JP4537495B2 - インスリン分泌性ペプチドの合成 - Google Patents

Description

本発明は、固相および溶液相プロセスを使用して、インスリン分泌性ペプチド、特にグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、およびその対応物を調製する方法に関するものである。さらに本発明は、この方法に使用することができる中間体ペプチドフラグメントに関するものである。

ペプチド合成のための多数の方法が文献に記載されている（例えば、米国特許第６，０１５，８８１号；Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4005-4008；Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4009-4012；Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526；Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:9307-9320；Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:11065-11133；およびAndersson et al. (2000) Biopolymers 55:227-250を参照されたい。様々な合成法は、合成が行われる相、すなわち液相または固相の物理的状態により区別される。

固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）では、アミノ酸またはペプチド基を固体支持体樹脂に結合させる。次に、関心対象のペプチド物質が形成するまで、支持体に結合したペプチドに連続的にアミノ酸またはペプチド基を結合させる。次に、支持体に結合したペプチドを典型的には支持体から切断し、さらなる加工および／または精製に供する。場合によっては、固相合成は成熟ペプチド産物をもたらし、別の場合では、支持体から切断されたペプチド（すなわち「ペプチド中間体フラグメント」）をさらに大型の成熟ペプチド産物の調製に使用する。

固相プロセスから生成したペプチド中間体フラグメントは、固相合成プロセスまたは液相合成プロセス（本明細書において「溶液相合成」と呼ぶ）で一緒にカップリングさせることができる。固相による有用成熟ペプチドの合成が不可能であり、実際的でもない場合に、溶液相合成は特に有用でありうる。例えば固相合成では、長鎖ペプチドは、まだ固体支持体に結びついている間についには不規則なコンフォメーションをとり、伸長中の鎖に追加のアミノ酸またはペプチド物質を付加することが困難になるおそれがある。ペプチド鎖が支持体樹脂上で長くなるほど、カップリングおよび脱保護などのプロセス段階の効率が下がるおそれがある。次にはこのことが、活性化可能なアミノ酸、共試薬、および溶媒などの出発物質の損失増加に加えて、これらの問題を埋め合わせるための長い加工時間を招くおそれがある。ペプチドの長さが大きくなるほど、これらの問題が増えるおそれがある。

したがって、固相手順のみを使用して単一フラグメントに合成された、３０アミノ酸長を超える成熟ペプチドが見出されることは比較的まれである。代わりに個別のフラグメントを別々に固相上で合成し、次に固相および／または溶液相でカップリングさせ、所望のペプチド産物を構築することができる。このアプローチは、フラグメントの候補を注意深く選択する必要がある。いくつかの一般原理がフラグメント選択の指針となることがあるが、フラグメントの候補を経験的に試験することがかなり頻繁に必要となる。ある状況でうまくいくフラグメント戦略が、他の状況ではうまくいかないおそれがある。妥当なフラグメントの候補が明らかになった場合でさえも、合成戦略が商業的に妥当な条件で機能するためには、プロセス改革がなお必要なことがある。したがって、ハイブリッド型スキームを使用したペプチド合成は大変なことが多く、多くの場合で、実際の合成を行うまでどのような問題が合成スキームに内在するのか予測することは困難である。

溶液相カップリングでは、二つのペプチド中間体フラグメント、または一つのペプチド中間体フラグメントおよび一つの反応性アミノ酸を、適切な溶媒中でカップリングするが、これを通常はカップリング反応の効率および質を促進する追加の試薬の存在下で行う。ペプチド中間体フラグメントは、一つのフラグメントのＮ−末端がもう一つのフラグメントのＣ−末端に、またはその逆にカップリング反応するように準備される。加えて、固相合成時に存在する側鎖保護基は、通常は溶液相カップリング時にフラグメント上に保持され、フラグメントの末端の特異的反応性を確実にする。これらの側鎖保護基は、典型的には成熟ペプチドが形成するまで除去されない。

合成スキーム全体における一つまたは複数の段階のささやかな改善が、成熟ペプチドの調製おける重大な改善になりうる。このような改善は、時間および試薬全体の大規模な節約につながることができ、最終産物の純度および収率を大きく改善することもできる。

ハイブリッド型合成における改善の重要性の考察は、これらの手順を使用して産生した任意の種類のペプチドにあてはめることができるが、治療的に有用なペプチドおよび商業的医学用途のための規模で製造されるペプチドの状況で特に重要である。大型生体分子薬、例えば治療用ペプチドの合成は非常に費用のかかることがある。他の要因に加えて、試薬のコスト、合成時間、多数の合成段階が原因で、これらの大型生体分子薬の合成プロセスのごくわずかな改善が、そのような薬を生産することが経済的に実行可能であるかにまでも重大な影響を及ぼしうる。このような改善が必要であるのは、大型生体分子薬に関するこれらの高い生産コストが原因であり、このことは、多くの場合で、この種の大型生体分子薬の適切な治療代替物がたとえあったとしても少数であるという事実に支援されている。

このことは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）およびその対応物の場合に明らかに分かる。これらのペプチドは、２型インスリン非依存性糖尿病、および肥満などの関連代謝障害の処置のための可能性のある治療薬に関連づけられている。Gutniak, M.K., et al., Diabetes Care 1994:17:1039-44。

Lopezらは、ネイティブなＧＬＰ−１が３７アミノ酸残基長であったと判定した。Lopez, L. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80:5485-5489 (1983)。この決定は、Uttenthal, L. O.ら（J. Clin. Endocrinal. Metabol., 61:472-479 (1985)）の研究により確認された。ネイティブなＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１（１−３７）の表記で表示することができる。この表記は、このペプチドが１（Ｎ−末端）から３７（Ｃ−末端）まで全てのアミノ酸を有することを示す。ネイティブなＧＬＰ−１は、配列番号１：

のアミノ酸配列を有する。

ネイティブなＧＬＰ−１（１−３７）は、広くはインスリンの生合成を仲介することができないが、このペプチドの生物学的に重要なフラグメントが実際にインスリン分泌性を有することが報告された。例えば、ネイティブな３１アミノ酸長ペプチドである配列２：

のＧＬＰ−１（７−３７）は、インスリン分泌性であり、ネイティブなＧＬＰ−１の７（Ｎ末端）から３７（Ｃ末端）位のアミノ酸を有する。ＧＬＰ−１（７−３７）は末端のグリシンを有する。このグリシンが不在の場合に、結果として生じるペプチドは、まだインスリン分泌活性であり、配列番号３：

のＧＬＰ−１（７−３６）と呼ばれる。

ＧＬＰ−１（７−３６）は、アミド化形のＣ−末端アルギニンを有して存在することが多く、この形は、ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ₂の表記で表示することができる。

ＧＬＰ−１（１−３７）は、広くはそのインスリン分泌性活性対応物にｉｎ ｖｉｖｏで変換される。例えば、ＧＬＰ−１（１−３７）は、自然にＧＬＰ−１（７−３７）にｉｎ ｖｉｖｏで変換される。このペプチドは、今度はＣ−末端グリシンのタンパク質分解性除去により追加の加工を受けて、ＧＬＰ−１（７−３６）を産生することもまたあり、このペプチドはアミド化形ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ₂で存在することが多い。したがって、治療処置は、ＧＬＰ−１（１−３７）またはその対応物の投与を伴うことがあり、このとき、そのインスリン分泌活性誘導体がｉｎ ｖｉｖｏ形成することが期待される。しかし通常は、研究中の治療処置は、インスリン分泌活性ＧＬＰ−１フラグメント自体の投与を伴う。

ＵＳ６，８８７，８４９によると、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）およびＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ₂のインスリン分泌活性は、膵β細胞に特異的と思われ、この細胞でこれらのペプチドはインスリン生合成を誘導すると思われる。このことは、これらのペプチドおよびその薬学的に許容される対応物を成人発症糖尿病の病因研究に有用にし、成人発症糖尿病は、インスリン分泌動特性が異常な、高血糖を特徴とする状態である。さらに、これらのグルカゴン様ペプチドは、この疾患の治療および処置に、ならびに高血糖の治療および処置に有用であろう。ＥＰ１１３７６６７Ｂ１によると、これらのペプチドまたはその薬学的に許容される対応物は、他の種類の糖尿病、肥満、グルカゴノーマ、気道分泌障害、代謝障害、関節炎、骨粗しょう症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、うっ血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、高血圧症、および／または食物摂取減少が望まれる障害の治療にもまた有用でありうる。

配列番号１〜３のネイティブなＧＬＰ−１（１−３７）およびそのネイティブなインスリン分泌活性対応物は、代謝的に不安定であり、わずか１〜２分のｉｎ ｖｉｖｏ血漿中半減期を有する。外因性に投与されたＧＬＰ−１もまた急速に分解する。この代謝不安定性は、ネイティブなＧＬＰ−１およびそのネイティブなフラグメントの治療潜在性を制限した。

安定性が向上した、ＧＬＰ−１ペプチドの合成対応物が開発された。例えば、配列番号４のペプチドがＥＰ１１３７６６７Ｂ１に記載されている：

このペプチドは、α−アミノイソ酪酸のアキラル残基（略名Ａｉｂで概略的に示す）が８および３５位に出現し、これらの位置での対応するネイティブなアミノ酸の代わりになる以外は、ネイティブなＧＬＰ−１（７−３６）と同様である。アキラルなα−アミノイソ酪酸は、メチルアラニンとしても知られている。このペプチドは、式（Ａｉｂ^8,35）ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ₂と称することができる。

ＥＰ１１３７６６７は、配列番号４のペプチドおよびその対応物を、固相技法を使用して単一フラグメントとして構築することができると述べている。ＥＰ１１３７６６７により示唆された単一フラグメント合成アプローチは問題がある。一問題点として、このアプローチは、最終的なアミノ酸カップリング、例えば、例として（Ａｉｂ^8,35）ＧＬＰ−１（７−３６）の場合はヒスチジンのカップリングでの高レベルのエピマー化につながるおそれがある。追加的に、クロマトグラフィーで精製する間に不純物を除去することが難しいおそれがあり、収率が低くなりすぎる傾向にある。結果として、商業的に許容される収率、純度、および量で配列番号４のペプチドおよびその対応物を製造できるために、配列番号４のペプチドを合成する改良された戦略が必要である。

これらの心配に加えて、ペプチドの大規模生産についての産物の回収率および産物の純度、ならびに試薬の取扱い、保存および廃棄に関する問題点が、ペプチド合成スキームの実現可能性に大きな影響を及ぼすことがある。したがって、大バッチ量で、収率を改善して、商業的関心がもたれるペプチド物質を効率的に生産することができるペプチド合成プロセスの必要性が引き続きある。

本発明は、インスリン分泌性ペプチドの調製に関するものであり、このペプチドは、固相および溶液相（「ハイブリッド型」）アプローチを使用して合成される。広くは、このアプローチは、固相化学反応を使用して三つの異なるペプチド中間体フラグメントを合成することを含む。次に、溶液相化学反応を使用して、フラグメントの一つに追加のアミノ酸物質を付加する。次に、固相および溶液相中でこれらのフラグメントを一緒にカップリングさせる。フラグメントの一つにシュードプロリン（pseudoproline）を使用することにより、フラグメントの固相合成が容易になり、それに続くこのフラグメントから他のフラグメントへの溶液相カップリングもまた容易になる。本発明は、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１（７−３６）ならびにこれらの天然および非天然対応物などのインスリン分泌性ペプチド、特にＧＬＰ−１（７−３６）、ならびにその天然および非天然対応物を形成させるために非常に有用である。

一局面では、本発明は、以下の段階を含む、インスリン分泌性ペプチドを作製する方法に関するものである：
ａ）アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰（配列番号６）（配列中、Ｘ⁸およびＸ¹⁰はそれぞれアキラルなアミノ酸残基であるか、または前記フラグメントは、Ｘ⁸およびＸ¹⁰残基を含むその対応物であって、Ｈ、Ｅ、Ｘ⁸およびＸ¹⁰はそれぞれ側鎖保護を含んでいてもよい）を含むペプチドフラグメントを調製する段階；および
ｂ）そのペプチドフラグメントをインスリン分泌性ペプチドに組み込む段階。

好ましくは、Ｘ⁸は、メチルアラニン（Ａｉｂ）に対応するアミノ酸残基である。Ｘ¹⁰は、好ましくはグリシンに対応するアミノ酸残基である。

さらなる局面では、本発明は、アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰（配列番号６）（配列中、Ｘ⁸およびＸ¹⁰は、それぞれアキラルなアミノ酸残基であり、Ｈ、Ｅ、Ｘ⁸およびＸ¹⁰はそれぞれ側鎖保護を含んでいてもよい）を有するペプチドフラグメントに関するものである。好ましくは、Ｘ⁸はＡｉｂに対応するアミノ酸残基であり、Ｘ¹⁰はグリシンに対応するアミノ酸残基である。

別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、インスリン分泌性ペプチドを作製する方法に関するものである：
ａ）アミノ酸配列ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号８）（配列中、記号Ｘ^17-18により表される残基はシュードプロリンのジペプチド残基である）を含むペプチドフラグメントまたはその対応物を調製する段階；および
ｂ）このペプチドフラグメントをインスリン分泌性ペプチドに組み込む段階。

別の局面では、本発明は、アミノ酸配列ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号８）（配列中、記号Ｘ^17-18で表す残基はシュードプロリンのジペプチド残基であり、前記アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含むペプチドまたはその対応物に関するものである。

さらなる局面では、本発明は、以下の段階を含む、請求項１記載のインスリン分泌性ペプチドを作製する方法に関するものである：
ａ）アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰（配列番号６）（配列中、Ｘ⁸およびＸ¹⁰は、それぞれアキラルなアミノ酸残基であり、ＨおよびＥのそれぞれは側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第１のペプチドフラグメントを、アミノ酸配列ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号８）（配列中、記号Ｘ^17-18で表す残基は、シュードプロリンのジペプチド残基であり、この配列の前記アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第２のペプチドフラグメントとカップリングさせて、アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号１１）（この配列の前記アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第３のペプチドフラグメントを提供する段階；および
ｂ）このペプチドフラグメントをインスリン分泌性ペプチドに組み込む段階。

別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、インスリン分泌性ペプチドを作製する方法に関するものである：
ａ）アミノ酸配列ＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵（配列番号９）（配列中、Ｘ³⁵はアキラルなアミノ酸残基であり、この配列の前記残基は、側鎖保護を含んでいてもよい）を含む、ペプチドフラグメントまたはその対応物を調製する段階；および
ｂ）このフラグメントをインスリン分泌性ペプチドに組み込む段階。

別の局面では、本発明は、以下の段階のうち一つまたは複数を含む、インスリン分泌性ペプチドを作製する方法に関するものである：
ａ）アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰（配列番号６）（配列中、Ｘ⁸およびＸ¹⁰は、それぞれアキラルなアミノ酸残基であり、ＨおよびＥはそれぞれ側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第１のペプチドフラグメントを提供する段階；
ｂ）アミノ酸配列ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号８）（配列中、記号Ｘ^17-18で表す残基は、シュードプロリンのジペプチド残基であり、この配列の前記アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第２のペプチドフラグメントを提供する段階；
ｃ）第１のフラグメントを第２のフラグメントとカップリングさせて、アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号１１）（この配列の前記アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第３のペプチドフラグメントを提供する段階；
ｄ）アミノ酸配列ＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵（配列番号９）（配列中、Ｘ³⁵はアキラルなアミノ酸残基であり、この配列の前記アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第４のペプチドフラグメントを提供する段階；
ｅ）アミノ酸配列ＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号１２）（この配列の前記残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のフラグメントをアルギニンとカップリングさせる段階；および
ｆ）アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号１３）（この配列の前記残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含むインスリン分泌性ペプチドを提供するために、第５のフラグメントを第３のフラグメントとカップリングさせる段階。

