类似物或衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)对包含编码所述GLP-1类似物的前体分子的核苷酸序列的宿主细胞在用于表达所述前体分子的适当条件下进行培养，
ii)从液体培养基中分离出表达的前体分子，
iii)对前体分子的赖氨酸基团进行保护，
iv)使受保护的包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与受保护的前体分子偶联，得到受保护的GLP-1类似物或衍生物，
v)使受保护的GLP-1类似物或衍生物的任何保护基脱保护，
vi)通过合适的方法分离所得到的GLP-1类似物或衍生物。
6.前述实施方案中任一项的方法，其中所述GLP-1类似物的前体分子选自包含以下通式的氨基酸序列的前体分子：
Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45
其中
Xaa16为Val或Leu；
Xaa18为Ser、Lys或Arg；
Xaa19为Tyr或Gln；
Xaa20为Leu或Met；
Xaa22为Gly或Glu；
Xaa23为Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa25为Ala或Val；
Xaa26为Lys、Glu或Arg；
Xaa27为Glu或Leu；
Xaa30为Ala、Glu或Arg；
Xaa33为Val、Lys或Arg；
Xaa34为Lys、Glu、Asn、His或Arg；
Xaa35为Gly；
Xaa36为Arg、Gly或Lys；
Xaa37为Gly、Ala、Glu、Pro、Lys，或不存在；
Xaa38为Lys、Ser，或不存在；
Xaa39为Ser、Lys，或不存在；
Xaa40为Gly，或不存在；
Xaa41为Ala，或不存在；
Xaa42为Pro，或不存在；
Xaa43为Pro，或不存在；
Xaa44为Pro，或不存在；
Xaa45为Ser，或不存在；
条件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44或Xaa45不存在，则下游每个氨基酸残基也不存在。
7.实施方案1-5中任一项的方法，其中所述GLP-1类似物的前体分子选自包含以下通式的氨基酸序列的前体分子：
Xaa9-Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45
其中
Xaa9为Glu或Asp；
Xaa10为Gly或Ala；
Xaa16为Val或Leu；
Xaa18为Ser、Lys或Arg；
Xaa19为Tyr或Gln；
Xaa20为Leu或Met；
Xaa22为Gly或Glu；
Xaa23为Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa25为Ala或Val；
Xaa26为Lys、Glu或Arg；
Xaa27为Glu或Leu；
Xaa30为Ala、Glu或Arg；
Xaa33为Val、Lys或Arg；
Xaa34为Lys、Glu、Asn、His或Arg；
Xaa35为Gly；
Xaa36为Arg、Gly或Lys；
Xaa37为Gly、Ala、Glu、Pro、Lys，或不存在；
Xaa38为Lys、Ser，或不存在；
Xaa39为Ser、Lys，或不存在；
Xaa40为Gly，或不存在；
Xaa41为Ala，或不存在；
Xaa42为Pro，或不存在；
Xaa43为Pro，或不存在；
Xaa44为Pro，或不存在；
Xaa45为Ser，或不存在；
条件是如果Xaa38Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44或Xaa45不存在，则下游每个氨基酸残基也不存在。
8.实施方案1-5中任一项的方法，其中所述GLP-1类似物的前体分子选自包含以下通式的氨基酸序列的前体分子：
Xaa8-Xaa9-Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45
其中
Xaa8为Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys；
Xaa9为Glu、Asp；
Xaa10为Gly、Ala；
Xaa16为Val或Leu；
Xaa18为Ser、Lys或Arg；
Xaa19为Tyr或Gln；
Xaa20为Leu或Met；
Xaa22为Gly或Glu；
Xaa23为Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa25为Ala或Val；
Xaa26为Lys、Glu或Arg；
Xaa27为Glu或Leu；
Xaa30为Ala、Glu或Arg；
Xaa33为Val、Lys或Arg；
Xaa34为Lys、Glu、Asn、His或Arg；
Xaa35为Gly；
Xaa36为Arg、Gly或Lys；
Xaa37为Gly、Ala、Glu、Pro、Lys，或不存在；
Xaa38为Lys、Ser，或不存在；
Xaa39为Ser、Lys，或不存在；
Xaa40为Gly，或不存在；
Xaa41为Ala，或不存在；
Xaa42为Pro，或不存在；
Xaa43为Pro，或不存在；
Xaa44为Pro，或不存在；
Xaa45为Ser，或不存在；
条件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44或Xaa45不存在，则下游每个氨基酸残基也不存在。
9.前述实施方案中任一项的方法，其中在包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端中的非蛋白氨基酸选自γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-氨基酸例如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺、D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、3-氨基甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、脱-氨基-组氨酸、β-丙氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸、(1-氨基环辛基)甲酸、α-甲基脯氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸和4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-C]吡啶-6-甲酸β-(1，2，4-三唑-1-基)-丙氨酸。
10.前述实施方案中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的长度为1个氨基酸。
11.实施方案1-9中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的长度为2个氨基酸。
12.实施方案1-9中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的长度为3个氨基酸。
13.实施方案1-9中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的长度为4个氨基酸。
14.前述实施方案中任一项的方法，其中N端氨基酸突出端包含2个非蛋白氨基酸。
15.实施方案1-13中任一项的方法，其中N端氨基酸突出端包含3个非蛋白氨基酸。
16.实施方案1-13中任一项的方法，其中N端氨基酸突出端包含4个非蛋白氨基酸。
17.前述实施方案中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有以下通式
Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10
其中、
Xaa7选自L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸和4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-C]吡啶-6-甲酸β-(1，2，4-三唑-1-基)-丙氨酸，
Xaa8选自Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸和α-甲基脯氨酸，
Xaa9选自Glu、Asp、γ，γ-二甲基Glu、β，β-二甲基Glu和β，β-二甲基Asp，和
Xaa10选自Gly、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸和(1-氨基环辛基)甲酸。
18.实施方案1-16中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有以下通式
Xaa7-Xaa8
其中
Xaa7选自L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸；1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-C]吡啶-6-甲酸β-(1，2，4-三唑-1-基)-丙氨酸；和
Xaa8选自Gly、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸和α-甲基脯氨酸，
19.实施方案1-16中任一项的方法，其中N端氨基酸突出端包含一个具有通式Xaa7的非蛋白氨基酸，
其中
Xaa7选自D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸；1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸和4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-C]吡啶-6-甲酸β-(1，2，4-三唑-1-基)-丙氨酸。
20.实施方案19的方法，其中N端氨基酸突出端为脱氨基-组氨酸，并且通过4-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基)-乙基]-1H-咪唑-1-盐例如三氟乙酸盐与表达的前体分子进行偶联反应。
21.实施方案1-5中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有实施方案17中定义的通式
Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10；
且GLP-1类似物具有实施方案3中定义的通式
Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45。
22.实施方案1-5中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有实施方案18中定义的通式
Xaa7-Xaa8；
且GLP-1类似物具有实施方案4中定义的通式
Xaa9-Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45。
23.实施方案1-5中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有实施方案19中定义的通式
