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CN104981251B - 胰岛素类似物二聚体 - Google Patents

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Abstract

本文公开了基于胰岛素多肽序列的具有独特的胰岛素受体激动剂活性的胰岛素类似物二聚体、连接两个胰岛素多肽的二聚化接头的二聚化位点和长度。按照一个实施方案，第一和第二胰岛素多肽独立地为两链胰岛素类似物或单链类似物,且第一和第二胰岛素多肽通过B29‑B29’、B1‑C8、B1‑B1或C8‑C8键彼此连接。

Description

胰岛素类似物二聚体
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年9月26日提交的美国临时专利申请号61/705,834的优先权，其内容通过引用以其整体结合到本申请中。
电子提交材料通过引用予以结合
通过引用以其整体予以结合的是随之同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，并且如下识别：2013年9月25日创建的名为“216463SEQLIST_ST25.txt”的45千字节ACII(文本)文件。
发明背景
胰岛素是一种由两链异二聚体组成的肽激素，其通过酶促加工以生物合成法来源于低效能单链胰岛素原前体。人胰岛素由通过二硫键结合在一起的两条肽链(“A链” (SEQID NO: 1)和“B链” (SEQ ID NO: 2))组成，具有共51个氨基酸。B链的C端区和A链的两个末端区在三维结构中缔合以装配用于高亲和力结合胰岛素受体的部位。
胰岛素在几乎所有形式的糖尿病中显示降低葡萄糖的优良无比的能力。遗憾的是，其药理学不是葡萄糖敏感性的，因此能够过度起作用，过度起作用可导致危及生命的低血糖。不稳定的药理学是胰岛素疗法的标志，使得极难以在不发生低血糖的情况下使血糖正常化。而且，天然胰岛素的作用时间短，需要修饰以使其适用于控制基础葡萄糖。延迟胰岛素起效的已确立方法包括降低溶解度和白蛋白结合。
胰岛素样生长因子1和2是其A和B链序列是高度同源的单链线性肽激素，与天然胰岛素具有约50%同源性。IGF A和B链通过“C-肽”连接，其中两种IGF的C肽在大小和氨基酸序列上不同，第一种长度为12个氨基酸，第二种为8个氨基酸。人IGF-1是70个aa的碱性肽，具有SEQ ID NO: 3所示蛋白质序列，与胰岛素原有43%同源性(Rinderknecht等(1978) J.Biol. Chem. 253:2769-2776)。人IGF-2是67个氨基酸碱性肽，具有SEQ ID NO: 4所示蛋白质序列。IGF显示对胰岛素B受体同种型比对A受体同种型显著更低的活性。
申请人之前已鉴定出对胰岛素受体显示高活性的基于IGF-l的胰岛素肽类似物(其中B链的天然Gln-Phe二肽被Tyr-Leu置换) (参见PCT/US2009/068713，其公开内容结合到本文中)。所述类似物(本文称为IGFYL类似物肽)比胰岛素更容易合成，并且能够开发用于胰岛素受体和IGF-1受体的共同激动剂(co-agonist)类似物和选择性胰岛素受体特异性类似物。而且，这些胰岛素类似物还可配制成用于本公开内容的单链胰岛素激动剂(参见PCT/US2001/040699，其公开内容结合到本文中)。
可以形成胰岛素和胰岛素类似物的多聚体，并可按与天然人胰岛素类似的方式用于治疗糖尿病。如本文所公开的，申请人发现胰岛素类似物二聚体的活性高度依赖于连接两个胰岛素多肽的二聚化接头的大小和位置。如本文所公开的，申请人发现保持完全固有效能但仅部分最大反应性的胰岛素二聚体以及对亚型B胰岛素受体有选择性的二聚体。在从给药部位清除和在血浆中平衡后，这类二聚体可提供更精确受控的胰岛素作用的开始和持续时间。
发明概述
本文公开了具有胰岛素受体激动剂活性的胰岛素类似物二聚体，其中二聚体的胰岛素活性水平随胰岛素多肽序列、二聚化的位点和连接两个胰岛素多肽的二聚化接头的长度而变化。胰岛素二聚体在第一和第二胰岛素多肽之间形成，其中每个胰岛素多肽包含A链和B链。本文公开的二聚体的第一和第二胰岛素多肽可独立选自两链胰岛素类似物或单链胰岛素类似物，其中第一和第二胰岛素多肽通过共价键或双官能接头彼此共价连接。
可采用本领域技术人员已知的标准技术，通过在两个官能团之间形成共价键，使第一和第二胰岛素多肽彼此共价结合。例如两个胰岛素多肽可包含或经修饰以包括允许二聚化键形成的必需官能团，所述二聚化键包括二硫键、酰胺键、硫醚键或酯键。在某些实施方案中，提供双官能接头以连接第一和第二胰岛素多肽，其中双官能接头包含羟基和羧酸基，或胺基和羧酸基或硫醇基和羧酸基或硫醇基和硫醇基。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽通过二硫键连接，而在一个备选的实施方案中，第一和第二胰岛素多肽通过硫醚键连接。
在一个实施方案中，胰岛素二聚体是包含第一和第二胰岛素多肽的胰岛素超级激动剂(super agonist) (即对胰岛素受体具有比天然胰岛素大的活性)，其中第一和第二胰岛素多肽各自为两链胰岛素。更具体地讲，第一胰岛素多肽通过每个B链的N端α胺或通过第一和第二胰岛素多肽的B1氨基酸的侧链与第二胰岛素多肽连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽通过位于相应的第一和第二胰岛素单链多肽的各个B链N端α胺的二硫键彼此连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽的A链和B链是天然人胰岛素A链和B链。在一个实施方案中，提供治疗糖尿病的改进方法，其中给予患者胰岛素超级激动剂。有利的是，使用超级激动剂允许以降低的浓度(包括33%、30%、25%、20%或小于20%的天然胰岛素的标准剂量浓度的浓度)给予胰岛素二聚体。另外，可使用超级激动剂胰岛素二聚体形成缀合物，其中非胰岛素组分的大小减小一半(相对于使用胰岛素单体的情况)，因为非胰岛素组分可与包含二聚体的第一和第二胰岛素多肽两者连接。例如第一和第二胰岛素多肽可被聚乙二醇化，其中各个PEG链的大小为5-10或5-20 Kd。从商业前景和治疗前景角度看，预期给予低浓度的具有与第一和第二胰岛素多肽连接的低分子量缀合物部分的胰岛素超级激动剂提供有益结果。
在一个实施方案中，胰岛素二聚体显示胰岛素部分激动剂活性。申请人不希望受任一种理论束缚，但是认为本文公开的胰岛素二聚体的部分激动剂活性来源于这样的事实，即该二聚体显示混合的激动剂/拮抗剂活性。在一个实施方案中，提供包含第一和第二胰岛素多肽的胰岛素部分激动剂二聚体，其中第一和第二胰岛素多肽各自为两链胰岛素多肽，且第一胰岛素多肽通过每个B链的羧基端，包括例如通过独立选自B26、B27、B28、B29和B30的氨基酸位置的氨基酸侧链，与第二胰岛素多肽连接。在一个实施方案中，相对于天然胰岛素，胰岛素部分激动剂对胰岛素受体具有小于66%、50%、40%、33%或20%最大活性。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽通过B链C端氨基酸(例如半胱氨酸)的氨基酸侧链间的二硫键任选通过添加至C端氨基酸(例如B27-B30)侧链的接头彼此连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽通过在第一和第二胰岛素多肽各自的B29氨基酸的氨基酸侧链之间形成的二硫键连接。在一个实施方案中，B29氨基酸是具有以下结构I的侧链的修饰赖氨酸：
，
且第一和第二胰岛素多肽通过二硫键连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽的A链和B链是天然的人胰岛素A链和B链。
在一个备选的实施方案中，提供显示胰岛素部分激动剂活性的胰岛素二聚体，其中第一和第二胰岛素多肽的至少一个是单链胰岛素，且第一和第二胰岛素多肽通过单链胰岛素多肽的连接部分的氨基酸侧链和第二胰岛素多肽B链的N端α胺或N端氨基酸的侧链彼此连接。任选第一和第二胰岛素多肽通过添加至单链类似物氨基酸侧链、添加至第一和第二胰岛素多肽各自B链的N端α胺，或N端氨基酸(例如B1-B4)的侧链的接头(例如半胱氨酸)连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽各自包含具有以下结构I的侧链的修饰赖氨酸：
，
且第一和第二胰岛素多肽通过二硫键连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽两者是其B链通过连接部分与A链连接的单链胰岛素多肽和通过第一和第二胰岛素多肽各自的连接部分每一个的氨基酸侧链彼此连接形成的胰岛素二聚体。按照一个实施方案，第一和第二胰岛素多肽包含人胰岛素的B链和A链或其类似物或衍生物。在一个实施方案中，单链胰岛素多肽连接部分8位上氨基酸的侧链与第二胰岛素多肽B链的N端氨基酸连接(即B1-C8键)。在一个实施方案中，二聚体包含通过B1-C8键与IGF1或IGF II或其类似物连接的人胰岛素多肽。
在一个实施方案中，本文公开的胰岛素二聚体的一个或两个胰岛素多肽还包含通过酰胺键或酯键与二聚体的第一或第二胰岛素多肽的氨基酸的N端α胺或侧链胺共价连接的自切割的二肽元件(U-B) (参见国际申请WO 2009/099763和PCT/US2009/068713，其公开内容在本文通过引用予以结合)。二肽随后的脱去可发生在生理条件下和在不存在酶活性时。在一个实施方案中，前药元件包含结构U-B的二肽，其中U为氨基酸或羟酸，B为通过B的羧基部分和胰岛素多肽的胺之间的酰胺键与所述单链胰岛素激动剂连接的N-烷基化氨基酸，其中U、B或U-B与之连接的单链胰岛素激动剂的氨基酸是非编码氨基酸。
本公开内容包括胰岛素激动剂二聚体的其它衍生物，包括改进基础胰岛素多肽的溶解度的修饰。在一个实施方案中，通过亲水部分与A链或B链的N端或与第一和第二胰岛素多肽的一个或两个的氨基酸侧链的共价键，包括与单链胰岛素多肽的连接肽的氨基酸侧链的键，提高胰岛素多肽的溶解度。在一个实施方案中，亲水部分与选自以下位置的氨基酸的侧链连接：A链的A9、A14和A15或B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29位。在一个实施方案中，亲水部分为聚乙二醇链、酰基或烷基。在一个实施方案中，亲水部分为白蛋白，包括例如白蛋白类，例如人血清白蛋白(HSA)和重组人白蛋白(rHA)。在一个实施方案中，亲水部分为聚乙二醇(PEG)链，其分子量范围选自约500-约40,000道尔顿。在一个实施方案中，聚乙二醇链的分子量的范围选自约500-约5,000道尔顿。在另一个实施方案中，聚乙二醇链的分子量为约10,000-约20,000道尔顿。
酰化或烷基化可延长胰岛素多肽在循环中的半衰期。酰化或烷基化可有利地延迟对胰岛素受体的作用开始时间和/或延长对胰岛素受体的作用持续时间。在亲水部分连接的相同氨基酸位置上，包括例如在连接部分的8位处或在包含自切割二肽元件的氨基酸的侧链上，胰岛素类似物可被酰化或烷基化。
本公开内容还包括包含本文公开的胰岛素二聚体和药学上可接受的载体的药物组合物。按照一个实施方案，提供包含本文公开的任何胰岛素二聚体(优选其纯度水平为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物。所述组合物可含有浓度为以下的本文公开的胰岛素二聚体：至少0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、6 mg/ml、7 mg/ml、8 mg/ml、9 mg/ml、10mg/ml、11 mg/ml、12 mg/ml、13 mg/ml、14 mg/ml、15 mg/ml、16 mg/ml、17 mg/ml、18 mg/ml、19 mg/ml、20 mg/ml、21 mg/ml、22 mg/ml、23 mg/ml、24 mg/ml、25 mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含被灭菌并任选储存在各种包装容器中的水溶液。在其它实施方案中，药物组合物包括冻干粉。药物组合物还可作为药盒的一部分包装，所述药盒包括用于将组合物给予患者的一次性装置。可给容器或药盒贴标签以保存在室温下或在冷藏温度下。
按照一个实施方案，提供调节胰岛素依赖性患者的血糖水平的改进方法，更具体地讲，提供伴随低血糖的风险降低而治疗糖尿病的方法。所述方法包括以对控制糖尿病是治疗有效的量将部分胰岛素激动剂二聚体给予患者的步骤。在一个实施方案中，部分激动剂胰岛素二聚体包含通过二聚化接头彼此连接的第一和第二胰岛素多肽，其中第一和第二胰岛素多肽各自独立地包含选自以下的胰岛素多肽
i) 包含通过链间二硫键连接的A链和B链的两链胰岛素类似物；和ii)包含A链、B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分的第一末端与B链的羧基端共价结合，且所述连接部分的第二末端与A链的氨基端共价结合。在一个实施方案中，A链包含GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 70)的序列，B链包含X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 44)的序列；和
a) 通过相应的第一和第二胰岛素多肽B29位处的氨基酸的侧链彼此连接的第一和第二胰岛素多肽；
b) 所述第一和第二胰岛素多肽的至少一个是单链胰岛素多肽，且第一和第二胰岛素多肽通过所述第一和第二胰岛素多肽之一的B1位处的氨基酸的侧链和所述连接部分的氨基酸的侧链彼此连接；或
c) 第一和第二胰岛素多肽两者是单链胰岛素多肽，且第一和第二胰岛素多肽通过相应的第一和第二胰岛素多肽的连接部分的氨基酸的侧链彼此连接。有利的是，部分激动剂二聚体显示最大剂量反应降低，因此申请人预期在给予患者时所述部分激动剂二聚体可降低低血糖的风险。
在又一个实施方案中，提供对亚型B胰岛素受体(IR-B)有选择性的胰岛素二聚体。申请人发现，在相对于天然胰岛素显示较高IR-A/IR-B比率(即相对于IR-B对IR-A的亲和力较高)的基于胰岛素的多肽和多肽(例如IGF I或IGF II)之间形成的二聚体显示对IR-B活化有优先，如相对于IR-A对IR-B的较高水平的最大受体反应所指示的。在一个实施方案中，提供对亚型B胰岛素受体有选择性的胰岛素二聚体。在一个实施方案中，二聚体包含第一和第二胰岛素多肽，其每一个是包含A链、B链和连接部分的单链胰岛素多肽，其中所述连接部分的第一末端与B链的羧基端共价连接，且所述连接部分的第二末端与A链的氨基端共价连接，其中
第一胰岛素多肽包含
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)的A链序列；
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 2)的B链序列；和
包含选自PEG8-K-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的第一连接部分，和
第二多肽包含
TPAX75SEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 88)或GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA(SEQ ID NO: 5)的A链序列；
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPA (SEQ ID NO: 87)或GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 10)的B链序列；和
包含选自PEG8-K-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的第二连接部分，其中
X68为精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；
X75为赖氨酸或精氨酸；m为选自1-4的整数，R15为H或NH2，而且其中
第一和第二胰岛素多肽通过(i)所述第一或第二胰岛素多肽之一的N端氨基酸的N端胺或侧链和另一个胰岛素多肽的连接部分的侧链或(ii)第一和第二胰岛素多肽各自相应的连接部分的氨基酸的侧链彼此连接。
附图简述
图1是制备人胰岛素的两步合成策略的示意图。实施例1提供所述程序的细节。
图2是比较合成人胰岛素相对于纯化天然胰岛素的胰岛素受体特异性结合的曲线图。通过图1详细描述的方法生产合成胰岛素，其中A7-B7键是所形成的第一个二硫键。如曲线图中提供的数据所示，两种分子具有相似的结合活性。
图3是比较天然胰岛素和IGF1(YB16LB17)类似物的相对胰岛素受体结合的曲线图。如曲线图中提供的数据所示，两种分子具有类似的结合活性。
图4是人胰岛素原(A链，SEQ ID NO: 1；B链，SEQ ID NO: 2和C链，SEQ ID NO: 92)和胰岛素样生长因子I和II (IGF I；SEQ ID NO: 3和IGF II；SEQ ID NO: 4)氨基酸序列的比对。比对表明这3种肽共有高水平的序列同一性(*表明无相应氨基酸的空区，短线(-)表明存在于胰岛素中的相同氨基酸)。
图5A和5B是描述前药dK,(N-异丁基G)-IGF1YL (SEQ ID NO: 86，通过A19 4-氨基Phe连接的二肽)的体外活性的曲线图。图5A是比较在PBS中温育的天然胰岛素和A19 IGF前药衍生物(IGF1YL：dK,(N-异丁基G)随时间(0小时、5小时和52小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图5B是比较在20%血浆/PBS中在37℃下温育的天然胰岛素和A19 IGF前药衍生物(IGF1YL：dK,(N-异丁基G)随时间(0小时、3.6小时和24.8小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。如曲线图中提供的数据所示，当前药形式转化为有活性的IGF1YL肽时，从A19 IGF前药衍生物样品恢复的活性提高。
图6是描述单链B0C1A0胰岛素类似物对A亚型胰岛素的相对体外结合活性和磷酸化活性的柱状图。对天然IGF-1 C肽(010)相对于C肽连接部分中各种氨基酸取代或缺失的活性进行了比较。在B0C1A0胰岛素类似物命名中，B0和A0标识是指A链和B链的天然胰岛素序列，而C1表示IGF-1 C肽。
图7是描述单链B0C1A0胰岛素类似物对A亚型胰岛素的相对体外结合活性和磷酸化活性的柱状图，其中连接性IGF-1 C肽的天然序列在1、2、3、4或8位处被标示的氨基酸取代修饰。该数据结合图8提供的数据表明胰岛素类似物的结合和磷酸化活性之间的一致性。
图8A-8C涉及使用PEG聚合物作为连接部分的单链胰岛素类似物。图8A是显示使用PEG聚合物作为连接部分的IGF-1 YL单链胰岛素类似物的制备的示意图。图8B和8C是描述通过4、8或16单体PEG连接部分连接的单链胰岛素类似物相对于天然胰岛素异源双链体的相对体外结合活性(图8B)和磷酸化活性(图8C)的曲线图。
图9A-9D是显示在小鼠中进行的比较胰岛素耐量试验结果的曲线图，比较了人胰岛素相对于3种不同的酰化胰岛素类似物降低并维持低血糖浓度的能力。测试了两种不同浓度的多肽(27 nmol/kg和90 nmol/kg)。酰化胰岛素包括MIU-41、MIU-36和MIU-37。MIU-41[B1(H5,H10,Y16,L17)26A:A1(H8,rEC16-K14,N18,N21)]是一种两链胰岛素类似物，具有通过与位于A14位的赖氨酸残基连接的γ谷氨酸接头的C16酰化。MIU-36 [B1(C16-K0,H5,H10,Y16,L17)26A:A1(N18,N21)]是一种两链胰岛素类似物，具有与B链N端连接的C16酰化。MIU-37 [B1(H5,H10,Y16,L17,C16rE-K22)26A:A1(N18,N21)]是一种两链胰岛素类似物，具有通过与位于B22位的赖氨酸残基连接的γ谷氨酸接头的C16酰化。
图10A-10D表示使用C57/Blk小鼠从对Detemir和MIU-56的比较胰岛素耐量试验中得到的结果。MIU-56是胰岛素单链类似物B1(H5,Y16,L17)26A-PEG8-K-PEG4-A1(N18,21)，其包含与连接A链和B链的连接部分(PEG8-K-PEG4)中的单一赖氨酸残基侧链连接的20 kDaPEG。图10A和10B是显示胰岛素耐量试验结果的曲线图，其比较了酰化胰岛素类似物Detemir相对于聚乙二醇化单链胰岛素类似物MIU-56降低和保持低血糖水平的能力。图10C和10D分别显示给予Detemir和MIU-56的小鼠的血糖AUC24小时。
图11A-11E。测试了B29-B29’胰岛素二聚体(多肽#51，通过B链的B29赖氨酸侧链间的二硫键连接在一起的2个天然胰岛素多肽间所形成的二聚体)对A型胰岛素受体的受体活性(参见图11A)；通过磷酸化测定法的B型胰岛素受体(参见图11B)和IGF-1受体(参见图11C)和通过体外HMEC增殖测定法测试的促有丝分裂性(参见图11D)。曲线图中的实线表示：通过标示浓度的天然胰岛素(■)或#51 (◆)刺激的A型或B型受体磷酸化(分别于图11A-11B)；短划线表示：通过共温育6 nM胰岛素和标示浓度的胰岛素(■)或#51 (◆)刺激的A型或B型受体磷酸化(分别于图11A-11B)。B29-B29’胰岛素二聚体相对于天然胰岛素对胰岛素和IGF受体的最大剂量反应略降低(约60%)。图11E显示B29-B29’胰岛素的结构。该二聚体相对于天然胰岛素被修饰，在于A链和B链的N端被氨基甲酰化以及B29位的赖氨酸允许巯基接头连接用于在B29处形成二硫键。两个胰岛素多肽各自包含通过未显示但以二聚体形式存在的天然胰岛素二硫键(A6-A11、A7-B7、A20-B19)彼此连接的天然的人胰岛素A链和B链。
图12A和12B提供得自B29-B29’胰岛素二聚体(图12B)相对于天然胰岛素(图12A)的比较胰岛素剂量滴定的数据。以3种剂量(6 nmole/kg、18 nmole/kg和72 nmole/kg)给予天然胰岛素，以3种较高的剂量(18 nmole/kg、72 nmole/kg和144 nmole/kg)给予B29-B29’胰岛素二聚体。与天然胰岛素类似，B29-B29’胰岛素二聚体降低血糖水平，但是B29-B29’胰岛素二聚体对于葡萄糖的起始降低不太急剧，并保持血糖水平在比天然胰岛素所见的甚至更平稳的状态下。
图13A-13C表明B1-B1’胰岛素二聚体的体外胰岛素活性。图13A显示B1-B1’胰岛素二聚体的合成，其中两个单链胰岛素类似物通过经由B1氨基酸侧链的二硫键连接。初始二聚体是无活性的，因为A链与B链的羧基端直接连接。然而在用胰蛋白酶切割单链实体时，便将单链胰岛素类似物转化成两链胰岛素类似物，并形成包含两链胰岛素多肽的胰岛素二聚体，活性恢复，图13B显示天然胰岛素、B1-B1’胰岛素二聚体(在用胰蛋白酶切割后)和B29-B29’胰岛素二聚体对A型胰岛素受体的相对体外活性。B1-B1’胰岛素二聚体(在用胰蛋白酶切割后)是完全胰岛素激动剂，比天然胰岛素具有更大效能。如图13C所示，B1-B1’胰岛素二聚体对A型和B型胰岛素受体两者具有活性，组氨酸置换B22位的天然精氨酸对活性没有显著影响。
图14A-14C表示从使用C57/Blk小鼠的B1-B1’和B29-B29’胰岛素二聚体的比较胰岛素耐量试验获得的结果。以12或60 nmole/kg的剂量给予人胰岛素(图14A)；以12、60或300 nmole/kg的剂量给予B1-B1’胰岛素二聚体和B29-B29’胰岛素二聚体(分别为图14B和14C)。体内实验结果显示，B1-B1’胰岛素二聚体的效能显得是天然胰岛素的约5倍(12nmole/kg B1-B1’胰岛素二聚体的葡萄糖降低特征与60 nmole/kg天然胰岛素的大致相当)。或者，B29-B29’胰岛素二聚体的效能显得只是天然胰岛素的约20% (60 nmole/kg天然胰岛素的葡萄糖降低特征与300 nmole/kg B29-B29’胰岛素二聚体大致相当)。
图15A和15B提供从聚乙二醇化单体和IFG 1单链胰岛素类似物的聚乙二醇化B1-B1'二聚体的胰岛素耐量试验获得的数据。该二聚体包含两个单链胰岛素多肽，其各自包含通过C1肽(C肽被修饰以在8位含有赖氨酸)连接的A链和B链，其中两个胰岛素多肽通过连接两个相应胰岛素多肽的N端氨基酸的PEG 20二聚化接头连接。测量了将多肽#39 (GlyB2-PEG20K单体；参见图15A)和多肽#57 (GlyB2-PEG20K-GlyB2二聚体；参见图15B)给予正常小鼠后血糖水平的24小时时间概况。
图16A-16C表明两个单链IGF-1胰岛素激动剂类似物间形成的胰岛素激动剂二聚体的体外胰岛素活性，其中包含二聚体的第一和第二胰岛素激动剂类似物多肽各自具有A链、B链和C肽，其中A链的N端通过C肽与B链的C端连接，且两个单链IGF-1胰岛素激动剂类似物通过2个C8氨基酸侧链间的二硫键彼此连接。图16A显示C8-C8’ IGF-1类似物二聚体的通用结构。图16B显示C8-C8’ IGF-1类似物二聚体对亚型A胰岛素受体的体外活性的结果。相对于天然胰岛素，C8-C8’ IGF-1类似物二聚体的最大剂量反应略降低(约75%) (参见图16B,▼)。而且，在较高浓度下(例如大于1 nmole/kg)，C8-C8’ IGF-1类似物二聚体具有拮抗剂性质(参见图16B，●)。图16C表明相对于IGF-1受体，C8-C8’ IGF-1类似物二聚体保持对胰岛素受体的选择性。
图17A-17D显示包含两个单链IGF-1胰岛素激动剂类似物的胰岛素二聚体的活性，其中A链和B链通过mini-peg连接部分(PEG8-K-PEG4)连接，且两个胰岛素多肽通过各自的连接部分的赖氨酸侧链连接(B1[[H5Y16L17]25-PEG8KPEG4-A1[N18,21]的LysC8-LysC8二聚体；多肽#53)。通过磷酸化测定法测试了对亚型A胰岛素受体(参见图17A)、亚型B胰岛素受体(参见图17B)和IGF-1受体的活性(参见图17C)，并通过体外亚型A胰岛素受体结合测定法测试了受体结合亲和力(参见图17D)。曲线图中的实线表示：通过标示浓度的天然胰岛素(■)或#53 (●)刺激的亚型A或亚型B受体磷酸化(分别于图17A-17B)；短划线表示：通过共温育6 nM胰岛素和标示浓度的胰岛素(■)或#53 (●)刺激的亚型A或亚型B受体磷酸化(分别于图17A-17B)。
图18A和18B表明包含两个单链IGF-1胰岛素激动剂类似物的胰岛素二聚体的活性，其中A链和B链通过经修饰以在C肽8位含有赖氨酸的C1肽连接，其中两个胰岛素多肽通过各自的连接部分的赖氨酸侧链连接(B1[[H5,10Y16L17]25-C1[K8]-A1[H8N18,21]的LysC8-LysC8二聚体；多肽#54)。通过体外磷酸化测定法测试了对亚型A胰岛素受体(参见图18A)和亚型B胰岛素受体(参见图18B)的活性。显示了通过标示浓度的天然胰岛素(■)或#53 (●)刺激的亚型A或亚型B受体磷酸化(分别于图18A-18B)。
图19A-19D表明包含两个IGF-1胰岛素激动剂类似物的胰岛素二聚体的活性。图19A提供通过第一无活性的胰岛素聚合物的N端氨基酸的侧链和第二单链IGF-1胰岛素激动剂类似物的C8氨基酸的侧链间形成的二硫键在第一无活性的胰岛素多肽和第二胰岛素聚合物之间形成的胰岛素二聚体的结构。所述第一胰岛素多肽是无活性的，因为A链与B链直接融合。如图19B中提供的数据所示，该多肽是胰岛素拮抗剂。然而，发现在两个有活性胰岛素多肽间使用相同的B0-C8键形成的二聚体显示部分激动剂和拮抗剂活性。图19C显示在单链IGF-1胰岛素激动剂和两链IGF-1胰岛素激动剂间形成的二聚体的结构，其中两个胰岛素多肽通过第一胰岛素多肽的N端氨基酸的侧链和第二胰岛素多肽的C8氨基酸的侧链间的二硫键连接。如图19D中提供的数据所示，该多肽显示胰岛素部分激动剂和拮抗剂活性。
图20A-20D显示包含两种不同的胰岛素多肽的胰岛素异二聚体的活性。多肽#59表示包含无活性的IGF 1类似物第一胰岛素多肽(B1[[C1H5Y16L17K29]29-A1[N18,21] (因A链与B链的羧基端直接连接所致无活性)和第二有活性的单链IGF 1类似物(B1[H5Y16L17]25-PEG8KPEG4-A1[N18,21])间形成的二聚体，其中A链和B链通过mini-peg连接部分(PEG8-K-PEG4)连接，且两个胰岛素多肽通过连接部分的赖氨酸侧链和无活性的胰岛素多肽的B1氨基酸侧链连接。多肽#60与多肽#59相同，只是无活性的胰岛素肽被胰蛋白酶切割以产生具有恢复到该多肽的胰岛素活性的两链IGF 1胰岛素类似物。通过磷酸化测定法测试了对A型胰岛素受体(参见图20A)、B型胰岛素受体(参见图20B)和IGF-1受体(参见图20C)的活性，并通过体外亚型A胰岛素受体结合测定法测试了受体结合亲和力(参见图20D)。曲线图中的实线表示：被标示浓度的天然胰岛素(■)、#53 (●)或#60 (▲)刺激的亚型A或亚型B受体磷酸化(分别于图20A-20B)；短划线表示：被共温育6 nM胰岛素和标示浓度的胰岛素(■)或#53 (●)刺激的亚型A或亚型B受体磷酸化(分别于图20A-20B)。
图21A-21E显示包含与IGF2多肽二聚化的胰岛素多肽的胰岛素异二聚体的活性。通过体外磷酸化测定法测试了多肽#61 (与B2-C2[K8]-A2-D2[R4]连接的B025-C1-A0)和多肽#62 (与B2-C2-A2-D2连接的B025-C1[K8]-A0)对亚型A胰岛素受体(参见图21A和21C)、亚型B胰岛素受体(参见图21B和21D)和IGF-1受体(参见图21E)的受体活性。曲线图表示：通过标示浓度的天然胰岛素(■) #53或#60 (●)刺激的亚型A或亚型B受体磷酸化。
图22A：制备化合物#48的合成流程(CysB1-CysB1 #2二聚体；参见表15-17)。
图22B：制备化合物#49的合成流程(PheB1-PheB1 #28二聚体；参见表15-17)。
图22C：制备化合物#51的合成流程(LysB29-LysB29胰岛素二聚体；参见表15-17)。
图22D：制备化合物#52的合成流程(LysB29-LysB29 MIU-3*二聚体；参见表15-17)。
图22E：制备化合物#53的合成流程(LysC8-LysC8 #3二聚体；参见表15-17)。
图22F：制备化合物#55的合成流程(LysB1-LysB1 #20*二聚体；参见表15-17)。
图22G：制备化合物#56的合成流程(LysB1-LysB1 #11二聚体；参见表15-17)。
图22H：制备化合物#58的合成流程(LysC8-PEG20K-LysC8 #3二聚体；参见表15-17)。
图23A：制备化合物B1-硫醇基激活的胰岛素类似物#2的合成流程。
图23B：制备化合物C8-硫醇基修饰的胰岛素类似物#3的合成流程。
图24A：制备二聚体#59的合成流程(有关化合物结构参见表18)。
图24B：制备二聚体#60的合成流程(有关化合物结构参见表18)。
图25A：制备B1-硫醇基激活的胰岛素类似物#27的合成流程。
图25B：制备C8-硫醇基修饰的IGF-2类似物#31的合成流程。
图25C：制备二聚体#61的合成流程(有关化合物结构参见表18)。
图26A：制备C8-硫醇基激活的胰岛素类似物#27*的合成流程。
图26B：制备B1-硫醇基修饰的IGF-2的合成流程。
图26C：制备二聚体#62的合成流程(有关化合物结构参见表18)。
发明详述
定义
为了描述并要求保护本发明，将根据下面给出的定义使用下列术语。
本文所用术语“约”意指大于或小于所述值或值的范围达10%，但无意将任何值或值的范围仅指定在这个较宽泛的定义内。前面有术语“约”的各个值或值范围也欲包括所述绝对值或值的范围的实施方案。
本文所用术语“前药”定义为在显示其药理作用前经过化学修饰的任何化合物。
本文所用术语“氨基酸”包括含有氨基和羧基官能团两者的任何分子，其中氨基和羧酸基与同一碳(α碳)连接。α碳任选可具有一个或两个其它的有机取代基。对于本公开内容的目的，未指定其立体化学的氨基酸的命名欲包括氨基酸的L型或D型或外消旋混合物。然而，在其中氨基酸用其三字母代码表示且包括上标数字的情况下，通过在三字母代码和上标数字之前加小写d来指定氨基酸的D型(例如dLys-1)，其中没有小写d的命名(例如Lys-1)欲指氨基酸的天然L型。在该命名中，加上标数字表示氨基酸在胰岛素类似物序列中的位置，其中位于胰岛素类似物序列中的氨基酸通过自N端连续编号的正的上标数字来表示。在N端或通过侧链与胰岛素类似物肽连接的其它氨基酸以0开始编号，且当它们进一步远离胰岛素类似物序列时，以负的整数值递增。例如，与胰岛素类似物的N端连接的二肽前药内的氨基酸位置称为aa-1-aa0-胰岛素类似物，其中aa0表示二肽的羧基端氨基酸，aa-1表示二肽的氨基端氨基酸。
本文所用术语“羟酸”是指经修饰用羟基置换α碳氨基的氨基酸。
本文所用术语“非编码氨基酸”包括不是任何下列20种氨基酸的L-异构体的任何氨基酸：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr。
“二肽”是α氨基酸或α羟酸通过肽键与另一个氨基酸连接形成的化合物。
没有任何其它标识的本文所用术语“化学切割”包括导致共价化学键断裂的非酶促反应。
“生物活性多肽”是指能够在体外和/或体内发挥生物作用的多肽。
如本文所用，一般提及肽/多肽时欲包括具有经修饰的氨基端和羧基端的肽/多肽。例如，标明标准氨基酸的氨基酸序列欲包括N端和C端的标准氨基酸以及N端的相应羟酸和/或经修饰以包含酰胺基代替末端羧酸的相应C端氨基酸。
本文所用“酰化”氨基酸是包含酰基的氨基酸，其对天然存在的氨基酸而言是非天然的，而不论通过哪种方式产生。产生酰化氨基酸和酰化肽的示例性方法是本领域已知的，包括在加入肽中之前使氨基酸酰化或肽合成后进行肽的化学酰化。在一些实施方案中，酰基使肽具有以下的一种或多种：(i)循环中的半衰期延长，(ii)作用开始时间延迟，(iii)作用持续时间延长，(iv)对蛋白酶(例如DPP-IV)的抗性改进，和(v)对IGF和/或胰岛素肽受体的效能提高。
本文所用“烷基化”氨基酸是包含烷基的氨基酸，其对天然存在的氨基酸而言是非天然的，而不论通过哪种方式产生。产生烷基化氨基酸和烷基化肽的示例性方法是本领域已知的，包括在加入肽中之前使氨基酸烷基化或在肽合成后进行肽的化学烷基化。虽不限于任何特定理论，但认为肽的烷基化可实现与肽的酰化类似(如果不是相同的话)的作用，例如循环中的半衰期延长，作用开始时间延迟，作用持续时间延长，对蛋白酶(例如DPP-IV)的抗性改进，和对IGF和/或胰岛素受体的效能提高。
本文所用术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药用载体，例如磷酸缓冲盐水溶液、水、乳液例如水包油或油包水乳液和各种类型的润湿剂。该术语还包括美国联邦政府管理机构批准的或列于美国药典的用于动物(包括人)的任何物质。
本文所用术语“药学上可接受的盐”是指保持母体化合物的生物活性并且不是生物学或其它方面不合乎需要的化合物的盐。本文公开的许多化合物能够通过存在的氨基和/或羧基或其类似基团形成酸式盐和/或碱式盐。