好ましくは、本発明は、以下の段階を含む、インスリン分泌性ペプチドを作製する方法に関するものである：
ａ）アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰（配列番号６）（配列中、Ｘ⁸およびＸ¹⁰はそれぞれアキラルなアミノ酸残基であり、ＨおよびＥはそれぞれ側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第１のペプチドフラグメントを提供する段階；
ｂ）アミノ酸配列ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号８）（配列中、記号Ｘ^17-18で表す残基は、シュードプロリンのジペプチド残基であり、この配列の前記アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第２のペプチドフラグメントを提供する段階；
ｃ）第１のフラグメントを第２のフラグメントとカップリングさせて、アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号１１）（この配列の前記アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第３のペプチドフラグメントを提供する段階；
ｄ）アミノ酸配列ＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵（配列番号９）（配列中、Ｘ³⁵はアキラルなアミノ酸残基であり、この配列の前記アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第４のペプチドフラグメントを提供する段階；
ｅ）アミノ酸配列ＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号１２）（この配列の前記残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントをアルギニンとカップリングさせる段階；および
ｆ）アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号１３）（この配列の前記アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含むインスリン分泌性ペプチドを提供するために、第５のフラグメントを第３のフラグメントとカップリングさせる段階。

別の局面では、本発明は、以下のさらなる段階を含む、本明細書前記の方法に関するものである：
ｇ）アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号５）およびその対応物（配列中、位置８、１０および３５の記号Ｘは、それぞれ独立してアキラルな、立体障害を受けていてもよいアミノ酸残基を表す）を含むインスリン分泌性ペプチドを提供するために、側鎖保護基を除去する段階。

側鎖保護基を除去する段階は、少なくとも一つの酸分解性試薬および少なくとも一つのカチオンスカベンジャーを含む脱保護溶液を採用することによって好ましくは実施される。全体的な脱保護のための酸分解試薬は、好ましくはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＨＣｌ、ＢＦ₃Ｅｔ₂ＯまたはＭｅ₃ＳｉＢｒなどのルイス酸、液体フッ化水素酸（ＨＦ）、臭化水素（ＨＢｒ）、トリフルオロメタンスルホン酸、およびその組み合わせからなる群より好ましくは選択される。適切なカチオンスカベンジャーは、好ましくはジチオスレイトール（ＤＴＴ）、アニソール、ｐ−クレゾール、エタンジチオールおよびジメチルスルフィドより選択される。脱保護溶液は水を含むこともまたある。

別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、インスリン分泌性ペプチドを作製する方法に関するものである：
ａ）アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰（配列番号６）（配列中、Ｘ⁸およびＸ¹⁰はそれぞれアキラルなアミノ酸残基であり、Ｈ、Ｅ、Ｘ⁸およびＸ¹⁰はそれぞれ側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第１のペプチドフラグメントを提供する段階；
ｂ）アミノ酸配列ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号８）（配列中、記号Ｘ^17-18で表す残基は、シュードプロリンのジペプチド残基であり、この配列の前記アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第２のペプチドフラグメントを提供する段階；
ｃ）第１のフラグメントを第２のフラグメントとカップリングさせて、アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号１１）（この配列の前記アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第３のペプチドフラグメントを提供する段階；
ｄ）アミノ酸配列ＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵（配列番号９）（配列中、Ｘ³⁵はアキラルなアミノ酸残基であり、この配列の前記アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第４のペプチドフラグメントを提供する段階；
ｅ）アミノ酸配列ＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号１２）（この配列の前記アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントをアルギニンとカップリングさせる段階；および
ｆ）式（配列番号５）ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒおよびその対応物のインスリン分泌性ペプチド（配列中、位置８、１０および３５の記号Ｘは、それぞれ独立してアキラルな、立体障害を受けていてもよいアミノ酸残基を表し、これらのアミノ酸残基のうち一つまたは複数は側鎖保護を含んでいてもよい）を提供するために、第５のフラグメントを第３のフラグメントとカップリングさせる段階。

本発明による合成スキームの概略図である。

フラグメント１２は、アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰（配列番号６）を含むペプチドフラグメントである。フラグメント１４は、アミノ酸配列Ｔ¹¹ＦＴＳＤ¹⁵ＶＸ^17-18ＹＬ²⁰ＥＧ（配列番号８）を含むペプチドフラグメントである。フラグメント１６は、アミノ酸配列Ｑ²³ＡＡ²⁵ＫＥＦＩＡ³⁰ＷＬＶＫＸ³⁵（配列番号９）を含むペプチドフラグメントである。中間体フラグメント１８は、アミノ酸配列Ｈ⁷Ｘ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤ¹⁵ＶＸ^17-18ＹＬ²⁰ＥＧ（配列番号１１）を含むペプチドフラグメントである。中間体ペプチドフラグメント２０は、アミノ酸配列Ｑ²³ＡＡ²⁵ＫＥＦＩＡ³⁰ＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号１２）を含むペプチドである。産物１１は、所望の保護されたペプチドＨ⁷Ｘ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤ¹⁵ＶＸ^17-18ＹＬ²⁰ＥＧＱＡＡ²⁵ＫＥＦＩＡ³⁰ＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号１３）（配列中、１７および１８位のＳｅｒ−Ｓｅｒは、まだ保護されているシュードプロリンの形である）である。この概略図を以下にさらに詳細に説明する。

下に説明する本発明の態様は、網羅的であることを意図せず、以下の詳細な説明に開示される厳密な形に本発明を限定することも意図しない。それどころか、これらの態様は、他の当業者が本発明の原理および実施を解釈および理解できるように選択および説明されるものである。

本発明は、固相および／または溶液相技法を使用して、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ならびにその天然および非天然インスリン分泌活性対応物などのペプチドを作製するための合成法を対象とする。本発明のペプチド分子は、保護されていてもよいし、保護されていなくてもよいし、部分的に保護されていてもよい。保護には、Ｎ−末端保護、側鎖保護、および／またはＣ−末端保護を挙げることができる。本発明は、広くはこれらのグルカゴン様ペプチド、その対応物、フラグメントおよびその対応物、ならびにこれらの融合産物およびその対応物の合成を対象とするが、本明細書における発明の教示は、他のペプチドの合成に、特に固相および溶液相アプローチの組み合わせを使用して合成されるペプチド合成にもまた適用することができる。本発明は、不純物、特にピログルタミン酸不純物と関係するペプチド中間体フラグメントの合成にもまた適用することができる。本発明の実施に有用な好ましいＧＬＰ−１分子には、天然および非天然ＧＬＰ−１（７−３６）ならびにその対応物が含まれる。

本明細書に使用する用語「アミノ酸配列を含む」は、好ましくは「アミノ酸配列を有する」ことを意味する。

本明細書に使用する「対応物」は、ペプチドの天然および非天然アナログ、誘導体、融合化合物、塩などを表す。本明細書に使用するペプチドアナログは、広くは別のペプチドまたはペプチド対応物に対する一つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、逆位および／または付加などにより改変されたアミノ酸配列を有するペプチドを表す。置換には、一つまたは複数の天然または非天然アミノ酸が関与することがある。置換は、好ましくは保存的または高度に保存的でありうる。保存的置換は、あるアミノ酸から、広くは同じ実効電荷ならびに同じサイズおよび形状を有する別のアミノ酸への置換を表す。例えば、脂肪族の、または置換された脂肪族のアミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、これらの側鎖における炭素とヘテロ原子の合計数の差が約４を超えないならば、およそ同じサイズを有する。これらの側鎖における分岐数の差が約１または２を超えないならば、これらはおよそ同じ形状をもつ。側鎖にフェニルまたは置換フェニル基を有するアミノ酸は、およそ同じサイズおよび形状を有するとみなされる。下に挙げるのは、５群のアミノ酸である。化合物中のアミノ酸を同一群の別のアミノ酸に交換すると、広くは保存的置換が生じる。

群Ｉ：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニンおよびＣ₁−Ｃ₄脂肪族またはＣ₁−Ｃ₄ヒドロキシ置換脂肪族の側鎖（直鎖または一分岐）を有する非天然アミノ酸。
群ＩＩ：グルタミン酸、アスパラギン酸、およびカルボン酸置換Ｃ₁−Ｃ₄脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を有する非天然アミノ酸。
群ＩＩＩ：リシン、オルニチン、アルギニン、およびアミンまたはグアニジノ置換Ｃ₁−Ｃ₄脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を有する非天然アミノ酸。
群ＩＶ：グルタミン、アスパラギン、およびアミド置換Ｃ₁−Ｃ₄脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を有する非天然アミノ酸。
群Ｖ：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシンおよびトリプトファン。

本明細書に使用する用語「対応物」は、さらに好ましくはペプチドの塩またはＣ−末端でアミド化されたその誘導体を表す。

「高度保存的置換」は、あるアミノ酸から、側鎖に同じ官能基を有し、ほぼ同じサイズおよび形状を有する別のアミノ酸への交換である。脂肪族または置換された脂肪族のアミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、これらの側鎖における炭素とヘテロ原子との合計数の差が２を超えない場合に、ほぼ同じサイズを有する。これらが側鎖に同数の分岐を有する場合に、これらはほぼ同じ形状を有する。高度保存的置換の例には、バリン対ロイシン、トレオニン対セリン、アスパラギン酸対グルタミン酸、およびフェニルグリシン対フェニルアラニンが挙げられる。

「ペプチド誘導体」は、広くはペプチド、ペプチドアナログ、または一つもしくは複数のその側鎖、α−炭素原子、末端アミノ基、および／もしくは末端カルボン酸基の化学的改変を有する他のペプチド対応物を表す。例として、化学的改変には、化学的部分の付加、新しい結合の創出、および／または化学的部分の除去が挙げられるが、それに限定されるわけではない。アミノ酸側基での改変には、リシンｅ−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン、またはリシンのＮ−アルキル化、グルタミン酸またはアスパラギン酸のカルボン酸基のアルキル化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミドが挙げられるが、それに限定されるわけではない。末端アミノ基の改変には、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル、およびＮ−アシル（例えば−ＣＯ−低級アルキル）改変が挙げられるが、それに限定されるわけではない。末端カルボキシ基の改変には、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステル改変が挙げられるが、それに限定されるわけではない。好ましい誘導体は、末端カルボキシ基でアミド化されている誘導体、例えばペプチドのアミド、低級アルキルアミド、またはジアルキルアミドである。したがって、部分的に、または完全に保護されたペプチドがペプチド誘導体を構成する。

本発明の実施において、ある化合物がインスリンホルモンの合成または発現を刺激するか、またはその刺激を引き起こすか、またはその刺激を引き起こすことを助けることができるならば、その化合物は「インスリン分泌」活性を有する。好ましい実施形態では、インスリン分泌活性は、米国特許第６，８８７，８４９号および第６，７０３，３６５号に記載されたアッセイにより実証することができる。

好ましい態様では、本発明は、以下の式（配列番号５）を有する合成（Ｘ⁸，Ｘ¹⁰，Ｘ³⁵）ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチド：

およびその対応物（配列中、位置８、１０、および３５の記号Ｘは、それぞれ独立してアキラルな、立体障害を受けていてもよいアミノ酸残基を表す）を合成するための方法を提供する。Ｘ⁸、Ｘ¹⁰、および／またはＸ³⁵残基の任意のものは、側鎖保護基を含んでいてもよい。この式のペプチドは、少なくともアキラルな、立体障害を受けていてもよいＸ⁸およびＸ³⁵残基が位置８および３５でネイティブなアミノ酸残基から置換されている点で、ネイティブなＧＬＰ−１（７−３６）と異なる。Ｘ¹⁰残基は、ネイティブな、アキラルなグリシンまたは別のアキラルなアミノ酸に由来することがある。アキラルなＸ⁸、Ｘ¹⁰、およびＸ³⁵アミノ酸の使用は、結果として生じるペプチドの安定化を助けるだけでなく、基本成分としてのこれらのアミノ酸の使用が、図１に示され、下にさらに説明される本発明の容易な合成経路もまた容易にすることもまた見出された。

本発明の原理により合成することのできる（Ｘ⁸，Ｘ¹⁰，Ｘ³⁵）ＧＬＰ−１１（７−３６）ペプチドの特に好ましい態様には、式（配列番号４）のペプチド：

およびその対応物が含まれ、この対応物は、好ましくはＣ−末端でアミド化されている。このペプチドは、Ｘ⁸およびＸ³⁵の両方としてアキラルなα−アミノイソ酪酸残基（すなわち略名Ａｉｂで概略的に示すメチルアラニン）を使用し、好ましくはＣ−末端にアミドを有し、１０位にネイティブなＧ残基を使用し、かつ式（Ａｉｂ^8,35）ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ₂と称することができる。この表示は、アミノ酸「Ａｉｂ」に対応するアミノ酸残基がネイティブなアラニンの代わりに８および３５位に出現することを示す。アキラルなα−アミノイソ酪酸は、メチルアラニンとしてもまた知られている。配列番号４のペプチドは、ＥＰ１１３７６６７Ｂ１に記載されている。８および３５位にＡｉｂ残基が存在することは、体内での代謝分解を減速させ、ネイティブなＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドよりもこのペプチドを体内でずっと安定にする。

本発明は、（Ａｉｂ^8,35）ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ₂などのＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドを作製するための改良法を提供する。例として、図１は、ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドおよびその対応物を合成するための例示的な一スキーム１０を概略的に示す。図１のスキーム１０は、ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドのスケールアップ合成に特に適すると考えられる。スケールアップの手順は、典型的には商業的流通に有用な量のペプチドを提供するために行われる。例えば、スケールアップ手順におけるペプチドの量は、一バッチについて５００ｇまたは１kgのことがあり、さらに典型的には一バッチについて数１０kg〜数１００kg以上のことがある。好ましい態様では、本発明の方法は、加工（合成）時間の短縮、産物の収率の改善、産物の純度の改善、ならびに／または必要な試薬および出発物質の量の減少などの改善を提供することができる。

図１に示す合成スキーム１０は、固相および溶液相技法の組み合わせを使用して、ペプチド産物１１を調製する。

図１に示すように、スキーム１０は、固相上でペプチド中間体フラグメント１２、１４、および１６を合成することを伴う。フラグメント１２は、配列番号６のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメント：

（配列中、Ｘ⁸およびＸ¹⁰は上記の通りである）またはＸ⁸およびＸ¹⁰残基を含むその対応物である。一つまたは複数のアミノ酸残基は、従来の常法通りの側鎖保護基を含んでいてもよい。いくつかの態様では、ペプチドフラグメント１２は、Ｃ−末端により樹脂に結合していてもよい。このフラグメントは、Ｎ−末端および／またはＣ−末端保護基を有してもよい。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成に関して特に有用なＮ−末端保護基であることが見出された。

フラグメント１２は、ネイティブなＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの７〜１０位のアミノ酸に対応する４個のアミノ酸残基を含み、したがって、表記（Ｘ⁸，Ｘ¹⁰）ＧＬＰ−１（７−１０）で表すことができる。好ましい態様では、配列番号７：

のＸ⁸はＡｉｂであり、Ｘ¹⁰はグリシンであるか、または１０位にＡｉｂ残基を含むその対応物である。配列番号７のペプチドフラグメントを、表記（Ａｉｂ⁸）ＧＬＰ−１（７−１０）で表示し、ネイティブなＧＬＰ−１（７−１０）の８位のネイティブなアラニンからＡｉｂへの置換を述べることができる。

固相合成は、広くはフラグメント１２のＣ−末端からＮ−末端方向で実施される。したがって、フラグメントのＣ−末端部に存在するＸ¹⁰アミノ酸は、固相樹脂支持体とカップリングする最初のアミノ酸残基である。次に、所望の配列に対応するようにアミノ酸残基を連続的に付加することによって固相合成は進行する。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ−末端残基（例えばＮ−末端ヒスチジン残基（Ｈ）が新生ペプチド鎖に付加された後に完了する。