Xaa7；
且GLP-1类似物具有实施方案4中定义的通式
Xaa8-Xaa9-Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45。
24.实施方案17-23中任一项的方法，其中N端突出端Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10或Xaa7-Xaa8中的C端非蛋白氨基酸或蛋白氨基酸，或非蛋白氨基酸Xaa7被活化。
25.实施方案24的方法，其中活化氨基酸选自：用常用碳二亚胺活化的酰基氯、酰基溴、酰基氟、对称酐、混合酐、羧酸，使用碳二亚胺和添加剂活化的羧酸以及用脲盐或盐活化的羧酸。
26.实施方案24的方法，其中活化氨基酸选自：使用常用的碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化的羧酸。
27.实施方案24的方法，其中活化氨基酸选自：使用碳二亚胺和选自以下的添加剂活化的羧酸：N-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑、6-氯-N-羟基苯并三唑(HOAt)和3-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(DhbtOH)。
28.实施方案24的方法，其中活化氨基酸选自用以下物质活化的羧酸：脲盐或盐、六氟-磷酸O-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基-脲(HBTU)、四氟硼酸O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲(TBTU)、六氟磷酸2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(HATU)、六氟磷酸1-苯并三唑基氧基三(二甲基氨基)(BOP)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基(PYBOP)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、五氟苯酚酯(PfP-酯)、2，4-二硝基苯酯、4-硝基苯酯、3-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HODhbt)、羰基二咪唑(CDI)、N-乙基-5-苯基异唑-3’-磺酸酯(NEPIS)。
29.前述实施方案中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的偶联发生在选自以下的有机极性溶剂中：1-甲基-吡咯烷-2-酮、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基-甲酰胺。
30.前述实施方案中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的偶联发生在含水溶剂混合物中。
31.实施方案30的方法，其中含水溶剂混合物包含选自以下的有机极性溶剂：1-甲基-吡咯烷-2-酮、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基-甲酰胺。
32.实施方案30或31的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的偶联发生在含水溶剂混合物中，其中反应混合物中的pH介于4和12之间，优选介于6和10之间。
33.前述实施方案中任一项的方法，其中在包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端中的氨基酸包含一个或多个保护基。
34.实施方案33的方法，其还包括从所述包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端中脱去一个或多个保护基的步骤。
35.实施方案1的方法，其还包括用酰化剂使表达的前体分子中至少一个赖氨酸残基的ε-氨基酰化的步骤。
36.实施方案35的方法，其中酰化剂是任选被活化和/或受一个或多个保护基保护的以下通式的羧酸类似物：
A-OH、A-C-D-OH、A-B-C-OH或A-B-C-D-OH；
其中
A选自：
其中n选自14、15、1617、18和19；p选自10、11、12、13和14，d选自0、1、2、3、4和5；m选自11、12、13、14、15、16、17；k选自0、1、2、3、4、5、11和27，m选自0、1、2、3、4、5和6，R1选自9H-芴-9基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苄基氨基甲酸酯基(Cbz)。
B选自
其中x选自0、1、2、3和4；y选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，
C选自
其中b和e各自独立选自0、1和2，c和f各自独立选自0、1和2，前提条件是当c为0时，b为1或2，或者当c为1或2时，b为0，并且当f为0时，e为1或2，或者当f为1或2时，e为0，和
D选自
且其中k选自0、1、2、3、4、5、11和27，m选自0、1、2、3、4、5和6。
37.实施方案36的方法，其中羧酸A-OH、A-C-D-OH、A-B-C-OH或A-B-C-D-OH被活化成活化酰化剂。
38.实施方案35的方法，其中所述酰化步骤发生在含水溶剂混合物中。
39.实施方案38的方法，其中所述含水溶剂混合物包含有机极性溶剂。
40.实施方案39的方法，其中所述有机极性溶剂选自1-甲基-吡咯烷-2-酮、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基-甲酰胺。
41.实施方案40的方法，其中1-甲基-吡咯烷-2-酮、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺或N-甲基-甲酰胺的量小于80％(体积/体积)。
42.实施方案40的方法，其中1-甲基-吡咯烷-2-酮、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺或N-甲基-甲酰胺的量小于50％(体积/体积)。
43.实施方案40的方法，其中1-甲基-吡咯烷-2-酮、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺或N-甲基-甲酰胺的量的范围为约40-80％(体积/体积)。
44.实施方案35的方法，其中将固体酰化剂加入反应混合物中。
45.实施方案35的方法，其中所述酰化步骤发生在含水溶剂混合物中，其中反应混合物的pH介于9和13之间，优选介于10和12之间或甚至更优选介于10.5和11.5之间。
46.实施方案35的方法，其中任选被活化的酰化剂包含一个或多个保护基。
47.实施方案46的方法，其还包括从所述活化酰化剂中脱去一个或多个保护基的步骤。
48.前述实施方案中任一项的方法，其还包括从所得前体分子中脱去N端肽原突出端的步骤。
49.实施方案1-47中任一项的方法，其还包括从所得前体分子中脱去C端肽原突出端的步骤。
50.前述实施方案中任一项的方法，其中宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
51.实施方案1-49中任一项的方法，其中宿主细胞是细菌宿主细胞。
52.实施方案1-49中任一项的方法，其中宿主细胞是酵母宿主细胞。
53.实施方案52的方法，其中酵母宿主细胞是酿酒酵母。
54.前述实施方案中任一项的方法，其中GLP-1类似物是人GLP-1(7-37)、人GLP-2、毒蜥外泌肽3或毒蜥外泌肽4的类似物或衍生物。
55.前述实施方案中任一项的方法，其中GLP-1类似物是人GLP-1(7-37)的类似物或衍生物。
56.前述实施方案中任一项的方法，其中所述GLP-1类似物选自
Aib8-GLP-1(7-36)-酰胺、Aib8-GLP-1(7-37)、Aib8，35GLP-1(7-37)、
[Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)、
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)、
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺、
[脱氨基His7，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺、
[脱氨基His7，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺、
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)、
[脱氨基His7，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)、
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Glu30，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)、
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺、
[脱氨基His7，Arg34]GLP-1-(7-37)、
[Aib8，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺、
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)酰胺、
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys、
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys、
[d脱氨基His7，Arg26，Arg34，]GLP-1-(7-37)-Lys、
[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺、及其类似物。
57.前述实施方案中任一项的方法，其中GLP-1类似物是药物组合物中唯一的有生物学活性的物质。
58.前述实施方案中任一项的方法，其中GLP-1类似物是毒蜥外泌肽4类似物。
59.前述实施方案中任一项的方法，所述方法包括对至少一个赖氨酸残基的ε-氨基进行选择性保护的步骤。
60.实施方案59的方法，其中在步骤(ii)从液体培养基中分离出表达的前体分子之后增加所述步骤。
61.实施方案59的方法，其中在实施方案1中所述的通过合适方法分离所得到的GLP-1类似物或衍生物的步骤(iv)之后增加所述步骤。
62.实施方案19的方法，其中N端氨基酸是通过活化酰化剂4-{3-[(2，5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-3-氧代丙基}-1H咪唑-1-引入的脱氨基-组氨酸
63.实施方案19的方法，其中N端氨基酸是通过使用活化酰化剂4-{3-[(2，5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-3-氧代丙基}-1H咪唑-1-三氟乙酸盐引入的脱氨基-组氨酸