本文所用术语“亲水部分”包括易溶于水或易吸收水且哺乳动物物种体内耐受而又无毒性作用(即是生物相容的)的任何化合物。亲水部分的实例包括聚乙二醇(PEG)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉(polymethoxazoline)、聚乙基噁唑啉(polyethoxazoline)、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺和衍生化纤维素例如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素及其共聚物以及天然聚合物，包括例如白蛋白、肝素和葡聚糖。
本文所用术语“治疗”包括预防特定病症或病况，或减轻与特定病症或病况有关的症状和/或防止或消除所述症状。例如，本文所用术语“治疗糖尿病”一般可指保持血糖水平接近正常水平，可包括根据指定情形提高或降低血糖水平。
本文所用胰岛素类似物的“有效”量或“治疗有效量”是指无毒但足以提供所需作用的胰岛素类似物的量。例如一种所需效果将会是预防或治疗高血糖症。“有效”的量在受试者与受试者间可不同，这取决于个体的年龄和一般状况、给药方式等。因此，不可能总是指定确切的“有效量”。然而，任何个别情况下，适当的“有效”量可通过本领域普遍技术人员采用常规实验来确定。
术语“胃肠外”意指不通过消化道而是通过某些其它途径，例如鼻内、吸入、皮下、肌内、脊柱内或静脉内。
在整个申请中，用字母和数字对于具体氨基酸位置的所有指称(例如A5位)是指在相应的天然人胰岛素A链(SEQ ID NO: 1)或B链(SEQ ID NO: 2)的A链(例如A5位)或B链(例如B5位)中该位置上的氨基酸，或者在其任何类似物的相应氨基酸位置上的氨基酸。例如，本文中没有任何其它说明的“B28位”的指称可意指其中SEQ ID NO: 2的第1个氨基酸缺失的胰岛素类似物B链的相应的B27位。同样，添加到天然B链N端的氨基酸以B0开始编号，然后随着氨基酸添加到N端，为递增的负值数字(例如B-1，B-2…)。或者，对单链类似物连接部分的氨基酸位置的任何指称参照IGF 1的天然C链(SEQ ID NO: 17)进行。例如，天然C链的9位(或“C9位”)处具有丙氨酸残基。
本文所用术语“天然人胰岛素肽”旨在指明包含SEQ ID NO: 1的A链和SEQ ID NO:2的B链的51个氨基酸异源双链体以及包含SEQ ID NO: 1和2的单链胰岛素类似物。本文所用的没有更多说明性语言的术语“胰岛素多肽”欲包括包含SEQ ID NO: 1的A链和SEQ IDNO: 2的B链的51个氨基酸异源双链体及其单链胰岛素类似物(包括例如已公布的国际申请WO96/34882和美国专利号6,630,348中公开的类似物，两者的公开内容通过引用结合到本文中)，包括包含天然A链和/或B链的修饰类似物的异源双链体和单链类似物及其对胰岛素受体具有活性的衍生物(例如IGF1和IGF2)。这类修饰类似物包括：A19、B16或B25位的氨基酸变为4-氨基苯丙氨酸的修饰，或者选自以下位置的一个或多个氨基酸取代：A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30，或者B1-4和B26-30位的任一个或全部缺失。本文定义的胰岛素多肽还可以是通过非肽部分(例如逆倒位片段(retroinverso fragment))的插入或取代，或者掺入非肽键例如氮杂肽键(CO被NH取代)或假肽键(例如NH被CH2取代)或酯键(例如缩肽，其中一个或多个酰胺(-CONHR-)键被酯(COOR)键置换)而衍生自天然存在的胰岛素的类似物。
“A19胰岛素类似物”是4-氨基苯丙氨酸或4-甲氧基苯丙氨酸取代天然胰岛素A链19位的天然酪氨酸残基的胰岛素肽。
本文所用“IGF1类似物”是包括包含A链和B链的多肽的通用术语，其中A链和B链序列各自分别与天然IGF1 A链和B链序列共有90%或更大的序列同一性。该术语还包括IGF YL类似物。
本文所用“IGF2类似物”是包括包含A链和B链的多肽的通用术语，其中A链和B链序列各自分别与天然IGF2 A链和B链序列共有90%或更大的序列同一性。
“IGF YL类似物”是包含SEQ ID NO: 19的IGF A链和SEQ ID NO: 58的IGF B链的肽。
本文所用术语“单链胰岛素类似物”包括一组结构上相关的蛋白质，其中胰岛素或IGFA和B链或其类似物或衍生物彼此共价连接形成线性多肽链。如本文所公开的，单链胰岛素类似物包含B链的羧基端通过连接部分与A链的氨基端共价连接。
本文所用的没有更多说明性语言的术语“胰岛素A链”欲包括SEQ ID NO: 1的21个氨基酸序列及其功能类似物和衍生物，包括A19胰岛素类似物的A链和本领域技术人员已知的其它类似物，包括SEQ ID NO: 1的序列因在选自以下位置的一个或多个氨基酸插入、缺失或取代而产生的修饰：A4、A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21。
本文所用的没有更多说明性语言的术语“胰岛素B链”欲包括SEQ ID NO: 2的30个氨基酸序列以及天然B链的修饰功能类似物，包括B16或B25位的氨基酸变为4-氨基苯丙氨酸的修饰，或者在选自以下位置的一个或多个氨基酸插入、缺失或取代：B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B25、B26、B27、B28、B29和B30，或者B1-4和B26-30位的任一个或全部缺失。
本文所用术语“衍生物”欲包括对化合物(例如氨基酸)的化学修饰，包括体外化学修饰，例如通过在多肽的一个或多个位置的侧链上引入基团，例如酪氨酸残基中的硝基或酪氨酸残基中的碘，或通过游离羧基转化为酯基或转化为酰胺基，或通过酰化使氨基转化为酰胺，或通过使羟基酰化得到酯，或通过使伯胺烷基化得到仲胺或亲水部分与氨基酸侧链连接。通过多肽中的氨基酸残基侧链的氧化或还原获得其它衍生物。
本文所用的没有更多说明性语言的术语IGF A链欲包括天然IGF 1或IGF 2 (分别为SEQ ID NO: 5和7)的21个氨基酸序列以及本领域技术人员已知的其功能类似物，包括SEQ ID NO: 5和7的序列因在选自以下的位置上的一个或多个氨基酸取代而产生的修饰：A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21。
本文所用的没有更多说明性语言的术语“IGF YL B链”欲包括包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列，包括例如SEQ ID NO: 6的序列以及IGF YL B链的类似物及其衍生物，包括B16或B25位的氨基酸变为4-氨基苯丙氨酸的修饰，或者在选自以下位置的一个或多个氨基酸取代：B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30，或者B1-4和B26-30位的任一个或全部缺失。
本文所用术语“同一性”涉及两个或更多个序列间的相似性。将相同残基的数目除以残基总数，将结果乘以100得到百分比而求出同一性。因此，两个完全相同的序列拷贝具有100%同一性，而彼此相比较具有氨基酸缺失、添加或取代的两个序列具有较低程度的同一性。本领域技术人员应认识到，可获得若干计算机程序用于确定序列同一性，例如应用算法例如BLAST (基础局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool),Altschul等(1993) J. Mol. Biol. 215:403-410)的计算机程序。
本文所用术语分子对第一受体相对于对第二受体的“选择性”是指以下比率：分子对第二受体的EC50除以分子对第一受体的EC50。例如，对第一受体的EC50为1 nM和对第二受体的EC50为100 nM的分子对第一受体的选择性是对第二受体的选择性的100倍。
本文所用的氨基酸“修饰”是指氨基酸的取代或者通过化学基团加至氨基酸和/或从氨基酸中脱去化学基团而引起的氨基酸的衍生化，包括被通常存在于人蛋白质中的20种氨基酸的任一个以及非典型或非天然存在的氨基酸取代。非典型氨基酸的市售来源包括Sigma-Aldrich (Milwaukee，WI)、ChemPep Inc. (Miami，FL)和Genzyme Pharmaceuticals(Cambridge，MA)。非典型氨基酸可购自商品供应商、从头合成或对天然存在的氨基酸进行化学修饰或衍生化。
本文所用氨基酸“取代”是指一个氨基酸残基被不同的氨基酸残基置换。
本文所用术语“保守氨基酸取代”在本文定义为下列5组之一内的交换：
I. 小的脂族无极性或略带极性的残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II. 极性带负电荷的残基及其酰胺：
Asp、Asn、Glu、Gln、半胱磺酸和高半胱磺酸；
III. 极性带正电荷的残基：
His、Arg、Lys；鸟氨酸(Orn)
IV. 大的脂族无极性残基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、高半胱氨酸
V. 大的芳族残基：
Phe、Tyr、Trp、乙酰基苯丙氨酸
本文所用通用术语“聚乙二醇链”或“PEG链”包括环氧乙烷和水的缩合聚合物的混合物，呈支链或直链，用通式H(OCH2CH2)nOH表示，其中n至少为2。“聚乙二醇链”或“PEG链”与数字后缀联用，表明其大致的平均分子量。例如PEG-5,000是指分子量总平均数为约5,000道尔顿的聚乙二醇链。
本文所用术语“聚乙二醇化”等术语包括通过将聚乙二醇链与化合物连接对其天然状态进行修饰的任何化合物。“聚乙二醇化多肽”是具有与多肽共价结合的PEG链的多肽。
本文所用“接头”是使两个独立实体彼此结合的键、分子或分子的基团。接头可为两个实体提供最佳间隔或可进一步提供允许两个实体彼此分开的不稳定连接。不稳定连接包括光可切割基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分和酶可切割基团。
本文使用的“胰岛素二聚体”是包含通过接头彼此共价结合的两个胰岛素多肽的复合体。术语胰岛素二聚体在缺乏任何限定性语言下使用时，既包括胰岛素同二聚体又包括胰岛素异二聚体。胰岛素同二聚体包含2个相同的胰岛素多肽，而胰岛素异二聚体包含2个不同的胰岛素多肽。
本文所用术语“C1-Cn烷基”，其中n可为1-6，表示具有1至规定数目的碳原子的支链或直链烷基。典型的C1-C6烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。
本文所用术语“C2-Cn烯基”，其中n可为2-6，表示具有2至规定数目的碳原子和至少一个双键的烯属不饱和支链或直链基团。这类基团的实例包括但不限于1-丙烯基、2-丙烯基(-CH2-CH=CH2)、1,3-丁二烯基(-CH=CHCH=CH2)、1-丁烯基(-CH=CHCH2CH3)、己烯基、戊烯基等。
术语“C2-Cn炔基”，其中n可为2-6，是指具有2-n个碳原子和至少一个三键的不饱和支链或直链基团。这类基团的实例包括但不限于1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基等。
本文所用术语“芳基”是指具有一个或两个芳族环的单环或二环碳环系统，包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。通过标明存在的碳数目来表示芳环的大小和取代基或连接基团的存在情况。例如，术语“(C1-C3烷基)(C6-C10芳基)”是指通过1-3元烷基链与母体部分连接的5-10元芳基。
本文所用术语“杂芳基”是指含有一个或两个芳族环且在芳族环中含有至少一个氮、氧或硫原子的单环或二环环系统。通过标明存在的碳数目来表示杂芳环的大小和取代基或连接基团的存在情况。例如，术语“(C1-Cn烷基)(C5-C6杂芳基)”是指通过1-“n”元烷基链与母体部分连接的5或6元杂芳基。
本文所用术语“卤素”是指由氟、氯、溴和碘组成的基团的一个或多个成员。
本文所用的没有更多标识的术语“患者”欲包括任何温血脊椎驯养动物(包括例如但不限于家畜、马、猫、狗和其它宠物)和人。
本文所用术语“分离的”意指已从其自然环境中取出。在一些实施方案中，类似物通过重组方法制备，并将类似物从宿主细胞中分离。
本文所用术语“纯化的”包括呈基本上不含通常在天然或自然环境中与分子或化合物有关的污染物的形式的分子或化合物的分离，并意指由于与原始组成的其它组分相分离而提高了纯度。本文使用术语“纯化的多肽”用于描述已与其它化合物相分离的多肽，其它化合物包括但不限于核酸分子、脂质和糖。
“肽模拟物(peptidomimetic)”是指具有不同于既有肽的通用结构的结构、但以类似于既有肽的方式(例如通过模拟该肽的生物活性)起作用的化合物。肽模拟物通常包含天然存在的氨基酸和/或非天然的氨基酸，但还可包含对肽骨架的修饰。例如肽模拟物可包括天然存在的氨基酸的序列，其中具有非肽部分(例如逆倒位片段)插入或取代，或掺入非肽键例如氮杂肽键(CO被NH取代)或假肽键(例如NH被CH2取代)或酯键(例如缩肽，其中一个或多个酰胺(-CONHR-)键被酯(COOR)键置换。或者肽模拟物可不含任何天然存在的氨基酸。
本文所用术语“带电荷的氨基酸”或“带电荷的残基”是指包含在生理pH下在水溶液中带负电荷的(即脱质子化)或带正电荷的(即质子化)的侧链的氨基酸。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸和高谷氨酸，而带正电荷的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电荷的氨基酸包括通常存在于人蛋白质的20种氨基酸中的带电荷的氨基酸以及非典型或非天然存在的氨基酸。
本文所用术语“酸性氨基酸”是指包含第二酸性部分(不是氨基酸的α羧酸)的氨基酸，第二酸性部分包括例如侧链羧酸基或磺酸基。
本文所用的没有更多说明性语言的术语“mini-PEG接头”是一种包含4-16个乙二醇单元的乙二醇线性聚合物，其使多肽与第二聚合物(通常为第二多肽)共价连接。任选mini-PEG可包含氨基酸。
缩写词：
可如下对胰岛素类似物进行缩写：
可用大写A表示A链，用大写B表示B链来标明胰岛素A和B链，其中上标0 (例如A0或B0)可表示基础序列是胰岛素序列(A链：SEQ ID NO: 1，B链SEQ ID NO: 2)，上标1 (例如A1或B1)可表明基础序列是IGF-1序列(A链：SEQ ID NO: 5，B链SEQ ID NO: 6)。偏离天然胰岛素和IGF序列的修饰在标示的A链或B链后用括号表示(例如[B1(H5,H10,Y16,L17):A1(H8,N18,N21)])，其中单字母氨基酸缩写词表示取代，数字表示采用天然胰岛素编号的相应A链或B链中取代的位置。A链或B链间的冒号表示两链胰岛素，而短线可表示共价键，因此表示单链类似物。在单链类似物中，A链和B链间可包括连接部分，标识C1是指天然IGF 1 C肽，SEQ ID NO: 17。有关连接部分的标识“C8位”表示位于该位置的氨基酸对应于SEQ ID NO:17的第8个氨基酸。
实施方案
本文公开了具有胰岛素受体激动剂活性的胰岛素类似物二聚体。该二聚体的胰岛素活性水平随二聚体的结构、特别是胰岛素类似物的序列、连接两个胰岛素多肽的二聚化接头的长度和二聚化的位点而变化。本文公开的胰岛素二聚体在第一和第二胰岛素多肽之间形成，其中各胰岛素多肽包含A链和B链。第一和第二胰岛素多肽可独立选自两链胰岛素类似物(即其中A链和B链仅仅通过内部半胱氨酸残基间的链间二硫键连接)和单链胰岛素类似物(即其中A链和B链在直链中彼此共价连接，并且也包括链间二硫键)，其中第一和第二胰岛素多肽通过共价键或双官能接头彼此连接形成二聚体。按照一个实施方案，第一和第二胰岛素多肽通过二硫键或双官能接头如下连接而彼此连接：
A) 使第一胰岛素多肽B链的N端α胺或N端氨基酸侧链与以下连接
i) 第二胰岛素多肽的N端α胺或N端氨基酸侧链；或
ii) 当第二胰岛素多肽是单链胰岛素类似物连接时，连接第二胰岛素多肽的B链与A链的连接部分的氨基酸侧链；
B) 使第一胰岛素多肽B链的B29氨基酸的侧链与以下连接
i) 第二胰岛素多肽B链的B29氨基酸的侧链；或
ii) 连接第二胰岛素多肽的B链与A链的连接部分的氨基酸侧链；或
C) 当第一胰岛素多肽是单链胰岛素类似物时，使连接第一胰岛素多肽的B链与A链的第一连接部分的氨基酸的侧链与连接第二胰岛素多肽的B链与A链的第二连接部分的氨基酸的侧链连接。在一个实施方案中，当二聚化接头通过连接部分的氨基酸侧链连接第一和第二胰岛素多肽时，连接通过连接部分的C8位的氨基酸而发生。
在一个实施方案中，单链类似物的连接部分包含mini-PEG接头，一种约8-16个乙二醇单元和任选一个或多个氨基酸的短线性聚合物。在一个实施方案中，mini-PEG接头包含结构(PEG)6-8-K-PEG4-6，包括例如PEG8-K-PEG4。在一个实施方案中，包含mini-PEG连接部分的单链胰岛素多肽间形成的二聚体，通过任选与mini-PEG接头的氨基酸(例如赖氨酸)的侧链连接的二聚化键(dimerization bond)或双官能接头连接在一起。例如，在一个实施方案中，mini-PEG接头PEG8-K-PEG4的赖氨酸的侧链可被进一步修饰以提供以下结构
，
使得侧链参与二硫键。在另一个实施方案中，连接部分为肽接头，包括例如IGF 1 C1或IGF 2 C2肽。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽通过与12个氨基酸肽接头的第8个氨基酸的侧链连接的键或双官能接头连接在一起。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物的C1或C2肽连接部分被修饰，任选通过8位的取代以包含含有以下结构的侧链的氨基酸
，
使得侧链参与二硫键。
本文公开的胰岛素二聚体可包含已知对胰岛素受体具有活性的天然人胰岛素的任何衍生物。在一个实施方案中，二聚体的第一和第二胰岛素多肽包含GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 70)的A链氨基酸序列和X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 44)的B链氨基酸序列，其中X4为谷氨酸或天冬氨酸；X5为谷氨酸或谷氨酰胺；X8为苏氨酸、组氨酸或苯丙氨酸；X9为丝氨酸、精氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；X10为丝氨酸或异亮氨酸；X12为丝氨酸或天冬氨酸；X14为精氨酸、酪氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；X15为谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；X25为组氨酸或苏氨酸；X29为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸；X30为组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸或半胱磺酸；X33为天冬氨酸或谷氨酸；X34为丙氨酸或苏氨酸；X41为天冬氨酸或谷氨酸；X42为丙氨酸、鸟氨酸或精氨酸；X45为酪氨酸或苯丙氨酸；且R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，两个A链相同，B链相同或不同。在另一个实施方案中，两个B链相同，两个A链相同或不同；在另一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽的序列相同。在一个实施方案中，A链包含独立选自以下的序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVEECCFRSCDLALLENYCN (SEQ ID NO: 12)和GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)，B链包含独立选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGEHGFFYTPR (SEQ ID NO: 13)和GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQID NO: 14)。
在一个实施方案中，二聚体的胰岛素多肽的一个或两个是单链胰岛素类似物，其中B链的羧基端通过连接肽与A链的氨基端连接。在一个实施方案中，胰岛素多肽的连接肽包含8-17个氨基酸的肽，更具体地讲，在一个实施方案中，该肽表示IGF-1 C肽或其类似物。在一个实施方案中，胰岛素多肽的连接肽包含选自以下的序列：GYGSSSRX68APQT (SEQ IDNO: 9)、GAGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 15)、SRVSRX68SR (SEQ ID NO: 98)、X51X52GSSSX57X68APQT (SEQ ID NO: 17)、X51X52GSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 16)、(SSSSX59APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX60)n (SEQ ID NO: 18)和MGSSSSX59APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQEEEEEX60 (SEQ ID NO: 19)，其中n为选自1、2或3的整数，X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸；X52为丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；X57和X58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸或鸟氨酸；X59和X60独立地为精氨酸、赖氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
X68为赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
其中m为1、2、3或4，在一个实施方案中，m为4。在一个实施方案中，A链独立选自GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO: 1)、GIVEECCFRSCDLALLENYCN (SEQ ID NO: 12)和GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)，B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)或GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQID NO: 14)，且连接A链和B链的连接肽由序列GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)组成，其中X68为包含以下结构的侧链的氨基酸：
。
在一个实施方案中，胰岛素二聚体是胰岛素超级激动剂(即对胰岛素受体具有比天然胰岛素大的活性)。在一个实施方案中，第一胰岛素多肽通过第一和第二胰岛素多肽的B链的N端α胺或N端氨基酸侧链与第二胰岛素多肽连接(即头接头的方式)，其中二聚体显示效能相对于天然胰岛素增加2倍或5倍。在一个实施方案中，超级激动剂胰岛素二聚体包含第一和第二胰岛素多肽，其中第一和第二胰岛素多肽各自为两链胰岛素类似物。更具体地讲，第一胰岛素多肽通过二硫键或第一和第二胰岛素多肽的各B链的2个N端α胺间的其它连接部分与第二胰岛素多肽连接(即头接头的方式)。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽两者的A链包含天然的人胰岛素序列(GIVEQCCTSICSLYQLENYCN；SEQ ID NO: 1)，且B链的至少一个包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGEHGFFYTPKT (SEQ ID NO: 20)。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽各自为天然的人胰岛素，且两个胰岛素多肽通过连接各胰岛素多肽的N端氨基的二硫键彼此连接。
在一个实施方案中，胰岛素二聚体是包含在第一和第二胰岛素多肽之间形成的二聚体的胰岛素部分激动剂，其中两个胰岛素多肽通过连接独立选自相应的第一和第二胰岛素多肽的B26、B27、B28、B29和B30位的B链C端氨基酸的氨基酸侧链的连接部分彼此连接。在一个实施方案中，胰岛素二聚体是包含在第一和第二胰岛素多肽之间形成的二聚体的胰岛素部分激动剂，其中两个胰岛素多肽通过连接独立选自相应的第一和第二胰岛素多肽的B28、B29和B30位的B链C端氨基酸的氨基酸侧链的连接部分彼此连接。在一个实施方案中，连接选自B26-B26’、B26-B27’、B26-B28’、B26-B29’、B26-B30’、B27-B26’、B27-B27’、B27-B28’、B27-B29’、B27-B30’、B28-B26’、B28-B27’、B28-B28’、B28-B29’、B28-B30’、B29-B26’、B29-B27’、B29-B28’、B29-B29’、B29-B30’、B30-B26’、B30-B27’、B30-B28’、B30-B29’和B30-B30’。在一个实施方案中，选自第一和第二胰岛素多肽的B26、B27、B28、B29和B30位的氨基酸包含以下结构I的侧链：
其中m为选自1-4的整数以允许通过2个C端氨基酸的二硫键形成二聚体。在一个实施方案中，胰岛素部分激动剂二聚体包含在第一和第二胰岛素多肽之间形成的二聚体，其中两个胰岛素多肽通过连接第一和第二胰岛素多肽各自的B29氨基酸的氨基酸侧链的连接部分彼此连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽的B29氨基酸包含以下结构I的侧链：
其中m为选自1-4的整数，任选其中m为4，第一和第二胰岛素多肽通过B29和B29’氨基酸侧链间的二硫键连接。在一个实施方案中，相对于天然胰岛素，胰岛素部分激动剂对胰岛素受体的活性小于66%、50%、40%、33%或20%。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽的A链独立选自GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)和GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQID NO: 11)，B链包含独立选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ IDNO: 2)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGEHGFFYTPR (SEQ ID NO: 13)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY(SEQ ID NO: 14)和GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 22)。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽两者的A链包含天然人胰岛素序列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO: 1)，B链的至少一个包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGEHGFFYTPKT (SEQ IDNO: 20)。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽包含人天然胰岛素A链和B链序列。
在一个实施方案中，胰岛素二聚体在第一浓度下具有胰岛素受体激动剂活性，但在第二较高浓度下具有胰岛素受体拮抗剂活性(即部分激动剂/拮抗剂胰岛素类似物)。在一个实施方案中，提供包含在第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽间形成的二聚体的部分激动剂/拮抗剂胰岛素类似物，其中第一胰岛素和第二胰岛素多肽两者为各自包含通过链间二硫键彼此连接的A链和B链的两链胰岛素类似物。在该实施方案中，第一和第二胰岛素多肽通过连接相应的两个B链的羧基端氨基酸侧链的二聚化接头彼此连接，其中第一和第二胰岛素多肽的A链独立选自GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)和GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)，第一和第二胰岛素的B链包含独立选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPX68T (SEQ ID NO: 2)和GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNX68PT(SEQ ID NO: 99)，其中X68为包含以下结构的侧链的氨基酸：
，
使得侧链参与二硫键。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽包含天然胰岛素序列，其中B29和B29'的赖氨酸被修饰以包含以下结构的侧链：
，
且二聚体通过B29和B29'侧链间的二硫键而形成。
在一个实施方案中，提供包含两个胰岛素多肽的部分激动剂/拮抗剂胰岛素类似物，其中胰岛素多肽的至少一个是单链胰岛素，且第一和第二胰岛素多肽通过包含在单链胰岛素多肽的连接肽内的氨基酸的氨基酸侧链，和第二胰岛素多肽的N端α胺或N端氨基酸的侧链彼此连接。按照一个实施方案，第一和第二胰岛素多肽包含人胰岛素的B链和A链或其类似物或衍生物。
在一个实施方案中，二聚体的胰岛素多肽的一个或两个为胰岛素单链类似物，其中B链的羧基端通过包含选自以下序列的肽与A链的氨基端连接：GYGSSSRX68APQT (SEQ IDNO: 9)、GYGSSSRKAPQT (SEQ ID NO: 21)、SRVSRX68SR (SEQ ID NO: 98)或X51X52GSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 16)，其中X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸；X52为丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；X57和X58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸、鸟氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
X68为赖氨酸、精氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
其中m为选自1-4的整数。在又一个实施方案中，提供包含第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽的部分胰岛素激动剂/拮抗剂，其中所述第一胰岛素多肽是单链胰岛素类似物，包含第一A链序列、第一B链序列和第一连接肽，其中所述第一连接肽的第一末端与第一B链的C端共价结合，所述第一连接肽的第二末端与第一A链的氨基端共价结合。第二胰岛素多肽任选为单链胰岛素类似物或包含第二A链序列和第二B链序列的两链胰岛素类似物，前提条件是当所述第二胰岛素多肽为单链胰岛素类似物时，所述第二胰岛素多肽还包含第二连接肽，其中所述第二连接肽的第一末端与B链的羧基端共价结合，所述第二连接肽的第二末端与A链的氨基端共价结合。第一和第二胰岛素多肽通过将所述第一连接肽的氨基酸侧链(任选在8位处)与以下共价连接的键或双官能连接部分而彼此连接：
a) 第二胰岛素多肽B链的N端α胺或N端氨基酸的侧链；或
b) 第二连接肽的氨基酸的氨基酸侧链，在一个实施方案中，第二连接肽的8位。
在一个实施方案中，部分激动剂二聚体的A链包含序列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 70)，二聚体的B链包含序列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 44)，其中X4为谷氨酸或天冬氨酸；X5为谷氨酸或谷氨酰胺；X8为苏氨酸、组氨酸或苯丙氨酸；X9为丝氨酸、精氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；X10为丝氨酸或异亮氨酸；X12为丝氨酸或天冬氨酸；X14为精氨酸、酪氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；X15为谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；X25为组氨酸或苏氨酸；X29为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸；X30为组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸或半胱磺酸；X33为天冬氨酸或谷氨酸；X34为丙氨酸或苏氨酸；X41为天冬氨酸或谷氨酸；X42为丙氨酸、鸟氨酸或精氨酸；X45为酪氨酸或苯丙氨酸；且R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物的连接肽选自GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)、SRVSRX68SR (SEQID NO: 98)、GYGSSSRKAPQT (SEQ ID NO: 21)和X51X52GSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 16)，其中X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸；X52为丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；X57和X58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸或鸟氨酸；X68为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
，