配列番号６：および７のペプチドフラグメントの選択および使用は、スキーム１０に重大な長所を提供する。まず第一に、Ｈは、少なくとも一部はエピマー化の問題が原因で、伸長中のペプチド鎖に付加することが困難なアミノ酸残基になりがちである。しかし、フラグメント１２は、これらの心配を大部分軽減するに足るほど小さい。そのうえ、フラグメント１２は、二つのキラル中心を有するに足るほど長い。したがって、単純な結晶化によりフラグメントを精製することができる。フラグメント１２がＡｉｂで終止するならば、このフラグメントはキラル中心を一つだけ有し、その結果としてラセミ体を精製することがより困難であろう。アキラルなＧをＣ−末端に位置させてもまた、ラセミ化する心配が回避されるが、そうでなくてもフラグメント１２のＣ−末端をキラルＥで終止しようとするとラセミ化する心配がありうる。要約すれば、ペプチド基本成分としてフラグメント１２を選択することは、このフラグメントを構築し、それを精製し、かつそれを他のペプチド物質とカップリングさせることをさらに容易にする。フラグメントの選択もまた、Ｈの低ラセミ化を享受する。驚くことに、Ｈは、いくつかの実施形態で非常に低レベルの、例えば約３重量％のエピマー化でこのフラグメントに付加される。

フラグメント１４は、配列番号８：

（配列中、記号Ｘ^17-18で表す残基は、下にさらに定義するシュードプロリンのジペプチド残基であるか、または１７および１８位にＸ^17-18を含むその対応物である）に記載のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントである。フラグメント１４は、広くはネイティブなＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの１１〜２２位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含むが、例外として、シュードプロリンジペプチド残基Ｘ^17-18は、対応するネイティブなＧＬＰ−１（７−３６）の１７および１８位を占有するＳＳ（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）残基の代わりに使用される。

フラグメント１４の一つまたは複数のアミノ酸残基は、従来の実施による側鎖保護基を含むことがある。いくつかの態様では、ペプチドフラグメント１４は、Ｃ−末端を介して結合した樹脂であってもよい。このフラグメントは、Ｎ−末端および／またはＣ−末端保護基を有していてもよい。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成に関して特に有用なＮ−末端保護基であることが見出された。配列番号８のペプチドフラグメントは、１７および１８位のＳｅｒ−Ｓｅｒ残基からＸ^17-18シュードプロリン残基への置換を述べるために、表記（Ｘ^17-18）ＧＬＰ−１（１１−２２）で表すことができる。

本発明の実施に使用する用語シュードプロリンは、ＳｅｒまたはＴｈｒなどのヒドロキシル官能アミノ酸残基を含むジペプチドを表し、このジペプチドでは、ヒドロキシ官能側鎖は、α−アミノと側鎖ヒドロキシルとの間の、プロリン様の、ＴＦＡ不安定なオキサゾリジン環として保護されている。オキサゾリジン環の結果として、ジペプチドは可逆的プロリン模倣体として機能する。

一般的には、ペプチドに組み込まれる典型的なシュードプロリン残基は、式

で表示することができ、式中、Φは、任意のアミノ酸残基を表示し、Ｒ¹およびＲ²は、それぞれ独立して適切な二価連結部分である。頻繁に、Ｒ¹は、式

の二価部分であり、式中、Ｒ³よびＲ⁴は、それぞれ独立してＨなどの一価部分またはメチルなどの低級アルキルである。Ｒ³およびＲ⁴は、環構造の共同メンバーのこともまたある。望ましくは、Ｒ³およびＲ⁴はそれぞれメチルである。オキサゾリジン環で保護されたＳｅｒの場合に、Ｒ²は二価部分ＣＨ₂であるが、一方で、Ｔｈｒの場合は、Ｒ²は二価部分（ＣＨ₃）ＣＨである。

用語「低級アルキル」は、炭素原子１〜６個、好ましくは炭素原子１〜４個の分岐または直鎖一価アルキル基を表す。この用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、２−エチルブチルなどの基によってさらに例示される。好ましい低級アルキル残基は、メチルおよびエチルであり、メチルが特に好ましい。

脱保護の間に、Ｒ¹部分は切断されて、以下の式：

（式中、ΦおよびＲ²は上に定義する通りである）のジペプチド残基を提供する。フラグメント１４に適用されるシュードプロリン残基は、好ましくはＳｅｒ−Ｓｅｒ残基に対応し、ここで、Ｃ−末端に近い方のＳｅｒはオキサゾリジン環で保護されており、以下の構造を有する：

Ｎ−末端に近い方のＳｅｒであるヒドロキシを有する側鎖は、ｔ−Ｂｕ保護基などにより保護されている。保護性オキサゾリジン環構造およびｔ−Ｂｕが切断されると、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ残基が生じる。

フラグメント１４の合成における基本成分としてこのようなプロリン模倣体を使用することは、本発明の状況で重大な利点を提供する。第１には、フラグメント１４の固相合成が非常に容易になる。シュードプロリンがフラグメント１４の固相合成の過程で使用されない場合に、１３〜１１の残基からＦｍｏｃを除去するときに大きな問題が起こることがある。この困難さはβシート形成が原因のおそれがあると考えられている。シュードプロリンの使用は、βシートの形成度を低下させることによりＦｍｏｃの除去をずっと簡単にすると考えられている。第２に、それに続く下記のフラグメント１４からフラグメント１２への、フラグメント１８を形成する固相カップリングが大いに容易になる。シュードプロリン残基の不在下で、典型的な溶液相カップリング溶媒へのフラグメント１８の溶解度は非常に低い。シュードプロリンは、フラグメント１８の溶解度特性を高め、このフラグメントを伴うフラグメント２０への溶液相カップリングを容易にする（下記図１の考察を参照されたい）。

固相合成は、一般的にはフラグメント１４のＣ−末端からＮ−末端方向に実施される。したがって、フラグメントのＣ−末端部分に存在するＧアミノ酸は、固相樹脂支持体とカップリングする最初のアミノ酸残基である。次に、固相合成は、所望の配列に対応するようにアミノ酸残基を連続的に付加することにより進行する。しかし、ＧＬＰ−１（７−３６）の１７および１８位にネイティブなＳｅｒ残基対を連続的に付加する代わりに、Ｘ^17-18シュードプロリンジペプチドが１７および１８位に対応する位置で伸長中の鎖に付加される。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ−末端残基（例えば、Ｎ−末端トレオニン残基（Ｔ）が新生ペプチド鎖に付加された後に完了する。

フラグメント１６は、配列番号９：

（配列中、Ｘ³⁵は上に定義する通りであるか、またはＸ³⁵残基を含むその対応物である）のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントまたはその対応物である。一つまたは複数のアミノ酸残基は、従来の実施による側鎖保護基を含むことがある。フラグメント１６は、ネイティブなＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの２３〜３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸残基を含むが、例外として３５位のネイティブなアミノ酸の代わりに、その位置にＸ³⁵がある。フラグメント１６は、表記（Ｘ³⁵）ＧＬＰ−１（２３−３５）で表示することができる。

いくつかの態様では、ペプチドフラグメント１６は、Ｃ−末端を介して樹脂に結合していてもよい。このフラグメントは、側鎖、Ｎ−末端および／またはＣ−末端に保護基を有していてもよい。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成に関して特に有用なＮ−末端保護基であることが見出された。

好ましい態様では、Ｘ³⁵は、配列番号１０：

のＡｉｂまたは３５位にＡｉｂを含むその対応物である。配列番号１０のペプチドフラグメントは、表記（Ａｉｂ³⁵）ＧＬＰ−１（２３−３５）で表示され、ネイティブなＧＬＰ−１（７−３６）の３５位のネイティブなアミノ酸からＡｉｂへの置換を述べることができる。

配列番号９および１０のフラグメント１６が、Ｃ末端の３６位にＲ（ａｒｇ）残基をまだ含まないことに注意されたい。Ａｒｇは、好ましくは側鎖保護を有さないＡｒｇを使用して、続いて溶液相中のフラグメント１６のＣ−末端とカップリングする。この戦略は、図１のスキーム１０に大きな利点を提供し、それは、この戦略が、保護されたＡｒｇを使用する結果生じがちな望まれない副反応を回避するからである。例えば、保護されたＡｒｇを脱保護する際に、脱保護の副産物がこのペプチドの他の構成要素、例えばトリプトファンと反応しがちなことがある。これは、精製のために利用できる未精製品中の所望のペプチドの量を低下させる。

固相合成は、一般的にはフラグメント１６のＣ−末端からＮ−末端方向に実施される。したがって、このフラグメントのＣ−末端部分に存在するＸ³⁵アミノ酸は、固相樹脂支持体とカップリングする最初のアミノ酸残基である。次に、固相合成は、所望の配列に対応するようにアミノ酸残基を連続的に付加することにより進行する。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ−末端残基（例えばＮ−末端グルタミン残基（Ｑ）が新生ペプチド鎖に付加された後で完了する。フラグメント１６の合成に使用される任意のアミノ酸は、従来の常法による側鎖保護を含むことがある。

Ｘ³⁵をロードされた支持体樹脂近傍の立体障害が原因で、伸長中のペプチド鎖へのリシン（３４）およびバリン（３３）のカップリングが、問題となるおそれがある。過剰のアミノ酸を用いてさえも、これらのカップリング反応を強制的に完了させることは困難である。溶媒の選択および／または末端キャッピングは、この問題の軽減を助けることができる。カップリング溶媒の性質は、カップリングが完了に進む度合いに影響を及ぼすことができることが見出された。例えば一セットの実験では、３：１ ＮＭＰ／ＤＣＭ、１：１ ＮＭＰ／ＤＣＭ、１：１ ＤＭＦ／ＤＣＭ、および３：１ ＤＭＦ／ＤＣＭ中でカップリング反応を実施した。これらの溶媒を組み合わせる比は、体積に基づく。ＮＭＰはＮ−メチルピロリドンを表し、ＤＣＭはジクロロメタンを表し、ＤＭＦはジメチルホルムアミドを表す。１：１ ＤＭＦ／ＤＣＭを使用した場合に、カップリング反応が完了までさらに進行することが見出された。

リシンおよびバリンカップリングのそれぞれの後に末端キャッピングもまた使用して、樹脂に支持された未反応の物質がさらなるカップリング反応を続行することを防止することができる。所望により精製する間に、末端キャッピングされた物質の方が容易に除去される。従来の末端キャッピング技法を使用することができる。

図１の参照を続けて、Ａｒｇに加えてフラグメント１２、１４、および１６を集合させて所望のペプチド１１を完成する。これを達成するために、フラグメント１２を固相上でフラグメント１４に付加し、配列番号１１：

（配列中、Ｘ⁸、Ｘ¹⁰、およびＸ^17-18は上に定義する通りである）のアミノ酸残基を組み込んださらに大型の中間体フラグメント１８を産生する。好ましい態様では、上に定義する通り、Ｘ⁸はＡｉｂであり、Ｘ¹⁰はネイティブなＧであり、Ｘ^17-18はシュードプロリンジペプチド残基である。この中間体ペプチドフラグメントは、表記（Ｘ⁸，Ｘ¹⁰，Ｘ^17-18）ＧＬＰ−１（７−２２）で表示することができる。

図１に、Ａｒｇを溶液相でフラグメント１６のＣ−末端に付加し、配列番号１２：

（配列中、Ｘ³⁵は上に定義する通りであり、好ましくはＡｉｂである）のアミノ酸残基を組み込んださらに大型の中間体ペプチドフラグメント２０を回収することをさらに示す。好ましくは、このようにペプチドフラグメントに付加されたＡｒｇは側鎖保護を含まない。この中間体ペプチドフラグメント２０は、表記（Ｘ³⁵）ＧＬＰ−１（２３−３６）で表示することができる。次に、ペプチドフラグメント１８および２０を、溶液相中でカップリングし、配列番号１３の所望の保護されたペプチド１１を回収するが、この配列で、１７および１８位のＳｅｒ−Ｓｅｒは、まだ保護されたシュードプロリン形である：

ペプチド１１は、表記（Ｘ⁸，Ｘ¹⁰，Ｘ^17-18，Ｘ³⁵）ＧＬＰ−１（７−３６）と称することができる。他のアミノ酸が側鎖保護を有する限りにおいて、この保護を望ましくはこの段階の間に維持する。

図１の反応スキームを実施するときに、固相および溶液相合成は、当産業界で公知の標準法により実施することができる。代表的な実施形態では、アミノ酸をＣ−末端からＮ−末端に付加する化学反応を使用して、ペプチドを固相中で合成する。したがって、特定のフラグメントのＣ−末端に隣接するアミノ酸またはペプチド基を、最初に樹脂に付加する。これは、アミノ酸またはペプチド基のＣ−末端官能基を樹脂支持体上の相補的官能基と反応させることによって起こる。アミノ酸またはペプチド基のＮ−末端側は、望まれない副反応を防止するためにマスクされる。アミノ酸またはペプチド基は、望ましくは側鎖保護もまた同様に含む。次に、関心対象のペプチドが形成するまで、アミノ酸またはペプチド基を、支持体に結合したペプチド物質に連続的に結合させる。これらの大部分は、従来の常法による側鎖保護もまた含む。各連続カップリングを行いながら、樹脂に結合したペプチド物質のＮ−末端のマスキング基を除去する。次に、Ｎ−末端がマスクされた次のアミノ酸のＣ−末端とこれを反応させる。したがって、固相合成の産物は、樹脂支持体に結合したペプチドである。

固相ペプチド合成の実施に適した任意の種類の支持体を使用することができる。好ましい態様では、支持体は、ポリアミド、ポリスルファミド、置換ポリエチレン、ポリエチレングリコール、フェノール樹脂、多糖、またはポリスチレンなどの一つまたは複数のポリマー、コポリマー、またはポリマーの組み合わせから作製されうる樹脂を含む。ポリマー支持体は、ペプチド合成に使用される溶媒に十分に不溶性で不活性な任意の固体でありうる。固体支持体は、典型的には合成の間に伸長中のペプチドをカップリングし、所望の条件で切断し、支持体からペプチドを放出することができる連結部分を含む。適切な固体支持体は、光切断可能、ＴＦＡ切断可能、ＨＦ切断可能、フッ素イオン切断可能、還元的切断可能、Ｐｄ（Ｏ）切断可能、求核的切断可能、またはラジカル切断可能なリンカーを有することがある。好ましい連結部分は、切断されたペプチドの側鎖基がまだ実質的に全体的に保護されている条件で切断可能である。

合成の好ましい一方法では、ペプチド中間体フラグメントは、トリチル基を含む酸感受性固体支持体上で、さらに好ましくはペンダント塩素基を有するトリチル基を含む樹脂上で、例えば２−クロロトリチルクロリド（２−ＣＴＣ）樹脂上で合成される（Barlos et al. (1989) Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946）。例には、トリチルクロリド樹脂、４−メチルトリチルクロリド樹脂、４−メトキシトリチルクロリド樹脂、４−アミノブタン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、４−アミノメチルベンゾイル２−クロロトリチル樹脂、３−アミノプロパン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、ブロモ酢酸２−クロロトリチル樹脂、シアノ酢酸２−クロロトリチル樹脂、４−シアノ安息香酸２−クロロトリチル樹脂、グリシノール（glicinol）２−クロロトリチル樹脂、プロピオン酸（propionic）２−クロロトリチル樹脂、エチレングリコール２−クロロトリチル樹脂、Ｎ−Ｆｍｏｃヒドロキシルアミン２−クロロトリチル樹脂、ヒドラジン２−クロロトリチル樹脂もまた挙げられる。いくつかの好ましい固体支持体にはポリスチレンが挙げられ、これは、ジビニルベンゼンと共にコポリマー化して、反応基がアンカーされた支持体物質を形成させることができる。

