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CN104955950B - 具有改善的脱靶特征谱的寡核苷酸 - Google Patents

具有改善的脱靶特征谱的寡核苷酸 Download PDF

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CN104955950B CN201380057694.6A CN201380057694A CN104955950B CN 104955950 B CN104955950 B CN 104955950B CN 201380057694 A CN201380057694 A CN 201380057694A CN 104955950 B CN104955950 B CN 104955950B
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Abstract

本发明提供了结合RNA的寡聚物，其由更低亲和力区域和更高亲和力区域组成，其中更高亲和力区域中的单体相较于更低亲和力区域中使用的单体以更高的水平提高与RNA碱基配对的寡聚物的解链温度(即亲和力)，其中所述解链温度的升高是相对于相同(碱基)序列的DNA单体的交替使用而言的。本发明的寡聚物可用于对靶RNA诸如mRNA和非编码RNA的结合，并且具有这样的有利方面：它们通过所述更低亲和力区域的脱靶结合相较于通过所述更高亲和力区域而言更不容易。

Description

具有改善的脱靶特征谱的寡核苷酸
发明背景
本发明涉及可结合互补RNA的寡聚物和寡核苷酸。寡核苷酸在科学、研究和开发中可用作试剂，例如用于检测和分析细胞RNA或用于调节细胞RNA的活性。
寡核苷酸也正被开发为治疗剂，其中，它们通常还旨在结合并调节细胞RNA的活性。结合细胞RNA的寡核苷酸在本文中也称为反义寡核苷酸。
一些反义寡核苷酸通过诱导它们的靶RNA去稳定(例如通过激活靶RNA的RNA酶H降解或通过激活RISC途径)来起作用。这样的寡核苷酸通常分别被描述为gapmers和siRNA。另一类寡核苷酸用作空间阻断剂，从而防止靶RNA与另一大分子相互作用。一个实例是剪接转换寡核苷酸，其调节mRNA前体的剪接。另一个实例是结合微小RNA并防止微小RNA结合其靶mRNA的微小RNA抑制剂。反义寡核苷酸的设计、制备和用途的详尽描述可见于"AntisenseDrug Technology,Principles,Strategies and Applications，第2版，由Stanley Crooke编辑"中。
很容易设计与给定的靶RNA互补、从而能够结合所述靶RNA的反义寡核苷酸。然而，当试图将反义寡核苷酸开发为治疗剂时，对靶的互补性是不够的。反义寡核苷酸需要进行修饰，以赋予其更多类似药物的性质，例如更好的效力、生物利用度和生物稳定性。此外，已经证明，许多反义寡核苷酸的问题是脱靶结合(off-target binding)，即结合于非目标的RNA，这可能导致不期望的效应。为了最大限度地减少脱靶结合，通常试图将其靶向RNA转录组中的独特序列。即便如此，反义寡核苷酸的脱靶结合仍是一个问题。本发明的一个目的是提供反义寡核苷酸，特别地在脱靶结合方面具有新的和期望的特征的空间阻断寡核苷酸。
发明概述
本发明提供了可结合RNA的寡聚物，其由如下部分组成：
·更低亲和力区域，
·更高亲和力区域，
·其中所述更高亲和力区域中的单体相较于所述更低亲和力区域中使用的单体而言以更高的水平提高与RNA碱基配对的寡聚物的解链温度(即亲和力)，其中所述解链温度的升高是相对于变通使用相同(碱基)序列的DNA单体而言的。