其中m为选自1-4的整数。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物的连接肽选自GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)、SRVSRX68SR (SEQ ID NO: 98)和PEG8-X68-PEG4，而在一个实施方案中，单链胰岛素类似物的连接肽为GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)或PEG8-X68-PEG4。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物的连接肽为GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO:9)。
在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽的序列相同。在一个实施方案中，部分激动剂二聚体包含相同的两个A链，其中B链相同或不同。在另一个实施方案中，两个B链相同，A链相同或不同。在一个实施方案中，A链包含独立选自以下的序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)和GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)，B链包含独立选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGEHGFFYTPR (SEQ ID NO: 13)和GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQID NO: 14)。在一个实施方案中，A链各自包含序列GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO:11)，B链各自包含序列GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 14)。在另一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽两者为单链类似物，且第一和第二胰岛素多肽通过第一和第二胰岛素多肽各自的连接肽的氨基酸的氨基酸侧链而彼此连接。
在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽的A链包含独立选自GIVDECCX8X9SCDLRRLEX18YCX21-R13 (SEQ ID NO: 81)的序列，所述第一和第二胰岛素多肽的B链包含独立选自X25LCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 82)的序列，其中X8为组氨酸或苯丙氨酸；X9为精氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；X18为甲硫氨酸或天冬酰胺；X21为丙氨酸或天冬酰胺；X25为组氨酸或苏氨酸；X42选自丙氨酸、鸟氨酸和精氨酸；且R13为COOH。在一个实施方案中，A链各自为GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)，B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)或GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQID NO: 14)，连接A链和B链的连接肽由序列GYGSSSRKAPQT (SEQ ID NO: 21)或GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)组成。在一个实施方案中，部分胰岛素激动剂/拮抗剂包含第一单链胰岛素多肽，其中A链和B链通过序列GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)连接，其中X68为具有以下结构I的侧链的氨基酸：
其中m为选自1-4的整数，二聚体通过第一胰岛素多肽的连接肽8位氨基酸的侧链和第二胰岛素多肽的N端氨基间的二硫键形成。在一个实施方案中，m为4。在一个实施方案中，部分胰岛素激动剂包含通过B1-C8二聚化接头或C8-C8二聚化接头连接的第一和第二单链胰岛素多肽，其中第一和第二胰岛素多肽两者的A链和B链为通过具有序列GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的连接部分连接的单链胰岛素类似物，其中X68为赖氨酸或具有以下结构I的侧链的氨基酸：
其中m为选自1-4的整数，二聚体通过B链的N端氨基酸侧链与连接部分8位的氨基酸侧链间的二硫键(B1-C8键)或相应的第一和第二胰岛素多肽的连接肽8位氨基酸的2个侧链间的二硫键(C8-C8键)形成。在一个实施方案中，部分胰岛素激动剂包含通过B1-C8二聚化接头连接的第一和第二单链胰岛素多肽，其中第一和第二胰岛素多肽两者的A链和B链通过mini-PEG接头(包括例如PEG8-K-PEG4)连接。在一个实施方案中，胰岛素二聚体是包含在第一和第二胰岛素多肽之间形成的二聚体的胰岛素部分激动剂，其中两个胰岛素多肽通过将第一和第二胰岛素多肽之一的B链的N端氨基酸的氨基酸侧链(包括例如来自B0、B1和B2位)与另一个胰岛素多肽的连接部分的氨基酸侧链(包括例如对应于IGF1 C肽的C6、C7、C8和C9的位置)连接的连接部分而彼此连接。在一个实施方案中，连接选自B0-C6、B0-C7、B0-C8、B0-C9、B1-C6、B1-C7、B1-C8、B1-C9、B2-C6、B2-C7、B2-C8、B2-C9。
按照一个实施方案，提供显示部分激动剂和部分拮抗剂活性的胰岛素类似物二聚体。在一个实施方案中，二聚体包含
i) 第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素和第二胰岛素多肽两者为包含A链、B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分的第一末端与B链的羧基端共价结合，且所述连接部分的第二末端与A链的氨基端共价结合。第一和第二胰岛素多肽通过共价连接相应的第一和第二胰岛素多肽的连接部分的赖氨酸侧链的携带PEG或二硫键的二聚化接头彼此连接。在一个实施方案中，二聚化接头选自
与侧链脂族胺(例如赖氨酸)连接的或。
在该实施方案中，第一和第二胰岛素的A链包含独立选自以下的序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)和GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)，第一和第二胰岛素的B链包含独立选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ IDNO: 23)、GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 77)、GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFY(SEQ ID NO: 89)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 14)、AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 90)和AYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFY (SEQID NO: 92)，
所述第一和所述第二胰岛素多肽的所述连接部分包含独立选自以下的序列：GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)、X51X52GSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 16)和PEG8-X68-PEG4，其中
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸；
X52为丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；
X57和X58之一为精氨酸，另一个为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；和
X68为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
。
按照一个实施方案，提供显示部分激动剂和部分拮抗剂活性的胰岛素类似物二聚体。在一个实施方案中，二聚体包含
第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素多肽为包含第一A链和第一B链的两链胰岛素类似物，其中所述第一A链和第一B链通过链间二硫键彼此连接；
所述第二胰岛素多肽为包含第二A链、第二B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分的第一末端与第二B链的羧基端共价结合，所述连接部分的第二末端与第二A链的氨基端共价结合，
其中第一和第二胰岛素多肽通过携带二硫键的二聚化接头彼此连接，其中二聚化接头的第一末端与所述第一胰岛素多肽的B链的N端氨基酸的侧链或N端胺共价连接，二聚化接头的第二末端与第二胰岛素多肽的连接部分的赖氨酸侧链共价连接，
所述第一和第二胰岛素多肽的A链包含独立选自以下的序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)和GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)
所述第一胰岛素多肽的所述B链包含独立选自以下的序列：CFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 94)、
CGPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 95)、
CGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 96)、
CGPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFYNKPT (SEQ ID NO: 9796)、
CAYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 91)和
CAYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 93)；
所述第二胰岛素多肽的所述B链包含独立选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)、
GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 77)、
GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 89)、
GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 14)、
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 90)和
AYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 92)；
所述第二胰岛素多肽的所述连接部分包含独立选自以下的序列：GYGSSSRX68APQT(SEQ ID NO: 9)、X51X52GSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 16)和PEG8-X68-PEG4，其中
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸；
X52为丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；
X57和X58之一为精氨酸，另一个为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
X68为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
。
按照一个实施方案，提供显示部分激动剂和部分拮抗剂活性的胰岛素类似物二聚体。在一个实施方案中，二聚体包含
第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素和第二胰岛素多肽两者为包含A链、B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分的第一末端与B链的羧基端共价连接，且所述连接部分的第二末端与A链的氨基端共价连接，而且其中第一和第二胰岛素多肽通过携带PEG或二硫键的二聚化接头彼此连接，其中二聚化接头的第一末端与第一或第二胰岛素多肽之一的连接部分的赖氨酸侧链共价连接，二聚化接头的第二末端与另一个第一或第二胰岛素多肽的B链的N端胺共价连接。在一个实施方案中，二聚化接头选自
与胰岛素B链的侧链脂族胺(例如赖氨酸)或N端胺连接的或。在该实施方案中，第一胰岛素多肽的A链包含序列TPAKSEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 103)；第一胰岛素多肽的B链包含序列AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 90)或AYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFY (SEQID NO: 92)；第二胰岛素多肽的A链包含序列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)；第二胰岛素多肽的B链包含独立选自FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)和GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 14)的序列。第一和第二胰岛素多肽的连接部分包含独立选自以下的序列：GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)、SRVSRX68SR (SEQ ID NO:98)和PEG8-X68-PEG4，其中X68为精氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
。
按照一个实施方案，提供显示部分激动剂和部分拮抗剂活性的胰岛素类似物二聚体。在一个实施方案中，二聚体包含
第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素和第二胰岛素多肽两者为包含A链、B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分的第一末端与B链的羧基端共价连接，且所述连接部分的第二末端与A链的氨基端共价连接，而且其中第一和第二胰岛素多肽通过共价连接至相应的第一和第二胰岛素多肽的连接部分的赖氨酸侧链的携带PEG或二硫键的二聚化接头而彼此连接，
所述第一和第二胰岛素的所述A链包含独立选自以下的序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)和GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)，
所述第一和第二胰岛素的所述B链包含独立选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)和GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ IDNO: 14)，
所述二聚化接头包含独立选自以下的序列：GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)和PEG8-X68-PEG4，其中
X68为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
。
按照一个实施方案，提供显示部分激动剂和部分拮抗剂活性的胰岛素类似物二聚体。在一个实施方案中，二聚体包含
第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素多肽为包含第一A链和第一B链的两链胰岛素类似物，其中所述第一A链和第一B链通过链间二硫键彼此连接；
所述第二胰岛素多肽为包含第二A链、第二B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分的第一末端与第二B链的羧基端共价结合，所述连接部分的第二末端与第二A链的氨基端共价结合，
其中第一和第二胰岛素多肽通过第一胰岛素多肽的B链的N端半胱氨酸侧链和第二胰岛素多肽的连接部分的修饰赖氨酸侧链间的二硫键彼此连接，
所述第一和第二胰岛素多肽的所述A链包含独立选自以下的序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)和GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)
所述第一胰岛素多肽的所述B链包含独立选自以下的序列：CFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 94)和CGPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFYNKPT (SEQ ID NO: 97)；
所述第二胰岛素多肽的所述B链包含独立选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)和GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ IDNO: 14)；
所述第二胰岛素多肽的所述连接部分包含序列GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)，其中X68为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
。
受体亚型选择性
在又一个实施方案中，提供对亚型B胰岛素受体(IR-B)有选择性的胰岛素二聚体。申请人发现，在基于胰岛素的多肽和显示较高IR-A/IR-B比率(即相对于IR-B对IR-A的亲和力较高)的肽(例如IGF I或IGF II)间形成的异二聚体显示对IR-B活化有优先，如相对于IR-A对IR-B的较高水平的最大受体反应所指示的。在一个实施方案中，提供显示相对于亚型A胰岛素受体对IR-B活化有优先的胰岛素异二聚体。
在一个实施方案中，第一胰岛素多肽包含GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 70)的A链氨基酸序列和X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ IDNO: 44)的B链氨基酸序列，第二多肽包含GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)、TPAX75SEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 88)或GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ IDNO: 5)的A链序列；AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPA SEQ ID NO: 87)或GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 10)的B链序列；和包含选自PEG8-X68-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的连接部分，其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；X5为谷氨酸或谷氨酰胺；X8为苏氨酸，组氨酸或苯丙氨酸；X9为丝氨酸、精氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；X10为丝氨酸或异亮氨酸；X12为丝氨酸或天冬氨酸；X14为精氨酸、酪氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；X15为谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；X25为组氨酸或苏氨酸；X29为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸；X30为组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸或半胱磺酸；X33为天冬氨酸或谷氨酸；X34为丙氨酸或苏氨酸；X41为天冬氨酸或谷氨酸；X42为丙氨酸、鸟氨酸或精氨酸；X45为酪氨酸或苯丙氨酸；R13为COOH或CONH2；X68为精氨酸、赖氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；
X75为赖氨酸或精氨酸。在一个实施方案中，异二聚体的胰岛素多肽是两链胰岛素多肽。在一个备选的实施方案中，异二聚体的第一和第二多肽两者是具有独立选自以下的连接部分的单链胰岛素多肽
GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)；
X51X52GSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 16)；
(SSSSX59APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX60)n (SEQ ID NO: 18)；
MGSSSSX59APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQEEEEEX60 (SEQ ID NO: 19)；和
W2-Z2-Y2，其中
W2为PEG6、PEG7或PEG8；
Y2为PEG4、PEG5或PEG6；和
Z2为赖氨酸、半胱氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
，其中
n为选自1、2或3的整数；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸；
X52为丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；
X57和X58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸或鸟氨酸；
X59和X60独立地为精氨酸或赖氨酸；和
X68为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
其中m为选自1-4的整数。
在一个实施方案中，二聚体包含第一和第二胰岛素样多肽，其至少一个是单链胰岛素样多肽，其中
第一胰岛素多肽包含
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)的A链序列；
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)的B链序列；和
任选包含选自PEG8-X68-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的第一连接部分，其中
X68为精氨酸、赖氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；和
第二多肽包含
TPAX75SEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 88)或GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA(SEQ ID NO: 5)的A链序列；
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPA SEQ ID NO: 87)或GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 10)的B链序列；和
任选包含选自PEG8-X68-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的第一连接部分，其中
X68为精氨酸、赖氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；和
X75为赖氨酸或精氨酸；而且其中第一和第二胰岛素多肽通过所述第一或第二胰岛素多肽之一的N端胺或N端氨基酸的氨基酸侧链和另一个胰岛素多肽的连接部分的赖氨酸侧链彼此连接，任选在连接部分的8位处。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽两者为单链胰岛素多肽。在一个实施方案中，第一或第二多肽之一为包含通过链间二硫键连接的A链和B链的两链异源双链体；另一个胰岛素多肽为包含A链、B链和连接部分的单链胰岛素多肽，其中连接部分为PEG8-X68-PEG4或GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)，其中
X68为赖氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；和
m为4，所述第一和第二胰岛素多肽通过两链胰岛素多肽B1位的氨基酸侧链和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的8位的氨基酸侧链或单链胰岛素多肽的PEG8-X68-PEG4的赖氨酸侧链彼此连接。
在一个实施方案中，异二聚体的第一和第二多肽各自为单链胰岛素多肽，其中第一胰岛素多肽包含
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)的A链序列；
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)的B链序列；和
包含选自PEG8-X6-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的第一连接部分；和
第二IGF多肽包含
TPAX75SEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 88)或GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA(SEQ ID NO: 5)的A链序列；
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPA SEQ ID NO: 87)或GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 10)的B链序列；和
包含选自PEG8-K-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的第二连接部分，其中
X68为赖氨酸、精氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；和
X75为赖氨酸或精氨酸；而且其中第一和第二连接部分连接各自B链的羧基端与A链，且第一和第二胰岛素多肽通过所述第一或第二多肽之一的N端胺或B1位的氨基酸侧链与另一个多肽的连接部分的赖氨酸侧链彼此连接。
在一个实施方案中，异二聚体的第一和第二多肽各自为单链胰岛素多肽，其中第一胰岛素多肽包含
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)的A链序列；
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)的B链序列；和
包含选自PEG8-K-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的第一连接部分；和
第二IGF多肽包含
TPAX75SEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 88)的A链序列；
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPA SEQ ID NO: 87)的B链序列；和
包含选自PEG8-X68-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的第二连接部分，其中
X68为精氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；和
X75为赖氨酸或精氨酸；而且其中第一和第二连接部分连接各自B链的羧基端与A链，且第一和第二胰岛素多肽通过所述第一或第二多肽之一的N端胺或B1位的氨基酸侧链与另一个多肽的连接部分的赖氨酸侧链彼此连接。
按照一个实施方案，提供显示部分激动剂和部分拮抗剂活性且对亚型B胰岛素受体有选择性的胰岛素类似物二聚体。在一个实施方案中，二聚体包含
第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素和第二胰岛素多肽两者为包含A链、B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中对于所述第一和第二胰岛素多肽的每一个，其各自的连接部分的第一末端与B链的羧基端共价结合，其各自的连接部分的第二末端与A链的氨基端共价结合，而且其中第一和第二胰岛素多肽通过携带二硫键的二聚化接头彼此连接，其中二聚化接头的第一末端与第一或第二胰岛素多肽之一的连接部分的赖氨酸侧链共价连接，二聚化接头的第二末端与另一个第一或第二胰岛素多肽的B链的N端胺共价连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽通过携带二硫键的二聚化接头彼此连接，其中二聚化接头的第一末端与第一胰岛素多肽的连接部分的赖氨酸侧链共价连接，二聚化接头的第二末端与第二胰岛素多肽的B链的N端胺共价连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽通过携带二硫键的二聚化接头彼此连接，其中二聚化接头的第一末端与第二胰岛素多肽之一的连接部分的赖氨酸侧链共价连接，二聚化接头的第二末端与第一胰岛素多肽的B链的N端胺共价连接。在该实施方案中，第一胰岛素多肽的A链包含序列TPAKSEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO:103)，第一胰岛素多肽的B链包含序列AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 90)，所述第一胰岛素多肽的连接部分包含序列RVSRX68SR (SEQ ID NO: 98)。第二胰岛素多肽的A链包含序列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)，第二胰岛素多肽的B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)，所述第二胰岛素多肽的连接部分包含序列GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)，其中
X68为精氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
。
单链胰岛素类似物的肽接头
按照一个实施方案，本文公开的单链胰岛素类似物的连接部分是IGF 1 C链序列(GYGSSSRRAPQT；SEQ ID NO: 24)或其衍生物。在一个实施方案中，该衍生物是通过赖氨酸、半胱氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸或乙酰基-苯丙氨酸残基的单一氨基酸取代而不同于SEQ IDNO: 24的肽，而在又一个实施方案中，赖氨酸、半胱氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸或乙酰基-苯丙氨酸氨基酸被聚乙二醇化或脂肪酰化。在一个进一步的实施方案中，连接部分是通过单一赖氨酸取代而不同于SEQ ID NO: 24的肽。在一个具体实施方案中，取代在SEQ ID NO:24的8位处进行。
申请人发现，使用IGF 1 C链序列和其类似物作为连接部分可产生具有接近野生型胰岛素活性的单链胰岛素类似物。而且，使用IGF 1 C链序列类似物作为连接部分，其中IGF 1 C链序列的2位被修饰，或羧基端4个氨基酸从IGF 1 C链序列中缺失，产生对胰岛素有选择性的单链胰岛素多肽(即与IGF-1受体相比，对胰岛素受体具有较高的结合和/或活性)。在一个实施方案中，相对于IGF-1受体，单链胰岛素多肽对胰岛素受体具有5x、10x、20x、30x、40x或50x较高的亲和力或活性。
按照一个实施方案，连接部分是IGF 1 C链序列(GYGSSSRRAPQT；SEQ ID NO: 24)的衍生物，并包含通过1-3个氨基酸取代或1-2个氨基酸取代而不同于GYGSSSRR (SEQ IDNO: 25)或GAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 26)的非天然序列。在一个实施方案中，氨基酸取代的至少一个是赖氨酸或半胱氨酸取代，而在一个实施方案中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。在一个实施方案中，连接部分是8-17个氨基酸的肽(或肽模拟物)，其包含通过1个氨基酸取代(包括例如被赖氨酸或半胱氨酸取代)而不同于GYGSSSRR (SEQ ID NO: 25)或GAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 26)的非天然氨基酸序列。在一个实施方案中，连接部分包含序列GYGSSSRR (SEQ ID NO: 25)或GAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 26)。在一个实施方案中，连接部分包含序列GAGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 15)、GYGSSSX57X68APQT (SEQ ID NO: 37)或通过单一氨基酸取代而不同于SEQ ID NO: 15的氨基酸，其中X57为精氨酸，X68为具有以下结构I的侧链的氨基酸：
其中m为选自1-4的整数。