固相合成に使用されている他の樹脂には、スチレンとジビニルベンゼンとのコポリマーで、４−ヒドロキシメチルフェニル−オキシメチルアンカー基を有するものを含む「Wang」樹脂（Wang, S.S. 1973, J. Am. Chem. Soc.）および４−ヒドロキシ−メチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂（Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters 35(27):4705-4706）が挙げられる。Wang、２−クロロトリチルクロリド、および４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂は、例えばCalbiochem-Novabiochem Corp.（San Diego, California）から購入することができる。

固相合成のための樹脂を調製するために、樹脂は、適切な溶媒中で予備洗浄することができる。例えば、２−ＣＴＣ樹脂などの固相樹脂をペプチドチャンバーに加え、適切な溶媒で予備洗浄する。予備洗浄した溶媒は、カップリング反応に使用される溶媒（または混合溶媒）の種類に基づき、またはその逆で選択することができる。洗浄およびその後のカップリング反応にも適する溶媒には、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジクロロエタン（ＤＣＥ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）など、およびこれらの試薬の混合物が挙げられる。他の有用な溶媒には、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、およびその混合物が挙げられる。場合によっては、カップリングは、二成分溶媒系中で、例えば９：１〜１：９、さらに通例には４：１〜１：４の範囲の体積比のＤＭＦおよびＤＣＭの混液中で行うことができる。

本発明の合成は、特に述べない限り、好ましくは適切な保護基の存在下で実施される。保護基の性質および使用は、当技術分野で周知である。広くは、適切な保護基は、加工および合成の間にそれが結びつく原子または部分が、例えば酸素または窒素が、望まれない反応に関与することを防止することを助けることができる任意の種類の基である。保護基には、側鎖保護基およびアミノ−またはＮ−末端保護基が挙げられる。保護基は、カルボン酸、チオールなどの反応または結合を防止することもまたできる。

側鎖保護基は、側鎖の一部がペプチド合成、加工などの段階に使用される化学物質と反応することを防止することを助ける、アミノ酸側鎖（すなわちアミノ酸一般式Ｈ₂Ｎ−Ｃ（Ｒ）（Ｈ）−ＣＯＯＨのＲ基）とカップリングした化学的部分を表す。側鎖−保護基の選択は、様々な要因、例えば行う合成、ペプチドが供される加工、および所望の中間体産物または最終産物の種類に依存することがある。側鎖保護基の性質は、アミノ酸自体の性質にもまた依存する。広くは、固相合成の間にα−アミノ基を脱保護するときに除去されない側鎖保護基が選択される。したがって、α−アミノ保護基および側鎖保護基は、典型的には同じではない。

場合によっては、そして固相合成および他のペプチド加工に使用される試薬の種類に応じて、アミノ酸は、側鎖保護基の存在を必要としないことがある。このようなアミノ酸は、典型的には側鎖に反応性酸素、窒素、または他の反応性部分を含まない。

側鎖保護基の例には、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ｔｅｒｔ−ブチル、トリフェニルメチル（トリチル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルエーテル（Ｂｚｌ）および２，６−ジクロロベンジル（ＤＣＢ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、アダマンチルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチルおよびｔ−ブチルエステル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、ｔ−アミルオキシ−カルボニル（Ａｏｃ）、および芳香族または脂肪族ウレタン型保護基、ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）などの感光性基；ならびにトリメチルシリルオキシカルボニル（ＴＥＯＣ）などのフッ素不安定基が挙げられる。

本発明の実施においてＧＬＰ−１ペプチドを合成するために通常使用されるアミノ酸のための好ましい側鎖保護基は、以下の表Ａに示される：
表Ａ：

アミノ末端保護基は、アミノ酸のα−アミノ基とカップリングした化学的部分を含む。典型的には、アミノ末端保護基は、伸長中のペプチド鎖に付加される次のアミノ酸の付加前、脱保護反応で除去されるが、そのペプチドを支持体から切断する場合に維持することができる。アミノ末端保護基の選択は、様々な要因、例えば行う合成の種類および所望の中間体産物または最終産物に依存することがある。

アミノ末端保護基の例には、（１）アシル型保護基、例えばホルミル、アクリリル（Ａｃｒ）、ベンゾイル（Ｂｚ）およびアセチル（Ａｃ）など；（２）芳香族ウレタン型保護基、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）および置換されたＺなど、例えばｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルなど；（３）脂肪族ウレタン保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニルなど；（４）シクロアルキルウレタン型保護基、例えば９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびシクロヘキシルオキシカルボニルなど；ならびに（５）チオウレタン型保護基、例えばフェニルチオカルボニルなどが挙げられる。好ましい保護基には、９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（４−ビフェニリル）−プロピル（２）オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル（Ｐｏｃ）およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）が挙げられる。

ペプチドＦｍｏｃまたはＦｍｏｃ様化学反応が固相ペプチド合成に大いに好ましいのは、結果として生じる保護された状態のペプチドの切断が、弱酸性切断剤を使用して比較的直接的に行われるからである。この種の切断反応は、結果として生じる副産物、不純物などに関して比較的汚染されておらず、膨潤および萎縮洗浄液の両方から大規模にペプチドを回収することを技術的および経済的に実行可能にし、収率を上げる。ペプチド合成に関して本明細書に使用する「大規模」は、広くは１バッチあたり少なくとも５００ｇ、さらに好ましくは少なくとも２kgの範囲でペプチドを合成することを含む。大規模合成は、典型的にはキログラム〜メートルトン範囲の生産を可能にするサイズの、樹脂、溶媒、アミノ酸、カップリングおよび脱保護反応用化学物質などの試薬の量を収容することができるスチール製反応容器などの脱保護反応大型反応容器中で行われる。

追加的に、Ｆｍｏｃ保護基は、側鎖保護基に対してペプチドから選択的に切断することができる結果、側鎖保護はＦｍｏｃが切断された場所に残る。この種の選択性は、アミノ酸カップリングの間に側鎖の反応を最小にするために重要である。追加的に、側鎖保護基を、Ｆｍｏｃに対して選択的に切断して除去し、Ｆｍｏｃをその場所に残すことができる。下にさらに説明する精製スキームの間に、この後者の選択性は非常に都合よく頼られる。

固相カップリング反応は、カップリング反応を増強または改善する一つまたは複数の化合物の存在下で行うことができる。反応速度を増大させ、副反応速度を減少することができる化合物には、第三級塩基、例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下で保護されたアミノ酸を活性化種（例えばＢＯＰ、ＰｙＢＯＰＯ、ＨＢＴＵ、およびＴＢＴＵは、全てＨＯＢｔエステルを発生する）に変換することができるホスホニウム塩およびウロニウム塩が挙げられる。他の試薬は、保護試薬を提供することによりラセミ化防止を助ける。これらの試薬には、カルボジイミド（例えばＤＣＣまたはＷＳＣＤＩ）に補助求核剤（例えば、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、またはＨＯＳｕ）を添加したものが挙げられる。クロロギ酸イソブチルを補助求核剤と共に、または補助求核剤なしに使用した混合無水物法もまた、それに関連する低いラセミ化が原因で、アジド法と同様に利用することができる。これらの種類の化合物もまた、カルボジイミド介在性カップリングの速度を増大させることができ、ＡｓｎおよびＧｌｎ残基の脱水を阻害することができる。

カップリングが完了したと判定された後で、カップリング反応混合物を溶媒で洗浄し、それに続きペプチド物質のアミノ酸残基のそれぞれについてカップリングサイクルを繰り返す。次のアミノ酸をカップリングさせるために、樹脂に結合した物質からのＮ−末端保護基（例えば、Ｆｍｏｃ基）の除去は、典型的にはＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの溶媒に２０〜５０％（重量に基づく）ピペリジンを含む試薬を用いた処理により達成される。Ｆｍｏｃ保護基を除去後に、典型的には数回の洗浄を行い、残留したピペリジンおよびＦｍｏｃ副産物（ジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物など）を除去する。

続くアミノ酸は、樹脂支持体上のペプチド物質のローディング係数に対して化学量論的に過剰のアミノ酸で利用することができる。広くは、カップリング段階で使用されるアミノ酸の量は、樹脂上の第１のアミノ酸のローディング係数と少なくとも等しい（１当量以上）。好ましくは、カップリング段階に使用されるアミノ酸の量は、少なくとも１．３当量（０．３過剰）以上であり、最も好ましくは約１．５当量（０．５過剰）以上である。場合によると、例えばカップリング段階は、１〜３の範囲のアミノ酸当量を利用する。

最終カップリングサイクルの後で、樹脂をＮＭＰなどの溶媒で洗浄し、次にＤＣＭなどの不活性な第２の溶媒で洗浄する。合成されたペプチド物質を樹脂から除去するために、切断されたペプチド物質がまだ十分な側鎖保護基および末端保護基を有するような切断処理を実施する。所定の位置に保護基を残すことは、樹脂の切断の間または後にペプチドフラグメントの望まれないカップリングまたは他の望まれない反応を防止することを助ける。Ｆｍｏｃまたは類似の化学反応をペプチドの合成に使用する場合に、保護された切断を任意の所望の方法で、例えば、ＤＣＭなどの溶媒中に酢酸または希ＴＦＡなどの比較的弱酸の試薬を使用することにより達成することができる。ＤＣＭ中に０．５〜１０重量パーセントの、好ましくは１〜３重量パーセントのＴＦＡを使用することが典型的である。例えば米国特許第６，２８１，３３５号を参照されたい。

固相樹脂からペプチド中間体フラグメントを切断する段階は、以下のような例示的なプロセスに沿って進行させることができる。しかし、樹脂からペプチド中間体フラグメントを効果的に切断する任意の適切なプロセスを使用することができる。例えば、樹脂に結合したペプチド物質が入った容器に約５〜２０容、好ましくは約１０容の酸性切断試薬含有
溶媒を加える。その結果、典型的にはビーズの形の樹脂は、試薬に浸される。液体内容物を適切な温度で適切な時間撹拌すると、切断反応が起こる。撹拌は、ビーズの凝集防止を助ける。適切な時間および温度条件は、使用される酸試薬、ペプチドの性質、樹脂の性質などの要因に依存するものである。全般的なガイドラインとして、約−１５℃〜約５℃、好ましくは約−１０℃〜約０℃で約５分〜２時間、好ましくは約２５分〜約４５分の撹拌が適切であろう。切断時間は、約１０分〜約２時間の範囲のことがあり、また最長１日のことさえある。切断は、反応の間に典型的に起こりうる反応の発熱を調節するためにこのような冷却された温度範囲で望ましくは実施される。加えて、低温の切断反応は、トリチル基などの酸感受性側鎖保護基がこの段階で除去されることを防止する。

切断処理の最後に、反応をクエンチする。これは、例えば、切断試薬をピリジンなどの適切な塩基と混合すること、および追加的に５分〜２時間、好ましくは約２０分〜約４０分などの追加的な時間撹拌し、かき混ぜ続けることによって達成することができる。塩基を添加することおよび撹拌の継続は、容器の内容物を温度を増加させる。撹拌の終わりに、容器の内容物は、約０℃〜約１５℃、好ましくは約５℃〜約１０℃の温度範囲にありうる。

ペプチド収率の局面を改善するための樹脂の膨張および萎縮などの要因を、合成プロセス全体に組み込んでもよい。これらの技法は、例えば、米国特許公報第２００５／０１６４９１２Ａ１号に記載されている。

いくつかの局面では、切断されたペプチドフラグメントは、他のペプチドフラグメントおよび／またはアミノ酸への溶液相カップリングのために調製することができる。溶液相中のペプチドカップリング反応は、例えば、New Trends in Peptide Coupling Reagents; Albericio, Fernando; Chinchilla, Rafeal; Dodsworth, David J.; and Najera, Armen; Organic Preparations and Procedures International (2003), 33(3), 203-303に総説されている。

溶液相中におけるペプチド中間体フラグメントから他のフラグメントまたはアミノ酸へのカップリングは、ｉｎ ｓｉｔｕカップリング試薬、例えば２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ｏ−（７−アゾベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤＩ）、またはｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）を使用して実施することができる。他のカップリング技法は、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）エステルおよびｐ−ニトロフェノール（ＨＯＮｐ）エステルなどの予備形成した活性エステル；予備形成した対称無水物；Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）などの非対称無水物；またはフッ化アシルおよび塩化アシルなどの酸ハライドを使用する。

適切なカップリング溶媒は、溶液相カップリング反応に使用することができる。使用されるカップリング溶媒が、形成するペプチド結合のラセミ化度；ペプチドおよび／またはペプチドフラグメントの溶解度；ならびにカップリング反応速度に影響を及ぼしうることが了解されている。いくつかの態様では、カップリング溶媒は、一つまたは複数の水混和性試薬を含む。水混和性溶媒の例には、例えば、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、またはその混合物が挙げられる。

他の態様では、カップリング反応は一つまたは複数の水非混和性試薬を含むことがある。水非混和性溶媒の例は、メチレンクロリドである。これらの態様では、水非混和性溶媒は、好ましくは脱保護反応と適合性であり、例えば水非混和性溶媒が使用されるならば、好ましくはその溶媒は脱保護反応に有害な影響を及ぼさない。

ペプチド１１が形成した後で、所望により産物を脱保護、精製、凍結乾燥、さらなる加工（例えば別のペプチドと反応させて融合タンパク質を形成させる）、これらの組み合わせなどに供することができる。

例えば本発明によると、側鎖保護基は、典型的には固相合成の間ずっと、そして溶液相カップリング反応に入るときおよびその間にもまたずっとペプチド中間体フラグメント上に保持される。広くは、溶液相カップリング段階が完了後に一つまたは複数の脱保護段階を行い、一つまたは複数の保護基をペプチドから除去することができる。

全体的な脱保護による側鎖保護基の除去は、典型的には側鎖保護基を切断するための酸分解薬剤を含む脱保護溶液を利用する。全体的な脱保護のために通常使用される酸分解試薬には、ニートなトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＨＣｌ、ＢＦ₃Ｅｔ₂ＯまたはＭｅ₃ＳｉＢｒなどのルイス酸、液体フッ化水素酸（ＨＦ）、臭化水素（ＨＢｒ）、トリフルエロメタンスルホン酸、およびその組み合わせが挙げられる。脱保護溶液は、適切なカチオンスカベンジャー、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、アニソール、ｐ−クレゾール、エタンジチオール、またはジメチルスルフィドのうち一つまたは複数もまた含む。脱保護溶液は、水もまた含むことがある。脱保護組成物中に存在する、本明細書に使用する試薬の量は、典型的には比で表現され、ここで、個別の構成要素の量は、分子が「重量部」または「体積部」などの「部」単位で表現され、分母は組成物中の合計部である。例えば、ＴＦＡ：Ｈ₂Ｏ：ＤＴＴを９０：５：５（重量／重量／重量）の比で含有する脱保護溶液は、９０／１００重量部のＴＦＡ、５／１００重量部のＨ₂Ｏ、および５／１００重量部のＤＴＴを有する。

いくつかの態様では、脱保護組成物中の酸分解薬剤、好ましくはＴＦＡの量が９０／１００重量部を超える脱保護反応を行うことができる。他の好ましい脱保護組成物は、９３／１００重量部以上の量、または９３／１００重量部〜９５／１００重量部の範囲の量で酸分解薬剤の量を含む。