64.前述实施方案中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的偶联发生在选自以下的有机极性溶剂中：1-甲基-吡咯烷-2-酮、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基-甲酰胺。
65.实施方案1-63中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的偶联发生在含水溶剂混合物中。
66.实施方案65的方法，其中含水溶剂混合物包含选自以下的有机极性溶剂：1-甲基-吡咯烷-2-酮、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基-甲酰胺。
67.实施方案1-63中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端的偶联发生在含水溶剂混合物中，其中反应混合物的pH介于7和11之间，优选介于8和10之间。
68.一种使用活化酰化剂4-{3-[(2，5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-3-氧代丙基}-1H咪唑-1-在促胰岛素剂中引入脱氨基组氨酸的方法
69.一种使用活化酰化剂4-{3-[(2，5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-3-氧代丙基}-1H咪唑-1-三氟乙酸盐在促胰岛素剂中引入脱氨基组氨酸的方法
现在将在下列非限制性实施例和附图中更详细地描述本发明。
实施例
所使用的缩略语：
Adoc：金刚烷基氧基羰基
Aib：α-氨基异丁酸
Boc：叔丁基氧基羰基
CH3CN：乙腈
DCM：二氯甲烷
DIC：二异丙基碳二亚胺
DIPEA：二异丙基乙胺
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
EtOAc：乙酸乙酯
Et2O：乙醚
Fmoc：9H-芴-9-基甲氧基羰基
HATU：六氟磷酸2-(7-氮杂苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3-四甲基脲
HBTU：六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3-四甲基脲
H2O：水
HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt：1-羟基苯并三唑
MeCN：乙腈
Mtt：4-甲基三苯甲基
MW：分子量
NaOH：氢氧化钠
NHS：N-羟基琥珀酰亚胺
NMP：1-甲基-吡咯烷-2-酮
OtBu：叔丁基酯
PyBoP六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基
PyBroP六氟磷酸溴-三-吡咯烷子基
r.t：室温
OSu：N-羟基琥珀酰亚胺酯
tBu：叔丁基
TBME：叔丁基甲基醚
TEA：三乙胺
TFA：三氟乙酸
TFFH四甲基氟代脲六氟磷酸酯
TIPS：三异丙基甲硅烷
Trt：三苯甲基、三苯基甲基
TSTU：四氟硼酸O-(N-琥珀酰亚胺基)-1，1，3，3-四甲基脲
通用方法
用于制备肽的通用方法(方法A)
可以按照Fmoc策略，在AppliedBiosystems433肽合成仪中，以0.25mmol或1.0mmol的水平，采用生产商提供的FastMocUV方案来制备肽，该方案利用在NMP(N-甲基吡咯烷酮)中HBTU(六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3-四甲基脲)或HATU(六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲)介导的偶联，以及Fmoc保护基的脱保护的UV监测。Wang树脂即基于三苯甲基的树脂可用作固相支持体，所使用的受保护的氨基酸衍生物是在适于ABI433A合成仪的预称量柱体中提供的标准Fmoc-氨基酸(由例如Anaspec或Novabiochem供应)。N端氨基酸在α氨基上受Boc保护(例如Boc-His(Boc)OH用于N端具有His的肽)。在一些情况下，通过使用用在酸性条件下裂解的基团在二肽酰胺键上保护的二肽可以改进肽的合成，所述基团例如但不限于2-Fmoc-氧基-4-甲氧基苄基或2，4，6-三甲氧基苄基。在肽中存在丝氨酸或苏氨酸的情况下，可以使用假脯氨酸(pseudoproline)二肽(参见例如Novobiochem2002/2003或更新版本的目录，或W.R.Sampson(1999)，J.Pep.Sci.5，403)。
用于制备肽的通用方法(方法B)
肽合成的一个替代性方法是通过在基于微波的Liberty肽合成仪(CEMCorp.，NorthCarolina)上进行的Fmoc化学法。可以使用Wang树脂即基于三苯甲基的树脂作为固相支持体。使用0.4M在NMP中和8-10倍摩尔过量的氨基酸溶液，用含DIC/HOAt的NMP进行偶联化学法。偶联条件是在高达70℃下5分钟。脱保护在高达70℃下用含5％哌啶的NMP实现。
GLP-1前体分子例如可通过各种层析法纯化，例如离子交换层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析法、反相HPLC等，这取决于所述多肽的类型。
用于制备酰化剂A-OH、A-B-C-D-OH、A-C-D-ON、A-B-C-OH以及N端氨基酸突出端Xaa 7 -Xaa 8 -Xaa 9 -Xaa 10 、Xaa 7 -Xaa 8 和Xaa 7 的通用方法
可以采用标准Fmoc化学法，在2-氯三苯甲基氯树脂上制备必需的羧酸。通过使树脂在合适的溶剂(如NMP、DCM、DMF等，优选DCM)中溶胀，可将第一Fmoc保护的氨基羧酸连接到2-氯三苯甲基氯树脂上。适当保护的Fmoc氨基羧酸与合适的碱(例如DIPEA或TEA)一起加入，在室温下搅拌树脂适当的一段时间(例如30分钟)。树脂用合适的溶剂(例如NMP、DMF或DCM)洗涤。
在室温下使用哌啶的NMP溶液、优选20％哌啶的NMP溶液达1-30分钟(通常10分钟)后，树脂用NMP、DMF或DCM充分洗涤，以实现Fmoc脱保护。重复该步骤直到实现完全脱保护，通常重复3次以上。
采用标准偶联条件，实现下一个Fmoc保护的氨基羧酸的偶联；使树脂在如NMP、DMF、DCM等溶剂或这些溶剂的混合物中溶胀。向另一种Fmoc保护的氨基羧酸在如NMP、DMF、DCM或其混合物等溶剂中的溶液以及HOBt或HOAt加入DIC或其等同物。将该混合物加入树脂中后，向混合物中加入DIPEA或TEA，在室温下搅拌该混合物1-16小时(通常3小时)。或者，搅拌混合物1-60分钟后，将DIPEA或TEA加入混合物中。通过TNBS试验、茚三酮试验或氯醌(choranil)试验判断偶联是否未完成，重复该步骤直到试验阴性。
或者可通过使用下列偶联试剂实现Fmoc保护的氨基羧酸的活化：PyBOP、PyBrOP、HBTU、HATU或TFFH。
可采用上文给出的方法，引入适当保护的Fmoc-氨基羧酸的进一步掺入。采用上述偶联条件，引入包括掺入羧酸衍生物的最后的偶联步骤。
通过用含20％三氟乙醇的DCM、DCM-TIPS-TFA(95.5∶2.5∶2)或六氟异丙醇处理树脂5分钟～3小时，可从树脂上裂解，得到完全保护的衍生物。
使用TFA-TIPS-水(95∶2.5∶2.5)由5分钟到3小时不等，也可从树脂上裂解，得到完全脱保护的衍生物。
或者可以采用文献中描述的标准方法，在溶液中制备衍生物。
适当保护的结构单元是市售的，或可以采用文献中描述的方法制备。
Xaa7是市售的，或可以通过文献中描述的方法制备。
用于酰化剂A-OH、A-B-C-D-OH、A-C-D-OH、A-B-C-OH和N端氨基酸突出端Xaa 7 -Xaa 8 -Xaa 9 -Xaa 10 、Xaa 7 -Xaa 8 和Xaa 7 活化的通用方法
所需氨基酸的活化可采用文献中描述的标准方法实现。如果需要活化酯例如N-羟基琥珀酰亚胺酯，则将羧酸溶于合适的溶剂(例如THF、乙酸乙酯、NMP或DMF)中。将六氟磷酸O-(N-琥珀酰亚胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲等试剂与诸如DIPEA或TEA等碱一起加入溶液中。在室温下搅拌混合物直到反应完成，通常由3小时到16小时不等。或者羧酸可与N-羟基琥珀酰亚胺一起溶解，并用DIC处理。产物混合物无需进一步纯化便可以直接使用，或可进行水法处理。
纯化
粗制肽用制备型HPLC纯化，柱用C18硅胶填充。干燥后，将粗制肽溶于50％乙酸/H2O，用H2O稀释后注入柱中，然后在40℃下在50分钟时间内，用CH3CN/水和0.1％TFA的梯度以10ml/分钟洗脱该柱。收集含有肽的流分，用水稀释后冻干。
分析
LCMS
LCMS在由SciexAPI100单四级杆质谱仪构成的装置中进行。仪器控制和数据获取通过在Windows2000计算机上运行的SciexSample控制软件中进行。HPLC泵连接至两个装有以下溶液的洗脱液贮器：
A：0.05％三氟乙酸/水
B：0.05％三氟乙酸/乙腈
分析在室温下进行，将适当体积的样品(优选20μl)注入柱中，该柱用乙腈梯度洗脱。
下表中给出所采用的HPLC条件、检测器设置和质谱仪设置：
柱：WatersXterraMSC-18X3mm，内径5μm
梯度：5％-90％乙腈，在7.5分钟时间内按1.5ml/分钟线性洗脱
检测：210nm(自DAD模拟输出(analogueoutput))
ELS(自ELS模拟输出)：40℃
MS电离方式：API-ES
HPLC
方法01_B4_2：RP分析采用配备有Waters996二极管阵列检测器的Waters600S系统进行。采用Symmetry300C18(5μm，3.9mmx150mm柱，42℃)，收集214nm和254nm下的UV检测液。在15分钟内以1.0min/min的流速，用5-95％乙腈、90-0％水和5％三氟乙酸(1.0％)/水的线性梯度洗脱。
方法02_B4_4：RP分析采用配备Waters2487双光带检测器(dualbanddetector)的AllianceWaters2695系统进行。采用Symmetry300C18(5μm，3.9mmx150mm柱，42℃)收集214nm和254nm下的UV检测液。在15分钟内以1.0min/min的流速，用5-95％乙腈、90-0％水和5％三氟乙酸(1.0％)/水的线性梯度洗脱。
实施例1
酵母表达系统的构建和GLP-1类似物前体分子(R34)GLP-1(8-37)的产生
表达质粒是C-POT型的，类似于EP171,142中所描述的表达质粒。它们是基于2μ的表达载体，其特征在于含有用于质粒选择和在酿酒酵母中保持稳定目的的粟酒裂殖酵母丙糖磷酸异构酶基因(POT)。质粒还含有酿酒酵母丙糖磷酸异构酶启动子和终止子(图1)。这些序列类似于质粒pKFN1003(参见WO90100075)中的相应序列，除了以下方面以外其正如所有其它序列一样：1)编码前导序列和胰岛素产物的融合蛋白EcoRI-Xbal片段的序列。2)引入沉默突变导致去除表达载体的2μ区中的NcoI位点。为了有利于不同融合蛋白的克隆，改变编码MFα1前导序列原的DNA序列以掺入NcoI位点(参见图2)，并将其称为MFα1*前导序列原。因此NcoI-Xbal片段只是被编码目标GLP-1前体分子的NcoI-Xbal片段置换。可以按照标准技术，采用合成寡核苷酸和PCR来合成这类NcoI-Xbal片段。除α-前导序列以外，也可以使用其它前导序列。