在又一个实施方案中，聚乙二醇链与所述连接部分的8位的氨基酸侧链连接。在另一个实施方案中，连接部分包含序列GX52GSSSRX58APQT (SEQ ID NO: 38)，其中X52为任何非芳族氨基酸，包括例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸，X58表示具有与其侧链共价连接的聚乙烯链的氨基酸。在一个实施方案中，X58为聚乙二醇化赖氨酸。在一个实施方案中，连接部分包含序列GYGSSSRX58 (SEQ ID NO: 100)或GAGSSSRX58APQT (SEQ ID NO:15)，其中X58表示具有与其侧链共价连接的聚乙烯链的氨基酸。
在一个实施方案中，连接部分为由以下组成的8-17个氨基酸序列：序列X51X52GSSSRR (SEQ ID NO: 27)、SEQ ID NO: 27的肽模拟物或通过SEQ ID NO: 27的3-8位之一处的1、2或3个氨基酸取代而不同于SEQ ID NO: 27的氨基酸序列，其中X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸，X52为任何氨基酸。在一个实施方案中，连接部分是长度为8个氨基酸的肽，包含序列GYGSSSRR (SEQ ID NO: 25)或通过单一氨基酸取代而不同于SEQ ID NO: 18的氨基酸序列，或其衍生物。
在另一个实施方案中，连接部分为8-17个氨基酸序列，其包含序列GX52GSSSRR(SEQ ID NO: 31) (其中X52为任何氨基酸)、SEQ ID NO: 31的肽模拟物或其在SEQ ID NO:31的1、3、4、5、6、7或8位的任一处以单一氨基酸取代而不同于SEQ ID NO: 31的类似物，前提条件是当连接肽长于8个氨基酸时，X52不是酪氨酸。按照一个实施方案，连接部分包含选自以下的8-17个氨基酸序列：GYGSSSRR (SEQ ID NO: 25)、GAGSSSRR (SEQ ID NO: 27)、GAGSSSRRA (SEQ ID NO: 28)、GAGSSSRRAP (SEQ ID NO: 29)、GAGSSSRRAPQ (SEQ ID NO:30)、GAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 26)、PYGSSSRR (SEQ ID NO: 31)、PAGSSSRR (SEQ IDNO: 32)、PAGSSSRRA (SEQ ID NO: 33)、PAGSSSRRAP (SEQ ID NO: 34)、PAGSSSRRAPQ (SEQID NO: 35)、PAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 36)。
非肽连接部分
在一个实施方案中，本文公开的单链胰岛素多肽的连接部分是相对短的双官能非肽聚合物接头，其长度接近8-16个氨基酸序列。按照一个实施方案，非肽连接部分为约4-20、8-18、8-16、8-14、10-14、10-12或11-13个单体的聚乙二醇接头。在一个实施方案中，提供单链胰岛素激动剂，其中天然B链的最后5个羧基氨基酸缺失，且氨基酸B25通过共价键与连接部分直接连接。连接部分的第二末端与A链的氨基酸A1共价结合，因此通过连接部分连接B链和A链。在一个实施方案中，连接部分为包含至少10个但不超过16个单体单元的线性聚乙二醇连接部分，而在另一个实施方案中，聚乙二醇连接部分包含至少12个但不超过16个单体单元，而在又一个实施方案中，聚乙二醇连接部分包含至少10个但不超过14个单体单元。
按照一个实施方案，聚乙二醇连接部分包含以下结构：
其中m为范围为6-18、8-16、10-14或11-13的整数。在一个实施方案中，m为选自10、11、12、13或14的整数。在一个实施方案中，m为12。
在一个实施方案中，提供单链胰岛素激动剂，其中天然B链的最后5个羧基氨基酸缺失，且氨基酸B25通过包含至少8个但不超过16个单体单元的聚乙二醇和1-4个氨基酸的氨基酸序列的连接部分与A链的氨基酸A1连接。按照一个实施方案，连接部分包含1-4个氨基酸序列和与所述1-4个氨基酸序列共价结合的长为至少8个但小于14个单体单元的线性聚乙二醇，条件是氨基酸序列不是YTPK (SEQ ID NO: 37)或FNKP (SEQ ID NO: 38)。在另一个实施方案中，提供单链胰岛素激动剂，其中天然B链的最后5个羧基氨基酸缺失，且氨基酸B25通过包含长为至少8个但小于14个单体单元的聚乙二醇和2-5个氨基酸序列的连接部分与A链的氨基酸A1连接。2-5个氨基酸序列可位于B链和聚乙二醇链之间，或位于A链和聚乙二醇链之间。然而，当2-5个氨基酸序列位于B链和聚乙二醇链之间时，氨基酸序列不是YTPKT (SEQ ID NO: 39)或FNKPT (SEQ ID NO: 40)。
在一个实施方案中，连接部分包含被1、2、3或4个氨基酸分隔开的2个聚乙烯链。在该实施方案中，连接部分包含通用结构：W2-Z2-Y2
其中
W2和Y2独立地为以下通用结构的聚乙二醇
；
Z2为1-3个氨基酸序列，其中m为3-7的整数。在一个实施方案中，W2为PEG6、PEG7或PEG8，Y2为PEG4、PEG5或PEG6，Z2为单个氨基酸。在一个实施方案中，Z2为Lys或Cys。在一个实施方案中，Z2包含聚乙二醇化Lys或Cys氨基酸。在一个实施方案中，连接部分包含表示被单个氨基酸分隔开的共8-12或10-14或12个乙二醇单体单元的2个聚乙烯链。在一个实施方案中，单个氨基酸为赖氨酸或半胱氨酸。在一个实施方案中，W2为PEG8，Y2为PEG4和Z2为赖氨酸。
胰岛素A链和B链
本发明的胰岛素多肽可包含人胰岛素的天然B链和A链序列(分别为SEQ ID NO: 1和2)或当以异源双链体彼此连接时具有胰岛素激动剂活性的任何已知的其类似物或衍生物。这类类似物包括例如具有因一个或多个氨基酸缺失、一个或多个氨基酸取代和/或一个或多个氨基酸插入(其不破坏胰岛素类似物的胰岛素活性)而不同于人胰岛素的A链和B链的A链和B链的蛋白质。
胰岛素类似物的一种类型即“单体胰岛素类似物”是本领域众所周知的。这些是人胰岛素的速效类似物，包括例如这样的胰岛素类似物，其中：
(a) B28位的氨基酰基残基被Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代，B29位的氨基酰基残基是Lys或Pro；
(b) B27、B28、B29和B30位任一位置的氨基酰基残基缺失或被非天然氨基酸取代。在一个实施方案中，提供包含B28位被Asp取代或28位被Lys取代和B29位被脯氨酸取代的胰岛素类似物。其它单体胰岛素类似物公开于Chance等，美国专利号5,514,646；Chance等，美国专利申请顺序号08/255,297；Brems等，Protein Engineering, 5:527-533 (1992)；Brange等，EPO公布号214,826 (1987年3月18日公布)；以及Brange等，Current Opinion inStructural Biology, 1:934-940 (1991)。这些公开内容通过引用明确结合到本文中用于描述单体胰岛素类似物。
胰岛素类似物还可用酸性形式置换酰胺化氨基酸。例如，Asn可被Asp或Glu置换。同样地，Gln可被Asp或Glu置换。具体地讲，Asn(A18)、Asn(A21)或Asp(B3)或这些残基的任何组合可被Asp或Glu置换。同样地，Gln(A15)或Gln(B4)或两者可被Asp或Glu置换。
如本文所公开的，提供包含人胰岛素的B链和A链或其类似物或衍生物的胰岛素单链类似物，其中B链的羧基端通过连接部分与A链的氨基端连接。在一个实施方案中，A链为选自以下的氨基酸序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)或GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)，B链包含选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 14)和GPETLCGX26ELVDX27LYLVCGDX42GFYFNKPT-R14(SEQ ID NO: 41) (其中X26和X27各自为丙氨酸，X42为精氨酸)或其相当于B26、B27、B28、B29和B30的1-5个氨基酸缺失的羧基缩短序列和这些序列的类似物，其中各序列被修饰以在相当于选自A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30的天然胰岛素位置(参见图4所示肽比对)的位置处包含1-5个氨基酸取代。在一个实施方案中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。在不会不利影响胰岛素的所需活性的这些位置处的合适的氨基酸取代为本领域技术人员所知，如例如Mayer等, Insulin Structure and Function, Biopolymers. 2007;88(5):687-713所表明的，其公开内容通过引用结合到本文中。
按照一个实施方案，胰岛素类似物肽可包含胰岛素A链和胰岛素B链或其类似物，其中A链包含在天然肽的长度内与GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)或GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)的至少一个共有至少70%序列同一性(例如70%、75%、80%、85%、90%、95%)的氨基酸序列，B链包含在天然肽的长度内与序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)，GPETLCGX26ELVDX27LYLVCGDX42GFYFNKPT-R14(SEQ ID NO: 41)的至少一个共有至少60%序列同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%)的氨基酸序列(其中X26和X27各自为丙氨酸，X42为精氨酸)或其相当于B27、B28、B29和B30的1-4个氨基酸缺失的羧基缩短序列。
可将其它氨基酸序列加至本发明的胰岛素多肽B链的氨基端或A链的羧基端上。例如，可将一系列带负电荷的氨基酸加至B链的氨基端上，包括例如长为1-12、1-10、1-8或1-6个氨基酸的肽且包含一个或多个带负电荷的氨基酸，包括例如谷氨酸和天冬氨酸。在一个实施方案中，B链氨基端突出端包含1-6个带电荷的氨基酸。在一个实施方案中，B链包含序列GEEEEEWFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPR (SEQ ID NO: 42)或GEEEEEKGPEHLCGAHLVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 43)，其中X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。按照一个实施方案，所公开的胰岛素多肽包含C端酰胺或酯替换A链上的C端羧酸基。
高效能胰岛素多肽还可根据描述于国际申请PCT/2009/068713 (其公开内容通过引用明确结合到本文中)的修饰的IGF I和IGF II序列来制备。更具体地讲，包含在相当于天然胰岛素的B16和B17的位置处天然IGF氨基酸被酪氨酸亮氨酸二肽取代的IGF I和IGFII的类似物对胰岛素受体的效能提高10倍。因此，本文所公开的胰岛素多肽可包括IGF I(SEQ ID NO: 5)或IGF II (SEQ ID NO: 7)的A链和IGF I (SEQ ID NO: 6)或IGF II (SEQID NO: 8)的B链或天然胰岛素(SEQ ID NO: 2)的B链。另外，本文所公开的胰岛素多肽可包括天然胰岛素A链或其类似物和IGF I (SEQ ID NO: 6)或IGF II (SEQ ID NO: 8)的B链以及所述B链的类似物。在一个实施方案中，胰岛素多肽包含IGF I (SEQ ID NO: 5) A链或其类似物或衍生物和IGF I (SEQ ID NO: 6)、IGF II (SEQ ID NO: 8)或天然胰岛素(SEQ IDNO: 2)的B链或其类似物或衍生物。
单链IGF或胰岛素A链和B链的其它修饰包括例如A19、B16或B25 (相对于天然胰岛素A链和B链)的一个或多个位置处的氨基酸变为4-氨基苯丙氨酸的修饰或者在选自以下位置处的一个或多个氨基酸取代：A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30 (相对于胰岛素的天然A链和B链)或者B1-4和B26-30位的任一个或全部缺失。在一个实施方案中，相对于天然胰岛素序列，选自A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30的位置处的取代是保守氨基酸取代。
按照一个实施方案，B链包含序列
R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 44)，A链包含序列
GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 45)，其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸；
R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 46)、FVNQ (SEQ ID NO: 47)、PGPE (SEQ ID NO:48)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端α胺；和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，X8、X25和X30各自为组氨酸。在又一个实施方案中，胰岛素多肽包含SEQ ID NO: 68的A链肽序列和/或SEQ ID NO: 69的B链肽序列的类似物，其中A链和B链的类似物各自包含1-3个另外的氨基酸取代。
按照一个实施方案，提供胰岛素类似物，其中胰岛素肽的A链包含序列GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 49)，B链包含序列X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 65)，其中
X8选自苏氨酸和组氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X23为天冬酰胺或甘氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸。在又一个实施方案中，B链包含序列X22VNQX25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYT-Z1-B1 (SEQ ID NO: 66)，其中
X22选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
Z1为选自天冬氨酸-赖氨酸、赖氨酸-脯氨酸和脯氨酸-赖氨酸的二肽；和
B1选自苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽。
按照一些实施方案，胰岛素多肽包含具有序列R23-R24-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 44)或R23-R22-HLCGSX30LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 67)的B链和具有序列GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 68)的A链
其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X14为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酰胺或谷氨酸；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X22选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸和甘氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸；
R22选自X22VNQ (SEQ ID NO: 101)、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺和键；
R23为N端α胺或X60(X61X62)dX63K (SEQ ID NO: 102)
其中
X60选自甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸；
X61和X62独立选自谷氨酸和天冬氨酸；
X63选自精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；
d为选自1-3的整数；
R24选自AYRPSE (SEQ ID NO: 46)、PGPE (SEQ ID NO: 48)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、二肽脯氨酸-谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和键；和
R13为COOH或CONH2。
按照一些实施方案，A链包含序列GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO:49)或GIVDECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 50)，B链包含序列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 51)，其中
X8为组氨酸或苯丙氨酸；
X9和X14独立选自精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
X23为天冬酰胺或甘氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸；和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，n和k的至少一个为1。
在又一个实施方案中，A链包含序列GIVDECCHX9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQID NO: 50)，B链包含序列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 51)，其中
X9和X14独立选自精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
X23为天冬酰胺或甘氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸，和
R13为COOH或CONH2。在又一个实施方案中，A链包含序列GIVDECCHX9SCDLX14X15LX17MX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 52)，B链包含序列X25LCGAX30LVDALYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 53)，其中
X9、X14和X15独立地为鸟氨酸、赖氨酸或精氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸，和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，B链选自HLCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQID NO: 54)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 55)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNPKT (SEQ ID NO: 56)和GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNKPT (SEQ ID NO: 57)，其中X42选自鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸。在又一个实施方案中，A链包含序列GIVDECCHX9SCDLX14X15LQMYCN-R13 (SEQ ID NO: 18)，其中X9、X14和X15独立地为鸟氨酸、赖氨酸或精氨酸。
在一个实施方案中，提供包含通式IB-LM-IA的胰岛素单链类似物，其中IB为选自以下的氨基酸序列：HLCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 54)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 55)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNPKT(SEQ ID NO: 56)和GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNKPT (SEQ ID NO: 57)，LM为选自以下的连接部分：GAGSSSX57RAPQT SEQ ID NO: 18)、GYGSSSX57R (SEQ ID NO: 58)，IA为氨基酸序列GIVDECCHX9SCDLX14X15LQMYCN-R13 (SEQ ID NO: 18)，其中X9、X14、X15、X42和X57独立地为鸟氨酸、赖氨酸或精氨酸。在一个进一步的实施方案中，连接部分为GYGSSSOR (SEQ ID NO:59)。
在一个实施方案中，B链选自HLCGAELVDALYLVCGDOGFY (SEQ ID NO: 60)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDOGFY (SEQ ID NO: 61)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDOGFYFNPKT (SEQID NO: 62)和GPEHLCGAELVDALYLVCGDOGFYFNKPT (SEQ ID NO: 63)，A链为GIVDECCHOSCDLOOLQMX19CN-R13 (SEQ ID NO: 64)，其中X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸。
胰岛素多肽的聚乙二醇化
申请人出乎意料地发现，亲水部分与本文公开的胰岛素单链类似物的共价连接提供起效较慢、持续时间延长和显示基础活性特性的类似物。在一个实施方案中，本文所公开的胰岛素多肽单链胰岛素类似物被进一步修饰以包含亲水部分，其与单链胰岛素类似物中位于选自A链的A9、A14和A15的位置上的氨基酸侧链共价连接或者在B链的N端α胺上(例如胰岛素型B链的B1位或IGF-1型B链的B2上)或者在B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29位的氨基酸侧链上或者在连接A链和B链的连接部分的任何位置上共价连接。在示例性的实施方案中，该亲水部分与在这些位置上的任一个的Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰基-苯丙氨酸残基共价连接。在一个实施方案中，亲水部分与连接部分的氨基酸侧链共价连接。
示例性的亲水部分包括聚乙二醇(PEG)，例如分子量为约1,000道尔顿-约40,000道尔顿或约20,000道尔顿-约40,000道尔顿的聚乙二醇。其它合适的亲水部分包括聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(例如POG)、聚氧乙烯化山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油(POG)、聚氧烷撑(polyoxyalkylene)、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇共聚物、单甲氧基聚乙二醇、单(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸) (均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇(propropylene glycol)均聚物(PPG)及其它聚环氧烷烃、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、肠菌酸(colonic acid)或其它多糖聚合物、聚蔗糖(Ficoll)或葡聚糖及其混合物。
按照一些实施方案，亲水部分例如聚乙二醇链的分子量选自约500-约40,000道尔顿。在一个实施方案中，亲水部分(例如PEG)的分子量选自约500-约5,000道尔顿或约1,000-约5,000道尔顿。在另一个实施方案中，亲水部分(例如PEG)的分子量为约10,000-约20,000道尔顿。在另外其它的示例性实施方案中，亲水部分(例如PEG)的分子量为约20,000-约40,000道尔顿。在一个实施方案中，亲水部分(例如PEG)的分子量为约20,000道尔顿。在一个实施方案中，提供胰岛素多肽，其中类似物的一个或多个氨基酸被聚乙二醇化，且共价连接的PEG链的总的分子量约为20,000道尔顿。
在一个实施方案中，葡聚糖用作亲水部分。葡聚糖是主要通过α1-6键连接的葡萄糖亚基的多糖聚合物。可获得许多分子量范围的葡聚糖，例如约1 kD-约100 kD，或从约5、10、15或20 kD到约20、30、40、50、60、70、80或90 kD。
还考虑了线性或支链聚合物。所得缀合物的制备物基本上可为单分散的或多分散的，且每个肽可具有约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分。
在一个实施方案中，亲水部分是聚乙二醇(PEG)链，任选连接至胰岛素单链类似物中选自A链的A9、A14和A15位、B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29位的氨基酸侧链、B链的N端α胺或连接A链和B链的连接部分的任何位置(包括例如在C8位)上。在一个实施方案中，胰岛素单链类似物包含8-12个氨基酸的肽连接部分，其中连接部分的氨基酸之一具有与其侧链共价结合的聚乙烯链。在一个实施方案中，胰岛素单链类似物包含8-12个氨基酸的肽连接部分，其中连接部分的氨基酸被聚乙二醇化，且在选自A链的A9、A14和A15；B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29位的位置上的一个或多个氨基酸也被聚乙二醇化。在一个实施方案中，共价连接的PEG链的总分子量约为20,000道尔顿。
亲水部分(例如聚乙二醇)可在用于使蛋白质与活化聚合物分子反应的任何合适条件下与胰岛素多肽连接。可采用本领域已知的任何方法，包括通过酰化、还原性烷基化、迈克尔加成、硫醇基烷基化或通过PEG部分上的反应基(例如醛、氨基、酯、硫醇基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)与目标化合物上的反应基(例如醛、氨基、酯、硫醇基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)的其它化学选择性缀合/连接方法。可用于使水溶性聚合物与一个或多个蛋白质连接的活化基团包括而不限于砜、马来酰亚胺、巯基、硫醇基、三氟甲磺酸基、三氟乙基磺酸酯(tresylate)、氮杂环丙烷(azidirine)、氧杂环丙烷和5-吡啶基。如果通过还原性烷基化与肽连接，则所选择的聚合物应具有单个活性醛，使得聚合度受控制。参见例如Kinstler等, Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002)；Roberts等,Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002)；以及Zalipsky等, Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995)。
在本发明的一个具体方面，具有硫醇基的胰岛素多肽上的氨基酸残基用亲水部分(例如PEG)修饰。在一些实施方案中，在迈克尔加成反应中，硫醇基被马来酰亚胺激活的PEG修饰，得到包含以下所示硫醚键的聚乙二醇化肽：
。
在一些实施方案中，在亲核取代反应中，硫醇基用卤素乙酰基激活的PEG修饰，得到包含以下所示硫醚键的聚乙二醇化肽：
。
胰岛素多肽的酰化
在一些实施方案中，胰岛素多肽被修饰以包含酰基。酰基可与胰岛素多肽的氨基酸直接共价连接，或通过间隔基(spacer)与胰岛素多肽的氨基酸间接连接，其中间隔基位于胰岛素多肽的氨基酸和酰基之间。胰岛素多肽可在亲水部分所连接的相同氨基酸位置上或在不同的氨基酸位置上被酰化。例如，酰化可发生在包括A链或B链的任何氨基酸的任何位置上以及连接部分内的位置上，只要在酰化时保持非酰化胰岛素多肽所具有的活性。非限制性实例包括A链的A14和A15位、对于胰岛素型B链在B1位或对于IGF-1型B链在B2位或单链胰岛素类似物的B链的B10、B22、B28或B29位或连接部分的任何位置处的酰化。
在本发明的一个具体方面，胰岛素多肽(或其衍生物或缀合物)通过胰岛素多肽的氨基酸侧链的胺、羟基或硫醇基的直接酰化而被修饰以包含酰基。在一些实施方案中，胰岛素多肽通过氨基酸的侧链胺、羟基或硫醇基被直接酰化。在一些实施方案中，酰化位于B28或B29 (按照天然胰岛素A链和B链序列的氨基酸编号)上。在这一方面，可提供在A链或B链序列中通过一个或多个氨基酸取代而被修饰的胰岛素多肽，包括例如A14、A15、B1、B2、B10、B22、B28或B29位(按照天然胰岛素A链和B链序列的氨基酸编号)或具有包含侧链胺、羟基或硫醇基的氨基酸的连接部分的任何位置。在本发明的一些具体实施方案中，胰岛素多肽的直接酰化发生在B28或B29位(按照天然胰岛素A链和B链序列的氨基酸编号)的氨基酸的侧链胺、羟基或硫醇基上。
在一个实施方案中，胰岛素多肽包含下式I的氨基酸：
其中n = 1-4
[式I]
在一些示例性的实施方案中，式I的氨基酸是其中n为4 (Lys)或n为3 (Orn)的氨基酸。
在另一个实施方案中，胰岛素多肽包含下式II的氨基酸：
其中n = 1-4
[式II]
在一些示例性的实施方案中，式II的氨基酸是其中n为1 (Ser)的氨基酸。
在又一个实施方案中，胰岛素多肽包含是下式III的氨基酸的侧链硫醇基：
其中n = 1-4
[式III]
在一些示例性的实施方案中，式III的氨基酸是其中n为1 (Cys)的氨基酸。
在又一个实施方案中，胰岛素多肽包含含式I、式II或式III的相同结构的二取代的氨基酸，只是式I、式II或式III的氨基酸的α碳所键合的氢被第二侧链置换。
按照一个实施方案，酰化胰岛素多肽包含肽和酰基间的间隔基。在一些实施方案中，胰岛素多肽与间隔基共价结合，所述间隔基与酰基共价结合。在一些示例性的实施方案中，胰岛素多肽通过间隔基的胺、羟基或硫醇基的酰化被修饰以包含酰基，该间隔基与B28或B29位(按照天然胰岛素的A链或B链的氨基酸编号)或间隔基部分的任何位置上的氨基酸侧链连接。间隔基所连接的胰岛素多肽的氨基酸可以是包含允许与间隔基连接的部分的任何氨基酸。例如包含侧链-NH2、-OH或-COOH的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是适合的。
在一些实施方案中，胰岛素多肽和酰基间的间隔基是包含侧链胺、羟基或硫醇基的氨基酸(或包含含有侧链胺、羟基或硫醇基的氨基酸的二肽或三肽)。在一些实施方案中，间隔基包括亲水双官能间隔基。在一个具体的实施方案中，间隔基包含氨基聚(烷氧基)羧酸基。在这一方面，间隔基可包括例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1-6的任何整数，n为2-12的任何整数，例如8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，可市购获自Peptides International,Inc. (Louisville，KY)。在一个实施方案中，亲水双官能间隔基包含两个或更多个反应基团，例如胺、羟基、硫醇基和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，亲水双官能间隔基包含羟基和羧酸基。在其它实施方案中，亲水双官能间隔基包含胺基和羧酸基。在其它实施方案中，亲水双官能间隔基包含硫醇基和羧酸基。
在一些实施方案中，胰岛素多肽和酰基间的间隔基是疏水双官能间隔基。疏水双官能间隔基是本领域已知的。参见例如Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson(Academic Press, San Diego, CA, 1996)，其通过引用以其整体予以结合。在某些实施方案中，疏水双官能间隔基包含两个或更多个反应基团，例如胺、羟基、硫醇基和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，疏水双官能间隔基包含羟基和羧酸基。在其它实施方案中，疏水双官能间隔基包含胺基和羧酸基。在其它实施方案中，疏水双官能间隔基包含硫醇基和羧酸基。包含羧酸基和羟基或硫醇基的合适的疏水双官能间隔基是本领域已知的，包括例如8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。