沈殿は、典型的にはエーテル、例えばジエチルエーテルまたはＭＴＢＥ（メチル ｔｅｒｔ−ブチル エーテル）を使用して行われる。沈殿後に、望ましくはペプチドを単離し、乾燥してから、他の成分と混合し、凍結乾燥し、パッケージに入れ、保存し、さらに加工し、かつ／または別な方法で取り扱う。これは、任意の適切な方法で達成することができる。一つの適切なアプローチによると、ペプチドを濾過により収集し、十分なＭＴＢＥ洗浄で洗浄し、適切なレベルまで最終塩含量を低下させ、次に乾燥する。

本発明は、ＧＬＰ−１ペプチドおよびその対応物を含む広範囲のペプチドを精製するために有用な技法もまた提供する。

特に好ましい精製プロセスは、クロマトグラフィー媒質による少なくとも二つの精製工程を伴い、ここで、少なくとも第１の工程は、第１のｐＨで起こり、少なくとも第２の工程は第２のｐＨで起こる。さらに好ましくは、第１の工程は酸性ｐＨで起こり、第２の工程は塩基性ｐＨで起こる。好ましい態様では、塩基性条件で起こる工程の前に、酸性状態の少なくとも一つの工程が起こる。例示的な実施形態では、この精製アプローチは、図１に示すスキーム１０から生じる完全に保護されたペプチド１１を精製する例示的な状況で説明することができる。最初にペプチドは、全体的に脱保護される。Ｎ−末端保護基および側鎖保護基の両方を切断する。第１のクロマトグラフィー工程は、約１〜５、好ましくは約２のｐＨを提供するために十分なＴＦＡを使用した水／ＡＣＮ（アセトニトリル）勾配で実施される。次に、第２の工程は、約８〜９、好ましくは８．５〜８．９のｐＨを提供するために少量のアンモニアおよび／または酢酸アンモニウムなどを使用した水／ＡＣＮ勾配で実施される。

酸であろうと塩基であろうと、均一なイオン種が各場合に存在する点で、ｐＨの値は均一性を促進する。したがって、望ましくは酸性ｐＨが十分に低いことにより、ペプチド物質中のアミノ酸残基の実質的に全てがプロトン化される。望ましくは塩基性ｐＨが十分に高いことにより、ペプチド物質中のアミノ酸残基の実質的に全てが脱プロトンされる。酸および塩基クロマトグラフィーは、任意の順序で実施することができる。アセテートがクロマトグラフィーの産物でありうる限り、ペプチドアセテートが所望の産物である場合に、塩基性クロマトグラフィーを最後に行うことが好都合である。

以下の例示的な実施例について本発明の原理をこれからさらに例示する。以下において、全てのパーセントおよび比は、別に明示的に述べない限り体積に基づくものである。

実施例１ Ｎ−末端にＦｍｏｃ保護ならびにＨｉｓおよびＧｌｕに側鎖保護を有するフラグメント１２の固相合成
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙをロードされた２ＣＴＣ樹脂の調製
最初に、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙをロードされた２ＣＴＣ樹脂を調製した。使用する試薬の量を以下の表に挙げる：

２−ＣＴＣ樹脂を５００mL容ペプチドリアクターにチャージし、４００mLのＤＣＭを用いて２５℃で３０分膨潤させた。ベッドから排液し、ＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５）８容中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨおよびＤＩＥＡの溶液を添加した。混合物を温度２５℃で２時間窒素下で撹拌した。

ベッドから排液し、３５０mLのＭＦで１回および１７５mLのＤＭＦで１回洗浄した。次に、２−ＣＴＣ樹脂上に残った活性部位を３５０mLのＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１）溶液で１時間末端キャップした。ベッドから排液し、２５０mLのＤＭＦで２回洗浄し、次に３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。樹脂を３×３５０mLのＩＰＡで洗浄することにより脱膨潤させた。樹脂を一定重量になるまで乾燥させ、ロードされた樹脂３８．２０ｇを得た。分析により、０．１８mmol/gというローディング係数が示された。

Ｂ．固相合成

固相合成は、本実施例１の第Ａ部で調製した、０．１８mmol/gでロードされたＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−２−ＣＴＣ樹脂２０．０ｇから出発して実施した。樹脂をＤＣＭ（２００mL）中で２５℃で３０分膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排液し、樹脂をＮＭＰで３回洗浄した（各洗浄について５容）。

次に、樹脂をＮＭＰ中の２０体積％ピペリジンで２回処理し（各処理について５容）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。２回目の２０％ピペリジン／ＮＭＰ処理後に、クロラニル試験陰性になるまで樹脂をＮＭＰ（各洗浄について５容）で５回洗浄した。

カップリング溶液を調製するためにアミノ酸（２．８５当量）および６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ、２．８５当量）を秤量し、２．５５倍容のＮＭＰに溶解させ、次に５〜１０℃でＤＩＥＡ（３．２５当量）と混合した。ＴＢＴＵ（２．８５当量）を５℃〜１０℃で１．３倍容のＮＭＰに溶解させた。次に、これら二つの溶液を合わせた。得られた溶液を反応容器に加えた。１．３倍容のＤＣＭでフラスコをすすぎ、これをリアクターに加え、次に、これを２５〜２７℃で２〜３時間撹拌した。Kaiser試験のために試料を抜き取り、反応が完了したかチェックした。カップリング反応が３時間後に完了していなければ（Kaiser試験陽性）、反応容器から排液し、活性化アミノ酸の新鮮溶液を用いて再カップリングを行った。カップリング反応の完了後に、カップリング溶液を排液し、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各洗浄について５容）。次に、フラグメント中の残りのアミノ酸についてＦｍｏｃ保護基の除去およびカップリング反応サイクルを繰り返した（すなわちＧｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ａｉｂ→Ｈｉｓ（ｔｒｔ）の順）。

活性化Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨとＨ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−２−ＣＴＣとの間のカップリング反応が困難であること、および活性化Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨが不安定であることから、１時間後に反応溶液を排液することによってカップリング反応を強制完了させ、直ちに第２の新鮮な活性化Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨ溶液を用いた再カップリング反応を行った。

本実施例の第Ｂ部で使用した全ての試薬を以下の表に挙げる：

樹脂に結合したペプチドフラグメントをＮＭＰ（５容）で４回、ＤＣＭ（６容）で５回、ＩＰＡ（５容）で３回洗浄した。次に、脱膨潤した樹脂を３５℃で真空下で乾燥させ、樹脂および樹脂に結合したペプチド２２．５８ｇを得た。

Ｃ．樹脂からのＦｍｏｃ保護および側鎖保護されたフラグメントの切断
上記第Ｂ部から構築された樹脂をＤＣＭ（使用した樹脂重量に対して１２．５容、樹脂１ｇあたり１２．５mlのＤＣＭまたは１kgあたり１２．５リットル）中で２５℃で３０分膨潤させ、次に、ＤＣＭで２回洗浄し（各洗浄について６．２５容）、あらゆるＮＭＰ残基を除去した。最終のＤＣＭ洗浄でこの樹脂を−５℃に冷却した。ＤＣＭを排液し、１％ ＴＦＡ／ＤＣＭの冷溶液を加え（−５℃〜−１０℃で１０容）、０℃で３０分間撹拌した。ピリジン（１．３当量のＴＦＡ）をリアクターに加えてＴＦＡを中和した。切断溶液を濾過し、フラスコに収集した。容器が２５℃まで加温する間に、樹脂をＤＣＭ（７．５容）で７回洗浄した。洗液を切断溶液と混合した。ＤＣＭ切断溶液を水（７．５容）と混合した。結果として生じる混合物を減圧下で蒸留し、ＤＣＭを除去した（２８℃で３５０torr）。ＤＣＭが除去されると、ペプチドフラグメントは水から沈殿した。フラグメントを水で洗浄し、真空下で３０℃〜３５℃で乾燥させた。合計４．７３ｇのＦｍｏｃ−（Ａｉｂ⁸）ＧＬＰ−１（７−１０）−ＯＨを得た。

実施例２
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙをロードされた２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙをロードされた２ＣＴＣ樹脂を調製した。使用した試薬の量を以下の表に挙げる：

２−ＣＴＣ樹脂を５００mL容ペプチドリアクターにチャージし、４００mLのＤＣＭで３０分膨潤させた。樹脂から排液し、ＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５容）８容中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨおよびＤＩＥＡの溶液を加えた。混合物を２５℃で２時間窒素下で撹拌した。

樹脂ベッドから排液し、４００mLのＤＭＦで１回および２００mLのＤＭＦで１回洗浄した。次に、２−ＣＴＣ樹脂上に残った活性部位をＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１容）溶液３９０mLで１時間末端キャップした。ベッドから再び排液し、３５０mLのＤＭＦで２回洗浄し、３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。次に、３×３５０mLのＩＰＡで洗浄することにより樹脂を脱膨潤させた。一定重量になるまで樹脂を真空下で３５℃で乾燥させ、ロードされた樹脂４８．５１ｇを得た。分析により、０．５４mmol/gというローディング係数が示された。

Ｂ．固相合成

固相合成は、０．５４mmol/gでロードされたＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−２−ＣＴＣ樹脂２７．５９ｇから出発して実施した。樹脂をＤＣＭ（３００mL）中で２５℃で３０分膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排液し、樹脂をＮＭＰで３回洗浄した（各洗浄について５容）。

次に、樹脂をＮＭＰ中の２０体積％ピペリジンで２回処理し（各処理について５容）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。２回目の２０％ピペリジン／ＮＭＰ処理後に、クロラニル試験陰性になるまで樹脂をＮＭＰで６回洗浄した（各洗浄について５容）。

カップリング溶液を調製するために、アミノ酸（１．７当量）および６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ、１．７当量）を秤量し、４．６倍容のＮＭＰに溶解させ、次に５℃〜１０℃でＤＩＥＡ（１．９当量）と混合した。ＴＢＴＵ（１．７当量）を５℃〜１０℃で２．２８倍量のＮＭＰに溶解させた。次に、二つの溶液を合わせた。結果として生じる溶液を反応容器に加えた。フラスコを２．２８容のＤＣＭでリアクターにすすぎ入れ、これを次に２５℃〜２７℃で２〜３時間撹拌した。試料をKaiser試験のために抜き取り、反応が完了したかチェックした。カップリング反応の完了後に、カップリング溶液を排液し、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各洗浄について５容）。フラグメント中の残りのアミノ酸についてＦｍｏｃ基の除去およびカップリング反応サイクルを繰り返した（すなわちＧｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ａｉｂ→Ｈｉｓ（ｔｒｔ）の順）。

本実施例で使用した全ての試薬を以下の表に挙げる：

Ｃ．樹脂からのフラグメントの切断
構築された樹脂をＮＭＰ（５容）で６回、次にＤＣＭ（６容）で８回洗浄し、ＮＭＰ残基を除去した。最終のＤＣＭ洗浄で樹脂を−５℃に冷却した。ＤＣＭを排液後、１％ＴＦＡ／ＤＣＭの冷（−５℃〜−１０℃）溶液（１０容）を加え、結果として生じるポット混合物を０℃で３０分間撹拌した。ピリジン（ＴＦＡの１．３当量）をリアクターにチャージし、ＴＦＡを中和した。切断溶液をフラスコに収集した。容器を２５℃まで加温する間に、樹脂をＤＣＭ（７．５容）で１１回洗浄し、切断溶液に排液した。ＤＣＭ溶液を水（１０容）と混合した。結果として生じる混合物を減圧下で蒸留し、ＤＣＭ（２８℃で３５０torr）を除去した。ＤＣＭが除去されると、フラグメントは水から沈殿した。フラグメントを水で洗浄し、真空下で３０℃〜３５℃で乾燥させた。合計１１．１２ｇのＦｍｏｃ−（Ａｉｂ⁸）ＧＬＰ−１（７−１０）−ＯＨ（収率７８．８％）を得た。

実施例３
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙをロードされた２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙをロードされた２ＣＴＣ樹脂を調製した。使用する試薬の量を以下の表に挙げる：

２−ＣＴＣ樹脂を５００mL容ペプチドリアクターにチャージし、４００mLのＤＣＭで３０分膨潤させた。ベッドから排液し、ＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５）８容中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨおよびＤＩＥＡの溶液を加えた。混合物を温度２５℃で２時間窒素下で撹拌した。

ベッドから排液し、４００mLのＤＭＦで１回洗浄した。次に、２−ＣＴＣ樹脂上のあらゆる残りの活性部位をＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１）溶液３９０mLで１時間末端キャップした。ベッドから排液し、３５０mLのＤＭＦで２回、次に３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。４×２５０mLのＩＰＡで洗浄することにより樹脂を脱膨潤させた。一定重量になるまで樹脂を真空下で３５℃で乾燥させ、ロードされた樹脂５２．０２ｇを得た。分析により、０．７２mmol/gのローディング係数が示された。

Ｂ．固相合成
固相合成は、０．７２mmol/gでロードされたＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−２−ＣＴＣ樹脂２４．４３ｇから出発して実施した。樹脂をＤＣＭ（２５０mL）中で２５℃で３０分膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排液し、樹脂をＮＭＰで３回洗浄した（各洗浄について５容）。

次に、樹脂をＮＭＰ中の２０％ピペリジンで２回処理し（各処理について５容）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。２回目の２０％ピペリジン／ＮＭＰ処理後に、クロラニル試験陰性になるまで樹脂をＮＭＰで６回洗浄した（各洗浄について５容）。

カップリング溶液を調製するために、アミノ酸および６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ）を秤量し、ＮＭＰに溶解させ、次に１０℃〜５℃でＤＩＥＡと混合した。ＴＢＴＵを１０℃〜５℃でＮＭＰに溶解させた。次に、二つの溶液を合わせた。結果として生じる溶液を反応容器に加えた。フラスコをＤＣＭでリアクターにすすぎ入れ（量については以下の表参照）、これを２５℃〜２７℃で２〜６時間撹拌した。Kaiser試験のために試料を抜き取り、反応が完了したかチェックした。カップリング反応が３時間後に完了していなければ（Kaiser試験陽性）、反応容器から排液し、活性化アミノ酸の新鮮溶液を用いて再カップリングを行った。カップリング反応が完了した後で、カップリング溶液を排液し、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各洗浄について５容）。次に、フラグメント中の残りのアミノ酸についてＦｍｏｃ基の除去およびカップリング反応サイクルを繰り返した（すなわちＧｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ａｉｂ→Ｈｉｓ（ｔｒｔ）の順）。

本実施例に使用する全ての試薬を以下の表に挙げる：

Ｃ．樹脂からのフラグメントＦｍｏｃ−ＡＡ（７−１０）−ＯＨの切断
構築された樹脂をＮＭＰ（５容）で６回およびＤＣＭ（６容）で７回洗浄し、ＮＭＰを除去した。最終のＤＣＭ洗浄で樹脂を−５℃に冷却した。ＤＣＭを排液し、樹脂ベッドを１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（１１．２６容）の冷溶液（−５℃〜−１０℃）と共に０℃で５分洗浄した。切断溶液をフラスコに収集したが、フラスコにはＴＦＡを中和するためのピリジン（合計ＴＦＡの１．３当量）を加えておいた。次に、冷１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（６．１４容）の第２の一部をリアクターに加え、２分間撹拌した。第２の切断溶液をもう一度収集フラスコに排液した。容器を２５℃まで加温する間に、樹脂をＤＣＭで９回洗浄し（８．２容）、切断溶液に排液した。ＤＣＭ溶液を水（８．２容）と混合した。結果として生じる混合液を減圧下で蒸留し、ＤＣＭを除去した（２８℃で３５０torr）。ＤＣＭが除去されると、フラグメントは水から沈殿した。フラグメントを水で洗浄し、３０℃〜３５℃の真空下で乾燥させた。配列番号７のＦｍｏｃ−（Ａｉｂ⁸）ＧＬＰ−１（７−１０）−ＯＨを合計１４．０２ｇ得た（収率８６．６％）。分析から、純度９４．３％ＡＮが示された。