从GeneartAG，BioPark，Josef-Engert-Str.11，D-93053Regensburg，Germany获得含有(R34)GLP-1(11-37)、(E22，R26，R34)GLP-1(8-37)K38和(E22，R26，R34，K37)GLP-1(8-37)编码序列的合成DNA片段。为编码(E22，R26，R34)GLP-1(8-37)K38和(E22，R26，R34，K37)GLP-1(8-37)的合成DNA配备编码N端突出端和C端突出端的3’和5’DNA序列以方便在酵母中表达(图2)，并将其称为Ext1-(E22，R26，R34)GLP-1(8-37)K38-Ext2和Ext1-(E22，R26，R34，K37)GLP-1(8-37)-Ext2。合成DNA用NcoI和XbaI消化，并与修饰cPOT型表达载体的NcoI-XbaI载体片段连接(图1)。这就产生3个分别编码(R34)GLP-1(11-37)(SEQIDNO：6)，Ext1-(E22，R26，R34)GLP-1(8-37)K38-Ext2(SEQIDNO：7)和Ext1-(E22，R26，R34，K37)GLP-1(8-37)-Ext2(SEQIDNO：8)的表达质粒pSA273、pSA277和pSA278。
使上述表达质粒在在氨苄西林存在下生长的大肠杆菌中增殖，并采用标准技术(Sambrook等，1989)分离。通过合适的限制性核酸酶(例如EcoRI、NcoI、XbaI)检查质粒DNA中的插入序列，序列分析显示所述质粒DNA含有GLP-1类似物前体分子(R34)GLP-1(11-37)、Ext1-(E22，R26，R34)GLP-1(8-37)K38-Ext2和Ext1-(E22，R26，R34，K37)GLP-1(8-37)-Ext2的正确序列(图2)。
将质粒转化至酿酒酵母菌株ME1719(MATa/αleu2/leu2pep4-3/pep4-3Δtpi：：LEU2/Δtpi：：LEU2Δura3/Δura3Δyps1：：URA3/Δyps1：：ura3Cir+)中。该菌株参见WO98/01535。在葡萄糖用作碳源的YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)琼脂(2％)平板上选出带有该质粒的酵母转化子。获得3株酵母：ySA251、ySA259和ySA260，分别表达(R34)GLP-1(11-37)(SEQIDNO：9)、Ext1-(E22，R26，R34)GLP-1(8-37)K38-Ext2(SEQIDNO：10)和Ext1-(E22，R26，R34，K37)GLP-1(8-37)-Ext2(SEQIDNO：11)。
将ME1719酵母菌株ySA251、ySA259和ySA260接种到5ml生长培养基中，例如由以下成分组成的培养基：5g/L(NH4)2SO4、184mg/L(NH4)2HPO4、2.88g/LKH2PO4、1.42g/LMgSO4·7H2O、1.28g/LK2SO4、10.00g/L琥珀酸、10.00g/L酪蛋白氨基酸、0.0112g/LFeSO4·7H2O、0.0086g/LMnSO4·H2O、0.0014g/LCuSO4·5H2O、0.00185g/LZnSO4·7H2O、0.0129g/LCaCl2·2H2O、0.071g/L柠檬酸、28.0mg/L间肌醇、14.0mg/L氯化胆碱、2.8mg/L硫胺、2.8mg/L烟酰胺、2.1mg/L泛酸钙、0.14mg/L生物素、0.14mg/L叶酸、40g/L葡萄糖。培养在30℃下进行3天。离心后，取出上清液用于定量HPLC分析，通过该方法测定分泌的GLP-1类似物的浓度。GLP-1前体分子本身通过LC/MS分析证实。按照广为接受的方法，通过赖氨酸特异性水解无色杆菌蛋白酶1(AchromobactorLyticusProtease1)除去用以促进(E22，R26，R34)GLP-1(8-37)K38和(E22，R26，R34，K37)GLP-1(8-37)表达的N端和C端突出端。
实施例2
酵母表达系统的构建和GLP-1类似物前体分子(R34)GLP-1(9-37)的产生
通过标准PCR，使用引物5’-AGGGGTATCCATGGCTAAGAGAGAAGGTACCTTCACCTCTGAC-3’和5’-AATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCG-3’和含有编码(R34)GLP-1(7-37)的DNA序列的质粒，来构建编码(R34)GLP-1(9-37)的合成DNA片段。设计有5’NcoI位点和3’XbaI位点的引物。因此PCR片段在纯化之后可以通过NcoI和XbaI消化并且与实施例1中所述修饰cPOT型表达载体的NcoI-XbaI载体片段连接。所得编码(R34)GLP-1(9-37)的质粒称为pSA82。
使表达质粒在在氨苄西林存在下生长的大肠杆菌中增殖并且采用标准技术(Sambrook等，1989)分离。通过合适的限制性核酸酶(例如EcoRI、NcoI、XbaI)检查质粒DNA中的插入序列，序列分析表明所述质粒DNA含有GLP-1类似物前体分子(R34)GLP-1(9-37)的正确序列。
将质粒转化至酿酒酵母菌株ME1719中，按照实施例1中所述，选择带有该质粒的酵母转化子。所得表达(R34)GLP-1(9-37)的酵母菌株称为ySA96。
将酵母菌株在生长培养基中培养，按照实施例1中所述，从培养基中回收(R34)GLP-1(9-37)。
实施例3
GLP-1前体的酵母表达系统的构建
为了提高所加工、分泌的肽的表达产量，使前导序列和Kex2p切割位点最优化。编码各种前导序列和(R34)GLP-1(11-37)或(R34)GLP-1(9-37)构建体的合成DNA片段通过标准PCR扩增。正向引物包括NcoI位点和编码最优化前导序列的序列。反相引物包括XbaI位点。因此，使得NcoI-XbaI限制性PCR片段克隆至NcoI-XbaI限制性cPOT型表达载体中。编码(R34)GLP-1(11-37)的表达构建体的序列、质粒编号和菌株名称见图4。
在氨苄西林存在下使表达质粒在大肠杆菌中增殖，并且采用标准技术(Sambrook等，1989)分离。使用合适的限制性内切酶，通过限制性内切核酸酶消化检查质粒构建体。对编码序列进行了序列验证。
将质粒转化至酿酒酵母菌株ME1719中。带有该质粒的酵母细胞按照实施例1所述来选择。基本按照实施例1所述来培养酵母菌株。
在Kex2p切割位点附近序列(P1～P6)的最优化，导致产量最适度的增加(图4：B)。对序列(P3～P6)中掺入脯氨酸作为增加Kex2p切割位点暴露于Kex2p的有效方法进行了研究。虽然，对于(R34)GLP-1(11-37)结果并不如此，但是对于(R34)GLP-1(11-37)观察到有效作用(图4：H、I)。残基P7到P11的变异对表达产量具有明显作用，当引入含有带电荷氨基酸的基序时，观察到2-2.5倍增加(图4：M-Z、K5-7、L2-4)。设计了一系列构建体用于在下游过程中用DAP-1(二肽基氨基肽酶)加工(图4：G、J、K、L)。构建体J和L在Thr-11之前的位置上含有Q，以防止GLP-1肽被DAP-1无选择性地切割。该Gln随后可用酶即Q-环化酶和pGAP酶(Qiagen)除去。
表1.
实施例4
N端突出端Boc-His(Boc)-Aib-Glu(O-tBu)-Gly-OH的制备
将2-氯三苯甲基氯树脂(1％DVB，1.4mmol/g，10g，14.0mmol)在DCM中预溶胀后，将其加入Fmoc-Gly-OH(8.3g，28mmol)和DIPEA(9.03g，70mmol)的100mlDCM溶液中，在室温下搅拌30分钟。树脂用NMP(2x100ml)和2x100mlDCM-MeOH-DIPEA(80∶15∶5，10分钟)和随后的NMP(3x100ml)洗涤后，用含20％哌啶的NMP(3x100ml)每次处理10分钟。树脂用NMP(6x100ml)、DCM(2x100ml)和MeOH(2x100ml)洗涤后，真空干燥过夜。树脂用含100ml20％哌啶的NMP处理10分钟。该步骤重复两次后，用NMP(5x100ml)洗涤。
将Fmoc-Glu(O-tBu)-OH(23.8g，56mmol)溶于100mlNMP和20mlDCM的混合物中。加入HOAt(7.62g，56mmol)，接着滴加DIC(7.07g，56mmol)。搅拌混合物15分钟后，加入DIPEA(9.03g，70mmol)，将混合物转移到树脂中。搅拌树脂16小时后，用NMP(4x100ml)洗涤。树脂用含20％哌啶的NMP(100ml)处理10分钟。该步骤重复两次后，树脂用NMP(5x100ml)洗涤。
将Fmoc-Aib-OH(18.22g，56mmol)溶于100mlNMP和20mlDCM的混合物中。加入HOAt(7.62g，56mmol)，接着滴加DIC(7.07g，56mmol)。搅拌混合物20分钟后，加到树脂中。搅拌混合物30分钟后加入DIPEA。搅拌混合物16小时后，树脂用NMP(4x100ml)洗涤。树脂用20％哌啶的NMP(100ml)溶液处理10分钟。该步骤重复两次后，树脂用NMP(5x100ml)洗涤。
将Boc-His(Boc)-OH(19.9g，56mmol)溶于100mlNMP和20mlDCM的混合物中。加入HOAt(7.62g，56mmol)，接着滴加DIC(7.07g，56mmol)。搅拌混合物20分钟后，加到树脂中。搅拌混合物30分钟后加入DIPEA。搅拌混合物16小时后，树脂用NMP(3x100ml)、DCM(4x100ml)洗涤。
加入三氟乙醇-DCM(1∶4，125ml)，搅拌树脂1小时。收集滤液，加入一份新的三氟乙醇-DCM(1∶4，125ml)并搅拌15分钟。收集滤液，真空除去溶剂，得到透明油状物。加入冰冷的乙醚(300ml)，于是形成白色沉淀。加入轻汽油醚(100ml)，滤出沉淀，用乙醚洗涤后真空干燥。
收率：7.3g
HPLC(方法01_B4)：Rt＝7.8分钟
LCMS：m/z＝944(M+H)+
分子量计算值＝943.2
实施例5
N端突出端Boc-His(Boc)-Aib-Glu(O-tBu)-Gly-OSuc的制备
向Boc-His(Boc)-Aib-Glu(O-tBu)-Gly-OH(1.0g，1.47mmol)的无水THF(60ml)溶液中加入DIPEA(0.47g，3.66mmol)和六氟磷酸O-(N-琥珀酰亚胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲(1.10g，3.66mmol)，在室温下搅拌反应混合物24小时。加入二氯甲烷(250ml)，溶液用H2O(2x100ml)洗涤。有机相经MgSO4干燥，过滤后真空浓缩，得到1.1gBoc-His(Boc)-Aib-Glu(O-tBu)-Gly-OSu。
HPLC(方法01_B4)：Rt＝8.3分钟
LCMS：m/z＝780.9(M+H)+
分子量计算值＝779.9
实施例6
酰化剂17-((S)-1-叔丁氧基羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十七烷酸叔丁酯的制备
通过用于制备和活化上述酰化剂A-OH、A-B-C-D-OH、A-C-D-OH、A-B-C-OH并类似于实施例4的通用方法，制备标题化合物。
HPLC(方法01_B4)：Rt＝16.2分钟