按照某些实施方案，双官能间隔基可以是包含长为3-10个原子的氨基酸骨架的合成或天然存在的氨基酸(例如6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸)。或者，间隔基可以是具有长为3-10个原子(例如6-10个原子)的肽骨架的二肽或三肽间隔基。与胰岛素多肽连接的二肽或三肽间隔基的各个氨基酸可独立选自：天然存在的和/或非天然存在的氨基酸，包括例如天然存在的氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)的任何D或L异构体或选自以下的非天然存在的氨基酸任何D或L异构体：β-丙氨酸(β-Ala)、N-α-甲基-丙氨酸(Me-Ala)、氨基丁酸(Abu)、α-氨基丁酸(γ-Abu)、氨基己酸(ε-Ahx)、氨基异丁酸(Aib)、氨基甲基吡咯甲酸、氨基哌啶甲酸、氨基丝氨酸(Ams)、氨基四氢吡喃-4-甲酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸(β-Asp)、氮杂环丁烷甲酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基正戊酸(瓜氨酸，Cit)、β-环己基丙氨酸(Cha)、乙酰氨基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dpr)、二羟基苯丙氨酸(DOPA)、二甲基噻唑烷(DMTA)、γ-谷氨酸(γ-Glu)、高丝氨酸(Hse)、羟脯氨酸(Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基-异亮氨酸(MeIle)、4-哌啶甲酸(Isn)、甲基-亮氨酸(MeLeu)、甲基-赖氨酸、二甲基-赖氨酸、三甲基-赖氨酸、亚甲基脯氨酸、甲硫氨酸-亚砜(Met(O))、甲硫氨酸-砜(Met(O2))、正亮氨酸(Nle)、甲基-正亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对氨基苯甲酸(PABA)、青霉胺(penicillamine，Pen)、甲基苯丙氨酸(MePhe)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-NO2))、4-氰基苯丙氨酸((Phe(4-CN))、苯甘氨酸(Phg)、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、3,4-二氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、硒代半胱氨酸(Sec)、U-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(Sta)、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸(ACHPA)、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1,2,3,4,-四氢-异喹啉-3-甲酸(Tic)、四氢吡喃甘氨酸、噻吩基丙氨酸(Thi)、U-苄基-磷酸酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、酪氨酸硫酸四丁胺、甲基-缬氨酸(MeVal)、1-氨基-1-环己烷甲酸(Acx)、氨基戊酸、β-环丙基-丙氨酸(Cpa)、炔丙基甘氨酸(Prg)、烯丙基甘氨酸(Alg)、2-氨基-2-环己基-丙酸(2-Cha)、叔丁基甘氨酸(Tbg)、乙烯基甘氨酸(Vg)、1-氨基-1-环丙烷甲酸(Acp)、1-氨基-1-环戊烷甲酸(Acpe)、烷基化3-巯基丙酸、1-氨基-1-环丁烷甲酸(Acb)。在一些实施方案中，二肽间隔基选自：Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-氨基丁酸-γ-氨基丁酸和γ-Glu-γ-Glu。
可通过长链烷烃的酰化对胰岛素多肽进行修饰以包含酰基。在具体的方面，长链烷烃包含与胰岛素多肽的羧基或其活化形式反应的胺、羟基或硫醇基(例如十八胺、十四醇和十六烷硫醇)。胰岛素多肽的羧基或其活化形式可以是胰岛素多肽的氨基酸(例如谷氨酸、天冬氨酸)的侧链的一部分或可以是肽骨架的一部分。
在某些实施方案中，胰岛素多肽通过用与胰岛素多肽连接的间隔基使长链烷烃酰化而被修饰以包含酰基。在具体的方面，长链烷烃包含与间隔基的羧基或其活化形式反应的胺、羟基或硫醇基。本文描述了包含羧基或其活化形式的合适的间隔基，包括例如双官能间隔基，例如氨基酸、二肽、三肽、亲水双官能间隔基和疏水双官能间隔基。本文所用术语“羧基的活化形式”是指具有通式R(C=O)X的羧基，其中X为离去基团，R为胰岛素多肽或间隔基。例如，羧基的活化形式可包括但不限于酰氯、酐和酯。在一些实施方案中，活化羧基是具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)离去基团的酯。
有关本发明的这些方面，其中长链烷烃被肽胰岛素多肽或间隔基酰化，长链烷烃可具有任何大小，并可包含任何长度的碳链。长链烷烃可以是直链或支链的。在某些方面，长链烷烃为C4-C30烷烃。例如，长链烷烃可以是以下任一种：C4烷烃、C6烷烃、C8烷烃、C10烷烃、C12烷烃、C14烷烃、C16烷烃、C18烷烃、C20烷烃、C22烷烃、C24烷烃、C26烷烃、C28烷烃或C30烷烃。在一些实施方案中，长链烷烃包含C8-C20烷烃，例如C14烷烃、C16烷烃或C18烷烃。
在一些实施方案中，胰岛素多肽的胺、羟基或硫醇基被胆固醇酸(cholesterolacid)酰化。在一个具体的实施方案中，肽通过烷基化脱氨基Cys间隔基(即烷基化3-巯基丙酸间隔基)与胆固醇酸连接。通过胺、羟基和硫醇基进行肽酰化的合适方法是本领域已知的。参见例如Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996)；Shimohigashi和Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982)；以及Previero等, Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972) (对于通过羟基酰化的方法)；San和Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005) (对于通过硫醇基酰化的方法)；Bioconjugate Chem. “Chemical Modifications of Proteins: History andApplications” 第1, 2-12页(1990)；Hashimoto等, Pharmacuetical Res. “Synthesisof Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity (胰岛素的棕榈酰衍生物的合成及其生物活性)” 第6卷, 第2期, 第171-176页(1989)。
酰化肽胰岛素多肽的酰基可具有任何大小，例如任何长度的碳链，并且可以是直链或支链的。本发明的一些具体的实施方案中，酰基为C4-C30脂肪酸。例如，酰基可以是以下任一种：C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸。在一些实施方案中，酰基是C8-C20脂肪酸，例如C14脂肪酸或C16脂肪酸。
在一个备选的实施方案中，酰基是胆汁酸。胆汁酸可以是任何合适的胆汁酸，包括但不限于胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸。
本文所述酰化胰岛素多肽可被进一步修饰以包含亲水部分。在一些具体的实施方案中，亲水部分可包含聚乙二醇(PEG)链。亲水部分的掺入可通过任何合适的方法(例如本文所述的任何方法)实现。在一些实施方案中，酰化单链类似物包含选自Cys、Lys、Orn、homo-Cys或Ac-Phe的氨基酸，且氨基酸的侧链与亲水部分(例如PEG)共价键合。在一个实施方案中，酰基任选通过包含Cys、Lys、Orn、homo-Cys或Ac-Phe的间隔基与A14、A15、B1位(对于胰岛素型B链)、B2位(对于IGF-1型B链)、B10、B22、B28或B29位(按照天然胰岛素的A链和B链的氨基酸编号)连接。
或者，酰化胰岛素多肽包含间隔基，其中间隔基被同时酰化和修饰以包含亲水部分。合适的间隔基的非限制性实例包括包含选自Cys、Lys、Orn、homo-Cys和Ac-Phe的一个或多个氨基酸的间隔基。
胰岛素多肽的烷基化
在一些实施方案中，胰岛素多肽被修饰以包含烷基。烷基可与胰岛素多肽的氨基酸直接共价连接，或通过间隔基与胰岛素多肽的氨基酸间接连接，其中间隔基位于胰岛素多肽的氨基酸和烷基之间。烷基可通过醚、硫醚或氨基键与胰岛素多肽连接。例如，胰岛素多肽可在亲水部分所连接的相同氨基酸位置上或在不同的氨基酸位置上被烷基化。烷基化可在胰岛素多肽内的任何位置(包括例如在B链的C端区或连接部分的位置)上进行，只要保持胰岛素活性。在本发明的一个具体方面，胰岛素多肽通过胰岛素多肽的氨基酸侧链的胺、羟基或硫醇基的直接烷基化被修饰以包含烷基。在一些实施方案中，胰岛素多肽通过氨基酸的侧链胺、羟基或硫醇基被直接烷基化。在本发明的一些具体的实施方案中，胰岛素多肽的直接烷基化通过A14、A15、B1位(对于胰岛素型B链)、B2位(对于IGF-1型B链)、B10、B22、B28或B29位(按照天然胰岛素的A链和B链的氨基酸编号)上的氨基酸的侧链胺、羟基或硫醇基发生。
在一些实施方案中，胰岛素多肽的氨基酸包含选自式I、式II和式III的氨基酸，且烷基通过分别包含在式I、式II和式III中的氨基、羟基或硫醇基连接。在一些示例性的实施方案中，式I的氨基酸是其中n为4 (Lys)或n为3 (Orn)的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，式II的氨基酸是其中n为1 (Ser)的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，式II的氨基酸是其中n为1 (Cys)的氨基酸。在另外其它的实施方案中，包含侧链胺、羟基或硫醇基的肽胰岛素多肽的氨基酸是包含式I、式II或式III的相同结构的二取代的氨基酸，只是与式I、式II或式III的氨基酸的α碳键合的氢被第二侧链置换。
在本发明的一些实施方案中，胰岛素多肽包含肽和烷基间的间隔基。在一些实施方案中，胰岛素多肽与间隔基共价结合，所述间隔基与烷基共价结合。在一些示例性的实施方案中，胰岛素多肽通过间隔基的胺、羟基或硫醇基的烷基化被修饰以包含烷基，其中间隔基与A14、A15、B1位(对于胰岛素型B链)、B2位(对于IGF-1型B链)、B10、B22、B28或B29位(按照天然胰岛素的A链和B链的氨基酸编号)的氨基酸侧链连接。间隔基所连接的胰岛素多肽的氨基酸可以是包含允许连接间隔基的部分的任何氨基酸(例如单个α-取代的氨基酸或α,α-二取代的氨基酸)。包含侧链-NH2、-OH或-COOH的胰岛素多肽的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是适合的。在一些实施方案中，肽胰岛素多肽和烷基间的间隔基是包含侧链胺、羟基或硫醇基的氨基酸或包含含有侧链胺、羟基或硫醇基的氨基酸的二肽或三肽。
在α胺被烷基化的情况下，间隔基氨基酸可以是任何氨基酸。例如，间隔基氨基酸可以是疏水氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr。或者，间隔基氨基酸可以是酸性残基，例如Asp和Glu。在示例性实施方案中，间隔基氨基酸可以是疏水氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸。或者，间隔基氨基酸可以是酸性残基，例如Asp和Glu，条件是烷基化发生在酸性残基的α胺上。在间隔基氨基酸的侧链胺被烷基化的情况下，间隔基氨基酸是包含侧链胺的氨基酸，例如式I的氨基酸(例如Lys或Orn)。在这种情况下，可使间隔基氨基酸的α胺和侧链胺两者烷基化，使得肽被二烷基化。本发明的实施方案包括所述二烷基化分子。
当烷基化通过间隔基的氨基酸的羟基发生时，间隔基的氨基酸或氨基酸之一可以是式II的氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，氨基酸是Ser。
当烷基化通过间隔基的氨基酸的硫醇基发生时，间隔基的氨基酸或氨基酸之一可以是式III的氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，氨基酸是Cys。
在一些实施方案中，间隔基包含亲水双官能间隔基。在一个具体的实施方案中，间隔基包含氨基聚(烷氧基)羧酸基。在这一方面，间隔基可包括例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1-6的任何整数，n为2-12的任何整数，例如8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，可市购获自Peptides International, Inc. (Louisville, KY)。在一些实施方案中，肽胰岛素多肽和烷基间的间隔基是亲水双官能间隔基。在某些实施方案中，亲水双官能间隔基包含两个或更多个反应基团，例如胺、羟基、硫醇基和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，亲水双官能间隔基包含羟基和羧酸基。在其它实施方案中，亲水双官能间隔基包含胺基和羧酸基。在其它实施方案中，亲水双官能间隔基包含硫醇基和羧酸基。
在一些实施方案中，肽胰岛素多肽和烷基间的间隔基是疏水双官能间隔基。在某些实施方案中，疏水双官能间隔基包含两个或更多个反应基团，例如胺、羟基、硫醇基和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，疏水双官能间隔基包含羟基和羧酸基。在其它实施方案中，疏水双官能间隔基包含胺基和羧酸基。在其它实施方案中，疏水双官能间隔基包含硫醇基和羧酸基。包含羧酸基和羟基或硫醇基的合适的疏水双官能间隔基是本领域已知的，包括例如8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。
间隔基(例如氨基酸、二肽、三肽、亲水双官能间隔基或疏水双官能间隔基)长度为3-10个原子(例如6-10个原子(例如6、7、8、9或10个原子))。在一个更具体的实施方案中，间隔基长度为约3-10个原子(例如6-10个原子)，烷基为C12-C18烷基，例如C14烷基、C16烷基，使得间隔基和烷基的总长度为14-28个原子，例如约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个原子。在一些实施方案中，间隔基和烷基的长度为17-28 (例如19-26、19-21)个原子。
按照一个实施方案，双官能间隔基是包含长度为3-10个原子的氨基酸骨架的合成或非天然存在的氨基酸(例如6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸)。或者，间隔基可以是具有长度为3-10个原子(例如6-10个原子)的肽骨架的二肽或三肽间隔基。与胰岛素多肽连接的二肽或三肽间隔基可由天然存在的和/或非天然存在的氨基酸组成，包括例如本文教导的任何氨基酸。在一些实施方案中，间隔基包含总的负电荷，例如包含一个或两个带负电荷的氨基酸。在一些实施方案中，二肽间隔基选自：Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-氨基丁酸-γ-氨基丁酸和γ-Glu-γ-Glu。在一个实施方案中，二肽间隔基为γ-Glu-γ-Glu。
经由胺、羟基和硫醇基的肽烷基化的合适方法是本领域已知的。例如，威廉逊醚合成可用来在胰岛素肽和烷基之间形成醚键。此外，肽与烷基卤化物的亲核取代反应可产生醚、硫醚或氨基键的任一种。烷基化肽胰岛素多肽的烷基可以具有任何大小，例如任何长度的碳链，并且可以是直链或支链的。在本发明的一些实施方案中，烷基为C4-C30烷基。例如，烷基可为以下的任一个：C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基。在一些实施方案中，烷基为C8-C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。
在一些具体的实施方案中，烷基包含胆汁酸的类固醇部分，例如胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸。
在一些实施方案中，胰岛素多肽通过使亲核的长链烷烃与胰岛素多肽反应而被修饰以包含烷基，其中胰岛素多肽包含适于亲核取代的离去基团。在具体的方面，长链烷烃的亲核基团包含胺、羟基或硫醇基(例如十八胺、十四醇和十六烷硫醇)。胰岛素多肽的离去基团可以是氨基酸侧链的一部分，或可以是肽骨架的一部分。合适的离去基团包括例如N-羟基琥珀酰亚胺、卤素和磺酸酯。
在某些实施方案中，胰岛素多肽通过使亲核的长链烷烃与胰岛素多肽所连接的间隔基反应而被修饰以包含烷基，其中间隔基包含离去基团。在具体的方面，长链烷烃包含胺、羟基或硫醇基。在某些实施方案中，包含离去基团的间隔基可以是本文论述的任何间隔基，例如还包含合适的离去基团的氨基酸、二肽、三肽、亲水双官能间隔基和疏水双官能间隔基。
当长链烷烃被胰岛素多肽或间隔基烷基化时，长链烷烃可具有任何大小，并可包含任何长度的碳链。长链烷烃可以是直链或支链的。在某些方面，长链烷烃为C4-C30烷烃。例如，长链烷烃可以是以下的任一个：C4烷烃、C6烷烃、C8烷烃、C10烷烃、C12烷烃、C14烷烃、C16烷烃、C18烷烃、C20烷烃、C22烷烃、C24烷烃、C26烷烃、C28烷烃或C30烷烃。在一些实施方案中，长链烷烃包含C8-C20烷烃，例如C14烷烃、C16烷烃或C18烷烃。
此外，在一些实施方案中，烷基化可在胰岛素多肽和胆固醇部分间发生。例如，胆固醇的羟基可置换长链烷烃上的离去基团，以形成胆固醇-胰岛素肽产物。本文所述烷基化胰岛素多肽可被进一步修饰以包含亲水部分。在一些具体的实施方案中，亲水部分可包含聚乙二醇(PEG)链。亲水部分的掺入可通过任何合适的方法(例如本文所述的任何方法)实现。在一些实施方案中，胰岛素多肽可包含选自Cys、Lys、Orn、homo-Cys或Ac-Phe的氨基酸，其中氨基酸的侧链与亲水部分(例如PEG)共价键合。在一些实施方案中，烷基任选通过包含Cys、Lys、Orn、homo-Cys或Ac-Phe的间隔基，且任选还包含与另一个氨基酸的侧链连接的亲水部分，与A14、A15、B1位(对于胰岛素型B链)、B2位(对于IGF-1型B链)、B10、B22、B28或B29位(按照天然胰岛素的A链或B链的氨基酸编号)连接。或者，烷基化胰岛素多肽可包含间隔基，其中间隔基同时被烷基化和修饰以包含亲水部分。合适的间隔基的非限制性实例包括包含选自Cys、Lys、Orn、homo-Cys和Ac-Phe的一个或多个氨基酸的间隔基。
缀合物
在一些实施方案中，使本文所述胰岛素多肽糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、通过例如二硫桥环化，或转化成盐(例如酸加成盐、碱加成盐)和/或任选缀合化。本公开内容还包括其中胰岛素多肽与异源部分连接的缀合物。胰岛素多肽和异源部分之间的缀合可以通过共价键合、非共价键合(例如静电相互作用、氢键、范德瓦尔斯相互作用、盐桥、疏水相互作用等)或两种类型的键合。可采用各种非共价偶联系统，包括生物素-抗生物素蛋白、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞粘附分子配偶体；或彼此有亲和力的任何结合配偶体或其片段。在一些方面，共价键是肽键。胰岛素多肽与异源部分的缀合可以是间接或直接缀合，前者可包括接头或间隔基。合适的接头和间隔基是本领域已知的，包括但不限于所描述的任何接头或间隔基。
本文所用术语“异源部分”与术语“缀合物部分”同义，是指不同于与其连接的胰岛素多肽的任何分子(化学或生物化学、天然存在的或非编码)。可与胰岛素多肽连接的示例性的缀合物部分包括但不限于异源肽或多肽(包括例如血浆蛋白质)、靶向剂、免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)、诊断标记例如放射性同位素、荧光团或酶标记、聚合物包括水溶性聚合物或其它治疗剂或诊断剂。在一些实施方案中，提供包含胰岛素多肽和血浆蛋白质的缀合物，其中血浆蛋白质选自白蛋白、运铁蛋白、血纤蛋白原和球蛋白。在一些实施方案中，缀合物的血浆蛋白质部分是白蛋白或运铁蛋白。在一个实施方案中，异源部分是白蛋白，包括例如白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)和重组人白蛋白(rHA)。在一些实施方案中，缀合物包含胰岛素多肽和以下的一种或多种：多肽、核酸分子、抗体或其片段、聚合物、胰岛素多肽量子点(uantum dot)、小分子、毒素、诊断剂、糖、氨基酸。
聚合物异源部分
在一些实施方案中，与胰岛素多肽缀合的异源部分是聚合物。在一些实施方案中，聚合物选自：聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基(polyalkylenes)及其衍生物包括聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸亚烷基酯、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八酯)、聚乙烯聚合物包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚卤乙烯、聚(乙酸乙烯酯)和聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、纤维素包括烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸纤维素邻苯二甲酸酯、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素和硫酸纤维素钠盐、聚丙烯、聚乙烯包括聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)和聚(对苯二甲酸亚乙酯)和聚苯乙烯。
在一些方面，聚合物是生物可降解聚合物，包括合成的生物可降解聚合物(例如乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酐、聚原酸酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和丙交酯-己内酯共聚物)和天然的生物可降解聚合物(例如藻酸盐及其它多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原、其化学衍生物(化学基团例如烷基、亚烷基的取代、添加、羟基化、氧化及本领域技术人员常规进行的其它修饰)、白蛋白及其它亲水蛋白质(例如玉米醇溶蛋白及其它醇溶谷蛋白和疏水蛋白质))及其任何共聚物或混合物。一般而言，这些物质通过酶促水解或体内暴露于水、通过表面蚀解或主体蚀解(bulk erosion)而降解。
在一些方面，聚合物是生物粘附聚合物，例如H. S. Sawhney, C. P. Pathak和J.A. Hubbell载于Macromolecules, 1993, 26, 581-587中描述的生物可蚀解水凝胶(其教导结合到本文中)、聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸盐、脱乙酰壳多糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八酯)。
在一些实施方案中，聚合物是水溶性聚合物或亲水聚合物。本文在“亲水异源部分”的标题下还进一步描述了亲水聚合物。合适的水溶性聚合物是本领域已知的，包括例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC；Klucel)、羟丙基甲基纤维素(HPMC；Methocel)、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素(Ethocel)、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟基烷基纤维素、各种纤维素醚、乙酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、乙酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、聚羟基烷基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟甲酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、马来酐/甲基乙烯基醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和聚丙烯酸钙、聚丙烯酸、酸式羧基聚合物、羧聚乙烯、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、甲基乙烯基醚-马来酐共聚物、羧基甲基酰胺、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚氧化亚乙基二醇、聚乙二醇及其衍生物、盐和组合。
在一个实施方案中，聚合物是聚亚烷基二醇，包括例如聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，异源部分是糖。在一些实施方案中，糖是单糖(例如葡萄糖、半乳糖、果糖)、二糖(例如蔗糖、乳糖、麦芽糖)、寡糖(例如棉子糖、水苏糖)、多糖(淀粉、直链淀粉、支链淀粉、纤维素、壳多糖、胼胝质、昆布多糖、木聚糖、甘露聚糖、岩藻多糖、半乳甘露聚糖。
在一些实施方案中，异源部分是脂质。在一些实施方案中，脂质是脂肪酸、类二十烷酸、前列腺素、白三烯、血栓烷、N-酰基乙醇胺)、甘油脂(例如单取代、二取代、三取代甘油)、甘油磷脂(例如磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、鞘脂(例如鞘氨醇、神经酰胺)、甾醇脂质(例如类固醇、胆固醇)、异戊烯醇脂质(prenol lipid)、糖脂或聚酮化合物、油、蜡、胆固醇、甾醇、脂溶性维生素、一甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂。
控释制剂
或者，本文所述胰岛素多肽可被修饰成贮库制剂形式，使得本公开内容的缀合物释放到其所给予的机体的方式在关于在机体内的时间和部位方面受到控制(参见例如美国专利号4,450,150)。本公开内容的缀合物的贮库制剂形式可以是例如包含本公开内容的缀合物和多孔材料或无孔材料(例如聚合物)的可植入组合物，其中本公开内容的缀合物被材料和/或降解的无孔材料包封或在整个材料和/或降解的无孔材料中扩散。然后将贮库制剂植入机体内有需要的部位，本公开内容的缀合物以预定速率从植入物中释放。
或者，大的贮库聚合物可与自切割二肽元件连接，所述二肽元件与本文所述胰岛素多肽共价结合。在该实施方案中，贮库聚合物将胰岛素多肽有效地隔离在其给药部位，直到随后通过非酶促反应以预定速率自单链类似物中切割。使用自切割二肽的胰岛素类似物的贮库制剂描述于PCT/US2009/068713，其公开内容结合到本文中。在一个实施方案中，提供包含二肽前药元件的胰岛素多肽，其中二肽前药元件与大的聚合物例如PEG或葡聚糖连接或被C18-C25烃酰化。在一个实施方案中，包含大的贮库聚合物(包括例如PEG)的自切割二肽元件与胰岛素单链类似物的连接部分的氨基酸(包括例如连接部分C8位的氨基酸)侧链连接。
可制备包含单链类似物的药物组合物，并且将药物组合物配制成具有所需要的体内释放特征。在一些方面，药物组合物是即释、控释、缓释、延长释放、延缓释放或两阶段释放制剂。配制用于控释的肽或缀合物的方法是本领域已知的。参见例如J Pharm 374：46-52(2009)和国际专利申请公布号WO 2008/130158、WO2004/033036、WO2000/032218和WO1999/040942。本发明的组合物还可包含例如胶束或脂质体，或其它一些包封形式，或可以延长释放形式给予以提供延长的贮存和/或递送作用。可按照任何方案给予所公开的药物制剂，包括例如每日(每日1次、每日2次、每日3次、每日4次、每日5次、每日6次)、每隔一天、每隔两天、每隔3天、每隔4天、每隔5天一次、一周一次、两周一次、每三周一次、每月一次或每两月一次。
胰岛素多肽的前药衍生物
本公开内容还包括本文公开的胰岛素多肽的前药类似物。有利的是，前药制剂改进基本肽的治疗指数，延迟作用开始时间，并延长胰岛素多肽的半衰期。所公开的前药化学结构可与活性部位胺化学缀合形成酰胺，其在二酮哌嗪形成时转化成母体胺，并释放前药元件 (参见国际专利申请PCT/US2009/068713，其公开内容明确结合到本文中)。这种新的生物学友好的前药化学结构在生理条件(例如pH约7，在37℃下在水性环境中)下自发降解，且不依赖于酶促降解。前药类似物的持续时间取决于二肽前药序列的选择，因此可允许前药制剂的灵活性。
在一个实施方案中，提供在生理条件下非酶促活化半衰期(t1/2)介于1-100小时之间的前药。本文所公开的生理条件欲包括约35-40℃的温度和约7.0-约7.4的pH，更通常包括在水性环境中7.2-7.4的pH和36-38℃的温度。在一个实施方案中，在生理条件下能够进行二酮哌嗪形成的二肽通过酰胺或酯键与胰岛素多肽共价连接(参见国际申请WO 2009/099763和PCT/US2009/068713，其公开内容结合到本文中)。
有利的是，切割速率及由此的前药活化，取决于二肽前体部分(pro-moiety)的结构和立体化学，还取决于亲核体的强度。本文公开的前药将最终化学转化为可被胰岛素/IGF受体识别的结构，其中这种化学转化的速度将决定体内生物作用的开始时间和持续时间。本申请公开的前药化学依赖不取决于其它化学添加剂或酶的分子内化学反应。转化速度受二肽取代基的化学性质及其在生理条件下切割的控制。因为生理pH和温度在十分确定的范围受严格调节，从前药转化至药物的速度将显示高的患者内和患者间再现性。
提供本文所公开的前药，其中胰岛素多肽的半衰期延长至少1小时，更通常大于20小时但小于100小时，并在生理条件下通过由内在的化学不稳定性驱动的非酶促反应转化成活性形式。在一个实施方案中，前药的非酶促活化t1/2时间介于1-100小时之间，更通常介于12和72小时之间，而在一个实施方案中，t1/2介于24-48小时之间，通过将前药在37℃和pH 7.2下在磷酸盐缓冲溶液(例如PBS)中温育来测量。在一个实施方案中，前药的半衰期为约1、8、12、20、24、48或72小时。在一个实施方案中，前药的半衰期为约100小时以上，包括长达168、336、04、672或720小时的半衰期，并在生理条件下通过由内在的化学不稳定性驱动的非酶促反应转化成活性形式。各种前药的半衰期应用公式t1/2 =.693/k来计算，其中‘k’为前药降解的一级速率常数。在一个实施方案中，前药的活化发生在酰胺键连接的二肽的切割、二酮派嗪或二酮吗啉和活性胰岛素多肽形成之后。
在另一个实施方案中，二肽前药元件通过酰胺键与胰岛素多肽共价结合，并且二肽还包含与二肽连接的贮库聚合物。在一个实施方案中，两个或更多个贮库聚合物与单个二肽元件连接。在一个实施方案中，贮库聚合物与包含二肽前药元件的氨基酸之一的侧链连接。选择生物相容的和具有足够大小的贮库聚合物，使得被二肽共价连接修饰的胰岛素多肽在给予患者时保持隔离在注射部位和/或不能够与其相应的受体相互作用。随后的二肽切割释放胰岛素多肽以与其既定靶标相互作用。携带二肽元件的贮库制剂可通过胰岛素多肽的任何合适的胺基经酰胺键(包括携带胰岛素多肽的内部天然或合成的氨基酸侧链的N端α胺或胺)与胰岛素多肽连接。在一个实施方案中，携带二肽元件的贮库制剂与单链类似物N端α胺或存在于单链类似物A19位的4-氨基苯丙氨酸的氨基连接。
按照一个实施方案，贮库聚合物选自本领域技术人员已知的生物相容的聚合物。贮库聚合物通常具有选自约20,000-120,000道尔顿的范围的大小。在一个实施方案中，贮库聚合物具有约40,000-100,000或约40,000-80,000道尔顿的范围的大小。在一个实施方案中，贮库聚合物的大小为约40,000、50,000、60,000、70,000或80,000道尔顿。合适的贮库聚合物包括但不限于葡聚糖、聚丙交酯、聚乙交酯、基于己内酯的聚合物、聚(己内酯)、聚酐、聚胺、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚二噁烷酮、聚缩醛、聚缩酮、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚原碳酸酯、聚磷腈、琥珀酸酯、聚(苹果酸)、聚(氨基酸)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚羟基纤维素、多糖、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸及其共聚物、三元共聚物和混合物及生物可降解聚合物及其包括基于己内酯的聚合物、聚己内酯的共聚物和包括聚对苯二甲酸丁二醇酯的共聚物。在一个实施方案中，贮库聚合物选自聚乙二醇、葡聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和乳酸和乙醇酸的共聚物，而在一个具体实施方案中，贮库聚合物是聚乙二醇。在一个实施方案中，贮库聚合物是聚乙二醇，且与二肽元件连接的贮库聚合物的总分子量为约40,000-80,000道尔顿。
已鉴定出在生理条件下促进分子内分解以释放有活性的胰岛素多肽的包含天然或合成氨基酸的具体二肽。二肽可与存在于胰岛素多肽上的氨基或通过修饰肽序列导入胰岛素多肽的氨基连接(通过酰胺键)。在一个实施方案中，选择二肽结构以抵抗被存在于哺乳动物血清中的肽酶(包括例如二肽基肽酶IV (DPP-IV))切割。因此，在一个实施方案中，与缺乏蛋白酶时进行反应相比，在血清蛋白酶存在下利用生理条件进行反应时，二肽前药组分从生物活性肽上的切割速率不显著提高(例如大于2X)。因此，二肽前药元件从胰岛素多肽(PBS中，在生理条件下)的切割半衰期不大于二肽前药元件在包含DPP-IV蛋白酶的溶液中自胰岛素多肽切割的半衰期的2、3、4或5倍。在一个实施方案中，包含DPP-IV蛋白酶的溶液是血清，更具体地讲是哺乳动物血清，包括人血清。
按照一个实施方案，二肽前药元件包含结构U-B，其中U为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸。在一个实施方案中，选择U-B的结构，其中在PBS中在生理条件下，U-B自胰岛素多肽的化学切割在约1-约720小时内完成至少约90%。在一个实施方案中，在PBS中在生理条件下，U-B自胰岛素多肽化学切割的半衰期(t1/2)为至少约1小时-约1周。在一个实施方案中，U、B或U-B所连接的胰岛素多肽的氨基酸为非编码氨基酸。在一些实施方案中，U和/或B为D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为D立体异构体构型的氨基酸，B为L立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为L立体异构体构型的氨基酸，B为D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为D立体异构体构型的氨基酸，B为D立体异构体构型的氨基酸。在一个实施方案中，B为N-烷基化氨基酸但不是脯氨酸。在一个实施方案中，氨基酸B的N-烷基化基团C1-C18烷基，而在一个实施方案中，N-烷基化基团为C1-C6烷基。在一个实施方案中，U为在α碳上具有二取代的氨基酸。