本发明的寡聚物可用于结合靶RNA，诸如mRNA和非编码RNA，并且具有这样的有利方面：它们通过所述更低亲和力区域的脱靶结合相较于通过所述更高亲和力区域而言更不容易。
附图概述
图1显示了结合于其目标靶(中靶(the on-target))的典型的空间阻断低聚物(steric block oligomer)。共有序列是与其它RNA共享的序列，并且优选地为细胞分子例如微小RNA上的结合位点的部分。与共有序列相邻的序列被指定为独特1，并且是在共享该共有序列的RNA之间不同(在本文中也被称为“特异性序列”)的序列。碱基对由寡聚物与靶之间的线指示。用增强对互补RNA的亲和力的单体类似物均匀地修饰寡聚物，这些修饰的位置通过指向靶的粗体(碱基对)线显示。寡聚物可以例如是BNA/2'O-甲基RNA寡聚物，亲和力增强性类似物则是BNA(双环核酸)。图示设计可以也只是在每第三位置或甚至所有位置上是亲和力增强性类似物或任何其它重复模式，这在寡聚物的整个长度上提供了相对均匀的亲和力。很显然，G:C碱基对比A:U碱基对更强。然而，为了简单起见，在本实例中不考虑这样的序列特异性亲和力变化。
图1B显示具有与图1A的寡聚物A相同的序列，但结合其目标靶的亲和力增强性修饰非均匀分布的空间阻断寡核苷酸。该寡聚物对互补RNA的亲和力将不会与1A的寡聚物显著不同。取决于选择的单体，总体亲和力可以更高或更低。
图1C显示具有与图1A的寡聚物A相同的序列、但结合其目标靶的亲和力增强性修饰非均匀分布的另一个空间阻断寡核苷酸。该寡聚物对互补RNA的亲和力将不会与1A或1B的寡聚物显著不同。取决于选择的单体，总体亲和力可以更高或更低。
理论上，所有3种寡聚物对互补RNA具有相似的亲和力，从而预期可具有相似的效力，例如当在细胞或生物体中使用时。然而，它们具有不同的脱靶特征(结合不同组的脱靶)。
图2显示与图1中举例说明的相同的、然而结合与目标靶共享共有序列的脱靶(offtarget)的寡聚物。
2A中的寡聚物对脱靶将具有中等的亲和力，然而2B中的寡聚物对脱靶将具有减小的亲和力，因为与共有序列互补的区域是"更低亲和力区域"，如通过亲和力增强性修饰(诸如BNA)的更低密度看到的。即，所述B寡聚物不太可能结合包含所述共有序列的脱靶。
然而，在另一方面，C寡聚物更可能结合包含共有序列的脱靶，因为其通过其“更高亲和力区域”进行该结合。
图3显示与图1和2中举例说明的相同的、然而结合不共享共有序列的脱靶的寡聚物。可看到寡聚物B将最高效地结合所述脱靶，因为其通过其更高亲和力区域结合，而寡聚物C最低效地结合所述脱靶，因为其通过其更低亲和力区域结合。即，寡聚物B对共享共有序列的RNA靶的增强的特异性以对包含所述特异性区域的RNA靶的特异性降低为代价来实现。
本发明的公开内容
本发明提供了用于靶向RNA例如mRNA和非编码RNA的寡聚物。
本发明的第一方面是结合包含如下区域(或更优选由如下区域组成)的10-40个单体的寡聚物：
·更低亲和力区域，
·更高亲和力区域，
·其中所述更高亲和力区域中的单体(一起)相较于所述更低亲和力区域中使用的单体(一起)升高与互补RNA碱基配对的寡聚物的解链温度(即亲和力)，其中所述解链温度的升高是相对于相同(碱基)序列的DNA单体的变通使用而言的，
·并且其中所述更低亲和力区域或更高亲和力区域具有5-12个连续单体，诸如5-10,5-9,5-8,6-10,7-10,8-10,6-9或6-8个连续单体，并且其中另一个区域毗邻5-12个单体的区域侧翼连接的两个子区域或由其组成。