LCMS：m/z＝944(M+H)+
分子量计算值＝943.2
实施例7
酰化剂17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-甲氧基)-乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)-十七烷酸的制备
将17-((S)-1-叔丁氧基羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]-乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十七烷酸叔丁酯溶于TFA，搅拌所得溶液2小时后，真空蒸发至干。将所得油状物与甲苯共蒸发三次至干，得到油状残余物。
LCMS：m/z＝831(M+H)+
实施例8
GLP-1衍生物[Arg34]GLP-1-(11-37)-N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)的制备
将[Arg34]GLP-(11-37)(50mg，0.017mmol)溶于2ml水，加入DIPEA(89μL，0.51mmol)。搅拌混合物10分钟后，测量pH至10.6。然后在10分钟内，滴加17-((S)-1-叔丁氧基羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十七烷酸叔丁酯(20.5mg，0.022mmol)的MeCN(1.5ml)溶液。搅拌反应混合物1小时后，真空除去MeCN，将溶液冻干。
将所得残余物溶于NMP(2ml)，然后加入DIPEA(22μL，0.17mmol)和Boc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu(26mg，0.033mmol)。搅拌反应混合物4小时后，加入又一份His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu(13mg0.017mmol)，搅拌反应混合物过夜。加入冰冷的乙醚(20ml)，于是形成白色沉淀。通过离心分离沉淀，滗出上清液。沉淀用10ml乙醚洗涤后风干。
脱保护
将粗制中间体溶于TFA-三异丙基甲硅烷-H2O(95∶2.5∶2.5，10ml)并搅拌3小时，然后将溶液真空浓缩至约1ml。加入冰冷的乙醚(20ml)，于是形成沉淀。通过离心分离沉淀，滗出上清液。沉淀用乙醚洗涤后干燥。将粗制化合物溶于乙酸-H2O(3∶7)(10ml)，并用HPLC纯化。
HPLC(方法02_B4)：Rt＝9.6分钟
LCMS：m/z＝1372.5(M+3H)3+
分子量计算值＝4113.7
实施例9
GLP-1衍生物N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-叔丁氧基羰基十七烷酰基-氨基)-4(S)-叔丁氧基羰基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基]-[Arg34]GLP-1-(9-37)肽的制备
向17-{(S)-1-叔丁氧基羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十七烷酸叔丁酯(94.0mg，0.112mmol)的NMP(2.0ml)溶液中加入六氟磷酸O-(1-琥珀酰亚胺基)-N，N，N′，N′-四甲基脲(TSTU，41.7mg，0.139mmol)和TEA(96.0μl，0.69mmol)。在室温下搅拌30分钟后，将混合物滴加到[Arg34]GLP-1-(9-37)肽(220mg，0.069mmol)的水(9ml)和TEA(96.0μl，0.69mmol)溶液中。在室温下再搅拌30分钟后，混合物用水(30ml)稀释并冻干16小时，得到油状物/非晶形混合物，将其溶于乙酸-乙腈-水(30∶20∶50，180ml)的混合物中，过滤后，用HPLC纯化，得到N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-叔丁氧基羰基十七烷酰基-氨基)-4(S)-叔丁氧基羰基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基]-[Arg34]GLP-1-(9-37)肽。
HPLC(方法02_B4_4)：Rt＝12.1分钟
LCMS：m/z＝1335.5(M+3H)3+
分子量计算值＝4003.6
实施例10
GLP-1类似物N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)-丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]-乙氧基}乙氧基)-乙酰基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)肽的制备
向Boc-His(Boc)-Aib-OH(23mg，0.052mmol)的NMP(2.0ml)溶液中加入六氟磷酸2-(1H-9-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(HATU，20mg，0.052mmol)和TEA(29μl，0.208mmol)。搅拌45分钟后，将混合物加入N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-叔丁氧基羰基十七烷酰基氨基)-4(S)-叔丁氧基羰基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)-乙氧基]乙氧基)乙酰基]-[Arg34]GLP-1-(9-37)肽(83mg，0.021mmol)和TEA3.6μl，0.026mmol)的溶液中。搅拌14天后，反应混合物用水(100ml)稀释，用HPLC纯化。合并纯的流分，真空除去有机溶剂后，将残余物冻干达16小时。
向残余物中加入三氟乙酸-三异丙基甲硅烷-水(94∶3∶3，10ml)的混合物。搅拌2小时后，将反应混合物真空蒸发，将残余物溶于水-氨(99∶1，100ml)的混合物中，用制备型HPLC纯化，得到标题化合物。
HPLC(方法02_B4_4)：Rt＝9.4分钟
LCMS：m/z＝1372(M+3H)3+
分子量计算值＝4113.7
实施例11
酰化剂20-[4-((S)-1-叔丁氧基羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}-丙基氨基甲酰基)哌啶-1-基]-20-氧代-二十烷酸叔丁酯的制备
通过用于制备和活化上述酰化剂A-OH、A-B-C-D-OH、A-C-D-OH、A-B-C-OH并类似于实施例4的通用方法，来制备标题化合物。
LCMS：m/z＝1111(M+H)+
LCMS：m/z＝1082.6(M+H)+
分子量计算值＝1082.4
实施例12
GLP-1类似物[脱氨基-His7，Glu22，Arg26，34，Lys37(Lys(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-4-羧基-4-{[1-(19-羧基十九烷酰基)哌啶-4-羰基]氨基}-丁酰基氨基)乙氧基]-乙氧基}-乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基)]-GLP-1(7-37)肽的制备
向[Glu22，Arg26，34，Lys37]GLP-1-(8-37)肽(46mg，0.013mmol)的2ml水溶液中加入DIPEA(50.4mg，0.39mmol)，搅拌混合物10分钟后，在15分钟过程中滴加20-[4-((S)-1-叔丁氧基羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-丙基氨基甲酰基)-哌啶-1-基]-20-氧代-二十烷酸叔丁酯(32.4mg，0.03mmol)的1mlMeCN溶液。搅拌反应混合物20分钟后加入水(20ml)，将溶液冻干。
将所得残余物溶于NMP(1ml)和4-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基)-乙基]-咪唑-1-甲酸金刚烷-1-基酯(Adoc-脱氨基His-OSu酯)，搅拌混合物3小时后，将其滴加到冰冷的乙醚(20ml)中。白色通过离心分离沉淀后，用乙醚(20ml)洗涤两次并干燥。
所得残余物用TFA-TIPS-水(95∶2.5∶2.5，1ml)处理3小时后，将其滴加到冰冷的乙醚(10ml)中。白色通过离心分离沉淀后，用乙醚(10ml)洗涤两次。残余物用制备型HPLC纯化，得到标题化合物。
HPLC(方法01_B4_2)：Rt＝11.1分钟
LCMS：m/z＝1484(M+3H)3+
分子量计算值＝4452.1
实施例13
4-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基)乙基]咪唑-1-甲酸金刚烷-1-基酯的制备
将4-(2-羧基乙基)咪唑-1-甲酸金刚烷-1-基酯(1g，3.1mmol)溶于THF(5ml)和DMF(10ml)中。使溶液冷却至0℃后，加入TSTU和DIEA。将溶液在0℃下搅拌1小时，在室温下搅拌16小时。将样品真空浓缩。加入EtOAc(100ml)，溶液用0.2NHCl(2x50ml)洗涤，经MgSO4干燥，真空浓缩，得到粘性结晶残余物(1.18g，收率90％)。粗产物无需进一步纯化便可使用。
LCMS：m/z＝416.2(M+H)
1H-NMR(DMSO，300MHz)(选定信号)δ8.22(s，1H)，7.37(s，1H)，3.02(t，2H)，2.82-2.88(m，2H)，2.81(s，4H)，2.19(s-br，9H)，1.66(s，6H)。
实施例14
GLP-1类似物N-ε37{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-羧基-3-{[1-(19-羧基十九烷酰基)哌啶-4-羰基]氨基}丙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Glu22，Arg26，34，Lys37]GLP-1(8-37)肽的制备
使用CEMLiberty肽合成仪，以Fmoc-Lys(Mtt)-wang树脂开始，制备GLP-1类似物。从Ala8中脱去Fmoc基团后，通过与二碳酸二叔丁酯进行双偶联，将N端保护起来。通过用DCM洗涤树脂，用六氟异丙醇在室温下处理树脂15分钟后，再用DCM洗涤树脂，从而脱去Mtt基团。使用Fmoc保护的试剂和二十烷酸一叔丁酯，在CEMLibert肽合成仪中制备N-ε37修饰物。将粗制肽从树脂TFA-TIPS-水(95∶2.5∶2.5)上裂解，在冰冷的乙醚中沉淀，通过离心分离。粗制肽用制备型HPLC纯化，(4cm直径x200mm，C18，60ml/分钟，33-53％乙腈)。
LCMS：m/z＝1065.8(M+4H)4+
实施例15
GLP-1类似物N-ε37{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-羧基-3-{[1-(19-羧基十九烷酰基)哌啶-4-羰基]氨基}丙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[脱氨基-His(Adoc)7，Glu22，Arg26，34，Lys37]GLP-1(7-37)肽的制备