在一个实施方案中，一个或多个二肽元件通过选自胰岛素多肽B链的N端氨基或存在于胰岛素多肽上的氨基酸的侧链氨基的一个或多个氨基形成的酰胺键与胰岛素多肽连接。在一个实施方案中，胰岛素多肽包含两个二肽元件，其中二肽元件任选被聚乙二醇化、烷基化、酰化或与贮库聚合物连接。按照一个实施方案，二肽突出端通过存在于活性部位上或附近的赖氨酸残基的侧链胺与胰岛素多肽共价连接。在一个实施方案中，二肽突出端通过合成氨基酸或修饰氨基酸连接，其中合成氨基酸或修饰氨基酸具有适于二肽突出端共价连接的官能团(例如氨基-苯丙氨酸的芳族胺)。按照一个实施方案，一个或多个二肽元件在选自B链的N端氨基或存在于相当于天然胰岛素的A19、B16或B25位的位置上的4-氨基-苯丙氨酸残基的芳族胺的侧链氨基的氨基与胰岛素多肽连接。
申请人发现，对于A链19位的天然酪氨酸可容纳4-氨基苯丙氨酸氨基酸部分的选择性插入，而又不丧失胰岛素肽的效能。随后这个活性部位氨基与本文公开的二肽前药元件的化学酰胺化显著降低胰岛素受体结合活性，因此提供合适的胰岛素前药(参见图5，提供IGF1Y16L17 (p-NH2-F)A19类似物的数据，其表明具有与胰岛素(p-NH2-F)A19相当的活性，参见图3)。申请人发现，可对IGFB16B17类似物肽进行类似修饰以为前药化学结构提供合适的连接位点。因此，在一个实施方案中，二肽前药元件通过酰胺键与胰岛素(p-NH2-F)A19的A194-氨基苯丙氨酸的芳族环或IGFB16B17胰岛素多肽连接，其中二肽的C端氨基酸包含N-烷基化氨基酸，二肽的N端氨基酸是任何氨基酸。在一个备选的实施方案中，前药包含通过酰胺键与N端α胺连接的二肽元件，其中二肽元件的一个侧链被酰化。
按照一个实施方案，提供包含具有二肽前药元件的B链的胰岛素多肽前药衍生物，所述二肽前药元件通过酰胺键与B链的N端α胺或存在于相当于天然胰岛素的A19、B16或B25的位置或存在于连接部分的4-氨基-苯丙氨酸残基的芳族胺的侧链氨基连接，其中二肽元件的一个侧链用C18-C25烃基酰化。胰岛素多肽前药衍生物可包含天然胰岛素A链或天然IGF-1 A链或其本文公开的任何类似物。在一个实施方案中，二肽包含N端C-烷基化氨基酸之后是N-烷基化氨基酸。
按照一个实施方案，二肽前药元件包含下式X的通用结构：
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W)C1-C12烷基，其中W是选自N、S和O的杂原子，或R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H和OH。在一个实施方案中，当前药元件与胰岛素多肽的N端α胺连接且R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环时，则R1和R2的至少一个不为H。
在一个实施方案中，提供包含结构IB-LM-IA的胰岛素多肽，其中IB包含序列J-R23R22-X25LCGX29X30LVEALYLVCG ERGFF (SEQ ID NO: 65)，LM为本文公开的连接部分，IA包含序列GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 49)，其中
X8选自苏氨酸和组氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X19为以下通用结构的氨基酸：
其中X选自OH或NHR10，其中R10为H或包含通用结构U-B的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸；
X23为天冬酰胺或甘氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
R22选自FVNQ (SEQ ID NO: 47)、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端α胺；和
R23为键或包含1-6个带电荷的氨基酸的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，B链包含序列X22VNQX25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYT-Z1-B1(SEQ ID NO: 66)，其中
X22选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
Z1为选自天冬氨酸-赖氨酸、赖氨酸-脯氨酸和脯氨酸-赖氨酸的二肽；和
B1选自苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽。
按照一个实施方案，提供包含结构IB-LM-IA的胰岛素多肽，其中IB包含序列X25LCGX29X30LVEALYLVCG ERGFF (SEQ ID NO: 65)，LM为共价连接IB与IA的本文公开的连接部分，IA包含序列GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21 (SEQ ID NO: 55)，其中在不存在任何间插氨基酸时，SEQ ID NO: 65的C端苯丙氨酸残基与连接部分LM直接共价结合。
在一个实施方案中，提供包含结构IB-LM-IA的胰岛素多肽，其中IB包含序列J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 51)，LM为本文公开的连接部分，IA包含序列GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 68)，其中
J为H或包含通用结构U-B的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为通过酰胺键连接的N-烷基化氨基酸；
X4为天冬氨酸或谷氨酸；
X8为组氨酸或苯丙氨酸；
X9和X14独立选自精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸或丙氨酸；
X15为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；
X19为酪氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
R22选自共价键、AYRPSE (SEQ ID NO: 46)、甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸三肽、脯氨酸-谷氨酸二肽和谷氨酸；
R23为键或包含1-6个带电荷的氨基酸的氨基酸序列；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸；和
R13为COOH或CONH2。
二肽前药元件
可以选择二肽前药元件的取代基及其与胰岛素多肽的连接部位以提供本文公开的胰岛素多肽的前药类似物的所需半衰期。例如，当包含以下结构的二肽前药元件与胰岛素多肽B链的N端氨基酸的α氨基连接时，
X
提供在PBS中在生理条件下t1/2为约1小时的化合物，其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或芳基；或R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；和
R5为胺。
在其它实施方案中，在N端连接且t1/2为例如约1小时的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：
其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；或R1和R2通过-(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NH2；
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；R8为H。
或者，在一个实施方案中，提供胰岛素多肽前药衍生物，其中二肽前药与胰岛素多肽B链的N端氨基酸的α氨基连接，且在PBS中在生理条件下前药的t1/2介于约6-约24小时之间。在一个实施方案中，提供在PBS中在生理条件下t1/2介于约6-约24小时间的胰岛素多肽前药衍生物，其中前药元件具有式X的结构，和
R1和R2独立选自氢、C1-C18烷基和芳基，或R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C8烷基和芳基；和
R5为胺，条件是R1和R2两者不为氢，且条件是R4或R8之一为氢。
在又一个实施方案中，提供胰岛素多肽前药衍生物，其中二肽前药与胰岛素多肽B链的N端氨基酸的α氨基连接，且前药在PBS中在生理条件下的t1/2介于约72-约168小时之间。在一个实施方案中，提供在PBS中在生理条件下t1/2介于约72-约168小时之间的胰岛素多肽前药衍生物，其中前药元件具有式X的结构，和
R1选自氢、C1-C8烷基和芳基；
R2为H；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；和
R5为胺或N-取代的胺或羟基；
条件是，如果R1为烷基或芳基，则R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环。
在一些实施方案中，具有与胰岛素多肽B链肽的N端α氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如介于约12-约72小时，或在一些实施方案中介于约12-约48小时之间的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：
X
其中R1和R2独立选自氢、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；和
R7选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；
条件是R1和R2两者不为氢，且条件是R4或R8的至少一个为氢。
在一些实施方案中，具有与胰岛素多肽B链肽的N端氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如介于约12-约72小时之间，或在一些实施方案中介于约12-约48小时之间的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：
X
其中R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和(C1-C4烷基)NH2，或R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4选自氢和C1-C8烷基；和
R5为NH2；
条件是R1和R2两者不为氢。
在其它实施方案中，具有与胰岛素多肽B链肽的N端氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如介于约12-约72小时之间，或在一些实施方案中介于约12-约48小时之间的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：
X
其中
R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和(C1-C4烷基)NH2；
R3为C1-C6烷基；
R4为氢；和
R5为NH2；
条件是R1和R2两者不为氢。
在一些实施方案中，具有与胰岛素多肽B链肽的N端氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如介于约12-约72小时之间，或在一些实施方案中介于约12-约48小时之间的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：
X
其中
R1和R2独立选自氢和C1-C8烷基、(C1-C4烷基)NH2，或R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基；
R4为(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；和
R7选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)OH；
条件是R1和R2两者不为氢。
另外，提供具有与胰岛素多肽的N端α氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如约72-约168小时的前药，其中二肽前药元件具有以下结构：
X
其中R1选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；
条件是，如果R1为烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，则R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环。
在一些实施方案中，二肽前药元件与胰岛素多肽的内部氨基酸的侧链胺连接。在该实施方案中，t1/2为例如约1小时的前药具有以下结构：
其中
R1和R2独立地为C1-C8烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；或R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NH2；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
而且，提供t1/2为例如介于约6-约24小时之间且具有与内部氨基酸侧链连接的二肽前药元件的前药，其中前药包含具有以下结构的二肽前药元件：
其中R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立地为氢、C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C8烷基，或R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；
条件是R1和R2两者不为氢，且条件是R4或R8的至少一个为氢。
另外，提供t1/2为例如约72-约168小时且具有与胰岛素多肽的内部氨基酸侧链连接的二肽前药元件的前药，其中二肽前药元件具有以下结构：
其中R1选自氢、C1-C18烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H或C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；条件是，如果R1和R2两者独立地为烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，则R1或R2的任一个通过(CH2)p与R5连接，其中p为2-9。
在一个实施方案中，二肽前药元件通过存在于胰岛素多肽的芳族氨基酸的芳基上的胺与胰岛素多肽连接，其中t1/2为例如约1小时的前药具有以下二肽结构：
其中R1和R2独立地为C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2或OH；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在另一个实施方案中，提供包含式IV的结构(其中m1为0-3的整数)且在PBS中在生理条件下t1/2为约6-约24小时的胰岛素多肽前药衍生物。在一个实施方案中，其中在PBS中在生理条件下t1/2为约6-约24小时的胰岛素多肽前药包含式IV的结构，其中，
R1选自氢、C1-C18烷基和芳基，或R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和芳基；和
R5为胺或N-取代的胺。在一个实施方案中，m1为1。
在一个实施方案中，提供具有通过芳族氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如约6-约24小时的前药，其中二肽包含以下结构：
其中
R1选自氢、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NHR6；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在另一个实施方案中，提供包含式IV的结构(其中m1为0-3的整数)且在PBS中在生理条件下t1/2为约72-约168小时的胰岛素多肽前药衍生物。在一个实施方案中，其中在PBS中在生理条件下t1/2为约72-约168小时的胰岛素多肽前药衍生物包含式IV的结构，其中，
R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和芳基；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4和R8各自为氢；和
R5选自胺、N-取代的胺和羟基。在一个实施方案中，m1为1。
在一个实施方案中，提供具有通过芳族氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如约72-约168小时的前药，其中二肽包含以下结构：
其中R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基、(C1-C4烷基)COOH和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4为氢或与R3一起形成4-6元杂环；
R8为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H或C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
按照一个实施方案，式X的二肽被进一步修饰以包含干扰胰岛素多肽与胰岛素或IGF-1受体相互作用的大的聚合物。随后二肽的切割从二肽复合物中释放胰岛素多肽，其中释放的胰岛素多肽是完全活性的。按照一个实施方案，式X的二肽被进一步修饰以包含干扰结合的胰岛素多肽与胰岛素或IGF-1受体相互作用的能力的大的聚合物。按照一个实施方案，胰岛素多肽包含以下式X的通用结构的二肽：
，其中式X的二肽的一个氨基酸侧链被聚乙二醇化或酰化。
在一个实施方案中，提供包含结构IB-LM-IA的胰岛素多肽，其中IB包含序列J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 69)；
LM包含本文所述的连接部分；和
IA包含序列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 70)，其中
J为H或式X的二肽元件；
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为以下通用结构的氨基酸：
其中X选自OH或NHR10，其中R10为H或包含式X的通用结构的二肽元件；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH和NHR12，其中R12为H或包含式X的通用结构的二肽元件；
R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 46)、FVNQ (SEQ ID NO: 47)、PGPE (SEQ ID NO:48)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端α胺；
R23为键或G(X60)d(X61)gK (SEQ ID NO: 71)
其中X60、X61独立地为谷氨酸或天冬氨酸；和
d和g为范围独立为1-6的整数；和
R13为COOH或CONH，而且其中式X的二肽被酰化或聚乙二醇化。在一个实施方案中，J包含酰化或聚乙二醇化的式X二肽。
本文公开的胰岛素多肽及其前药衍生物可被进一步修饰以提高肽在生理pH下在水溶液中的溶解度，同时通过防止肽的肾清除来提高肽的有效持续时间。该肽容易清除，因为当与血浆蛋白质相比时其相对小的分子大小。增加肽的分子量高于40 kDa超过了肾的阈值，并显著延长在血浆中的持续时间。因此，在一个实施方案中，肽前药被进一步修饰以包含共价连接的亲水部分。
在一个实施方案中，亲水部分为血浆蛋白质、聚乙二醇链或免疫球蛋白的Fc部分。因此，在一个实施方案中，本文公开的胰岛素类似物被进一步修饰以包含与氨基酸的侧链共价连接的一个或多个亲水基团。
按照一个实施方案，本文公开的胰岛素前药通过将亲水部分与B链的N端氨基酸或位于B链的羧基端的赖氨酸氨基酸(或其它合适的氨基酸)的侧链(包括例如SEQ ID NO: 2的29位)连接被进一步修饰。在一个实施方案中，提供单链胰岛素前药衍生物，其中连接部分的氨基酸之一通过将亲水部分与肽接头的侧链连接而被修饰。在一个实施方案中，修饰氨基酸为半胱氨酸、赖氨酸或乙酰基苯丙氨酸。
按照一个实施方案，提供胰岛素多肽的前药衍生物，其中式X的二肽元件还包含聚乙二醇、烷基或酰基。在一个实施方案中，一个或多个聚乙二醇链与式X的二肽连接，其中聚乙二醇链的总分子量的范围为约20,000-约80,000道尔顿，或40,000-80,000道尔顿，或40,000-60,000道尔顿。在一个实施方案中，分子量为约40,000道尔顿的至少一个聚乙二醇链与式X二肽连接。在另一个实施方案中，式X的二肽被足够大小的酰基酰化以结合血清白蛋白，因此在给药时使IGFB16B17类似物肽失活。酰基可以是直链或支链的，而在一个实施方案中为C16-C30脂肪酸。例如，酰基可以是C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸的任一种。在一些实施方案中，酰基为C16-C20脂肪酸，例如C18脂肪酸或C20脂肪酸。
在另一个实施方案中，本文公开的胰岛素多肽及其前药类似物通过将修饰氨基酸添加至胰岛素多肽的A链的羧基端或氨基端或B链的氨基端而被进一步修饰，其中添加的氨基酸被修饰以包含与氨基酸连接的亲水部分。在一个实施方案中，添加至C端的氨基酸是修饰的半胱氨酸、赖氨酸或乙酰基苯丙氨酸。在一个实施方案中，亲水部分选自血浆蛋白质、聚乙二醇链和免疫球蛋白的Fc部分。
按照一个实施方案，提供包含本文公开的任何新的胰岛素二聚体(优选纯度水平为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物。所述组合物可含有浓度为以下的本文公开的胰岛素二聚体：至少0.5mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、6 mg/ml、7 mg/ml、8 mg/ml、9 mg/ml、10 mg/ml、11 mg/ml、12 mg/ml、13 mg/ml、14 mg/ml、15 mg/ml、16 mg/ml、17 mg/ml、18mg/ml、19 mg/ml、20 mg/ml、21 mg/ml、22 mg/ml、23 mg/ml、24 mg/ml、25 mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含被灭菌的水溶液，并任选包含在各种包装容器中保存。在其它实施方案中，药物组合物包括冻干粉。药物组合物可进一步包装作为药盒的一部分，所述药盒包括用于将组合物给予患者的一次性装置。可给容器或药盒贴标签以保存在室温下或在冷冻温度下。
所公开的胰岛素二聚体及其相应的前药衍生物被认为适用于之前针对胰岛素肽所描述的任何用途。因此，本文公开的胰岛素二聚体及其相应的前药衍生物可用于治疗高血糖症或治疗由高血糖水平所致的其它代谢病。因此，本发明包括包含本文公开的胰岛素二聚体或其前药衍生物和药学上可接受的载体的药物组合物，用于治疗患有高血糖水平的患者。按照一个实施方案，使用本文公开的胰岛素二聚体治疗的患者是驯养动物，而在另一个实施方案中，待治疗的患者是人。
根据本公开内容治疗高血糖症的一种方法包括采用任何标准给药途径将本文公开的胰岛素二聚体或其贮库制剂或前药衍生物给予患者的步骤，给药途径包括胃肠外，例如静脉内、腹膜内、皮下或肌内、鞘内、经皮、直肠、口服、经鼻或通过吸入。在一个实施方案中，皮下或肌内给予组合物。在一个实施方案中，胃肠外给予组合物，且将胰岛素多肽或其前药衍生物预包装在注射器中。
本文公开的胰岛素二聚体及其贮库制剂或前药衍生物可单独给予或与其它抗糖尿病药组合给予。本领域已知的或在研究中的抗糖尿病药包括天然胰岛素、天然胰高血糖素及其功能类似物；磺酰脲类，例如甲苯磺丁脲(Orinase)、醋磺己脲(Dymelor)、妥拉磺脲(Tolinase)、氯磺丙脲(Diabinese)、格列吡嗪(Glucotrol)、格列本脲(Diabeta、Micronase、Glynase)、格列美脲(Amaryl)或格列齐特(Diamicron)；美格列奈类，例如瑞格列奈(Prandin)或那格列奈(Starlix)；双胍类，例如二甲双胍(Glucophage)或苯乙双胍；噻唑烷二酮类，例如罗格列酮(Avandia)、吡格列酮(Actos)或曲格列酮(Rezulin)或其它PPARγ抑制剂；抑制糖消化的α葡糖苷酶抑制剂，例如米格列醇(Glyset)、阿卡波糖(Precose/Glucobay)；艾塞那肽(Byetta)或普兰林肽；二肽基肽酶-4 (DPP-4)抑制剂，例如维格列汀或西格列汀；SGLT (依赖于钠的葡萄糖转运蛋白1)抑制剂；或FBPase (果糖1,6-二磷酸酶)抑制剂。
可采用本领域技术人员已知的标准药学上可接受的载体和给药途径配制包含本文公开的胰岛素二聚体或其贮库制剂或前药衍生物的药物组合物，并给予患者。因此，本公开内容还包括包含一种或多种本文公开的胰岛素二聚体(或其前药衍生物)或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含在pH约4.0-约7.0磷酸缓冲系统中浓度为1mg/ml的胰岛素二聚体。药物组合物可包含胰岛素二聚体作为唯一的药用活性组分，或胰岛素二聚体可与一种或多种其它的活性剂组合。
本文所述所有治疗方法、药物组合物、药盒和其它类似的实施方案考虑了胰岛素二聚体或其前药衍生物包括其所有药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，提供具有将胰岛素二聚体组合物给予患者的装置的药盒。药盒可另外包括各种容器，例如小瓶、管、瓶等。优选药盒还可包括使用说明书。按照一个实施方案，药盒的装置是气雾剂分散装置，其中将组合物预包装在气雾剂装置内。在另一个实施方案中，药盒包含注射器和针，而在一个实施方案中，将胰岛素二聚体组合物预包装在注射器内。
本发明的化合物可通过标准合成方法、重组DNA技术、制备肽和融合蛋白的任何其它方法制备。虽然某些非天然氨基酸无法通过标准重组DNA技术表达，但是其制备的技术是本领域已知的。适用时，除标准肽化学反应以外，包括非肽部分的本发明化合物还可通过标准有机化学反应合成。
对于本文公开的所有实施方案，第一和第二胰岛素多肽可独立选自以下配对的任一个：A链1和B链1、A链1和B链2、A链1和B链3、A链1和B链4、A链1和B链5、A链1和B链6、A链1和B链7、A链1和B链8、A链1和B链9、A链1和B链10、A链1和B链11、A链1和B链12、A链1和B链13、A链1和B链14、A链1和B链15、A链1和B链16、A链2和B链1、A链2和B链2、A链2和B链3、A链2和B链4、A链2和B链5、A链2和B链6、A链2和B链7、A链2和B链8、A链2和B链9、A链2和B链 10、A链2和B链 11、A链2和B链12、A链2和B链13、A链2和B链14、A链2和B链15、A链2和B链16、A链3和B链1、A链3和B链2、A链3和B链3、A链3和B链4、A链3和B链5、A链3和B链6、A链3和B链7、A链3和B链8、A链3和B链9、A链3和B链10、A链3和B链11、A链3和B链12、A链3和B链13、A链3和B链14、A链3和B链15、A链3和B链16、A链4和B链1、A链4和B链2、A链4和B链3、A链4和B链4、A链4和B链5、A链4和B链6、A链4和B链7、A链4和B链8、A链4和B链9、A链4和B链10、A链4和B链11、A链4和B链12、A链4和B链13、A链4和B链14、A链4和B链15、A链4和B链16、A链5和B链1、A链5和B链2、A链5和B链3、A链5和B链4、A链5和B链5、A链5和B链6、A链5和B链7、A链5和B链8、A链5和B链9、A链5和B链10、A链5和B链11、A链5和B链12、A链5和B链13、A链5和B链14、A链5和B链15、A链5和B链16、A链6和B链1、A链6和B链2、A链6和B链3、A链6和B链4、A链6和B链5、A链6和B链6、A链6和B链7、A链6和B链8、A链6和B链9、A链6和B链10、A链6和B链11、A链6和B链12、A链6和B链13、A链6和B链14、A链6和B链15、A链6和B链16。另外，本文公开的本发明的二聚体构建体还包括上述胰岛素多肽的所有单链类似物，其中连接部分为SRVSRX68SR (SEQ ID NO: 98)或GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)，
A链：
A链1. GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)，
A链2. GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)，
A链3. GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)，
A链4. TPAX75SEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 88)，
A链5. TPAKSEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 103)，和
A链6. GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)；
B链：
B链1. FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)，
B链2. FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)，
B链3. GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 77)，
B链4. CGPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNPK (SEQ ID NO: 78)，
B链5. GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT(SEQ ID NO: 79)，
B链6. AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPA SEQ ID NO: 87)，
B链7. GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 10)，
B链8. TPAKSEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 103)，
B链9. AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 90)，
B链10. AYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFYFSRPA (SEQ ID NO: 80)，
B链11. CFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 94)，
B链12. CGPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 95)，
B链13. CGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 96)，
B链14. CGPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFYNKPT (SEQ ID NO: 97)，
B链15. CAYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 91)和
B链16. CAYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 93)。
实施例1
胰岛素A链和B链的合成
采用Boc化学，在4-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂或4-羟基甲基-苯基乙酰氨基甲基(PAM)树脂上合成胰岛素A链和B链。使用HF/对甲酚95:5在0℃下达1小时，将肽从树脂上切割下来。在除去HF且进行醚沉淀后，将肽溶于50%乙酸水溶液，并冻干。或者，采用Fmoc化学合成肽。使用三氟乙酸(TFA)/三异丙基甲硅烷(TIS)/H2O (95:2.5:2.5)在室温下达2小时，将肽从树脂切割下来。通过加入过量的乙醚使肽沉淀，使沉淀在酸性缓冲水溶液中溶解。通过RP-HPLC监测肽的品质，并通过质谱法(ESI或MALDI)证实。
合成在氨基酸7处具有单个游离半胱氨酸，且所有其它半胱氨酸均被保护成为乙酰氨基甲基A-(SH)7(Acm)6,11,20的胰岛素A链。合成在7位具有单个游离半胱氨酸，且另一个半胱氨酸被保护成为乙酰氨基甲基B-(SH)7(Acm)19的胰岛素B链。粗制肽通过常规RP-HPLC纯化。
按照图1所示通用方法，将合成的A链和B链通过其天然二硫键连接而彼此连接。相应的B链通过在DMF或DMSO中溶解被激活成Cys7-Npys类似物，并在室温下以1:1摩尔比率与2,2’-二巯基双(5-硝基吡啶) (Npys)反应。通过RP-HPLC监测活化，通过ESI-MS证实产物。
通过相应的A-(SH)7(Acm)6,11,20和B-(Npys)7(Acm)19以1:1摩尔比率溶解成10 mg/ml总肽浓度形成第一个B7-A7二硫键。在链结合反应完成时，将混合物稀释成50%乙酸水溶液的浓度。通过加入碘同时形成最后2个二硫键。将40倍摩尔浓度过量的碘加入溶液中，将混合物在室温下再搅拌1小时。通过加入抗坏血酸水溶液终止反应。混合物通过RP-HPLC纯化，通过MALDI-MS证实最终的化合物。如图2和表1中的数据所示，对于胰岛素受体结合，按照该方法制备的合成胰岛素完全比得上纯化的胰岛素。
可采用允许非编码氨基酸掺入蛋白质中的系统，包括例如美国专利号7,045,337和7,083,970教导的系统，来体内合成包含修饰氨基酸(例如A19位的4-氨基苯丙氨酸)的胰岛素肽。
实施例2
胺基(N端和赖氨酸)通过还原性烷基化的聚乙二醇化
a. 合成
将摩尔比率1:2:30的胰岛素(或胰岛素类似物)、mPEG20k-甲醛(Aldyhyde)和NaBH3CN溶于pH 4.1-4.4的乙酸缓冲液中。反应溶液由0.1 N NaCl、0.2 N乙酸和0.1 NNa2CO3组成。胰岛素肽浓度为约0.5 mg/ml。反应在室温下进行6小时。通过RP-HPLC监测反应程度，反应的收率为约50%。
b. 纯化