应当理解，当上文中提及“更高亲和力区域中的单体”和“更低亲和力区域中使用的单体”时，指的是所述区域中的单体一起而非单个的单体。因此，并非所述更高亲和力区域中的每一个单体相较于所述更低亲和力区域中使用的单个单体而言一定会升高解链温度。
优选地，更高亲和力区域中的单体(一起)相较于更低亲和力区域中使用的单体而言使与RNA碱基配对的寡聚物的解链温度(即亲和力)升高至少5℃，诸如至少5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，其中所述解链温度的升高是相对于变通使用相同序列的DNA单体而言的。
当提及与RNA碱基配对的寡聚物的解链温度(在本文中也称为tm或tm值)时，优选在100mM NaCl,0.1mM EDTA,10mM NaH2PO4,5mM Na2HPO4,pH 7.0中，使用1.0μM浓度的寡聚物和互补RNA测量所述温度。
在一个优选实施方案中，所述更高亲和力区域中的单体相对于所述更低亲和力区域中的单体而言平均起来(每单体)升高解链温度。即，将更低和更高亲和力区域的tm的升高分别除以所述更低和更高亲和力区域中的单体的数目。应当指出，更低亲和力区域的tm的升高可以是负的，当tm相对于变通使用相同序列的DNA单体而言降低时情况即如此。
优选地，更高亲和力区域中的单体相较于更低亲和力区域中的单体平均起来(每单体)使解链温度升高至少2℃，诸如3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃。
所述寡聚物通常是寡核苷酸，并且优选包含至少2种不同类型的单体，所述单体例如选自DNA、RNA、BNA(具体地2',4'-二环核酸(2'4'-BNA)诸如ENA和LNA(2'-O,4'-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖基及其类似物，例如氨基-LNA、硫代-LNA、α-L-核糖基-LNA、β-D-木糖基-LNA、S-cMOE(2',4'-约束MOE)、R-cMOE、cEt(2',4'-约束乙基)、吗啉代、氨基磷酸酯、FANA、PNA、CENA、2'MOE、2'F、2'O-甲基。
特别优选地，所述更高亲和力区域包含2',4'-二环核酸(2'4'-BNA)。
在另一个实施方案中，所述更低亲和力区域仅包含2种类型的单体，所述单体优选选自DNA、RNA、吗啉代、氨基磷酸酯、FANA、PNA、UNA、2'MOE、2'F和2'O-甲基。
在另一个实施方案中，所述更低亲和力区域仅包含一种类型的单体，所述单体优选选自吗啉代、氨基磷酸酯、FANA、PNA、UNA、2'MOE、2'F和2'O-甲基。
如对于本领域普通技术人员来说已知的，不同单体通常对tm具有不同效应。例如，BNA对tm具有强效应，2'-修饰具有适度的效应。一些修饰如例如UNA甚至降低tm，即具有负效应。
如本说明书中所用，2',4'-二环核酸在本文中被分类为对tm具有强效应的单体。吗啉代、氨基磷酸酯-、FANA,PNA,CENA,2'MOE,2'F,2'O-甲基单体在本文中被分类为对tm具有适度效应的单体。降低tm的单体为例如UNA(解锁核酸(unlocked nucleic acid))。DNA和RNA单体在本文中就tm而言被分类为中性单体(DNA单体为参照单体)。
在一个优选实施方案中，所述更低亲和力区域相较于所述更高亲和力区域具有更低密度(亲和力增强性单体的数目/给定区域中单体的总数)的对tm具有强和/或适度效应的单体。该特征通常可用于容易地鉴定本发明的寡聚物，例如通过鉴定寡聚物内的更低亲和力区域。