将GLP-1类似物N-ε37{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-羧基-3-{[1-(19-羧基十九烷酰基)哌啶-4-羰基]氨基}丙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Glu22，Arg26，34，Lys37]GLP-1(8-37)肽(2.1mg，0.001mmol)溶于NMP(105μL)。通过将25.3mg溶于1296μLNMP中来制备4-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基)乙基]咪唑-1-甲酸金刚烷-1-基酯溶液，将25μL该溶液加入肽溶液中，接着加入DIEA(0.9μL)。转化成产物后进行LCMS分析。在室温下2小时后，观察到产物与起始肽的ELS信号比为976∶28(97％转化)。
LCMS：m/z＝1141.1(M+4H)4+
实施例16
酰化剂19-{[反式-4-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-丙基氨基甲酰基)-环己基甲基]-氨基甲酰基}-十九烷酸的制备
将19-{[反式-4-((S)-1-叔丁氧基羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-丙基氨基甲酰基)-环己基甲基]-氨基甲酰基}-十九烷酸叔丁酯(1.0g，0.9mmol)在TFA(10ml)中搅拌1小时45分钟后，加入100ml冰冷的乙醚。白色通过离心分离沉淀后，用乙醚洗涤3次，得到标题化合物。
将沉淀真空干燥16小时。
LCMS：m/z＝999(M+1)+
实施例17
GLP-1类似物N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-({反式-4-[(19-羧基十九烷酰基氨基)甲基]环己烷羰基}氨基)-丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]-[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)肽的制备
将通过重组技术制备的[Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(8-37)(300mg，0.09mmol)溶于6ml水，加入DIPEA(373μL，2.19mmol)并搅拌10分钟，然后滴加19-{[反式-4-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-丙基氨基甲酰基)-环己基甲基]-氨基甲酰基}-十九烷酸(175.7mg，0.18mmol)的NMP(1.7ml)溶液。搅拌混合物90分钟后，加入Na2HPO4x7H2O(470.6mg，1.76mmol)，用1NHCl调节pH至8.4。
在另一个烧瓶中，将3-(1H-咪唑-4-基)-丙酸(93.2mg，0.53mmol)、四氟硼酸O-(N-琥珀酰亚胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲(159.0mg，0.53mmol)和DIPEA(180μL，1.06mmol)在NMP(0.75ml)中混合，搅拌溶液1小时后，将其滴加到含有肽的反应混合物中。搅拌混合物14小时，然后加入哌啶(350μL，3.51mmol)。再搅拌混合物2小时后，将其用水稀释至总体积20ml，用制备型HPLC纯化(使用33-53％MeCN/水的梯度)。
LCMS：m/z＝1475.8(M+3H)3+
实施例18
GLP-1类似物N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)-乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)的替代性制备
将通过重组技术制备的[Arg34]GLP-1-(11-37)(100mg，0.033mmol)溶于2ml水，加入DIPEA(113μL，0.66mmol)并搅拌10分钟，然后在15分钟内分几小部分加入17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基-甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-丙基-氨基甲酰基)-十七烷酸(55mg，0.066mmol)(按照实施例2、3和13制备)中。搅拌混合物60分钟后，加入Na2HPO4x7H2O(353.9mg，1.32mmol)，使用1NHCl调节pH至8.3。将Fmoc-His-Aib-Glu-Gly-OSu(246.2mg，0.33mmol)加入含有肽的反应混合物，搅拌混合物14小时，然后加入哌啶(400μL，4.05mmol)。再搅拌混合物30分钟后，将其用水-MeCN(9∶1)稀释成40ml的总体积，用制备型HPLC纯化(使用30-50％MeCN/水的梯度)。
LCMS：m/z＝1372.5(M+3H)3+
实施例19
GLP-1类似物N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)-乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)肽的替代性制备
酰化：在70mlMetrohm848Titrinoplus滴定仪的反应室中，将重组[Arg34]GLP-1-(11-37)(99mg；33μmol)悬浮于H2O(4ml)中。在自动滴定仪SET程序控制下调节pH至pH＝11.3(加入3.8ml，0.1MNaOH(水溶液))。肽在pH＝11.3下完全溶解。将活化侧链17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-甲氧基)-乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)-十七烷酸(55mg，66μmol，2当量)溶于NMP(250μL)，并转移到250μLHamilton注射器中。通过自动注射泵的作用，在10分钟内加入250μL(2.0当量)该溶液。再过60分钟后，取出样品(10μL)用90μLMeCN-H2O(1∶1)稀释，UPLC显示出N26酰化产物(约95％)的主峰+痕量的未反应肽+痕量的水解侧链。
连接：将四肽NHS酯Fmoc-His-Aib-Glu-Gly-OSu(123mg，165μmol，5当量)溶于NMP(250μL)。用稀乙酸调节反应混合物的pH至6.9。然后通过滴定仪上的pH-stat功能调节pH至7.0。在20分钟内加入250μLNHS酯。使pH稳定在pH＝7.0±0.1。
再过30分钟后取出样品，UPLC显示酰化中间体和预期产物(N端位置上被Fmoc保护)之比为1∶1。
如上再加入5当量四肽NHS酯。将溶液搅拌16小时。此时酰化中间体和产物之比为2∶8。
如上再加入2.5当量(共12.5当量)四肽NHS酯。将溶液搅拌16小时。此时酰化中间体和产物之比约为1∶9。
将哌啶(1.6ml)加入反应混合物中，连续搅拌1小时。
UPLC显示完全脱保护。粗产物用反相HPLC纯化，得到62mg(45％)所需要的产物(纯度98％)。
LCMS：m/z＝1372.5(M+3H)3+
实施例20
Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(O-tBu)-Gly-OH的制备
甘氨酸的加载
将树脂在DCM(1升，20分钟)中预溶胀后，将其加入Fmoc-Gly-OH和DIPEA的500mlDCM溶液中，并搅拌60分钟。树脂依次用DMF(2x500ml)、2x500mlDCM-MeOH-DIPEA(80∶15∶5，10分钟)、DMF(3x500ml)和DCM(500ml)洗涤后，在室温下静置过夜。
偶联1
含20％哌啶的DMF(500ml)用于Fmoc脱保护持续50分钟，然后树脂用DMF(8x500ml)洗涤。
将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和TCTU溶于700mlDMF，加入反应器中，加入DIPEA。搅拌混合物6小时。按照HPLC试验，仍存在游离胺基团；偶联用1/4试剂重复进行。当偶联反应完成(不存在氨基)时，树脂用DMF(4x500ml)洗涤。
偶联2
将Fmoc-Aib-OH和TCTU溶于700mlDMF溶液，放入反应器中后，并加入DIPEA。搅拌混合物50分钟。当偶联反应完成(不存在氨基)时，树脂用DMF(4x500ml)洗涤。
偶联3
含20％哌啶的DMF(500ml)用于Fmoc脱保护持续30分钟，然后树脂用DMF(8x500ml)洗涤。
将Fmoc-His(Boc)-OH和TCTU溶于700mlDMF，将溶液放入反应器后，加入DIPEA。搅拌混合物50分钟。当偶联反应完成(不存在氨基)时，树脂用DMF(3x500ml)和DCM(2x500ml)洗涤。
第一次裂解
使用1/7树脂进行第一次裂解。加入三氟乙醇-DCM(1∶4，500ml)，搅拌树脂70分钟。收集滤液后，真空除去溶剂，得到油状物。将油状物溶于乙酸乙酯，放置在冰箱中以形成晶体。将晶体过滤，使用乙醚洗涤后风干，得到6.1g产物(收率45％)，由HPLC所得的纯度为99.0％。
第2次裂解
用3/7树脂进行第2次裂解。加入三氟乙醇-DCM(1∶4，1000ml)，搅拌树脂90分钟。收集滤液后，真空除去溶剂，得到油状物。将油状物溶于乙酸乙酯，放置在冰箱中过夜形成晶体。将晶体过滤，经乙醚洗涤后风干，得到33.1g产物(收率80％)，HPLC所得纯度98.7％。
收率：6.1g(45％)
ESI+MSm/z：805.1(M+H)+，1610.7(2M+H)+。
HPLCRt(Luna4.6x250，5μl，100A；乙腈/缓冲液*30∶70～60∶40，30分钟，1ml/分钟，220nm)：23.31分钟；纯度99.0％
和33.1g(80％)
ESI+MSm/z：805.1(M+H)+，1610.8(2M+H)+。
HPLCRt(Luna4.6x250，5μl，100A，乙腈/缓冲液*30∶70～60∶40，30分钟，1ml/分钟，220nm)：23.16分钟；纯度98.7％
*缓冲液：2.71gKH2PO4、7.13gNaH2PO4·2H2O溶于H2O(2L)。
实施例21
Fmoc-His-Aib-Glu-Gly-OSuc·TFA盐的制备
将Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(O-tBu)-Gly-OH(1.25g，1.56mmol)溶于THF(10ml)后，加入DIPEA(0.64g，3.73mmol)和TSTU(0.56g，1.87mmol，1.2当量)。搅拌混合物过夜。
LCMS：约95％转化。将混合物过滤后，真空除去溶剂。加入EtOAc(100ml)，有机相用冷的0.1NHCl洗涤两次后经Na2SO4干燥，过滤后蒸发，得到粗制的Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu(1.1g，79％)。
将粗产物溶于DCM(2ml)，加入TFA(1ml)。搅拌1小时。LCMS：100％脱保护。有机溶剂蒸发后，将冰冷的乙醚加入残余物中，所得沉淀经过滤收集后，在真空炉中干燥，得到Fmoc-His-Aib-Glu-Gly-OSu(430mg)。