将反应混合物用0.1% TFA稀释2-5倍，并加到制备型RP-HPLC柱。HPLC条件：C4柱；流速10 ml/分钟；A缓冲液：10% ACN和0.1% TFA的水溶液；B缓冲液：含0.1% TFA的ACN溶液；线性梯度B% 0-40% (0-80分钟)；PEG-胰岛素或类似物以约35%缓冲液B洗脱。在通过硫酸解(sulftolysis)或胰蛋白酶降解进行化学修饰后，通过MALDI-TOF证实所需化合物。
胺基(N端和赖氨酸)通过N-羟基琥珀酰亚胺酰化的聚乙二醇化。
a. 合成
将胰岛素(或胰岛素类似物)连同mPEG20k-NHS一起以1:1的摩尔比率溶于0.1 NN-二(羟乙基)甘氨酸(Bicine)缓冲液(pH 8.0)中。胰岛素肽浓度为约0.5 mg/ml。通过HPLC监测反应进程。在室温下2小时后反应收率为约90%。
b. 纯化
将反应混合物稀释2-5倍，并加载到RP-HPLC中。
HPLC条件：C4柱；流速10 ml/分钟；A缓冲液：含10% ACN和0.1% TFA的水溶液；B缓冲液：含0.1% TFA的ACN溶液；线性梯度B% 0-40% (0-80分钟)；以约35% B收集PEG-胰岛素或类似物。在通过硫酸解或胰蛋白酶降解进行化学修饰后，通过MALDI-TOF证实所需化合物。
苯丙氨酸芳环上乙酰基的还原胺化聚乙二醇化
a. 合成
将胰岛素(或胰岛素类似物)、mPEG20k-酰肼和NaBH3CN以1:2:20的摩尔比率溶于乙酸缓冲液(pH 4.1-4.4)中。反应溶液由0.1 N NaCl、0.2 N乙酸和0.1 N Na2CO3组成。胰岛素或胰岛素类似物浓度为约0.5 mg/ml。在室温下达24小时。反应过程通过HPLC监测。反应转化率为约50%。(通过HPLC计算)。
b. 纯化
将反应混合物稀释2-5倍，并加载到RP-HPLC中。
HPLC条件：C4柱；流速10 ml/分钟；A缓冲液：含10% ACN和0.1% TFA的水溶液；B缓冲液：含0.1% TFA的ACN溶液；线性梯度B% 0-40% (0-80分钟)；以约35%B收集PEG-胰岛素或PEG-胰岛素类似物。在通过硫酸解或胰蛋白酶降解进行化学修饰后，通过MALDI-TOF验证所需化合物。
实施例3
胰岛素受体结合测定法：
在竞争结合测定法中，利用闪烁亲近技术(scintillation proximitytechnology)，测量各种肽对胰岛素或IGF-1受体的亲和力。在Tris-Cl缓冲液(0.05 MTris-HCl，pH 7.5、0.15 M NaCl、0.1% w/v牛血清白蛋白)中对肽进行系列3倍稀释，并在96孔板(Corning Inc.，Acton，Ma)中与0.05 nM (3-[125I]-碘酪氨酰) A TyrA14胰岛素或(3-[125I]-碘酪氨酰) IGF-1 (Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)混合。各孔中存在1-6微克等分的由过量表达人胰岛素或IGF-1受体的细胞制备的血浆膜碎片，加入0.25 mg/孔聚乙烯亚胺处理的麦胚凝集素A型闪烁亲近测定珠粒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。在800 rpm下振荡5分钟后，将板在室温下温育12小时，用MicroΒ1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)测量放射活性。用相对于试验样品最高浓度，4倍浓度过量的“不带放射性的”天然配体，测量各孔的非特异性结合的(NSB)放射活性。在不含竞争剂的孔中检测总的结合放射活性。如下计算%特异性结合：%特异性结合= (结合的-NSB/总的结合的-NSB) X 100。通过应用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)，确定IC50值。
实施例4
胰岛素受体磷酸化测定法：
为了测量胰岛素或胰岛素类似物的受体磷酸化，将受体转染的HEK293细胞铺板于96孔组织培养板(Costar #3596，Cambridge，MA)，在补充了100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10 mM HEPES和0.25%牛生长血清(HyClone SH30541，Logan，UT)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中在37℃、5% CO2和90%湿度下培养16-20小时。在补充了0.5%牛血清白蛋白(Roche Applied Science #100350，Indianapolis，IN)的DMEM中制备系列稀释的胰岛素或胰岛素类似物，加到具有贴壁细胞的孔中。在37℃下在具有5% CO2的潮湿气氛中温育15分钟后，在室温下将细胞用5%低聚甲醛固定20分钟，用磷酸缓冲盐水(pH 7.4)洗涤2次，用含2%牛血清白蛋白的PBS封闭1小时。然后将板洗涤3次，装入按照生产商的建议在含2%牛血清白蛋白的PBS中复溶的辣根过氧化物酶缀合的抗磷酸酪氨酸抗体(Upstatebiotechnology #16-105，Temecula，CA)。在室温下温育3小时后，将板洗涤4次，将0.1 mlTMB单一溶液底物(Invitrogen，#00-2023，Carlbad，CA)加入各孔中。通过加入0.05 ml 1 NHCl，5分钟后终止显色。在Titertek Multiscan MCC340 (ThermoFisher，Pittsburgh，PA)上测量450 nm处的吸光度。绘制吸光度对肽浓度的剂量反应曲线，通过应用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)确定EC50值。
实施例5
模式二肽切割速率的确定(PBS中)
特异性六肽(HSRGTF-NH2；SEQ ID NO: 72)用作模式肽，可研究其二肽N端突出端切割速率。制备二肽延伸的模式肽，将Boc保护的肌氨酸和赖氨酸依次加入模式肽结合的树脂以产生肽A (Lys-Sar-HSRGTF-NH2；SEQ ID NO: 74)。通过HF切割肽A，并通过制备型HPLC纯化。
使用HPLC的制备型纯化
采用基于二氧化硅的1X 25 cm Vydac C18 (5 μ粒径，300 A°孔径大小)柱上的HPLC分析进行纯化。所用仪器为：Waters Associates 600型泵，注射器717型，UV检测器486型。所有样品使用230 nm的波长。溶剂A含有蒸馏水中的10% CH3CN /0.1% TFA，溶剂B含有CH3CN中的0.1% TFA。使用线性梯度(0-100% B，2小时内)。流速为10 ml/分钟，流分大小为4ml。自约150 mg的粗制肽，得到30 mg纯肽。
将肽A以1 mg/ml的浓度溶于PBS缓冲液中。将该溶液在37℃下温育。在5小时、8小时、24小时、31小时和47小时收集样品用于分析。用等体积的0.1% TFA降低pH使二肽切割猝灭。通过LC-MS定性监测切割速率，通过HPLC进行定量研究。应用Peak SimpleChromatography软件，定量测定前药和母体模式肽的保留时间和相对峰面积。
使用质谱法的分析
采用具有标准ESI离子源的Sciex API-III电喷雾四极质谱仪，获得质谱。采用的电离条件如下：阳离子模式的ESI；离子喷雾电压，3.9 kV；喷孔电压(orifice potential)，60 V。所用喷雾气体和幕气为流速0.9 L/分钟的氮气。以0.5Th/步进和2 msec停留时间，从600-1800 Thompsons记录质谱。将样品(约1mg/mL)溶于含1%乙酸的50%乙腈水溶液中，通过外部注射器泵以5 μL/分钟的速率导入。分析前，按照生产商提供的说明书(MilliporeCorporation，Billerica，MA)，使用含有0.6 µL C4树脂的ZipTip固相提取触头(extraction tip)，使溶解于PBS的肽脱盐。
采用HPLC的分析
采用配备214 nm的UV检测器和150 mmX 4.6 mm C8 Vydac柱的Beckman SystemGold Chromatography系统，进行HPLC分析。流速为1 ml/分钟。溶剂A含有蒸馏水中的0.1%TFA，溶剂B含有90% CH3CN中的0.1% TFA。采用线性梯度(0%-30%B，10分钟内)。收集数据，并应用Peak Simple Chromatography软件进行分析。
测定各个前肽的切割速率。通过其各自的峰面积确定前肽和模式母体肽的浓度。通过对不同时间间隔的前药浓度的对数作图，确定前药的一级解离速率常数。该图的斜率提供速率常数‘k’。应用式t1/2 = .693/k，计算各种前药的切割的半衰期。确定该模式肽HSRGTF-NH2 (SEQ ID NO: 72)的Lys-Sar突出端的半衰期为14.0小时。
实施例6
使用全d-同种型模式肽测定血浆中二肽切割半衰期的速率
使用其它的模式六肽(dHdTdRGdTdF-NH2 SEQ ID NO: 75)测定血浆中二肽切割的速率。使用各个氨基酸的d-异构体以防止前药突出端以外的模式肽被酶促切割。这种模式d-异构体六肽以类似于l-异构体的方式合成。如之前对肽A所报告的，将肌氨酸和赖氨酸依次加入N端以制备肽B (dLys-dSar-dHdTdRGdTdF-NH2 SEQ ID NO: 75)。
确定各个前肽的切割速率。通过其各自的峰面积求出前肽和模式母体肽的浓度。通过对不同时间间隔的前药浓度的对数作图，确定前药的一级解离速率常数。该图的斜率提供速率常数‘k’。确定该模式肽dHdTdRGdTdF-NH2 (SEQ ID NO: 74)的Lys-Sar突出端的半衰期为18.6小时。
实施例7
采用实施例5描述的方法测定与模式六肽(HSRGTF-NH2；SEQ ID NO: 72)连接的其它二肽的切割速率。这些实验中产生的结果见表2和3。
表2：PBS中与N端对氨基-Phe侧链连接的二肽U-B自模式六肽(HSRGTF-NH2；SEQ IDNO: 72)的切割
化合物 U (氨基酸) O (氨基酸) t ½
1 F P 58小时
2 羟基-F P 327小时
3 d-F P 20小时
4 d-F d-P 39小时
5 G P 72小时
6 羟基-G P 603小时
7 L P 62小时
8 叔L P 200小时
9 S P 34小时
10 P P 97小时
11 K P 33小时
12 dK P 11小时
13 E P 85小时
14 Sar P ≈1000小时
15 Aib P 69分钟
16 羟基-Aib P 33小时
17 环己烷 P 6分钟
18 G G 无切割
19 羟基-G G 无切割
20 S N-甲基-Gly 4.3小时
21 K N-甲基-Gly 5.2小时
22 Aib N-甲基-Gly 7.1分钟
23 羟基-Aib N-甲基-Gly 1.0小时
表3：PBS中与1 (X)位的组氨酸(或组氨酸类似物)连接的二肽U-B自模式六肽(XSRGTF-NH2；SEQ ID NO: 76)的切割
NH2-U-B-XSRGTF-NH2 (SEQ ID NO: 76)
化合物 U (氨基酸) O (氨基酸) X (氨基酸) t ½
1 F P H 无切割
2 羟基-F P H 无切割
3 G P H 无切割
4 羟基-G P H 无切割
5 A P H 无切割
6 C P H 无切割
7 S P H 无切割
8 P P H 无切割
9 K P H 无切割
10 E P H 无切割
11 二氢 V P H 无切割
12 P d-P H 无切割
13 d-P P H 无切割
14 Aib P H 32小时
15 Aib d-P H 20小时
16 Aib P d-H 16小时
17 环己基- P H 5小时
18 环丙基- P H 10小时
19 N-Me-Aib P H >500小时
20 α,α-二乙基-Gly P H 46小时
21 羟基-Aib P H 61
22 Aib P A 58
23 Aib P N-甲基-His 30小时
24 Aib N-甲基-Gly H 49分钟
25 Aib N-己基-Gly H 10分钟
26 Aib 氮杂环丁烷-2-甲酸 H >500小时
27 G N-甲基-Gly H 104小时
28 羟基-G N-甲基-Gly H 149小时
29 G N-己基-Gly H 70小时
30 dK N-甲基-Gly H 27小时
31 dK N-甲基-Ala H 14小时
32 dK N-甲基-Phe H 57小时
33 K N-甲基-Gly H 14小时
34 F N-甲基-Gly H 29小时
35 S N-甲基-Gly H 17小时
36 P N-甲基-Gly H 181小时
实施例8
具有适于前药构建的结构的胰岛素类似物的鉴定
已知A链的19位是胰岛素活性的重要位点。在该位点允许前药元件连接的修饰因此是需要的。已合成了A19位的胰岛素的特定类似物，并对其对胰岛素受体的活性进行了表征。已鉴定出A19处的两种高活性结构类似物，其中在近似完全活性胰岛素类似物的鉴定中，第二活性部位芳族残基(B24)处可比的结构变化并不成功。
表4和表5表示A19位处对于对胰岛素受体的完全活性的高结构保守性(采用实施例3所述的测定法测定受体结合)。表4表明仅两种在A19具有修饰的胰岛素类似物具有类似于天然胰岛素的受体结合活性。对于4-氨基胰岛素类似物，提供了来自3个独立实验的数据。标为“活性(测试中)”的一栏比较同时进行的2个独立实验的胰岛素类似物相对于天然胰岛素的结合百分比。标为“活性(0.60 nM)”的一栏是胰岛素类似物相对于采用该测定法对于胰岛素结合获得的历史平均值的相对百分比结合。在任一分析中，两种A19胰岛素类似物(4-氨基苯丙氨酸和4-甲氧基苯丙氨酸)显示大致等于天然胰岛素的受体结合。表5提供的数据显示，与天然胰岛素具有相当结合活性的两种A19胰岛素类似物(4-氨基和4-甲氧基)同样对胰岛素受体具有相当的活性(采用实施例4所述测定法测定受体活性)。
表4：A19胰岛素类似物的胰岛素受体结合活性
表5：A19胰岛素类似物的胰岛素受体磷酸化活性
实施例9
胰岛素样生长因子(IGF)类似物IGF1 (YB16LB17)
申请人已发现对胰岛素受体具有与天然胰岛素类似的活性的IGF类似物。更具体地讲，IGF类似物(IGF1 (YB16LB17))包含天然IGF A链(SEQ ID NO: 5)和修饰的B链(SEQ IDNO: 6)，其中天然IGF B链(SEQ ID NO: 3)的15和16位的天然谷氨酰胺和苯丙氨酸分别被酪氨酸和亮氨酸残基置换。如图3和下表6所示，IGF1 (YB16LB17)和天然胰岛素的结合活性表明各自为胰岛素受体的高效力激动剂。
表6
实施例10
IGF前药类似物
根据A19胰岛素类似物的活性(参见实施例8)，对IGF1 A:B(YB16LB17)类似物进行类似修饰，并对其结合并刺激胰岛素受体活性的能力进行了研究。如表7所示，IGF类似物，IGF1 (YB16LB17) A(p-NH2-F)19与胰岛素受体特异性结合，其中该类似物的二肽延伸的类似物无法特异性结合胰岛素受体。注意，二肽突出端缺乏允许二肽自发切割的适当结构(在二肽的第二位上不存在N-烷基化氨基酸)，因此无法恢复胰岛素受体结合。
还可采用允许非编码氨基酸掺入蛋白质中的系统，包括例如美国专利号7,045,337和7,083,970中教导的系统，体内合成包含修饰氨基酸(例如A19位的4-氨基苯丙氨酸)的IGF A:B(YB16LB17)胰岛素类似物肽。
表7
制备了IGFB16B17类似物肽的其它前药类似物，其中二肽前药元件(丙氨酸-脯氨酸)通过酰胺键与A链的氨基端连接(IGF1(YB16LB17) (AlaPro)A-1,0)。如表8所示，IGF1(YB16LB17)(AlaPro)A-1,0对胰岛素受体的亲和力降低。注意，根据表3的数据，二肽前药元件缺乏允许二肽前药元件自发切割的适当结构，因此检测到的胰岛素受体结合不是前药元件切割的结果。
表8
实施例11
其它IGF胰岛素类似物。
IGF1 (YB16LB17)肽序列的进一步修饰揭示在其对胰岛素和IGF-1受体的效能方面不同的其它IGF胰岛素类似物。表9提供了这些类似物每一种的结合数据(采用实施例3的测定法)，其中修饰的位置根据在天然胰岛素肽中的相应位置标示(DPI = des B26-30)。例如，本文没有任何更多说明而提及的“B28位”可意指SEQ ID NO: 2的第1个氨基酸缺失的胰岛素类似物B链的相应的B27位。因此一般提及“B(Y16)”是指天然IGF-1序列(SEQ ID NO:3) B链15位的酪氨酸残基的取代。表9中提供了有关胰岛素和IGF类似物的相对受体结合的数据，表10中提供了有关IGF类似物刺激的磷酸化的数据(采用实施例4中的测定法)。
实施例12
胰岛素多肽的生物合成和纯化
将包含通过IGF-I C链连接的天然胰岛素B链和A链的胰岛素-IGF-I (B0-C1-A0)小基因(minigene)克隆至表达载体pGAPZα A (购自Invitrogen)，该载体在用于重组蛋白质在酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中组成型表达和纯化的GAP启动子(甘油醛-3-磷酸脱氧酶(GAPDH)的启动子)控制下。将小基因与编码酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) α-交配因子前导信号的N端肽融合，所述前导信号用于将重组蛋白质分泌到培养基中。使用小基因和前导α-交配因子序列之间的Kex2切割位点切割用于分泌具有天然氨基端的小基因的前导序列。在B0C1A0小基因的1 (G1a)、2 (Y2a)、3 (G3a)、4 (S4a)、5(S5a)、6 (S6a)、7 (R7a)、8 (R8a)、10 (P10a)、11 (Q11a)和12 (T12a)位将单一位点丙氨酸突变引入C肽。
将包括B0C1A0、11个丙氨酸突变体的小基因和其它选择的衍生物通过电穿孔转化至酵母巴斯德毕赤酵母中。在最低限度的甲醇板中选出阳性转化株，进行各毕赤酵母分离株的基因组制备，通过PCR证实构建体整合至酵母基因组中。在琼脂糖DNA凝胶中观察833碱基对PCR产物。通过相应酵母系的发酵来产生胰岛素类似物。在500 ml Beckman离心管中以5 K离心20分钟使酵母细胞沉淀，保留培养基用于随后的蛋白质纯化。
将生长培养基上清液通过0.2 μm Millipore滤器过滤。将乙腈(ACN)加入上清液中至20%的最终体积。上清液经得自Sigma的用20% ACN水溶液预平衡的AmberliteXAD7HP树脂纯化。树脂然后用30 ml 20% ACN水溶液漂洗2次，用含有0.1% TFA的30% ACN水溶液除去污染物。部分纯化的胰岛素类似物用含有0.1% TFA的54% ACN水溶液从柱上洗脱，并冻干。将冻干样品重新悬浮于0.025M NH3HCO3 pH 8中，并在Luna C18柱(10 μm粒径，300A°孔径)上纯化。使用20-60% ACN水溶液的线性梯度将蛋白质从柱上洗脱。合并MALDI-MS阳性流分，并转移至一次性闪烁管中用于后续冻干。然后将冻干样品重新悬浮于含有0.1% TFA的20%ACN水溶液中，并在Luna C18柱(10 μm粒径，300A°孔径)上纯化。使用含0.1% TFA的18-54%ACN水溶液的线性梯度从柱中洗脱蛋白质。在吸光度280 nm处监测蛋白质洗脱。通过C8分析柱对MALDI-TOF MS阳性流分进行分析以确保纯度。
B0-C1-A0类似物显示对胰岛素受体同种型和IGF-1受体两者同样有效的效能。2位的酪氨酸突变为丙氨酸或通过缺失C9-12使C肽缩短至8个氨基酸提供通过显著降低IGF-1受体活性而选择性提高胰岛素作用的特异性。另参见表11A和11B提供的数据：
表11A
胰岛素结合与磷酸化分析
(B 0 C 1 A 0 )
表11B
IGF-1结合与磷酸化分析
(B 0 C 1 A 0 )
图6和7提供以结合亲和力(IC50)和通过酪氨酸磷酸化的生物化学信号传导(EC50)的比率的单链胰岛素突变体的体外分析。两个独立的测量表明极好的一致性，因此验证了这个体外方法用于结构功能分析。所有的类似物保持单一单位纳摩尔活性，其某些特定类似物证实效能略有提高(低的单一单位纳摩尔)。大多数胰岛素选择性类似物是我们失去C肽的最后4个残基的类似物，在C肽的2位处具有丙氨酸突变，或两种改变的组合。
实施例13
通过Mini-Peg连接的单链胰岛素类似物的合成和表征。
采用两步天然链连接方法，通过固相合成制备一系列单链胰岛素类似物。初始肽为线性构建体，其中N端自CysB19开始，持续直到具有短的线性乙二醇聚合物的AsnA21，乙二醇聚合物用作最后的B链氨基酸C端与A链第一个氨基酸(通常为甘氨酸)的N端的连接。B链的N端(其通常始于最终胰岛素类似物的第一个N端氨基酸，终于B链的氨基酸18，通常为缬氨酸)与单个线性肽进行片段偶联。一旦通过硫醇基辅助的天然链连接进行偶联，便将该肽通过层析法纯化，转化成正确的二硫化物异构体，并再次通过高效层析法纯化。通过HPLC和MS分析，对所有胰岛素类似物的纯度进行分析。
图8A以使用PEG8作为接头的单个实例提供合成设计示意图。应用相同方法合成较短或较长长度的类似物以及通过使用不止一个以线性方式共价连接的mini-peg作为酰胺所获得的可变长度的类似物。
图8B和8C提供通过研究在特定位置上经规定长度的mini-peg连接的单链胰岛素类似物所获得的体外实验结果。图8b和8C表示使用4、8或16个乙二醇单元的minipeg得到相对于天然激素活性小于5%的低效能胰岛素类似物，通过结合或生物化学信号传导测量。
表11C提供的数据表明当使用相同大小的mini-peg接头将缩短的B链的C端与A链的N端偶联时，效能极大地提高。一旦与mini-peg偶联，des-V (缺失氨基酸B26-30)胰岛素类似物与天然激素有竞争性效力，相对于全长B链类似物增加超过10倍。
表11C：mini-PEG连接的单链胰岛素类似物对胰岛素和IGF-1受体的磷酸化活性
使用PEG链接头对单链类似物进行了比较分析，以测量不同大小的PEG连接部分如何影响对胰岛素和IGF-1受体的体外活性，所述体外活性由通过磷酸化的受体信号传导测量。数据显示PEG12DesV构建体(其中B链的5个羧基端氨基酸已缺失)提供最有效力的化合物。
构建包含PEG12和单个氨基酸(甘氨酸或赖氨酸)作为连接部分的单链类似物，所述连接部分将DesV B链与天然胰岛素A链连接。单链peg/氨基酸连接的类似物对胰岛素和IGF-1受体的体外活性的比较分析显示，peg/氨基酸连接的类似物是有效力的胰岛素受体激动剂，所述体外活性由受体结合和通过磷酸化的受体信号传导测量。同样地，将2个赖氨酸残基加至连接部分(单链peg/(赖氨酸)2连接的类似物)，产生有效力的单链peg/氨基酸连接的胰岛素受体激动剂，由受体结合和通过磷酸化的受体信号传导测量。
实施例14
酰化胰岛素类似物
对小鼠进行比较胰岛素耐量试验，比较了人胰岛素相对于3种不同的酰化胰岛素类似物降低和保持低血糖浓度的能力。对两种不同浓度(27 nmol/kg和90nmol/kg)的化合物进行了测试。酰化胰岛素包括MIU-41 (具有通过与位于A14位的赖氨酸残基连接的γ谷氨酸接头的C16酰化的两链胰岛素类似物)、MIU-36 (具有与B链的N端连接的C16酰化的两链胰岛素类似物)和MIU-37 (具有通过与位于B22位的赖氨酸残基连接的γ谷氨酸接头的C16酰化的两链胰岛素类似物)。与天然胰岛素相比，甚至在8小时后，所有3种酰化胰岛素类似物提供更基础和持续降低的葡萄糖水平(参见图9A-9D)。
实施例15
聚乙二醇化胰岛素类似物
制备了各种聚乙二醇化胰岛素类似物，并进行了体外测试。表12显示各个类似物相对于天然胰岛素的活性百分比。
表12. 聚乙二醇化IGF-1和胰岛素类似物
对小鼠进行比较胰岛素耐量试验，比较了酰化胰岛素类似物Detemir相对于聚乙二醇化单链胰岛素类似物MIU-56：B1(H5,Y16,L17)25-PEG8-K-PEG4-A1(N18,21)的能力。该单链类似物包含20 kDa PEG，其与连接A链和B链的连接部分(PEG8-K-PEG4)中单个赖氨酸残基的侧链连接。聚乙二醇化类似物具有持续作用时间达24小时，其起效是逐步的，足以避免在24小时内持续作用所需要的剂量下的动物镇静。
制备包含通过20 kDa PEG链头-头连接的两个胰岛素单链类似物(B1(H5,Y16,L17)25-C1-A1(N18,21)的二聚体(MIU 58)。发现二聚体的效力比母体化合物低，但仍有活性。
总之，胰岛素类似物的聚乙二醇化，不论使用基于胰岛素还是基于IGF的肽骨架，体内均提供不存在低血糖时更长的作用持续和基础特征。
实施例16
胰岛素前药类似物的比较胰岛素耐量
给予正常小鼠胰岛素异二聚体类似物[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-NH2)]或其前药衍生物。前药衍生物[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-dLys(Ac),NLeu)]包含在A19位的4-氨基-苯丙氨酸取代，其中二肽dLys(Ac),NLeu在A19残基位的4-氨基处共价连接。这种二肽可在生理条件下自主切割，其半衰期为约5小时。在将前药衍生物[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-dLys(Ac),NLeu)]离体温育24小时后，将所得化合物给予小鼠，并对其降低血糖的能力与母体化合物相比较。发现两种化合物表现得几乎相同。
实施例17
聚乙二醇化低效能丙氨酸类似物
可通过降低本文公开的各种胰岛素类似物对胰岛素受体的活性，来延长其作用持续时间。因此，在一个实施方案中，可对本文公开的胰岛素类似物进行修饰以降低其对胰岛素受体的效能，包括通过1-8、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸取代的修饰。在一个实施方案中，氨基酸取代是选自B5、B10、B24、A1或A8位的丙氨酸取代。这些位置的一个或多个上的丙氨酸取代大大降低效能，因此延长对胰岛素受体的作用持续时间。在一个实施方案中，本文公开的胰岛素类似物通过B5、B24、A1或A8位的单个丙氨酸氨基酸取代被进一步修饰。这些化合物可如表13中所示的通过聚乙二醇化被进一步修饰(GE5W = GEEEEEW，一种加到胰岛素类似物的N端以提高溶解度的肽)。
表13
如表14中所示，制备了单链和两链胰岛素类似物，并针对对胰岛素和IGF-1受体的活性进行了体外测试，并与其聚乙二醇化衍生物进行了比较。与聚乙二醇化衍生物相比，非聚乙二醇化形式具有较高的活性。此外，使用2个10 kDa PEG链使两链胰岛素类似物二聚乙二醇化，产生与包含单个20 kDa PEG链的相同类似物相比大致相似活性的化合物(参见B1(H5,10Y16L17K29)29:A1(H8,N18,21)相对于B1,A14-10KB1(H5,10Y16L17R29)29:A1(H8K14N18,21)和B1(H5,10Y16L17K29)29:A1(H8N18,21)的相对活性)。对于单链类似物B1(H5,10Y16L17K29)29-A1(H8,N18,21)，加入20 kDa产生对胰岛素A型受体具有几乎100倍活性的化合物(B1(H5,10Y16L17K29)29-A1(H8N18,21)。因此，通过制备作为两链或单链类似物的胰岛素类似物，并通过选择PEG链的大小、数目和连接位点，可改进胰岛素类似物的体内效能，且可能改进体内作用持续时间。
实施例18
胰岛素二聚体的制备
用于合成二聚体衍生物的单体肽的序列列于表16中。
表15. 胰岛素二聚体的序列。
表16. 起始胰岛素单体的序列。
#48：CysB1-CysB1 #2*二聚体完全化学合成
通过用二硫键使两个胰岛素类似物#2*分子在其N端半胱氨酸上交联来制备二聚体#48。通过两个肽段的天然化学连接，来制备类似物#2*。将是半胱氨酸的保护形式的非天然氨基酸噻唑烷-4-甲酸(Thz)引入B链的N端。在胰岛素类似物以所形成的3个二硫键折叠成正确构象后，通过在水溶液中在pH 4.0下用甲氧基胺处理，使Thz转化成半胱氨酸。Thz的引入在B链N端上提供额外的半胱氨酸，而又不破坏天然胰岛素序列中其它6个半胱氨酸的二硫键配对。为了促进在B链N端形成交联二硫键，将DTNP (2,2’-二巯基双(5-硝基吡啶))加入一半的CysB1肽中以激活N端半胱氨酸。将活化肽与另一半的CysB1肽反应，得到二硫键连接的同二聚体。在合成完成后，将二聚体类似物用胰蛋白酶处理，以将两个肽亚基转化成两链结构(参见图22A：#48 (CysB1-CysB1 #2二聚体)的合成流程)。
#49：PheB1-PheB1 #28二聚体和#50：PheB1-(GE5W)2-PheB1 #30二聚体半合成
通过使两个胰岛素类似物(#28或#30)单体二聚化，来制备类似物#49和#50。肽#28由胰岛素B链(desB30)和A链组成，具有单个KB29R突变使得能够酶切割。肽#28在B22位处含有另一个精氨酸，其较不易被蛋白酶消化。通过控制反应时间、反应温度和酶/肽比率，我们能够选择性地在ArgB29的C端切割，产生两链胰岛素。可通过质谱法测量分子量增加18 Da，来证实转化为两链结构。肽#30在结构上与#28类似，不同的是RB22H突变和在N端存在前序列GEEEEEW。ArgB22被HisB22置换以允许更精确有效的胰蛋白酶切割。
用通过使两个胰岛素肽在N端氨基上交联的类似策略，来合成#49和#50两者。二聚体#49的合成见图22B。在DIC和DIEA存在下，将S-三苯甲基-巯基丙酸用羟基琥珀酰亚胺激活，以形成胺反应性琥珀酰亚胺基酯(NHS酯)。使NHS酯与N端氨基反应，形成在各肽N端具有s-三苯甲基-巯基丙酸的酰胺键。通过用无水TFA处理，随后脱去三苯甲基保护基。通过该方法，将额外的硫醇基引入各个生物合成胰岛素肽的N端。将一半的N端硫醇基修饰的肽用DTNP (2,2’-二巯基双(5-硝基吡啶))激活，然后与另一半混合以产生N端交联的胰岛素二聚体(#49和#50)。在合成完成后，将二聚体用胰蛋白酶处理以将两个肽亚基转化成两链结构。
#51：LysB29-LysB29胰岛素二聚体合成
使两个天然人胰岛素肽在其LysB29残基处二聚化，来合成二聚体#51。在pH 7.0下通过氨基甲酰化，选择性地保护B链和A链N端的氨基。随后，使赖氨酸B29的侧链的ε-胺与活化的s-三苯甲基-巯基丙酸反应，产生LysB29硫醇基修饰的胰岛素。通过TFA处理脱去三苯甲基保护基，接着在被DTNP (2，2’-二巯基双(5-硝基吡啶))催化的两个硫醇基间形成二硫键(参见图22C)。
#52：LysB29-LysB29 MIU-3*二聚体和#54：LysC8-LysC8 #11*二聚体合成
二聚体#52和#54两者为生物合成的单链胰岛素类似物的二聚体，其有意地在序列中含有单个赖氨酸。二聚体#52由在LysB29残基上对称性地交联的两个MIU-3*分子组成。MIU-3之前被鉴定为单链胰岛素类似物，对3种受体(包括A型和B型胰岛素受体和IGF-1受体)显示共同激动作用(co-agonism)。MIU-3*与MIU-3有相同的肽序列，不同的是N端处的前序列GEEEEEW。二聚体#54用单链胰岛素类似物#11*构建，其在类似物#11的C8位含有单个赖氨酸置换。采用与#51合成相似的策略，通过交联赖氨酸残基，来构建#52和#54两者。按#51合成所述，将N端α-胺选择性地用氨基甲酰化封闭，然后将硫醇基修饰引入赖氨酸侧链ε-胺(流程4)。
#53：LysC8-LysC8 #3二聚体合成
二聚体#53自单链胰岛素类似物#3制备，其具有非肽接头作为C结构域。肽#3由desV B链、PEG接头和A链组成。将赖氨酸残基插入8单元PEG和4单元PEG之间以用作二聚化位点。肽#3通过两个肽段之间的天然化学连接来制备。简单地说，第1段含有B链的前17个氨基酸和其C端处的活化硫酯。第1段的N端在完成肽装配后仍在树脂上时被乙酰化。使第1段与第2段连接，产生全长单链胰岛素肽，第2段代表B链的C端、PEG接头和A链。使全长产物脱盐进入折叠缓冲液，以允许肽折叠和二硫化物形成。将正确折叠的肽通过反相层析纯化，随后用于硫醇基修饰。肽#3在C结构域中部只含有赖氨酸侧链上的一个氨基，其允许位点特异性硫醇基引入。通过在用DTNP催化下在两个硫醇基之间形成二硫键，使硫醇基修饰的胰岛素肽(#3)二聚化(图22E)。
#55：LysB1-PEG9-LysB1 #20*二聚体合成
二聚体#55含有在其赖氨酸B1侧链胺处用短的9单元PEG间隔基交联的两个单链胰岛素肽#20*。肽#20*与#20具有相同的序列，不同的是在B1位Trp突变成Lys。肽#20*在胰岛素肽的N端含有前序列GEEEEE，其B1位的赖氨酸作为LysC切割位点用于脱去前序列。通过氨基甲酰化选择性地封闭N端胺，留下LysB1的ε-胺用于与胺反应试剂进行交联反应。然后使LysB1的ε-胺与在两端具有琥珀酰亚胺基酯的同基-双官能(homo-bifunctional) 9单元PEG反应，产生PEG9连接的胰岛素二聚体(参见图22F)。通过反相层析将PEG肽二聚体从一-聚乙二醇化肽和未反应的试剂中分离出来。
#56：GlyB2-PEG10K-GlyB2 #11二聚体和#57：GlyB2-PEG20K-GlyB2 #11二聚体合成
通过使两个单链胰岛素肽的N端氨基与不同长度的双官能PEG接头交联，来制备二聚体#56和#57。用琥珀酰亚胺基酯(NHS酯)使PEG接头在两端官能化，其与N端胺反应，并在PEG接头两端与两个胰岛素分子缀合(参见图22G)。通过反相层析将PEG肽二聚体从一-聚乙二醇化肽和未反应的试剂中分离出来。
#58：LysC8-PEG20K-LysC8 #3二聚体合成
通过使两个单链胰岛素类似物#3的赖氨酸ε-胺与在两端具有NHS酯的双官能20KPEG接头交联，来制备二聚体#58。随着ε-胺和NHS酯之间的反应，两个肽与PEG接头的两端缀合(参见图21H)。通过反相层析将PEG肽二聚体从一-聚乙二醇化肽和未反应的试剂中分离出来。
实施例19
体外生物活性
B1-B1胰岛素二聚体
#48：CysB1-CysB1 #2*二聚体(完全激动剂)
胰岛素类似物B1[H5Y16L17O22R29]29:A1[O9,14,15N18,21]来源于IGF-1，除ArgB29以外，其所有精氨酸均被鸟氨酸置换。鸟氨酸的侧链是比赖氨酸的侧链短的一个亚甲基。鸟氨酸肽不被胰蛋白酶识别，因为缩短的侧链不匹配酶的活性部位。因此，胰蛋白酶切割针对B链的C端的ArgB29，这在切割后得到两链胰岛素。根据之前结合测定结果，该类似物对A型胰岛素受体显示55%活性。类似物#2*包括在B链N端额外的非天然氨基酸Thz，通过用甲氧基胺处理可转化为半胱氨酸。在折叠过程完成后，ThzB1在游离半胱氨酸存在时在折叠缓冲液中转化成CysB1。通过在CysB1和溶液中存在的添加的游离氨基酸半胱氨酸间形成二硫键，类似物2*保持单体状态。在磷酸化测定法中，Cys-CysB1肽对A型胰岛素受体显示23.1%活性，在结合测定法中显示55.4%活性。这表明将单个半胱氨酸加至B链N端不影响体外结合或信号传导。
类似物#48，类似物#2*的二聚体形式，在磷酸化测定法中显示101.7%受体活性，在结合测定法中为146.7%。二聚化导致受体活性3~4倍增加，其可能随之而变化。
实施例20
二硫键连接的二聚体通过完全化学合成的制备
B1-B1二硫键连接的二聚体(# 48)的合成