由此得出结论，具有均匀分布的高亲和力和/或适度亲和力的单体的寡聚物不是本发明范围的部分，因为它们不包含更低亲和力区域。同样地，与均匀分布具有微小偏离的寡聚物不是本发明范围的部分，因为微小偏离不足以产生在亲和力(如以寡核苷酸的解链温度表达的)上与所述寡聚物的其余部分显著相异的具有更低亲和力的区域。
在许多实施方案中，所述寡聚物包含一个或多个硫代磷酸酯连键。所述寡聚物可以例如用硫代磷酸酯连键完全修饰，或例如用1、2或3个硫代磷酸酯连键在每一个末端进行修饰。硫代磷酸酯连键通常降低解链温度。然而，这可通过例如2'4'BNA单体的使用来抵消。即更高亲和力区域可很好地包含硫代磷酸酯连键。
寡聚物的长度和亲和力
寡聚物对互补RNA的总体亲和力(如通过解链温度表达的)取决于寡聚物的长度以及亲和力增强性(和有时减小性)单体的含量。本发明的一个目的是设计寡核苷酸，以便其对其目标靶具有充足的亲和力，同时显示相对于共享相同序列(其因此为共享序列)的其它靶而言增强的对其目标靶的选择性和/或效力。
所述寡聚物的长度优选为10至40个单体。在其它实施方案中，所述长度为10至35个单体、10至30个单体、10至25个单体。甚至更优选，所述寡聚物的长度为10至20个单体，例如11至19个单体或12至18个单体。
当使用更短的长度时，必需使用更高密度的增强所述寡聚物亲和力的单体。特别优选的是对亲和力具有强效应的2',4'-二环核酸(2'4'-BNA)。因此，在一个优选实施方案中，至少30％的单体是2'4'-BNA单体，所述单体例如选自LNA(2'-O,4'-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖基及其类似物，例如氨基-LNA、硫代-LNA、α-L-核糖基-LNA、β-D-木糖基-LNA、S-cMOE(2',4'-约束MOE)、R-cMOE、cEt(2',4'-约束乙基)。更优选地，至少35％，例如至少40％、45％、50％、55％或60％是2'4'-BNA单体。
与RNA碱基配对的寡聚物的解链温度应当优选为至少60℃。在其它实施方案中，优选寡聚物的tm为至少65℃、至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃、至少90℃或至少95℃。
甚至更优选地，tm为至少75℃，诸如80℃、85℃、90℃或95℃。
在一个实施方案中，所述更低亲和力区域比所述更高亲和力区域短。在另一个区域中，所述更低亲和力区域比所述更高亲和力区域长。
更低和更高亲和力区域
如上所述，优选地，所述更低亲和力区域相较于所述更高亲和力区域具有更低密度的对tm具有强和/或适度效应的单体。
当所述寡聚物包含2'4'-BNA单体时，这些单体的密度在所述更高亲和力区域中可以为例如100％(完全修饰)、50％(每隔1个单体具有1个BNA的混聚物，例如每隔一个位置有1个BNA单体)、33％(每2个其它单体，例如每第三个位置上有1个BNA)、25％等。BNA不一定被均匀分散在高亲和力区域。不管怎样，更低亲和区域可容易地通过更低密度的2'4'-BNA单体来鉴定。当所述更高亲和力区域包含2'4'BNA单体时，其通常每4个非BNA单体包含至少1个BNA，并且通常也不包含4或5个连续非BNA单体。
所述更高亲和力区域中2'4'-BNA单体的量优选为所述寡聚物的更低亲和力区域中的至少2倍，或甚至更优选3、4或5倍。
在一个优选实施方案中，更低亲和力区域不包含选自2'4'-BNA、PNA、2'MOE和2'F的任何亲和力增强性单体。
更优选地，所述更低亲和力区域不包含任何2'4'-BNA单体。
在另一个实施方案中，所述更低亲和力区域包含至少5个连续单体，诸如6或7个连续的不为2'4'BNA单体的单体。