LCMS：m/z＝746.3(M+H)+
实施例22
3-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-丙酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯的制备
将3-(N-三苯甲基咪唑-4-基)丙酸(Jung等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，6，2317-2336，1998)(50g，0.13mol)溶于DCM(500ml)，加入N-羟基琥珀酰亚胺(24g，0.209mol)和N，N’-二环己基碳二亚胺(35g0.170mol)，同时用冰浴保持内部温度低于30℃。将所得混合物在室温下搅拌过夜。将混合物过滤后，将所得溶液真空浓缩，加热时再溶于THF(350ml)，与2-丙醇(350ml)混合至所得温度为32℃，然后冷却至5℃。将结晶产物过滤，用2-丙醇(150ml)洗涤后真空干燥，得到标题化合物(47.3g，收率75％)。
1HNMR(D6-DMSO，400MHz)：δ7.15-6.99(m，9H)，6.82(s，1H)，6.81-6.62(m，6H)，6.38(s，1H)，2.63(t，3H)，2.4(m，6H)。
实施例23
4-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基)-乙基]-1H-咪唑-1- 三氟乙酸盐的制备
将3-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-丙酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(40g，83mmol)溶于DCM(240ml)。加入三异丙基甲硅烷(42ml)和三氟乙酸(240ml)，将所得溶液在室温下搅拌90分钟。将溶液真空蒸发，再溶于乙腈(120ml)，滴加叔丁基甲基醚(290ml)，使溶液冷却至8℃。沉淀经过滤收集后真空干燥，得到白色化合物(24g，82％)。
1HNMR(D6-DMSO，400MHz)：δ8.90(s，1H)，7.47(s，1H)，3.09(t，2H)，2.79(t，2H)，2.79(s，4H)。
实施例24
GLP-1类似物N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-({反式-4-[(19-羧基十九烷酰基氨基)甲基]环己烷羰基}氨基)-丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]-[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)肽的替代性制备
将通过重组技术制备的[Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(8-37)肽(80g，0.023mol)溶于水(6400ml)，加入三乙胺(28ml)至pH11.0。将(22S)-22-{[(反式-4-{[(19-羧基十九烷酰基)氨基]甲基}-环己基)羰基]氨基}-1-[(2，5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1，10，19-三氧代-3，6，12，15-四氧杂-9，18-二氮杂二十三烷-23-酸(34.9g，0.035mol)溶于NMP(210ml)，在2小时以内加入该溶液中，同时通过连续加入三乙胺(triehylamine)保持pH介于11.0-11.1之间。通过加入1M硫酸(水溶液，140ml)调节pH至7.0。将4-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基)-乙基]-1H-咪唑-1-三氟乙酸盐(36.99g，0.105mol)溶于NMP，在2小时内加入该溶液中，同时通过连续加入三乙胺保持pH为7.0-7.1。加入1MNaOH(水溶液，500ml)调节pH至11.2后，将溶液在室温下搅拌7小时。通过加入1M硫酸(水溶液，140ml)调节pH至7.4，得到共7973.8g，将其用制备型HPLC纯化。
LCMS：m/z＝1476(M+3H)3+
实施例25
[Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)肽的制备
将Arg34-GLP-1[9-37]·4TFA(103mg；0.028mmol)溶于2ml水，另用2x1ml水转移到滴定仪反应室内。反应室配备了搅拌磁体(stirringmagnet)、pH电极和滴定管。溶液的pH为1.9。将滴定仪设置为固定pH＝11.3的‘STAT’方法。由滴定仪加入滴定剂氢氧化钠(3.27ml，0.1M水溶液)，以达到pH＝11.3。将(Boc)2O(186mg，0.85mmol，3当量)溶于NMP(2.500ml)，使250μLHammilton注射器装满该溶液(即250μL；18.6mg(Boc)2O，3当量)。
将水(1.0ml)加入反应室以使总体积为8.3ml，然后在室温下，在20分钟内借助注射泵加入(Boc)2ONMP溶液。滴定仪通过自动加入滴定剂保持pH＝11.3。再搅拌10分钟后，LCMS显示88％的Lys26(NHBoc)产物以及diboc产物(9％)和起始原料(3％)。用少量体积的稀HOAc(水溶液)调整溶液pH至6.5，将滴定仪设置在pH＝7.5用于进一步反应。
将Boc-His(Boc)-Aib-OSu(305mg，0.568mmol，20当量)溶液溶于NMP(500μL)，得到总体积为715μL。在2x30分钟内保持pH＝7.5，将该溶液2x250μL(2x7当量)加入反应混合物中。观察到Boc-His(Boc)-Aib-OSu立即沉淀，但在搅拌时全部溶解。加入结束后，在pH＝7.5和室温下，再搅拌混合物2小时，以使反应物溶解，并进行反应。
将混合物冻干并用含有3％TIPS和3％水的TFA处理2小时。蒸发溶剂，残余物用HPLC纯化，得到所需产物。
LCMSm/z：849.88(M+4H)4+，1132.86(M+3H)3+。计算值3396.698(M+H)+。
实施例26
Boc-His(Boc)-Aib-OH的制备
Aib的加载：将2-氯三苯甲基氯树脂1％DVB(负载1.1mmol/g)(10.0g，11mmol)在DCM中预溶胀后，将其加入Fmoc-Aib-OH(7.16g，22mmol)和DIPEA(9.4ml，55mmol)的DCM(100ml)溶液中。搅拌混合物60分钟。树脂用NMP(2x100ml)、DCM-MeOH-DIPEA(80∶15∶5)(2x100ml，各10分钟)和NMP(3x100ml)洗涤。经洗涤的树脂用含20％哌啶的NMP(3x100ml，各10分钟)处理。树脂用NMP(6x100ml)洗涤。
偶联：将Boc-His(Boc)-OH(15.64g，44mmol)溶于NMP(100ml)和DCM(20ml)，加入HOBt(5.95g，44mmol)，接着慢慢加入DIC(6.81ml，44mmol)。搅拌混合物15分钟后，加入DIPEA(9.40ml，55mmol)。将活化的混合物加入树脂中，搅拌树脂16小时后，用NMP(4x100ml)和DCM(10x100ml)洗涤。
裂解：加入三氟乙醇-DCM(1∶4，100ml)，搅拌树脂1小时。收集滤液后，加入一份新的三氟乙醇-DCM(1∶4，100ml)，并搅拌15分钟，收集滤液。将合并的滤液真空蒸发后，加入石油醚(petrolether)(50ml)。所得沉淀用石油醚洗涤，收集后，在40℃真空炉中干燥16小时，得到Boc-His(Boc)-Aib-OH(1.00g，收率21％，纯度95％)。
LCMSm/z：441.18(M+H)+。计算值440.227(M+H)+。
实施例27
Boc-His(Boc)-Aib-OSu的制备
将Boc-His(Boc)-Aib-OH(0.70g，1.59mmol)溶于THF(5.0ml)，加入TSTU(1.44g，4.77mmol)和DIPEA(1.36ml，7.95mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。LCMS显示几乎完全转化成唑酮产物。将反应混合物过滤后，蒸发溶剂。将残余物再溶于DCM(10ml)，加入N-羟基琥珀酰亚胺(292mg，2.56mmol，1.6当量)。在室温下搅拌混合物过夜。UPLC显示所需Su-酯(85％)的主峰、痕量的未反应起始原料和5％的闭环唑酮。在室温下减压蒸发溶剂，加入H2O(25ml)以溶解未反应的N-羟基琥珀酰亚胺。滗出H2O后，将残余物溶于EtOAc(100ml)，经MgSO4干燥，过滤后蒸发，得到白色泡沫状物，含有70％所需产物。
LCMSm/z：538.18(M+H)+。计算值538.251(M+H)+
实施例28
Fmoc-His-Aib-OSu的制备
将Fmoc-His(Trt)-Aib-OH(5g，7.1mmol)溶于THF(50ml)。加入DCC(1.61g，7.8mmol)和NHS(0.94g，8.2mmol)，在室温下搅拌所得溶液16小时。将DCU过滤后，将溶液真空蒸发。将所得油状物溶于DCM(34ml)，加入三氟乙酸(34ml)和TIPS(6ml)。在室温下搅拌溶液2小时，真空蒸发至25ml，滴加到TBME(200ml)中，搅拌60分钟，经过滤收集所得白色沉淀，再用TBME洗涤。将所收集的沉淀真空干燥16小时。
LCMS：m/z＝560(M+H)+
实施例29
GLP-1衍生物[Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)肽的制备
将[Arg34]GLP-1(9-37)肽·4TFA(103mg；0.028mmol)溶于0.1MTEA(水溶液，7.5ml)，再加入TEA(140μl)至所得pH为11.28。将FmocOSu(90mg)溶于NMP(1600μl)，并将334μl(0.055mmol)该溶液滴加到肽的水溶液中。通过加入1MH2SO4(水溶液)调节pH至7。将FmocHisAibOSu三氟乙酸盐(90mg，0.134mmol)溶于NMP(800μl)并滴加到所述溶液中，同时通过连续加入1MNaOH(水溶液)保持pH介于7.0和7.5之间。加入哌啶(2ml)，在室温下搅拌所得溶液60分钟。加入TBME(5ml)，并搅拌混合物30分钟。水相经分离后冻干。
LCMS：m/z＝1134(M+3H)3+。

Claims (15)

1.一种用于制备在N端部分包含一个或多个非蛋白氨基酸的GLP-1类似物或衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)对包含编码所述GLP-1类似物的前体分子的核苷酸序列的宿主细胞在用于表达所述前体分子的适当条件下进行培养，
ii)从液体培养基中分离出表达的前体分子，
iii)保护所述前体分子的赖氨酸基团，
iv)将包含一个或多个非蛋白氨基酸的被保护的N端氨基酸突出端与被保护的前体分子偶联，以获得被保护的GLP-1类似物或衍生物，
v)使被保护的GLP-1类似物或衍生物的任何保护基脱保护，
vi)通过合适的方法分离所得到的GLP-1类似物或衍生物。