実施例４ 側鎖を保護されたＦｍｏｃ−（Ａｉｂ ³⁵ ）ＧＬＰ−１（２３−３５）−ＯＨの固相合成
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ａｉｂをロードされた２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｆｍｏｃ−Ａｉｂをロードされた２ＣＴＣ樹脂を調製した。使用した試薬の量を以下の表に挙げる：

２−ＣＴＣ樹脂を５００mL容ペプチドリアクターにチャージし、４００mLのＤＣＭで３０分膨潤させた。ベッドから排液し、ＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５）８容中のＦｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨおよびＤＩＥＡの溶液を加えた。混合物を温度２５℃で２時間窒素下で撹拌した。

ベッドから排液し、１回目は４００mL、２回目は２００mLのＤＭＦで洗浄し、次に、２−ＣＴＣ樹脂上に残ったあらゆる活性部位をＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１）溶液４００mLで１時間末端キャップした。ベッドから排液した。樹脂を４５０mLのＤＭＦ／ＭｅＯＨ／ＤＩＥＡ（４：０．９：０．１）で１回、２００mLのＤＭＦで１回、および３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。３×３５０mLのＩＰＡで洗浄することにより、樹脂を脱膨潤させた。樹脂を一定重量になるまで乾燥させ、ロードされた樹脂４５．１５ｇを得た。分析により、０．２４mmol/gというローディング係数が示された。

Ｂ．固相合成
０．２４mmol/gのローディング係数を有するＦｍｏｃ−Ａｉｂ−２−ＣＴＣ樹脂１０．０１ｇを反応容器にチャージし、ＤＣＭ（１２０mL）中で２５℃で３０分膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排液し、樹脂をＮＭＰで３回洗浄した（各洗浄について６容）。

次に、樹脂をＮＭＰ中の５体積％ピペリジンで２回処理し（各処理について６容）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。２回目の５％ピペリジン／ＮＭＰ処理後に、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各洗浄について６容）。

カップリング溶液を調製するために、アミノ酸（１．８７５当量）および１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール一水和物（ＨＯＢＴ水和物、２．０７当量）を３．５倍容のＮＭＰに５℃〜１０℃で溶解させ、次に、ＮＭＰ（１．５倍容）中のＨＢＴＵ溶液１６．１mL（２．０当量）と混合した。次に、２．２mLのＤＩＥＡ（２．６３当量）を活性化容器に１０℃〜５℃で加えた。結果として生じる溶液を反応容器に移した。活性化容器を１．５倍容のＤＣＭでリアクターにすすぎ入れ、次にこれを２５℃で２時間撹拌した。反応容器から排液した。活性化アミノ酸（１．８７５当量）の新鮮溶液を用いて、カップリング反応をもう一度繰り返した。２回目のカップリング反応が完了後に、カップリング溶液を排液し、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各洗浄について６容）。次に、Ｆｍｏｃ基の除去およびカップリング反応サイクルを、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（すなわちＬｙｓ（Ｂｏｃ）→Ｖａｌ→Ｌｅｕ→Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ｉｌｅ→Ｐｈｅ→Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ａｌａ→Ｇｌｎ（ｔｒｔ）の順）。

本実施例に使用する全ての試薬を以下の表に挙げる：

構築された樹脂をＮＭＰ（６容）で４回、ＤＣＭ（６容）で４回、およびイソプロパノール（ＩＰＡ、６容）で３回洗浄することにより単離した。構築された樹脂を３５℃の真空下で乾燥させた。構築された樹脂１４．３ｇを得た。

Ｃ．構築された樹脂からの中間体フラグメントの切断
上記からの構築された樹脂６．６ｇを１０倍容のＤＣＭ中で３０分膨潤させ、−１０℃に冷却した。ＤＣＭを排液し、１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（１２容、−５℃〜−１０℃）の冷溶液を加え、０℃で３０分間撹拌した。ピリジン（ＴＦＡ２〜３当量）の入ったフラスコに切断溶液を収集した。２５℃まで加温する間に、樹脂を１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（１０倍容）と共に５分間撹拌し、ピリジン（２〜３当量）を加えた。さらに５分後に、溶液を収集した。樹脂をＤＣＭで４回洗浄した（１０容）。全てのＤＣＭ洗液を水と混合した（水／ＤＣＭ＝１／４）。結果として生じる混合液を減圧下で蒸留し（２８℃で３５０torr）、ＤＣＭを除去した。ＤＣＭが除去されると、フラグメントは水から沈殿した。フラグメントを水で洗浄し、３０℃〜３５℃の真空下で乾燥させた。切断手順をもう一度繰り返した。合計２．３６ｇのＦｍｏｃ−（Ａｉｂ³⁵）ＧＬＰ−１（２３−３５）−ＯＨを得た（収率９２％）。

実施例５
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ａｉｂをロードされた２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｆｍｏｃ−Ａｉｂをロードされた２ＣＴＣ樹脂を調製した。本実施例に使用する試薬の量を以下の表に挙げる:

２−ＣＴＣ樹脂を５００mL容ペプチドリアクターにチャージし、４００mLのＤＣＭで３０分膨潤させた。ベッドから排液し、ＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５）８容中のＦｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨおよびＤＩＥＡの溶液を加えた。混合物を温度２５℃で２時間窒素下で撹拌した。

ベッドから排液し、４００mLのＤＭＦで洗浄した。次に、２−ＣＴＣ樹脂上に残ったあらゆる活性部位をＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１）溶液４００mLで１時間末端キャップした。ベッドから排液し、４００mLのＤＭＦで１回、２００mLのＤＭＦで１回、および３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。３×３５０mLのＩＰＡで洗浄することにより樹脂を脱膨潤させた。一定重量になるまで樹脂を乾燥させ、ロードされた樹脂４５．３２ｇを得た。分析により、０．３０mmol/gというローディング係数が示された。

Ｂ．固相合成
固相合成は、０．３０mmol/gでロードされたＦｍｏｃ−Ａｉｂ−２−ＣＴＣ樹脂１５．０ｇから出発して実施した。樹脂をＤＣＭ（１５０mL）中で２５℃で３０分膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排液し、樹脂をＤＣＭで２回（各洗浄について６容）およびＮＭＰで３回（各洗浄について６容）洗浄した。

次に、樹脂をＮＭＰ中の２０％ピペリジンで２回処理し（各処理について６容）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。２回目の２０％ピペリジン／ＮＭＰ処理の後で、クロラニル試験陰性になるまで樹脂をＮＭＰで６回洗浄した（各洗浄について６容）。

カップリング溶液を調製するために、アミノ酸（１．７当量）および６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ、１．７当量）を秤量し、２．６倍容のＮＭＰに１０℃〜５℃で溶解させ、次にＤＩＥＡ（１．９から３．０当量）と混合した。ＴＢＴＵまたはＨＢＴＵ（１．７当量）を１．３３倍容のＮＭＰに１０℃〜５℃で溶解させた。次に、二つの溶液を合わせた。結果として生じる溶液を反応容器に加えた。混合フラスコを１．３３倍容のＤＣＭでリアクターにすすぎ入れ、次にこれを樹脂と共に２５℃〜２７℃で２〜３時間撹拌した。Kaiser試験のために試料を抜き取り、反応が完了したかチェックした。カップリング反応が３時間後に完了していなければ（Kaiser試験陽性）、反応容器から排液し、活性化アミノ酸の新鮮溶液を用いて再カップリングを行った。カップリング反応が完了した後で、カップリング溶液を排液し、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各洗浄について６容）。次に、フラグメント中の残りのアミノ酸についてＦｍｏｃ基の除去およびカップリング反応サイクルを繰り返した（すなわちＬｙｓ（Ｂｏｃ）→Ｖａｌ→Ｌｅｕ→Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ｉｌｅ→Ｐｈｅ→Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ａｌａ→Ｇｌｎ（ｔｒｔ）の順）。

２−メチルアラニン（Ａｉｂ）と２−ＣＴＣ樹脂との間の可能性のあるバトレッシング効果が原因で、第１の二つのアミノ酸（Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−３４およびＶａｌ−３３）のカップリング反応を強制完了させるにはかなり困難がある。したがって、（Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−３４、Ｖａｌ−３３）についての両カップリング反応を３回行った（すなわちカップリングの後に２回の再カップリングを行う）。また、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−３４およびＶａｌ−３３のカップリング反応の後で、無水酢酸を使用して樹脂に結合した未反応の物質を末端キャップした。これは、クロマトグラフィー精製の間に所望の産物から不純物を遠く離すことによりその後の精製の効率を改善した。

本実施例に使用する全ての試薬を以下の表に挙げる：

Ｃ．構築された樹脂からのフラグメントの切断
上記から構築された樹脂をＤＣＭで７回洗浄し（各洗浄について６容）、ＮＭＰ残基を除去し、最後のＤＣＭ洗浄で樹脂を−５℃に冷却した。ＤＣＭを排液し、１％ＴＦＡ／ＤＣＭの冷溶液（−５〜−１０℃で１２容）を加え、０℃で３０分間撹拌した。ピリジン（ＴＦＡの１．３当量）の入ったフラスコに切断溶液を収集した。容器を２５℃まで加温する間に、樹脂をＤＣＭで９回洗浄し（１０容）、切断溶液に排液した。ＤＣＭ溶液を水（６容）と混合した。結果として生じる混合物を減圧下で蒸留し、ＤＣＭを除去した（２８℃で３５０torr）。ＤＣＭが除去されると、フラグメントは水から沈殿した。フラグメントを洗浄し、３０℃〜３５℃の真空下で乾燥させた。この実施例について、切断手順をもう一度繰り返した。合計６．７８ｇのＦｍｏｃ−（Ａｉｂ³⁵）ＧＬＰ−１（２３−３５）−ＯＨを純度８７．３％ＡＮで得た（収率６８．１％）。

実施例６
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ａｉｂをロードされた２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｆｍｏｃ−Ａｉｂをロードされた２ＣＴＣ樹脂を調製した。本実施例に使用する試薬の量を以下の表に挙げる：

２−ＣＴＣ樹脂を５００mL容ペプチドリアクターにチャージし、４００ＤＣＭで３０分膨潤させた。ベッドから排液し、ＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５）８容中のＦｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨおよびＤＩＥＡの溶液を加えた。混合物を温度２５℃で２時間窒素下で撹拌した。

ベッドから排液し、４００mLのＤＭＦで洗浄した。次に、２−ＣＴＣ樹脂上に残ったあらゆる活性部位をＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１）溶液４００mLで１時間末端キャップした。ベッドから排液し、４００mLのＤＭＦで１回洗浄し、２００mLのＤＭＦで１回洗浄し、３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。３×３５０mLのＩＰＡで洗浄することにより樹脂を脱膨潤させた。一定重量になるまで樹脂を乾燥させ、ロードされた樹脂４７．５６ｇを得た。分析により、０．３７mmol/gというローディング係数が示された。

Ｂ．固相合成
固相合成は、０．３７mmol/gでロードされたＦｍｏｃ−Ａｉｂ−２−ＣＴＣ樹脂２５．０ｇから出発して実施した。樹脂をＤＣＭ（２５０mL）中で２５℃で３０分膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排液し、樹脂をＤＣＭで２回（各洗浄について６容）およびＮＭＰで３回（各洗浄について６容）洗浄した。

次に、樹脂をＮＭＰ中の２０体積％ピペリジンで２回処理し（各処理について６容）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。２回目の２０％ピペリジン／ＮＭＰ処理後に、クロラニル試験陰性になるまで樹脂をＮＭＰで６回洗浄した（各洗浄について６容）。

カップリング溶液を調製するために、アミノ酸および６−クロロ−１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ）を秤量し、３．２倍容のＮＭＰ（またはＬｙｓ−３４、Ｖａｌ−３３、およびＧｌｎ−２３についてはＤＭＦ）に溶解させ、次に１０℃〜５℃でＤＩＥＡと混合した。ＴＢＴＵを１０℃〜５℃で１．６倍容のＮＭＰ（またはＬｙｓ−３４、Ｖａｌ−３３、およびＧｌｎ−２３についてはＤＭＦ）に溶解させた。次に、二つの溶液を合わせた。結果として生じる溶液を反応容器に加え、フラスコを１．６倍容のＤＣＭでリアクターにすすぎ入れ、これを樹脂と共に２５℃〜２７℃で２〜３時間撹拌した。Kaiser試験のために試料を抜き取り、反応が完了したかチェックした。３時間後にカップリング反応が完了していなければ（Kaiser試験陽性）、反応容器から排液し、活性化アミノ酸の新鮮溶液を用いて再カップリングを行った。カップリング反応が完了した後で、カップリング溶液を排液し、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各洗浄について６容）。次に、フラグメント中の残りのアミノ酸についてＦｍｏｃ基の脱保護およびカップリング反応サイクルを繰り返した（すなわちＬｙｓ（Ｂｏｃ）→Ｖａｌ→Ｌｅｕ→Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ｉｌｅ→Ｐｈｅ→Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ａｌａ→Ｇｌｎ（ｔｒｔ）の順）。

２−メチルアラニン（Ａｉｂ）と２−ＣＴＣ樹脂との間の可能性のあるバトレッシング効果が原因で、第１の二つのアミノ酸（Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−３４およびＶａｌ−３３）のカップリング反応を強制完了させるにはかなり困難がある。アミノ酸および６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ両方の利用を１．７Ｅｑから２．５Ｅｑに、ＤＩＥＡの利用を１．９Ｅｑから３．０Ｅｑに増加させることで、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−３４、Ｖａｌ−３３、およびＧｌｎ（ｔｒｔ）−２３についてのカップリング条件を改変した。カップリング反応用の溶媒もまた、カップリング反応を強制完了させるためにＮＭＰからＤＭＰに変更した。また、本実施例では、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−３４およびＶａｌ−３３のカップリング反応後に、樹脂に結合した未反応の物質を末端キャップするために無水酢酸を使用した。これは、クロマトグラフィー精製の間に所望の産物から不純物を遠く離すことによりその後の精製の効率を改善した。

本実施例に使用する全ての試薬を以下の表に挙げる：

Ｃ．構築された樹脂からのフラグメントの切断
上記から構築された樹脂をＤＣＭで６回洗浄して（各洗浄について６容）ＮＭＰを除去し、最終のＤＣＭ洗浄で樹脂を−５℃に冷却した。ＤＣＭを排液し、１％ＴＦＡ／ＤＣＭの冷溶液（−５℃〜−１０℃で１０容）を加え、０℃で３０分間撹拌した。切断溶液をピリジン（ＴＦＡの１．３当量）の入ったフラスコに収集した。容器が２５℃まで加温する間に、樹脂をＤＣＭで７回洗浄し（６容）、切断溶液に排液した。ＤＣＭ溶液を水（１０容）と混合した。結果として生じる混合物を減圧下で蒸留し、ＤＣＭを除去した（２８℃で３５０torr）。ＤＣＭが除去されると、フラグメントは水から沈殿した。フラグメントを洗浄し、真空下で３０℃〜−３５℃で乾燥させた。この実施例のために、切断手順をもう一度繰り返し、完全な切断を達成した。合計１２．３６ｇのＦｍｏｃ−（Ａｉｂ³⁵）ＧＬＰ−１（２３−３５）−ＯＨを純度８４．３％ＡＮで得た（収率５９．３５％）。

実施例７
１．樹脂の洗浄
予備ロードされたＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｏ−２−ＣＴＣ樹脂（０．１８〜０．６５mmol/gをロード）またはＦｍｏｃ−Ａｉｂ−Ｏ−２−ＣＴＣ（０．２５〜０．６５mmol/gをロード）から出発して、標準的なＦｍｏｃ化学反応を適用した。樹脂を最初に１０倍容のＤＣＭで３０〜６０分膨潤させた。次にＤＣＭを排液し、樹脂を１０倍容のＮＭＰで３〜５回洗浄した（各回５分）。