在另一个实施方案中，更低亲和力区域包含至少5个不为DNA单体的连续单体，诸如6或7个不为DNA单体的连续单体。
在另一个实施方案中，更低亲和力区域的5'末端和更低亲和力区域的3'末端都不是BNA单体。甚至更优选地，更低亲和力区域的5'末端的两个单体和所述单体的5'末端的两个单体都不是BNA单体。这一特征有助于确定本发明寡聚物内的更低亲和力区域。
优选地，更低亲和力区域对互补RNA的解链温度低于70℃，诸如低于65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40和35℃。该实施方案中的解链温度可通过测量针对具有对应于更低亲和力区域的长度的截短RNA的tm来测量，即其中所述截短RNA不能与所述寡聚物的更高亲和力区域碱基配对。甚至更优选地，更低亲和力区域对互补RNA的解链温度低于60℃，诸如低于55℃、50℃、45℃、40℃和35℃。
优选地，所述更低亲和力区域是连续的并且具有5-12个单体，诸如5-10,5-9,5-8,6-10,7-10,8-10,6-9或6-8个连续单体。甚至更优选的是6-10个连续单体的更低亲和力区域。即在一个优选实施方案中，所述寡聚物的更低亲和力区域可被鉴定为在6-10个单体的区域中不具有或仅具有1个BNA单体的区域，其中所述寡聚物的其余部分内BNA单体的密度具有更高的BNA单体密度，因此所述寡聚物的其余部分是高亲和力区域。
用途和有利方面-选择性
本发明的寡聚物可用于结合靶RNA诸如mRNA和非编码RNA，并且具有这样的有利方面：相较于通过更高亲和力区域而言，它们通过更低亲和力区域更不容易脱靶结合。
考虑例如在一个区域中具有相同序列并且在相邻区域中5至10个核苷酸的序列长度上有例如1、2或3个核苷酸差异的10-40个单体的两个RNA序列(在RNA靶诸如mRNA或非编码RNA内)。相异的区域可称为"特异性区域"，而相同的区域可称为"共享区域"。同样可以存在共有共享序列并且在相邻特异性区域中有差异的多个靶RNA。
当目的是设计相对于另一个靶(所述脱靶)优先结合一个RNA序列(所述目标靶，在本文中也称为中靶)的寡聚物时，很显然的是所述寡聚物应当与目标靶互补。然而，在本发明之前，设计和使用这样的寡聚物并非显而易见的，所述寡聚物包含更高亲和力区域和更低亲和力区域，以便所述寡核苷酸的更高亲和力区域应当与(目标)中靶的特异性区域互补并且更低亲和力区域应当与共享区域(脱靶与中靶之间共享的)互补。这样，通过共享区域的脱靶结合将因以tm表示的更低亲和力而被最小化，同时仍然维持对目标靶的高亲和力。
在另一方面，如果一定程度的脱靶结合是可接受的或甚至是想要的，那么所述寡聚物的更高亲和力区域应当与共享区域互补，并且更低亲和力区域应当与特异性序列互补。这样，通过共享区域的脱靶结合将得以增加。
应理解，当与具有相同序列的均匀修饰的寡聚物相比较时，本发明的寡聚物不需要总体上对细胞转录组中的脱靶有或多或少的结合。然而，它们对共有相同的共享序列的脱靶具有减少的结合(因为更低亲和力区域与所述共享序列互补)。潜在地，这可在以牺牲更多的通过更高亲和力区域的脱靶结合为代价来实现。不管怎样，本发明的寡聚物相较于具有相同序列的均匀修饰的寡聚物具有不同的脱靶特征谱。
因此，本发明的寡聚物可被设计成相较于具有相同序列和相似tm值的均匀修饰的寡聚物而言在目标脱靶之间具有更少的脱靶结合，或在目标脱靶之间具有更多的脱靶结合。
应当理解，所述寡聚物优选地对其目标靶将具有完全互补性。
在下文中进一步描述本发明的寡聚物的非明显特征和用途。
本发明的寡聚物的活性/作用机制-空间阻断