2.一种用于制备在N端部分包含一个或多个非蛋白氨基酸的GLP-1类似物或衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)对包含编码所述GLP-1类似物的前体分子的核苷酸序列的宿主细胞在用于表达所述前体分子的适当条件下进行培养，
ii)从液体培养基中分离出表达的前体分子，
iii)用任选被活化的酰化剂酰化表达的前体分子中至少一个赖氨酸残基的ε氨基，以获得前体分子衍生物，并任选分离所述前体分子衍生物，
iv)将包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与表达的前体分子衍生物偶联，
v)通过合适的方法分离所得到的GLP-1类似物或衍生物；
其中所述酰化步骤在水溶剂混合物中进行并且反应混合物的pH为9至13。
3.权利要求1的方法，其中将所述N端氨基酸突出端保护起来后用于步骤iv)，并且在N端突出端偶联后再脱保护。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述GLP-1类似物的前体分子选自包含以下通式的氨基酸序列的前体分子：
Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45
其中
Xaa16为Val或Leu；
Xaa18为Ser、Lys或Arg；
Xaa19为Tyr或Gln；
Xaa20为Leu或Met；
Xaa22为Gly或Glu；
Xaa23为Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa25为Ala或Val；
Xaa26为Lys、Glu或Arg；
Xaa27为Glu或Leu；
Xaa30为Ala、Glu或Arg；
Xaa33为Val、Lys或Arg；
Xaa34为Lys、Glu、Asn、His或Arg；
Xaa35为Gly；
Xaa36为Arg、Gly或Lys；
Xaa37为Gly、Ala、Glu、Pro、Lys，或不存在；
Xaa38为Lys、Ser，或不存在；
Xaa39为Ser、Lys，或不存在；
Xaa40为Gly，或不存在；
Xaa41为Ala，或不存在；
Xaa42为Pro，或不存在；
Xaa43为Pro，或不存在；
Xaa44为Pro，或不存在；
Xaa45为Ser，或不存在；
条件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44或Xaa45不存在，则下游每个氨基酸残基也不存在。
5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述GLP-1类似物的前体分子选自包含以下通式的氨基酸序列的前体分子：
Xaa9-Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45
其中
Xaa9为Glu或Asp；
Xaa10为Gly或Ala；
Xaa16为Val或Leu；
Xaa18为Ser、Lys或Arg；
Xaa19为Tyr或Gln；
Xaa20为Leu或Met；
Xaa22为Gly或Glu；
Xaa23为Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa25为Ala或Val；
Xaa26为Lys、Glu或Arg；
Xaa27为Glu或Leu；
Xaa30为Ala、Glu或Arg；
Xaa33为Val、Lys或Arg；
Xaa34为Lys、Glu、Asn、His或Arg；
Xaa35为Gly；
Xaa36为Arg、Gly或Lys；
Xaa37为Gly、Ala、Glu、Pro、Lys，或不存在；
Xaa38为Lys、Ser，或不存在；
Xaa39为Ser、Lys，或不存在；
Xaa40为Gly，或不存在；
Xaa41为Ala，或不存在；
Xaa42为Pro，或不存在；
Xaa43为Pro，或不存在；
Xaa44为Pro，或不存在；
Xaa45为Ser，或不存在；
条件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44或Xaa45不存在，则下游每个氨基酸残基也不存在。
6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述GLP-1类似物的前体分子选自包含以下通式的氨基酸序列的前体分子：
Xaa8-Xaa9-Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45
其中
Xaa8为Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys；
Xaa9为Glu、Asp；
Xaa10为Gly、Ala；
Xaa16为Val或Leu；
Xaa18为Ser、Lys或Arg；
Xaa19为Tyr或Gln；
Xaa20为Leu或Met；
Xaa22为Gly或Glu；
Xaa23为Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa25为Ala或Val；
Xaa26为Lys、Glu或Arg；
Xaa27为Glu或Leu；
Xaa30为Ala、Glu或Arg；
Xaa33为Val、Lys或Arg；
Xaa34为Lys、Glu、Asn、His或Arg；
Xaa35为Gly；
Xaa36为Arg、Gly或Lys；
Xaa37为Gly、Ala、Glu、Pro、Lys，或不存在；
Xaa38为Lys、Ser，或不存在；
Xaa39为Ser、Lys，或不存在；
Xaa40为Gly，或不存在；
Xaa41为Ala，或不存在；
Xaa42为Pro，或不存在；
Xaa43为Pro，或不存在；
Xaa44为Pro，或不存在；
Xaa45为Ser，或不存在；
条件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44或Xaa45不存在，则下游每个氨基酸残基也不存在。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端中的非蛋白氨基酸选自γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-氨基酸例如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺、D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、3-氨基甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、脱-氨基-组氨酸、β-丙氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸、(1-氨基环辛基)甲酸、α-甲基脯氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸和4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-C]吡啶-6-甲酸β-(1,2,4-三唑-1-基)-丙氨酸。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有以下通式
Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10
其中
Xaa7选自L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸和4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-C]吡啶-6-甲酸β-(1,2,4-三唑-1-基)-丙氨酸；
Xaa8选自Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸和α-甲基脯氨酸；
Xaa9选自Glu、Asp、γ,γ-二甲基Glu、β,β-二甲基Glu和β,β-二甲基Asp，和
Xaa10选自Gly、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸和(1-氨基环辛基)甲酸。
9.权利要求1-7中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有以下通式
Xaa7-Xaa8
其中
Xaa7选自L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-C]吡啶-6-甲酸β-(1,2,4-三唑-1-基)-丙氨酸；和
Xaa8选自Gly、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸和α-甲基脯氨酸。
10.权利要求1-7中任一项的方法，其中包含一个非蛋白氨基酸的所述N端氨基酸突出端具有以下通式
Xaa7
其中
Xaa7选自D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸和4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-C]吡啶-6-甲酸β-(1,2,4-三唑-1-基)-丙氨酸。
11.权利要求10的方法，其中所述N端氨基酸突出端是脱氨基-组氨酸，并且偶联反应由4-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基)-乙基]-1H-咪唑-1-盐例如盐三氟乙酸盐与表达的前体分子进行。
12.权利要求1-11中任一项的方法，所述方法还包括用酯化剂使表达的前体分子中的至少一个赖氨酸残基的ε-氨基酰化的步骤，所述酰化剂任选被活化和/或被一个或多个保护基保护。
13.权利要求12的方法，其中所述酰化剂是被任选活化和/或被一个或多个保护基保护的以下通式的羧酸类似物：
A-OH、A-C-D-OH、A-B-C-OH或A-B-C-D-OH，
其中，
A选自：
其中n选自14、15、1617、18和19；p选自10、11、12、13和14，d选自0、1、2、3、4和5；m选自11、12、13、14、15、16、17；k选自0、1、2、3、4、5、11和27，m选自0、1、2、3、4、5和6，R1是普遍接受的保护基，
B选自：
其中x选自0、1、2、3和4；y选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，
C选自：
其中b和e各自独立选自0、1和2，c和f各自独立选自0、1和2，前提条件是当c为0时，b为1或2，或者当c为1或2时，b为0，并且当f为0时，e为1或2，或者当f为1或2时，e为0，
其中，当一个或多个游离羧酸存在时，其任选被普遍接受的保护基保护起来，和
D选自：
其中k选自0、1、2、3、4、5、11和27，m选自0、1、2、3、4、5和6。
14.权利要求13的方法，其中R1选自9H-芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苄基氨基甲酸酯基(Cbz)。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述宿主细胞选自哺乳动物宿主细胞、鸟类宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、细菌宿主细胞、真菌宿主细胞和酵母宿主细胞。
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