２．全般合成サイクル：
本実施例７の第Ａ節にしたがって洗浄した樹脂を使用して、ＮＭＰ中の２０(v/v)％ピペリジンの約１０×溶液で２回処理することによってＦｍｏｃ除去を達成した。処理は各回１５〜３０分続けた。ピペリジン／ＮＭＰ溶液を各処理後に排液した。次に、樹脂をＮＭＰで４〜５回洗浄した（１０倍容、各回５分）。

カップリング溶液を調製するために、Ｆｍｏｃで保護されたアミノ酸（ＡＡ）およびＨＯＢｔを秤量し（１．５〜２．０当量）、１０℃で４倍容のＮＭＰに溶解させ、ＤＩＥＡ（１．５〜２．０当量）と混合した。ＨＢＴＵ（１．５〜２．０当量）を１０℃で３倍容のＮＭＰに溶解させた。次に、二つの溶液を合わせ、３倍容のＤＣＭと１〜２分混合した。結果として生じる溶液を反応容器に加え、１．５〜５時間撹拌しながら樹脂と混合した。試料をKaiser試験のために抜き取り、反応が完了したかチェックした。不完全なカップリングは再カップリングさせた。カップリング反応が完了後、カップリング溶液を排液し、樹脂をＮＭＰで５回洗浄した（１０培養、各回５分）。

Ａ．一般的な合成手順により、同様に一般的な合成手順を使用してネイティブな配列を有するフラグメントＦｍｏｃ−ＧＬＰ−１（１１−２２）−２−ＣＴＣを段階的に構築し、配列番号７のフラグメントを、この第Ａ節で調製した結果として生じるフラグメントＦｍｏｃ−ＧＬＰ−１（１１−２２）−２−ＣＴＣと、一般的な合成手順を使用してカップリングさせた。

Ｂ．一般的な合成手順により、フラグメントＦｍｏｃ−ＧＬＰ−１（１１−２２）−２−ＣＴＣを段階的に構築した。しかし、Ｆｍｏｃの除去条件は、ＮＭＰ中の２０（ｖ／ｖ）％ピペリジンの代わりにＮＭＰ中の１０（ｖ／ｖ）％ピペリジンおよび２（ｖ／ｖ）％ＤＢＵの溶液に変更した。加えて、ＡＡ１４［Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−］の位置およびＡＡ１３［Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−］の位置での処理時間を１．５時間に延長して反応の完了を推進した。同じ一般的な合成手順を使用して、配列番号７のフラグメントを、結果として生じるＦｍｏｃ−ＧＬＰ−１（１１−２２）−２−ＣＴＣと、一般的な合成手順を使用してカップリングさせた。

Ｃ．ＮＭＰ中の１０（ｖ／ｖ）％ピペリジンおよび２（ｖ／ｖ）％ＤＢＵとしてのＦｍｏｃ除去溶液を用いた一般的な合成手順により、フラグメントＦｍｏｃ−（Ｘ^17-18）ＧＬＰ−１（１１−２２）−２−ＣＴＣを段階的に構築した。次に、配列番号７のフラグメントを、結果として生じるＦｍｏｃ−（Ｘ^17-18）ＧＬＰ−１（１１−２２）−２−ＣＴＣと、一般的な合成手順を用いてカップリングさせた。

Ｄ．一般的な合成手順により、フラグメントＦｍｏｃ−（Ｘ^17-18）ＧＬＰ−１（１１−２２）−２−ＣＴＣを段階的に構築した。次に、配列番号７のフラグメントを、結果として生じるＦｍｏｃ−（Ｘ^17-18）ＧＬＰ−１（１１−２２）−２−ＣＴＣと、一般的な合成手順を用いてカップリングさせた。

Ｅ．すぐ上の第Ｄ節の一般的な合成手順により、そして以下の表に述べる相違点を除き、フラグメントＦｍｏｃ−（Ｘ^17-18）ＧＬＰ−１（１１−２２）−２−ＣＴＣを段階的に構築した。次に、配列番号７のフラグメントを、結果として生じるＦｍｏｃ−（Ｘ^17-18）ＧＬＰ−１（１１−２２）−２−ＣＴＣフラグメントと、一般的な合成手順を使用してカップリングさせた。

以下の表は、本実施例の手順Ａ〜Ｅの詳細をまとめたものである：

Ｆ．フラグメントの切断：
本実施例で合成された任意のペプチドフラグメントに関してフラグメントの切断を達成するために、構築されたペプチド−樹脂を１０倍容のＤＣＭ中で３０分膨潤させ、−１０℃に冷却する。ＤＣＭを排液し、１％ＴＦＡ／ＤＣＭ溶液（１０倍容）を加え、３０分間撹拌する。ピリジン（ＴＦＡに対して２〜３当量）の入ったフラスコに切断溶液を収集する。２５℃まで加温する間に、樹脂を１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（１０倍容）で５分処理し、次にピリジン（ＴＦＡの２〜３当量）を加える。もう５分間撹拌した後に、溶液を収集する。次に、樹脂を１０倍容のＤＣＭで４回洗浄する（各回５分）。全ての洗液および切断液を合わせ、水と混合する（水／ＤＣＭ比＝体積比約１／４）。結果として生じる混合液を減圧蒸留し、ＤＣＭを除去する（３５０torr/２８℃）。ＤＣＭが除去されると、ペプチドフラグメントは水から析出（crash out）するので、濾過する。ペプチドフラグメントを水で洗浄し、３０℃で真空下で乾燥させる。

実施例８ 液合成：Ａｒｇの付加
（Ａｉｂ³⁵）ＧＬＰ−１（２３−３５）フラグメント（表Ａによる側鎖保護を有し、Ｎ−末端にＦｍｏｃ保護を有する）（９．１１ｇ、３．９４mmol）をＤＭＳＯ（９０mL）に溶解させた。この溶液に、１０mLのＤＭＳＯと一緒にＨＯＢｔ（２．４２ｇ、４当量）、ＨＢＴＵ（５．９８ｇ、４当量）、ＤＩＥＡ（３．４４mL、５当量）、およびＨ−Ａｒｇ（２ＨＣｌ）−ＮＨ_２（３．８８ｇ、４当量）をチャージした。反応物を撹拌し、ＨＰＬＣによりモニターした。４時間後に、反応は完了していなかったため、２mLのＤＩＥＡを加えた。反応を一晩行った。次に、ピペリジン（５mL）を反応混合物に加えた。Ｆｍｏｃの除去を２時間で行った。反応混合物を氷水（８００mL）でクエンチし、４０分撹拌した。形成した白色固体を濾過し、水（４００mL）で洗浄し、一晩乾燥させ、フラグメント（Ａｉｂ³⁵）ＧＬＰ−１（２３−３６）を得た（９．６５ｇ、重量収率１０９％）。

実施例９
表Ａに記載の側鎖保護基およびＮ−末端のＦｍｏｃ保護を有するフラグメント（Ａｉｂ⁸、Ｘ^17-18）ＧＬＰ−１（７−２２）（７．７３ｇ、２．８８mmol）をＤＭＳＯ（６５mL）に溶解させた。

この溶液に、２０mLのＤＭＳＯと一緒にＨＯＢｔ（０．７３ｇ、４．７７mmol）、ＨＢＴＵ（１．４６ｇ、３．８５mmol）、ＤＩＥＡ（０．７１mL、７．４０mmol）、およびフラグメント（Ａｉｂ³⁵）ＧＬＰ−１（２３−３６）（８．５ｇ、３．４５mmol）をチャージした。反応物を撹拌し、ＨＰＬＣによりモニターした。３時間後に、カップリングは完了した。次に、ピペリジン（５mL）を反応混合物に加えた。Ｆｍｏｃの除去を２時間で行った。反応混合物を氷水（８００mL）でクエンチし、３０分撹拌した。形成した白色固体を濾過し、水（４００mL）で洗浄し、一晩乾燥させ、保護されたペプチド（Ａｉｂ⁸，^X17-18，Ａｉｂ³⁵）ＧＬＰ−１（７−３６）を得た。

実施例１０ 全体的な脱保護
実施例９に準じて調製したペプチド（１６．２４ｇ）をＴＦＡ／ＤＴＴ／水溶液（１００mL／５ｇ／２．０mL）で２時間処理し、結果として生じる溶液を氷浴中のＭＴＢＥ（８００mL）に注いだ。３０分撹拌後に、形成した白色固体を濾過し、ＭＴＢＥ（４００mL）で洗浄し、乾燥させ、粗ペプチド産物を提供した（１６．０ｇ、重量収率１３８％）。結果として生じる脱保護されたペプチドを、これより「粗」ペプチドと呼ぶ。

実施例１１ 精製
粗ペプチドの精製をKromasil（登録商標）Ｃ４（１０ミクロン、２．０×２５cm）カラムで行い、純度９８＋％および収率約６０％（含有物比）で精製ペプチド回収した。精製は、ｐＨ２で第１通過のクロマトグラフィー精製と、それに続くｐＨ９での第２通過を伴った。この精製の後に、精製されたペプチドは、多様な方法でさらに取扱いまたは加工することができる。例として、第２通過からの結果として生じる精製プールを凍結乾燥するか、または濃縮カラムを通過させ、沈殿により単離することができる。両方の単離により、所望のペプチド（アセテート）が回収されよう。

二つの通過プロセスの概要として、粗ペプチドを５mg/ml（含有物に基づく）で１０％アセトニトリル／水（０．２Ｍ酢酸）混合物に溶解させる。１０００mgのインジェクション（含有物に基づく）をアセトニトリル／ＴＨＦ／水／ＴＦＡ勾配を使用して繰り返し行い、純度約９５％の画分をプールする。純度約７０％の「リサイクル画分」もまたプールし、これは収率約３４％を表す。同じアセトニトリル／ＴＨＦ／水／ＴＦＡ勾配を使用して、リサイクル画分を再インジェクトし、純度約８５％のプールを主プールと混合する。第１通過のクロマトグラフィー精製についての含有物比の収率は７０％である。

次に、同じKromasil（登録商標）Ｃ４カラムを用いるが、アセトニトリル／ＴＨＦ／水／酢酸アンモニウム（ｐＨ８．８）勾配を使用した第２通過で、合わせた第１通過のプール（ｐＨ２）をさらに精製した。画分を合わせ、第２通過の回収率約８５％で９８＋％の純度を得た。両精製段階についての全体収率は６０％（含有物比）となろう。

次に、同じKromasil（登録商標）Ｃ４カラムを使用するが、メタノール／水／酢酸アンモニウムのステップ勾配を使用して、合わせた第２通過のプール（ｐＨ８．８）を濃縮した。画分を合わせ、単離の準備ができた状態にした。

Ａ．粗ペプチド溶液の調製：
粗ペプチド８ｇを０．２Ｎ酢酸／アセトニトリルの溶液（９０％：１０％）５００mlに溶解させた。溶液を０．４５ミクロンデュラポア（Durapore）フィルター（直径４７mm）（Millipore）で１回、次にSupor EKVディスクスタックミクロンフィルター（直径０．６５／０．２mm）（Pall Filters）で濾過した。粗インジェクション溶液をＨＰＬＣにより分析し、１mlあたり含有されるペプチド５．０２mg（ｗｔ％）を含有することが見出された（含有されるペプチドは５００ml×５．０２mg/ml＝２５１２mg）。

Ｂ．クロマトグラフィー ｐＨ約２で第１通過
以下の条件で粗溶液を用いてインジェクションを４回繰り返して行った：
カラム：Kromasil製、Ｃ４（１０ミクロン）充填、寸法２．０×２５cm
検出器：２８０nmに設定した紫外検出器（バンド幅８nm、３５０／２０nm参照）
カラム温度：室温
流速：１３．０ml/分（後方圧約５０bar）
移動相：
Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸／１５％アセトニトリル／８５％水混液
Ｂ＝０．１％トリフルオロ酢酸／１５％テトラヒドロフラン／７０％アセトニトリル／１５％水混液
勾配：勾配は、移動相Ａ１００％から開始し、０．１分維持する。次に、試料をポンプＣによりカラムにマニュアルでロードする（ポンプＣの説明については下記参照）。試料のロード後に、１００％Ａから８３％Ａへの直線勾配を１分運転する。次に、その後１１分、移動相を８３％Ａに保つ。次に、第２の直線勾配を７３％Ａまで１０分かけて運転する。次に、その後１５分、移動相を７３％Ａに保つ。次に、運転を完了し、続いて１００％Ｂのフラッシュを１０分、続いて１００％Ａでカラムの再平衡化を２０分行う。

別のアイソクラチックHP1100ポンプ（ポンプＣ）を使用して９．０ml/分で試料をロードした。最初８３％Ａで１１分間等濃度で維持し、続いて７３％Ａまで直線勾配をその後１０分かけることにより、初期に溶出した不純物を主ピークと分離する。次に、７３％Ａを１５分維持する間に、主ペプチドピークが溶出する。この７３％Ａで１５分維持する間に、画分を収集する。

Ｃ．ｐＨ約２の第１回通過のリサイクル：
合わせたプールに添加することができる純度を下回る純度をもつと判定された画分からリサイクルプールを得る。これらの画分を別々に合わせ、等容の水で希釈した。リサイクルのインジェクションを、この別々に合わせたプール由来のカラムに戻した。同じクロマトグラフィー条件を使用し、許容される純度の画分を合わせ、等容の水で希釈し、第１回通過の合わせたプールに加える。

ペプチドピーク近くに溶出する不純物が増加することが原因で、リサイクルインジェクションのためのロードは、粗インジェクションよりも有意に少ない。平均して２回の粗インジェクション毎に１回のリサイクルインジェクションがある。

Ｄ．ｐＨ８．８の第２回通過の分取クロマトグラフィー
最後に合わせた第１回通過プールをｐＨ８．８で再クロマトグラフィーすることによりさらに精製した。第２回通過についてｐＨ８．８を使用すると、不純物の溶出順序が有意に変化し、高い回収率でよりよい浄化が可能になる。この第２のクロマトグラフィー段階に使用する条件は次の通りであった：
カラム：Kromasil製、Ｃ４（１０ミクロン）充填、寸法２．０×２５cm
検出器：２８０nmに設定した紫外線検出器（バンド幅８nm、参照３５０／２０nm）
カラム温度：室温
流速：１３．０ml/分（後方圧約５０ｂａｒ）
移動相：
Ａ＝１５％アセトニトリル／８５％水（酢酸アンモニウム２g/lおよび濃水酸化アンモニウム１ml/lを含有する）の混液
Ｂ＝１５％テトラヒドロフラン／６０％アセトニトリル／２５％水（酢酸アンモニウム２g/lおよび濃水酸化アンモニウム１ml/lを含有する）の混液
勾配：勾配は、移動相Ａ１００％から開始し、０．１分維持する。次に、試料をポンプＣによりカラムにマニュアルでロードする。試料のロード後に、１００％Ａから６７％Ａへの直線勾配を２分かけて運転する。次に、その後３３分、移動相を６７％Ａに保つ。次に、運転を完了し、続いて１００％Ｂのフラッシュを５分、続いて１００％Ａでカラムの再平衡化を１５分行う。

別のアイソクラチックHP1100ポンプを９．０ml/分（ポンプＣ）で使用して試料をロードした。３０分のローディング段階の後で、１００％Ａから６７％Ａへの短い勾配を３０．２〜３２分かけた。６７％Ａに３３分保つ間に、主ペプチドピークが溶出した。画分の収集は、カラムのロード後２０分から開始して、主ピークが溶出を完了した後に終了する。画分を約１５分収集する。許容される画分をプールし、等容の水で希釈する。この精製段階でリサイクルが可能であるが、廃棄する画分は全般にリサイクルインジェクションを正当化するに足るペプチドを含有しない。多数回のインジェクション行い、廃棄する画分をリサイクルのためにプールするならば、このリサイクルは実行可能になりうる。