通过逐步固相肽合成，合成肽段B1[Thz1H5Y16L17](1-18)-α-硫酯-RRRR-NH2、B1(19-29)[O22]-A1[O9,14,15N18,21]-NH2和N-乙酰基-B1[H5Y16L17](1-18)-α-硫酯-RRRR-NH2。通过天然化学连接将两个肽段连接在一起，得到全长胰岛素肽。在pH 4.0下用2 mM甲氧基胺处理，使N端Thz氨基酸转化成半胱氨酸。将反应物在室温下搅拌3小时，通过MALDI-TOF证实转化完成。然后调节肽溶液至pH 8.0，加入10 % DMSO以诱导二硫化物形成。通过分析型HPLC监测二聚体形成。在反相柱上使二聚化产物与未反应的单体分离，通过MALDI证实身份。
C8-C8二硫键连接的二聚体(# 53)的合成
将s-三苯甲基-巯基丙酸(Trt-SCH2CH2COOH) (National Biochemical Corp.,Ohio)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) (Sigma)和二异丙基碳二亚胺(DIC)各1 mmol在室温下在搅拌的同时在2 mL DMF中混合30分钟，以制备Trt-SCH2CH2CO-NHS酯。将胰岛素肽以10 mM的浓度溶于含5% TEA的无水DMF中。将2 eq活化的Trt-SCH2CH2CO-NHS酯加入溶液中。将反应物在室温下搅拌2小时后，用2%乙醇胺终止反应。然后反应物用含4%苯硫基甲烷(Sigma)和8%三异丙基甲硅烷(TIPS) (Sigma)的无水TFA稀释5倍以脱去三苯甲基保护基。将脱保护反应物在室温下搅拌30分钟，然后用乙醚稀释20倍以将肽提取入沉淀中。将稀的反应物离心，将沉淀的肽溶于1%乙酸/20%乙腈水溶液中，并冻干。将冻干产物重新溶于DMSO中。将一半的肽溶液与1 eq 2,2’-二硫双(5-硝基吡啶) (DTNP) (Sigma)混合以激活硫醇基。可通过分析型HPLC监测激活反应，出现黄色也表明反应过程。然后将活化肽与另一半未反应的肽混合，得到二硫键连接的二聚体。通过反相HPLC，将二聚化产物从未反应的单体中分离，合并所需流分，并冻干。通过MALDI或LC-MS证实身份。
二硫键连接的二聚体通过半合成的制备
通过来自大肠杆菌(E.coli)细胞的生物合成，来制备胰岛素类似物。为了使N端胺氨基甲酰化，将胰岛素肽以0.5 mg/ml的浓度溶于含50 mM氰酸钾(Sigma)的PBS缓冲液(pH7.0)中。在室温下搅拌反应物过夜，通过MALDI证实氨基甲酰化反应完成。使氨基甲酰化肽在反相柱上脱盐，合并含肽流分，并冻干。使HS-CH2CH2CO在N端的α-胺或赖氨酸侧链的ε-胺处与肽缀合，并且如二聚体#53合成所述，通过在两个胰岛素分子间形成二硫键，得到胰岛素二聚体。
PEG连接的二聚体通过半合成的制备
将通过化学合成或生物合成制备的胰岛素肽以10 mg/ml的浓度溶于含5% DIEA的无水DMF中。将0.5当量的双官能NHS-PEGn-NHS (n=9，10K，20K) (Creative PEGWorks)加入肽溶液中。将反应物在室温下搅拌1小时。通过分析型HPLC监测反应过程。完成后，将反应物用0.1% TFA/10%乙腈水溶液稀释到至少20倍反应体积。然后将稀的反应物加载到反相柱上，将二聚化衍生物纯化，并冻干。
体外生物活性测定法
竞争结合测定法
在竞争结合测定法中，利用闪烁亲近技术，测试了胰岛素类似物的受体结合亲和力。在测试中包括重组人胰岛素(Eli Lilly & Co.，Indianapolis，IN)作为标准品(“不带放射性的”天然胰岛素)。在96孔板(Corning Inc.，Acton，MA)中，用含有50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，0.1%w/v牛血清白蛋白(Sigma Aldrich，St Louis，MO)，pH 7.5的闪烁亲近测定缓冲液，对胰岛素类似物和胰岛素标准品进行系列5倍稀释。将稀释的肽与0.05nM重组人[125I]-胰岛素(3-[125I]碘酪氨酰TyrA14)胰岛素(Perkin Elmer，Waltham，MA)混合。将1-6mg等分的由过量表达人胰岛素受体的细胞制备的血浆膜碎片连同蛋白酶抑制剂和0.25 mg聚乙烯亚胺处理的(PVT)麦胚凝集素(WGA)闪烁亲近测定珠粒(Aersham Biosciences，Piscataway，NJ)一起加到各孔中。将板在800 rpm下振荡5分钟后，在室温下温育12小时。用MicroΒ1450液体闪烁计数器(Perkin Elmer，Waltham，MA)测量放射活性。用是试验样品最高浓度4倍的“不带放射性的”天然胰岛素，测量各孔的非特异性结合的(NSB)放射活性。在不含“不带放射性的”天然胰岛素作为竞争剂的孔中，检测总的结合放射活性(TB)。如下计算特异性结合百分比：[(结合-NSB)/TB] × 100%。对%特异性结合与试验样品浓度的作图，通过Origin软件(Origin Lab，Northampton，MA)确定，得到IC50值。类似物的亲和力表示为相对于天然人胰岛素的亲和力的值[IC50 (胰岛素)/IC50 (类似物) × 100%]。
受体激酶活性测定法
将具有过量表达A型胰岛素受体、B型胰岛素受体或IGF-1受体的转染的HEK 293细胞保持在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM) (Hycone，Logan，UT)中，该培养基补充了含有抗生素的10%牛生长血清、10 mM HEPES和125 µg/ml Zeocine。将细胞以4.0 × 104个细胞/孔的密度铺板在聚赖氨酸包被的96孔板(Corning)上的80 µl血清耗竭培养基中。使细胞在补充0.25%牛生长血清、抗生素和10 mM HEPES的不含血清的DMEM中培养16小时。用含0.5% BSA的DMEM，对胰岛素类似物和胰岛素标准品进行系列5倍稀释。将20 µl类似物溶液加入含有转染细胞的各孔中，在37℃下温育15分钟。在温育后，将细胞用福尔马林固定20分钟，然后用含有0.1 % TritonX-100的PBS缓冲液洗涤2次。然后加入含有PBS、0.1 %TritonX-100和2% BSA的封闭溶液以封闭非特异性抗体结合部位。在3次洗涤后，将50 µl抗体4G10抗磷酸酪氨酸-HRP缀合物(Millipore)稀释10,000倍，并加入板中。将细胞与抗体一起在室温下温育3小时，然后用含有0.1 % TritonX-100的PBS洗涤4次。加入100 µl荧光底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB) (Invitrogen，Carlsbad，CA)，温育5-10分钟用于荧光显色。通过加入1N HCl，终止荧光显色反应。通过Titerteck multi-scan MCC340读数器上在450 nm处对板进行扫描，记录荧光信号。通过用Origin软件(Origin Lab，Northampton，MA)对OD450nm与试验样品浓度作图，来计算EC50值。
在所有测定中，在各个实验中都将测定相对于人胰岛素标准品或人IGF标准品的活性，然后对实验数量取平均。因此类似物的EC50或IC50可表示受体结合活性。
拮抗作用测定法
用含0.5% BSA的DMEM，对胰岛素类似物和胰岛素标准品进行系列5倍稀释。将10 µl类似物溶液与10 µl 12 nM胰岛素溶液混合以制备含有6 nM胰岛素和所需浓度的胰岛素类似物的混合物。将20 µl的混合溶液加到含有转染细胞的各孔中，在37℃下温育15分钟。随后的程序与上述受体激酶活性测定法相同。
啮齿动物中的胰岛素耐量试验
在整个检查期间，在禁食的C57BL/6小鼠或db/db小鼠中进行了急性胰岛素耐量试验。皮下给予试验化合物。恰在注射前和8小时试验的1、2、3、6和8小时或24小时试验的1、2、3、6、8、12和24小时测量血糖水平。
B1-B1 PEG连接的胰岛素二聚体(完全激动剂)
制备一系列PEG连接的B1-B1二聚体以鉴定接头长度对受体活性的作用。PEG接头的分子大小自500Da到20KDa变化。所有PEG连接的B1-B1二聚体对胰岛素受体是完全激动剂，其受体活性概括于表17中。二聚体#55包括9单元短的PEG作为两个胰岛素间的接头，#55的活性类似于其单体肽骨架#20*。二聚体#56和#57含有相对大的PEG接头。这在很大程度上降低了受体活性，据推测是因为位阻所致。增加PEG接头的分子大小明确诱导对受体活性的更消极的作用。然而，对A型和B型胰岛素受体两者，PEG20K交联的二聚体(#57)的效力是20K聚乙二醇化单体(#39)的几乎4倍，这就表明二聚体的结构显得诱导与胰岛素受体的协同结合，导致了受体活性提高。
表17. PEG连接的胰岛素二聚体的受体活性
实施例21
B29-B29胰岛素二聚体
#51：LysB29-LysB29胰岛素二聚体(部分激动剂)
二聚体#51是一种建立在天然胰岛素序列上的B29-B29交联二聚体。二聚体#51在结构上与之前报告的B29-B29’ PEG连接的二聚体相似，不同的是#51通过形成二硫键被交联。#51的接头长度虽然不同，但与B29-B29’二聚体的大致相同，因为LysB29的ε-胺被8原子接头分隔。另外，#51在B链和A链的N端含有氨基甲酰化，这降低受体效能至约30%，但保持对胰岛素受体的完全激动作用。
与之前报告的B29-B29’二聚体一样，#51还显示对胰岛素受体的部分激动作用。二聚体#51能够诱导对胰岛素受体的S形剂量反应曲线，其中对胰岛素受体通过二聚体#51诱导的最大反应正好是由天然胰岛素诱导的一半(图11A和图11B)。与对胰岛素受体的其它弱完全激动剂不一样，仅通过提高配体浓度不会达到最大反应。图11中未列出部分激动剂的EC50，因为最大反应的不同水平所致，该值不可与完全激动剂的相比。
部分激动剂#51还显示针对胰岛素对胰岛素受体的作用的拮抗作用。为了测试拮抗作用，将过量表达胰岛素受体的工程改造的HEK293细胞用规定浓度的#51和6 nM胰岛素组合进行处理。根据先前的受体激酶活性测定法结果，6 nM胰岛素能够诱导95%最大反应。在对照实验中，用胰岛素替换二聚体#51，重复该程序。拮抗作用测定法显示，#51能够拮抗胰岛素的作用，并降低受体反应至被天然胰岛素诱导的最大反应的一半。
二聚体#51还显示，在与天然胰岛素相比时对IGF-1受体的效能降低(图11C)。由于反应曲线因低效能所致不完全，因此不清楚#51对IGF-1受体是部分激动剂还是弱完全激动剂。在HMEC增殖测定法中，二聚体#51在刺激HMEC细胞生长时还显示弱效能(图11D)。
C8-C8胰岛素二聚体
#53：LysC8-LysC8 #3二聚体(部分激动剂)
通过使2个类似物#3分子二聚化，来制备二聚体#53。肽#3是一种IGF-1来源的单链类似物，含有用8单元mini-PEG、赖氨酸和4单元mini-PEG连接的IGF-1 B链和A链。将精选的突变引入B链和A链中，以恢复胰岛素受体活性，并降低IGF-1受体活性。肽#3对胰岛素受体是完全有效的。通过与巯基丙酸反应将额外的硫醇基引入LysC8侧链。在各自的C8位的两个硫醇基间形成二硫键以将两个肽交联，并产生二聚体#53。
二聚体#53对A型和B型胰岛素受体两者亦是部分激动剂。由#53诱导的最大反应也正好是由胰岛素诱导的对两种受体的最大反应的一半。与#51不同，#53的受体反应曲线是钟形的。随浓度增加，受体反应下降。在高浓度下，#53能够使受体完全失活。拮抗作用测定显示，#53竞争性地抑制胰岛素的作用，并且在高浓度下使胰岛素受体完全沉默。对IGF-1受体，#53还显示部分激动作用。虽然在刺激受体反应中#53显示不足，但在与胰岛素受体结合中是完全有效的。在结合测定法中，随浓度增加，#53能够从胰岛素受体中完全置换放射性标记的胰岛素。#53的结合亲和力甚至是天然胰岛素的约1.5倍(图17)。结合亲和力和诱导生物反应的能力间的偏差应当是对胰岛素作用的拮抗作用的原因。在B29-B29’二聚体的研究中报告了这种现象，在B29-B29’二聚体和C8-C8’二聚体的现有数据中再次观察到这种现象，这表明了该偏差是部分激动剂二聚体的独特的结构特性。这种部分激动作用可能与新的体内治疗性质有关，因为拮抗胰岛素作用的能力可能限制过量给药的倾向。
#58：LysC8-PEG-LysC8 #3二聚体(完全激动剂)
具有在类似物#3的C8位缀合的20k PEG的类似物#38是完全激动剂。因此，部分激动作用不是通过由C8位的修饰诱导的结构改变引起的。为了研究二聚体内两个胰岛素分子间的距离的作用，引入20K PEG接头以使两个类似物#3分子在其C8位处交联，这得到二聚体#58。在#58中，两个胰岛素分子被大的PEG间隔基分隔开，预期更独立地起作用。二聚体#58显示对胰岛素受体的完全激动作用，其效能降低，据推测是因空间排列的PEG接头所致。用PEG接头将两个胰岛素分子分隔开破坏对胰岛素受体的部分激动作用，表明了两个活性部位间的距离对部分激动作用是至关重要的。PEG连接的二聚体#58显示与聚乙二醇化单体#38相似的效能。对于B1-B1 PEG连接的二聚体所观察到的效能增加不出现在C8-C8 PEG连接的二聚体中，表明了对于与胰岛素受体的协同结合，C8-C8’键可能比B1-B1’键更不适宜。
#54：LysC8-LysC8 #11*二聚体(完全激动剂)
还从IGF-1来源的单链类似物(#11*)制备二聚体#54。作为mini-PEG接头的替代，#11*的C结构域含有来源于IGF-1 C肽的12个氨基酸。IGF-1 C肽的ArgC8被LysC8置换，其用作二聚化位点。二聚体#54对胰岛素受体几乎是完全激动剂(图18A和18B)。由#54诱导的最大受体反应的水平比由其它两种部分激动剂#51和#53诱导的高得多。二聚体#53和二聚体#54显示受体作用方式的显著差异，虽然它们两者都具有C8-C8’键。差异可能来源于肽骨架的结构。#3和#11*间最明显的差异是C结构域的含量。肽#3用非肽基PEG接头作为C结构域，而#11含有12个氨基酸序列。虽然两个C结构域的长度大致相同，但认为PEG接头比氨基酸序列更灵活，不太可能受结构刚性限制。在B29-B29二聚体的研究中也观察到结构柔性的重要性。两链胰岛素的二聚体(#51)是部分激动剂，而用12个氨基酸C肽连接B链和A链(#52)破坏部分激动作用。肽#11*在B10和A8位还含有两个额外的His突变，被设计来提高受体选择性。这两个突变被认为不太可能涉及部分激动作用确定。
动物研究：体内活性
B1-B1’二聚体#50 (完全激动剂)和B29-B29’二聚体#51 (部分激动剂)
在整个检查期间，在禁食的正常小鼠中测试了完全激动剂#50和部分激动剂#51。通过皮下注射给予试验化合物，在注射后24小时内测量血糖水平。
将胰岛素给予正常小鼠作为阳性对照。这在注射后2小时内诱导血糖水平快速降低。血糖水平在注射后2小时开始升高，并在4小时后返回基线(图14A。完全激动剂#50显示体内效能显著提高。12 nmol/kg剂量的#50显示与60 nmol/kg剂量的天然胰岛素类似的血糖作用。以60 nmol/kg剂量给予#50的8只小鼠的组中仅2只小鼠存活，以300 nmol/kg给药的组中无一存活(图14B)。在体外测定法中，二聚体#50的效能是天然胰岛素的大约2倍，但体内#50的效能是胰岛素的约5倍。显著提高的体内活性可能是亲合力的结果，这无法在体外基于细胞的测定法捕获到。
部分激动剂#51显示体内效能降低。由60 nmol/kg剂量的#51诱导的血糖作用与由20 nmol/kg剂量的胰岛素诱导的类似。此外，由300 nmol/kg剂量的#51诱导的血糖概况与由60 nmol/kg剂量的胰岛素诱导的类似。甚至在最高剂量300 nmol/kg下，#51不诱导低血糖(图14C)。效能降低可能是对受体的部分活化引起的，如体外所观察的一样。
PEG连接的二聚体和聚乙二醇化单体
聚乙二醇化单体和PEG连接的二聚体两者能够诱导血糖降低，并且与非聚乙二醇化肽相比，该作用延长。聚乙二醇化单体的血糖作用延长超过24小时，但在给予PEG连接的二聚体后，在6小时后血糖水平开始上升。这就表明，PEG连接的二聚体可比聚乙二醇化单体更快地从循环中清除。
PEG连接的二聚体对胰岛素受体是完全激动剂。体外GlyB2-PEG20K-GlyB2二聚体#57的效能是GlyB2-PEG20K单体#39的约5倍。然而，二聚体#57的体内血糖作用不比单体#39的延长，两种剂量下的二聚体#57的AUC低于单体#39的AUC。由二聚体的结构引起的受体效能提高可加快受体介导的清除，这可导致药代动力学概况缩短(参见图15A和15B)。
实施例22
胰岛素异二聚体的制备
在本研究中，我们制备了共价连接的胰岛素异二聚体，其由一个有活性的单链胰岛素和一个无活性的单体小胰岛素原(mini-proinsulin)通过连接B29和A1的肽键组成。无活性的单体单元可被酶促转化为活性状态，这允许我们研究各单体单元各自的功能。另外，我们设计了两个胰岛素-IGF-2异二聚体以通过IR-A优选的IGF-2结合选择性地拮抗IR-A活性。胰岛素-胰岛素异二聚体和胰岛素-IGF-2异二聚体的结构信息概括于表18中，用于构建这些异二聚体的单体肽列于表19中。
表18. 胰岛素-胰岛素异二聚体和胰岛素-IGF-2异二聚体的序列。
表19. 胰岛素和IGF-2单体的序列
通过交联两个不同的胰岛素单体，来合成胰岛素异二聚体。通过在硫醇基激活的胰岛素肽和硫醇基修饰的胰岛素衍生物之间形成二硫键，来实现位点特异性交联。
二聚体#59由两个不同的胰岛素类似物#2(sc)和#3组成。它在#2(sc)的B1位和#3的C8位之间交联。#2和#3两者来源于具有精选突变的基于IGF-1的序列以恢复胰岛素受体活性并降低IGF-1受体活性。肽#2(sc)由具有通过线性α-酰胺键连接的LysB29和GlyA1的B链和A链组成。通过用LysC酶处理，单链#2(sc)可转化成两链类似物#2(tc)。肽#2(tc)在与胰岛素受体结合和刺激受体活化中是完全有效的。类似物#2在B链N端含有非天然氨基酸Thz，其可通过在水溶液中在pH 4.0下用甲氧基胺处理转化成半胱氨酸。使N端半胱氨酸与另一肽的活化硫醇基反应形成二硫键，使两个胰岛素单体交联以形成二聚体。
#2的完全合成见图23A。分别通过逐步固相肽合成，来制备两个肽段。第1段含有B链的N端18个氨基酸以及设计用于天然化学连接的硫酯活化。将4个精氨酸加至硫酯的C端以提高该段的溶解度。第2段由剩余的B链和全长A链组成。将两个肽段通过反相层析纯化后连接在一起，得到全长单链胰岛素。通过硫醇基-硫酯交换，使第2段的N端半胱氨酸与第1段的C端硫酯反应，得到硫酯连接的中间体。5元环内发生重排以在两个肽段间形成天然肽键。通过分析型HPLC和质谱法证实连接反应的完成。一旦完成，便将连接反应物加载到大小排阻柱中用于脱盐和缓冲液交换。将肽从小分子试剂中分离，并交换进入折叠缓冲液(20 mM甘氨酸，0.5 M GnHCl，pH 10.5)中。合并含有所需肽产物的流分，调节肽浓度至0.5 mg/ml。将半胱氨酸以8 mM的浓度加到折叠反应中以促进二硫键改组和肽重折叠过程。将氮气泵入肽溶液中以降低空气介导的氧化的速率，这用来降低错折叠的异构体的形成。在不搅拌的情况下，将折叠反应保持在室温或者在4℃下。一般在室温下花费24小时或在4℃下花费48小时以完成肽折叠过程。通过分析型HPLC可观察折叠过程，因为在折叠成正确构象后，肽的疏水性降低。肽折叠还可通过质谱法证实，这通过由于形成3个二硫键，分子量减少6道尔顿来指示。通过反相层析，将正确折叠的肽从错折叠的异构体和其它试剂中分离。然后纯化的胰岛素类似物#2在pH 4.0下用甲氧基胺处理以将N端Thz转化为半胱氨酸。还将硫醇基活化试剂2,2’-二硫双(5-硝基吡啶) (DTNP)加入肽溶液中以原位激活N端半胱氨酸的硫醇基。硫醇基激活的胰岛素类似物#2通过反相层析纯化，并用于异二聚体构建。
硫醇基修饰的胰岛素类似物#3的制备见图23B。类似物#3是一种单链胰岛素类似物，具有作为B链和A链之间的C结构域的非肽基接头。之前的研究已鉴定出用12单元PEG连接TyrB25与GlyA1产生对胰岛素受体完全有效的单链胰岛素类似物(PCT/US2011/040699，其公开内容结合到本文中)。我们在PEG接头的中部包括额外的赖氨酸用作修饰的部位。这种改变不影响受体活性。肽#3在B链N端被乙酰化以封闭α-胺，这允许在赖氨酸侧链ε-胺上的位点特异性修饰。肽#3还用固相肽合成和天然化学连接的组合进行差异合成。第1段含有B链的N端17个氨基酸和C端的硫酯尾。该肽段通过t-Boc化学合成，因为C端硫酯是碱不稳定的。在将肽从树脂上切割下之前，使N端胺乙酰化。第2段含有B链剩余的7个氨基酸、8单元mini-PEG、赖氨酸后接4单元mini-PEG和全长A链。第2肽段可通过t-Boc化学和Fmoc化学两者制备，且在该研究中，它通过Fmoc策略合成。通过上述相同方法，使全长类似物#3连接和折叠。为了将硫醇基引入赖氨酸的侧链胺中，我们通过使s-三苯甲基-巯基丙酸在DIC和DIEA存在下与羟基琥珀酰亚胺反应，制备了胺-反应性琥珀酰亚胺基酯(NHS酯)。使NHS酯与N端氨基反应形成酰胺键，这使s-三苯甲基-巯基丙酸与肽的N端缀合。随后通过用无水TFA处理，脱去三苯甲基保护基。因此，将额外的硫醇基引入生物合成胰岛素肽的N端而又不干扰3个预先形成的二硫键。
将硫醇基激活的胰岛素类似物#2和硫醇基修饰的类似物#3以1:1的比率溶于DMSO中。两个硫醇基间二硫键的形成，产生两个胰岛素分子间的B1-C8键，这就得到#59 (CysB1-LysC8 #2(sc)-#3胰岛素异二聚体) (图24A)。可通过LysC蛋白酶使二聚体#59转化成#60。LysC在LysB29的C端选择性地切割，这得到两链结构(图24B)。
类似物#61是一种异二聚体，由一个单链胰岛素单体和一个IGF-2单体组成。胰岛素类似物#27的N端胺通过二硫键与IGF-2类似物#31的LysC8侧链胺交联。肽#27是一种单链胰岛素类似物，含有胰岛素desV B链、12个氨基酸IGF-1 C链和胰岛素A链。肽#31是一种IGF-2类似物，具有ArgC8Lys和LysD4Arg的2个突变，这允许与C8位的位点特异性缀合。在大肠杆菌细胞通过生物合成制备#27和#31两者。通过与s-三苯甲基-巯基丙酸的活化NHS酯反应，在N端胺上对纯化的胰岛素类似物#27进行修饰。三苯甲基保护基用TFA切割，得到游离硫醇基，随后用DTNP (2,2’-二硫基-双-(5-硝基吡啶)激活硫醇基(图25A)。在与IGF-2类似物#31交联之前，将硫醇基激活的胰岛素#27纯化。经设计，#31在序列中在C8位只含1个赖氨酸氨基酸。在pH 7.0下通过与氰酸钾反应，用氨基甲酰化选择性地封闭类似物#31的N端胺，这使LysC8成为唯一的反应部位用于与该活化NHS酯偶联。然后采用上述相同策略，用巯基-丙酰基修饰LysC8 (图25B)。然后将硫醇基修饰的#31与#27以1:1的比率在DMSO中混合，得到二聚体#61 (#27-#31异二聚体) (图25C)。在二硫化物形成反应中释放的5-硝基吡啶-2-硫醇基在DMSO中显出黄色，这表明反应的进展。
与#61相比，二聚体#62含有一个反向键。IGF-2的N端与单链胰岛素类似物#27*的LysC8交联。肽#27*与#27具有相同的序列，不同的是经设计用于交联化学的C8位的赖氨酸突变。将肽#27*在N端选择性地氨基甲酰化，然后如上所述用巯基-丙酰基修饰LysC8 (图26A)。其它单体单元从天然IGF-2肽制备。天然IGF-2在D结构域中含有赖氨酸残基。通过在pH10.5下乙酰亚胺化(acetimidation)，选择性地封闭该赖氨酸的ε-胺。由于这两个氨基的差异化pKa，因此乙酰亚胺化反应不发生在N端α-胺上。然后用巯基-丙酰基修饰N端α-胺(图26B)。硫醇基修饰的#27*或硫醇基修饰的IGF-2可被DTNP激活，且随后与另一肽的游离硫醇基反应。在该研究中，我们选择激活硫醇基修饰的#27*，因为#27*的疏水性大于IGF-2的疏水性，且激活的Cys(Npys)-27*具有更大的疏水性。这允许通过反相HPLC的保留时间测量的两个单体洗脱峰完全分离。将C8-硫醇基激活的#27*与B1-硫醇基修饰的IGF-2以1:1的比率在DMSO中混合，得到二聚体#62 (图26C)。两个单体峰间出现一个新的洗脱峰表明二聚体形成。
异二聚体的体外受体活性
通过用线性α-酰胺键将B29与A1连接，使#59的一个单体单元失活。之前的研究显示，胰岛素的LysB29和A链的N端之间的肽键使该分子完全失活，但是B29-A1胰岛素的晶体结构与天然胰岛素的基本相同。通过使一个单体失活，设计了#59以研究另一个活性单体的功能。二聚体#59显示对A型胰岛素受体极小的激动作用。由#59诱导的最大受体反应并非显著不同于基线水平。将过量表达胰岛素受体的HEK293细胞用6 nM胰岛素和特定浓度的#59处理。6 nM的胰岛素浓度被证实在诱导对胰岛素受体的95%最大反应中是有效的。在6 nM胰岛素存在下通过增加#59浓度而降低受体反应，表明了二聚体#59能够抑制用作胰岛素受体的拮抗剂的受体反应(图20A)。使聚乙二醇(PEG)与类似物#3的LysC8缀合不改变这种最大反应的水平，因为类似物#38是效能降低(较高的EC50)的完全激动剂。从未报道过与胰岛素序列的精选残基缀合的部分(例如PEG或脂肪酸)影响最大受体活化。使无活性的胰岛素分子与有活性的胰岛素肽缀合的生物学结果明显不同于使无活性的聚合物(例如PEG)与胰岛素缀合的结果。虽然类似物#2(sc)几乎与PEG对胰岛素受体一样无活性，但是当存在于二聚体的结构中时，显示显著的抑制作用。
通过用LysC蛋白酶处理，将无活性的单体单元#2(sc)转化成有活性的两链结构#2(tc)，这就得到二聚体#60。#60中的两个单元是通过B1-C8键交联的活性实体。酶处理恢复对胰岛素受体的部分激动作用，其最大受体反应增加至50%。二聚体#60还显示针对胰岛素的作用的拮抗作用。当与6 nM胰岛素共温育时，递增浓度的#60能够从几乎100%降低受体反应回到0% (基线水平) (图20B)。虽然#60诱导比#59高的对胰岛素受体的最大反应，但其拮抗胰岛素作用的能力几乎与#59相同。#60的半最大抑制浓度(IC50)为1.89±0.29 nM，而#59的IC50为2.08±0.54 nM，如在拮抗作用试验中测量的。对于B型胰岛素受体，由#59诱导的最大反应只是由天然胰岛素诱导的10%。通过酶处理产生的二聚体#60仍然是部分激动剂，但由#60诱导的最大反应增加至50% (图20C)。二聚体#59显示对IGF-1受体的部分激动作用。由#59诱导的最大反应的水平是由天然IGF-1诱导的50%。二聚体#60是完全激动剂，其对IGF-1受体的效能显著增加(图20D)。#60的二聚体的结构使得能够与IGF-1受体协同结合，这将两个一价弱IGF-1受体激动剂转化成有效的二价二聚体。
#60的受体反应曲线与#53 (一种具有C8-C8键的胰岛素类似物#3的同二聚体)的基本相同。这表明了使一个胰岛素类似物与另一个单链胰岛素的C8位交联是对胰岛素受体的部分激动作用的一个因素，不论它是B1-C8键还是C8-C8键。与C8位缀合的单体胰岛素单元的受体活性影响由二聚化衍生物诱导的对胰岛素受体的最大反应的水平。当该单元是无活性的时，受体活化几乎被完全抑制。恢复该单元的受体活性还提高最大受体反应的水平。
实施例23
受体同种型选择性提高的胰岛素二聚体
针对含有一个无活性的单体单元的异二聚体所观察到的抑制作用为设计受体同种型选择性提高的异二聚体提供了一个构思。胰岛素受体以两种同种型存在：A型胰岛素受体(IR-A)和B型胰岛素受体(IR-B)。IR-B主要在胰岛素反应组织中表达，通常被认为与代谢作用有关。相对于IR-B的优先选择在胰岛素药物设计中具有重要意义，因为它可能提供改进的药理学益处。胰岛素同等地结合并激活两种受体同种型。结构上类似的肽IGF-2可以接近胰岛素亲和力的亲和力结合IR-A，但它对IR-B具有1/10倍的结合亲和力。因为将两个胰岛素分子系在二聚体的结构中产生对胰岛素受体的拮抗作用，所以将IR-A优选的IGF-2肽与胰岛素缀合还可提供对IR-A比对IR-B更多的拮抗作用。作为在刺激受体活化中改变固有效能(其可通过EC50测量)的替代，设计受体选择性异二聚体以调节最大受体反应的水平。
通过化学合成制备胰岛素异二聚体
通过固相肽合成和天然化学连接，合成胰岛素类似物#2(sc) B1[Thz1H5Y16L17K29]29-A1[N18,21]。在完成天然化学连接反应后，通过大小排阻柱将连接的肽#2(sc)交换进入折叠缓冲液(0.5 M GnHCl，20 mM甘氨酸，pH 10.5)中。调节肽浓度至0.5 mg/ml，将8 mM半胱氨酸加入肽溶液中。无需搅拌将折叠反应在室温下静置24小时。通过分析型反相HPLC和质谱法监测折叠反应的完成。在折叠完成后，调节pH至4.0，将2 mM甲氧基胺加入肽溶液中。另加入每1当量胰岛素肽2当量的硫醇基活化试剂2,2’-二硫双(5-硝基吡啶) (DTNP)。自Thz向Cys的转化一般耗时4小时完成，且CysB1被DTNP原位激活。CysB1(Npys)-肽#2(sc)通过反相HPLC纯化。
使单链胰岛素类似物#3与活化NHS酯反应以产生硫醇基修饰的肽。为了制备Trt-SCH2CH2CO-NHS酯，将s-三苯甲基-巯基丙酸(Trt-SCH2CH2COOH) (National BiochemicalCorp., Ohio)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) (Sigma)和二异丙基碳二亚胺(DIC)各1 mmol在搅拌的同时在室温下在2 mL DMF中混合30分钟。将胰岛素肽以10 mM的浓度溶于含5% TEA的无水DMF中。将2 eq的活化Trt-SCH2CH2CO-NHS酯加入溶液中。将反应物在室温下搅拌2小时后，用2%乙醇胺终止反应。然后将5倍体积的含4%苯硫基甲烷(Sigma)和8%三异丙基甲硅烷(TIPS) (Sigma)的无水TFA加入反应中以脱去三苯甲基保护基。将脱保护反应物在室温下搅拌30分钟，然后用乙醚稀释20倍以将肽提取入沉淀中。将稀释的反应物离心，将沉淀的肽溶于1%乙酸/20%乙腈水溶液中，并冻干。将Cys激活的#2(sc)和硫醇基修饰的#3以1:1的比率溶于DMSO中，以允许在#2的CysB1和#3的LysC8(SH-CH2CH2CO)之间形成二硫化物，这就得到B1-C8连接的异二聚体#59。黄色出现表明二聚体形成，因为在硫化物形成后释放Npy。通过分析型HPLC监测反应过程，通过质谱法证实二聚体形成。二聚体#59通过反相HPLC纯化，并冻干。
通过LysC蛋白酶将二聚体59的单体#2单元切割成两链结构，得到二聚体#61。将二聚体#59以0.5 mg/ml的浓度溶于PBS中。将每1 mg肽0.5单位的LysC加入肽溶液中。将切割反应物在37℃水浴中温育12小时。通过质谱法，以分子量增加18道尔顿证实切割。
胰岛素异二聚体通过半合成的制备
通过生物合成从大肠杆菌细胞制备胰岛素和IGF-2类似物。使胰岛素类似物#27*和IGF-2类似物#31在N端胺上被氨基甲酰化。将肽以0.5 mg/ml的浓度溶于含50 mM氰酸钾(Sigma)的PBS缓冲液(pH 7.0)中。在室温下搅拌反应物过夜，通过MALDI证实氨基甲酰化反应完成。使氨基甲酰化肽在反相柱上脱盐，合并含肽流分，并冻干。为了阻断IGF-2的LysD4的ε-胺，将IGF-2肽溶于50 mM NaHCO3水溶液(pH 10.5)中。将乙亚氨酸甲酯(Methylacetimidate) (Sigma)以50倍摩尔浓度过量加入肽溶液中。在室温下搅拌乙酰亚胺化反应物30分钟。通过用1 N HCl降低pH至3.0来终止反应。
使HS-CH2CH2CO与类似物#27或IGF-2肽的N端α-胺或氨基甲酰化#27*或#31的赖氨酸的侧链ε-胺缀合。引入胰岛素类似物#27或#27*中的硫醇基用DTNP激活。修饰的肽通过反相HPLC纯化，并冻干。将#27和#31以1:1的比率溶于DMSO中，得到二聚体#61。将#27*和IGF-2以1:1的比率溶于DMSO中，得到二聚体#62。
结果
设计了具有B1-C8键的两个胰岛素-IGF-2异二聚体以研究其对两种胰岛素受体同种型的活性。二聚体#61由一个单链胰岛素#27和一个IGF-2类似物#31组成。#27的N端通过二硫键与#31的LysC8交联。肽#31来源于具有LysD4Arg和ArgC8Lys的2个突变的IGF-2序列。该设计将交联化学引向LysC8位。这2个位点对受体活性不是必需的，且这2个位点的突变对IR-A和IR-B两者的效能仅略降低2倍。二聚体#62还含有一个单链胰岛素类似物#27*，其LysC8通过二硫键与天然IGF-2的N端胺交联。在二聚体#62中，使胰岛素和IGF-2单体的取向反转以研究两个单体单元中取向的作用。
二聚体#61对两种受体是部分激动剂，但是对IR-B的最大反应较高。对IR-A，由#61诱导的最大反应是由天然胰岛素诱导的最大反应的约50%，而对IR-B，最大反应为约80%(图22A和22B)。含有反向取向的胰岛素和IGF-2单元的二聚体#62还显示对IR-B的较高最大反应。二聚体#62对IR-B几乎是完全激动剂，因为最大反应与胰岛素的几乎相同。相比之下，#62对IR-A仍是部分激动剂。它诱导的最大反应是胰岛素对A型胰岛素受体诱导的约80%(图22C和22D)。
二聚体#61和#62两者显示对B型胰岛素受体的优先选择，通过较高的最大受体反应所表明。相对于#62，二聚体#61显示对受体活化更大的抑制作用，因为由#61诱导的对两种受体同种型的最大反应低于由#62诱导的最大反应。胰岛素和IGF-2单体单元的取向不改变受体选择性，但对受体活化抑制仍具有作用。#61和#62两者的反应曲线为钟形，对于胰岛素同二聚体#53和胰岛素异二聚体#60也观察到如此。在达到最大水平后，通过递增浓度的#61或#62降低受体反应。然而，用#61或#62，受体反应只可降低至约50%，而#53和#60能够在高浓度下完全抑制受体活化。#61和#62两者对IGF-1受体是部分激动剂，#61对最大受体活化显示比#62更大的抑制作用(图22E)。

Claims (5)

1.一种胰岛素类似物二聚体，所述二聚体包含
第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素和第二胰岛素多肽两者为分别包含第一组和第二组A链和B链的两链胰岛素类似物，其中每组的A链和B链通过链间二硫键彼此连接，而且其中第一和第二胰岛素多肽通过连接各自的两个B链的羧基端氨基酸的侧链的二硫键彼此连接，其中
所述第一和第二胰岛素多肽的所述A链各自由序列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ IDNO: 1)组成；
所述第一和第二胰岛素的所述B链各自由序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPX68T(SEQ ID NO: 2)组成，其中
X68为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
。
2.权利要求1的胰岛素类似物二聚体在制备用于降低与治疗糖尿病有关的低血糖的风险的药物中的用途。
3.一种药物组合物，其包含权利要求1的胰岛素类似物二聚体和药学上可接受的载体。
4.权利要求1的化合物在制备用于治疗高血糖症的药物中的用途。
5.权利要求1的化合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
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