Ｅ．濃縮：
合わせたプールの第２回通過を最終的に合わせたものを同じカラムにロードし、異なる移動相を使用して迅速に溶出させ、単離用にペプチドを濃縮する。この段階に使用する条件は以下の通りであった：
カラム：Kromasil製、Ｃ４（１０ミクロン）充填、寸法２．０×２５cm
検出器：２８０nmに設定した紫外線検出器（バンド幅８nm、参照３５０／２０nm）
カラム温度：室温
流速：１３．０ml/分（後方圧約５０bar）
移動相：
Ａ＝１０％メタノール／９０％２０ｍＭ酢酸アンモニウムの混液
Ｂ＝９０％メタノール／１０％２０ｍＭ酢酸アンモニウムの混液
勾配：勾配は、移動相Ａ１００％から開始し、０．１分維持する。次に、試料をポンプＣによりカラムにマニュアルでロードする。試料のロード後に、移動相を１００％Ａに５分保つ。次に、移動相を直ちに次の２０分の１００％Ｂに切り替える。次に、運転を完了させ、続いて１００％Ａで１５分間カラムの再平衡化を行う。

別のアイソクラチックHP1100ポンプを９．０ml/分（ポンプＣ）で使用して試料をロードした。４５分のローディング段階の後で、１００％Ａを５分間短時間維持し、次に１００％Ｂへの段階勾配を２０分間運転して、ペプチドを溶出させた。１００％Ｂへの段階勾配の２分後に主ピークが溶出を始めた。その後１２分の画分はペプチドを含有し、単離のためにプールした。

実施例１２ 凍結乾燥
１リットル容の広口ＦＬＰＥボトルを黒く塗った。このボトルに、水性アセトニトリル／酢酸アンモニウム中の（Ａｉｂ⁸，^X17-18，Ａｉｂ³⁵）ＧＬＰ−１（７−３６）アセテートの精製プール（２１０ml）を加えた。容器を脱イオン水３×５mLですすぎ、すすぎ液をプールに加えた。この溶液を混ぜて均一にし、次にキャップをして、液体窒素中でシェル凍結（shell frozen）した。凍結したボトルのキャップを外し、口を二重のキムワイプで覆い、輪ゴムで固定した。ボトルを凍結乾燥器のヴァキュテーナー（vacutainer）に置き、凍結乾燥させた。コンデンサーの温度は−８９℃、圧は１９ミクロンであった。

２４時間後にヴァキュテーナーに通気し、進行をチェックしたが、まだ氷の音が聞こえた。凍結乾燥を再び開始した。

さらに１８時間後にボトルを凍結乾燥器から取り出し、重量をチェックした。重量は不安定で、産物の吸湿性が原因で急速に増加した。固まった産物を黒く塗ったシンチレーションバイアルに速やかに移し、秤量し、ペプチド０．８２２ｇを得た。

実施例１３：精製ペプチドの沈殿
フラスコ中で、純粋な（Ａｉｂ⁸，^X17-18，Ａｉｂ³⁵）ＧＬＰ−１（７−３６）アセテート１００．５mgをＭｅＯＨ／水（９：１容積比）中の２０ｍＭ酢酸アンモニウム２mLに含む溶液を、ＭｅＯＨ／水（９：１容積比）中の２０ｍＭ酢酸アンモニウム１mLで希釈した。撹拌しながら、イソプロパノール（ＩＰＡ）２０mLを２０℃〜２５℃でフラスコにゆっくりと流加した。１５mLのＩＰＡを添加後にポット混合物は濁った。撹拌を２０℃〜２５℃で一晩続けた。沈殿産物を濾過し、５mLのＩＰＡで洗浄し、次に一定重量になるまで真空下で２５℃で乾燥させた。ペプチド９０．９mgを得た（回収率９０．４２％）。

実施例１４：精製ペプチドの単離
フラスコ中で、純粋な（Ａｉｂ⁸，^X17-18，Ａｉｂ³⁵）ＧＬＰ−１（７−３６）アセテート４９７．７mgをＭｅＯＨ／水（９：１容積比）中の２０ｍＭ酢酸アンモニウム１０mLに含む溶液を、ＭｅＯＨ／水（９：１容積比）中の２０ｍＭ酢酸アンモニウム６mLで希釈した。撹拌しながら、イソプロパノール（ＩＰＡ）４０mLを２０℃〜２５℃で３５分かけてフラスコにゆっくりと流加した。２mLのＩＰＡを添加後にポット混合物は濁った。撹拌を２０℃〜２５℃で１時間続けた。沈殿産物を濾過し、５mLのＩＰＡで洗浄し、次に一定重量になるまで真空下で２５℃で乾燥させた。ペプチド４５８．４mgを得た（回収率９２％）。

実施例１５：精製ペプチドの単離
フラスコ中、純粋な（Ａｉｂ⁸，^X17-18，Ａｉｂ³⁵）ＧＬＰ−１（７−３６）アセテート約１０００mgを、ＭｅＯＨ／水（９：１容積比）中の２０ｍＭ酢酸アンモニウム１５０mLに含む撹拌溶液に、９００mLのＩＰＡを濃縮カラムを通して２０℃〜２５℃でゆっくりと加えた。この添加は４５分かけて完了した。２６０mLのＩＰＡを添加後にポット混合物は濁った。撹拌を２０℃〜２５℃で４０分続けた。沈殿産物を濾過し、５mLのＩＰＡで洗浄し、次に一定重量になるまで真空下で２０℃〜２５℃で乾燥させた。ペプチド７４６mgを得た（回収率７４．６％）。

Claims (29)

1. 以下の段階のうち一つまたは複数を含む、インスリン分泌性ペプチドを作製する方法：
   ａ）アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰（配列番号６）（配列中、Ｘ⁸およびＸ¹⁰はそれぞれアキラルなアミノ酸残基であり、ＨおよびＥはそれぞれ側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第１のペプチドフラグメントを提供する段階；
   ｂ）アミノ酸配列ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号８）（配列中、記号Ｘ^17-18で表す残基はシュードプロリンのジペプチド残基であり、該配列のアミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第２のペプチドフラグメントを提供する段階；
   ｃ）該第１のフラグメントを該第２のフラグメントとカップリングさせて、アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号１１）（該配列のアミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第３のペプチドフラグメントを提供する段階；
   ｄ）アミノ酸配列ＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵（配列番号９）（配列中、Ｘ³⁵はアキラルなアミノ酸残基であり、該配列のアミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第４のペプチドフラグメントを提供する段階；
   ｅ）アミノ酸配列ＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号１２）（該配列の残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、該第４のペプチドフラグメントをアルギニンとカップリングさせる段階；および
   ｆ）アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号１３）（該配列の残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含むインスリン分泌性ペプチドを提供するために、該第５のフラグメントを該第３のフラグメントとカップリングさせる段階。
2. ａ）〜ｆ）の段階を含む、請求項１記載の方法。
3. 以下の段階をさらに含む、請求項１または２記載の方法：
   ｇ）アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号５）（配列中、位置８、１０、および３５の記号Ｘは、それぞれ独立してアキラルな、立体障害を受けていてもよいアミノ酸残基を表す）を含むインスリン分泌性ペプチドおよびその対応物を提供するために、側鎖保護基を除去する段階。
4. 以下の段階を含む、請求項１記載のインスリン分泌性ペプチドを作製する方法：
   ａ）アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰（配列番号６）（配列中、Ｘ⁸はＡｉｂに対応するアミノ酸残基であり、Ｘ¹⁰はグリシンに対応するアミノ酸残基であり、ＨおよびＥはそれぞれ側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第１のペプチドフラグメントを提供する段階；
   ｂ）アミノ酸配列ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号８）（配列中、記号Ｘ^17-18で表す残基はシュードプロリンのジペプチド残基であり、該配列のアミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第２のペプチドフラグメントを提供する段階；
   ｃ）該第１のフラグメントを該第２のフラグメントとカップリングさせて、アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号１１）（該配列のアミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第３のペプチドフラグメントを提供する段階；
   ｄ）アミノ酸配列ＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵（配列番号９）（配列中、Ｘ³⁵はＡｉｂに対応するアミノ酸残基であり、該配列のアミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第４のペプチドフラグメントを提供する段階；
   ｅ）アミノ酸配列ＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号１２）（該配列の残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、該第４のペプチドフラグメントをアルギニンとカップリングさせる段階；および
   ｆ）式ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号５）（Ｘ⁸およびＸ³⁵はＡｉｂに対応するアミノ酸残基であり、Ｘ¹⁰はグリシンに対応するアミノ酸残基である）のインスリン分泌性ペプチドおよびその対応物を提供するために、該第５のフラグメントを該第３のフラグメントとカップリングさせ、続いて該側鎖保護基を除去する段階。
5. 以下の段階を含む、請求項１記載のインスリン分泌性ペプチドを作製する方法：
   ａ）アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰（配列番号６）を含むペプチドフラグメントを調製する段階（配列中、Ｘ⁸およびＸ¹⁰はそれぞれアキラルなアミノ酸残基であるか、または該フラグメントがペプチドの塩またはＣ−末端でアミド化されたその誘導体であり、Ｈ、Ｅ、Ｘ⁸およびＸ¹⁰はそれぞれ側鎖保護を含んでいてもよい）；および
   該ペプチドフラグメントをインスリン分泌性ペプチドに組み込む段階。
6. Ｘ⁸がメチルアラニンに対応するアミノ酸残基である、請求項１または５記載の方法。
7. Ｘ¹⁰がグリシンに対応するアミノ酸残基である、請求項１または５記載の方法。
8. アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰（配列番号６）（配列中、Ｘ⁸およびＸ¹⁰はそれぞれアキラルなアミノ酸残基であり、Ｈ、Ｅ、Ｘ⁸およびＸ¹⁰はそれぞれ側鎖保護を含んでいてもよい）を有するペプチドフラグメント。
9. Ｘ⁸がＡｉｂに対応するアミノ酸残基であり、Ｘ¹⁰がグリシンに対応するアミノ酸残基である、請求項８記載のペプチドフラグメント。
10. インスリン分泌性ペプチドが、アミノ酸配列（配列番号５）ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列中、位置８、１０、および３５の記号Ｘは、それぞれ独立してアキラルな、立体障害を受けていてもよいアミノ酸残基を表し、アミノ酸残基の一つまたは複数は側鎖保護を含んでいてもよい）およびペプチドの塩またはＣ−末端でアミド化されたその誘導体を含む、請求項５記載の方法。
11. Ｘ⁸およびＸ³⁵の少なくとも一つがＡｉｂ残基である、請求項１０記載の方法。
12. Ｘ¹⁰がグリシン残基である、請求項１０記載の方法。
13. 以下の段階を含む、請求項１記載のインスリン分泌性ペプチドを作製する方法：
    ｂ）アミノ酸配列ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号８）（配列中、記号Ｘ^17-18で表す残基はシュードプロリンのジペプチド残基である）を含むペプチドフラグメントを調製する段階；および
    該ペプチドフラグメントをインスリン分泌性ペプチドに組み込む段階。
14. インスリン分泌性ペプチドが、アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号１３）（配列中、記号Ｘ⁸、Ｘ¹⁰、およびＸ³⁵は、それぞれ独立してアキラルなアミノ酸残基を表し、Ｘ^17-18はシュードプロリン残基であり、アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）およびその対応物を含む、請求項１３記載の方法。
15. Ｘ^17-18が、式
    （式中、Φは、側鎖保護を含んでいてもよい任意のアミノ酸残基を表し、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれ独立して適切な二価連結部分である）を有する、請求項１または１３記載の方法。
16. Φが、側鎖保護を含んでいてもよいＳｅｒ残基を表す、請求項１５記載の方法。
17. Ｒ²が−ＣＨ₂−である、請求項１５記載の方法。
18. Ｒ¹が、
    （式中、Ｒ³およびＲ⁴は、それぞれ独立してＨもしくは低級アルキルより選択される一価部分であるか、またはＲ³およびＲ⁴は、環構造の共同メンバーであってもよい）である、請求項１５記載の方法。
19. Ｒ³およびＲ⁴がそれぞれメチルである、請求項１８記載の方法。
20. アミノ酸配列ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号８）（配列中、記号Ｘ^17-18で表す残基はシュードプロリンのジペプチド残基であり、アミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含むペプチドまたはペプチドの塩またはＣ−末端でアミド化されたその誘導体。
21. 以下の段階を含む、請求項１記載のインスリン分泌性ペプチドを作製する方法：
    ｃ）アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰（配列番号６）（配列中、Ｘ⁸およびＸ¹⁰はそれぞれアキラルなアミノ酸残基であり、ＨおよびＥはそれぞれ側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第１のペプチドフラグメントを、アミノ酸配列ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号８）（配列中、記号Ｘ^17-18で表す残基はシュードプロリンのジペプチド残基であり、該配列のアミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第２のペプチドフラグメントとカップリングさせて、アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧ（配列番号１１）（該配列のアミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含む第３のペプチドフラグメントを提供する段階；および
    該ペプチドフラグメントをインスリン分泌性ペプチドに組み込む段階。
22. 以下の段階を含む、請求項１記載のインスリン分泌性ペプチドを作製する方法：
    ｄ）アミノ酸配列ＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵（配列番号９）（配列中、Ｘ³⁵はアキラルアミノ酸残基であり、該配列の残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含むペプチドフラグメントまたはその対応物を調製する段階；および
    該ペプチドフラグメントをインスリン分泌性ペプチドに組み込む段階。
23. Ｘ³⁵がメチルアラニンアミノ酸残基である、請求項２２記載の方法。
24. 以下の段階をさらに含む、請求項２２記載の方法：
    ｅ）アミノ酸配列ＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号１２）（該配列の残基は側鎖保護を含んでいてもよい）を含むペプチドフラグメントを提供するために、アミノ酸配列ＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵（配列番号９）を含むペプチドフラグメントまたはペプチドの塩またはＣ−末端でアミド化されたその誘導体をアルギニンとカップリングさせる段階。
25. Ｒが側鎖保護を含まない、請求項２４記載の方法。
26. インスリン分泌性ペプチドが、アミノ酸配列ＨＸ⁸ＥＸ¹⁰ＴＦＴＳＤＶＸ^17-18ＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＸ³⁵Ｒ（配列番号１３）（配列中、記号Ｘ⁸、Ｘ¹⁰、およびＸ³⁵は、それぞれ独立してアキラルアミノ酸残基を表し、該配列のアミノ酸残基は側鎖保護を含んでいてもよく、Ｘ^17-18はシュードプロリンの残基である）およびペプチドの塩またはＣ−末端でアミド化されたその誘導体を含む、請求項２２記載の方法。
27. インスリン分泌性ペプチドが、アミノ酸配列（配列番号５）
    （配列中、位置８、１０、および３５の記号Ｘは、それぞれ独立してアキラルな、立体障害を受けていてもよいアミノ酸残基を表し、アミノ酸残基の一つまたは複数は側鎖保護を含んでいてもよい）およびペプチドの塩またはＣ−末端でアミド化されたその誘導体を含む、請求項２２記載の方法。
28. インスリン分泌性ペプチドが、アミノ酸配列（配列番号４）
    およびペプチドの塩またはＣ−末端でアミド化されたその誘導体を有する、請求項１〜７、１３または２１〜２５記載の方法。
29. インスリン分泌性ペプチドが、アミノ酸配列（配列番号４）
    およびＣ末端がアミド化されたその対応物を有する、請求項２８記載の方法。