本发明的寡聚物通常是空间阻断剂，即，它们结合靶RNA而不介导所述靶RNA的降解。空间阻断寡核苷酸在本领域中已得到良好描述，并且例如被用作剪接转换寡核苷酸和微小RNA抑制剂。如本领域普通技术人员所已知的，许多单体可用于空间阻断寡核苷酸的设计，因为大多数人工核苷酸单体不允许RNA酶H的募集。参见例如Antisense DrugTechnology,Principles,Strategies and Applications，第2版，由Stanley Crooke编辑，第93页，其提及2-O-Me、2-O-甲氧基乙基(MOE)和2-O-氨基丙基、氨基磷酸酯和甲基膦酸酯衍生物，以及锁核酸(LNA/2'4'-BNA)、肽核酸(PNA)和基于吗啉代的寡聚物。这些单体的混合物也不允许RNA酶H募集。RNA酶H募集通常需要至少5个连续DNA单体，最常见地使用6、7或8个连续单体。因此，在一个优选实施方案中，本发明的寡聚物不包含连续DNA单体，诸如5、6、7或8个连续DNA单体。
在一个实施方案中，所述寡聚物不包含吗啉代单体。
在另一个实施方案中，所述寡聚物不包含FANA单体。
在另一个实施方案中，所述寡聚物不包含PNA单体。
在另一个实施方案中，所述寡聚物不包含CENA单体。
在另一个实施方案中，所述寡聚物不包含2'MOE单体。
在另一个实施方案中，所述寡聚物不包含2'F单体。
在另一个实施方案中，所述寡聚物不包含2'O-甲基单体。
在另一个实施方案中，所述寡聚物不包含氨基磷酸酯单体。
优选靶RNA和序列
细胞大分子诸如RNA结合蛋白和RNA(例如mRNA或微小RNA)的结合位点通常包含在相同细胞大分子的其它结合位点之间共享的序列。这样的序列在本文中称为共有序列。如上所述，本发明的一个目的是提供这样的寡聚物，所述寡聚物就靶向目标靶(RNA)方面相对于与所述目标靶共享序列的其它RNA而言具有增强的(或减弱的)选择性。在一个优选实施方案中，所述共享的序列是RNA结合蛋白或RNA的结合位点和/或所述共享序列可由共有序列表示。
避免或减少对共有相同(共有)序列的其它RNA的脱靶结合的一个方式可以是避免将所述共有序列作为靶，即在所述寡聚物中不包括与共有区域互补的序列。然而，当期望所述寡聚物阻断结合位点时，这可减小寡聚物的活性，因为所述结合位点此时未被完全阻断。最常见地，期望确实靶向共有序列以及相邻区域。
具有增强的选择性的寡聚物是最优选的。在这些实施方案中，更低亲和力区域优选与共有序列互补。更低亲和力区域的长度优选与共有序列的长度相同或长1、2、3或4个单体。可将额外的单体添加至更低亲和力区域的5'末端、更低亲和力区域的3'末端或两者。
优选的共有序列为给定的微小RNA的mRNA中的微小RNA结合位点，其通常与微小RNA的位置2-7(所谓的种子序列)享有互补性，但在该区域外部的序列有差异。即在该情况下，结合位点的共有序列是与微小RNA的种子序列互补的序列。
另一个优选的共有序列是在微小RNA家族间共享的种子序列，所述家族微小RNA通常在种子序列之外是不同的。
因此，在一个优选实施方案中，本发明的寡聚物包含可结合与SEQ ID NO:1-2042中任一个的位置1-7、2-7、1-8或2-8互补的RNA序列的更低亲和力区域，或可结合包含SEQID NO:1-2042中任一个的位置1-7、2-7、1-8或2-8的RNA序列的更低亲和力区域，其中各位置是从5'末端开始计数的。能够结合共有序列的区域可被称为抗-共有序列，其因此包含在寡聚物的更低亲和力区域内，或与寡聚物的更低亲和力区域相同。在本实施方案中，当相对于相同家族中的其它微小RNA而靶向一个微小RNA时，或当相对于相同微小RNA的其它结合位点而靶向一个微小RNA结合位点时，所述寡聚物增强了选择性。
同样地，所述寡聚物还可用于减弱选择性。在本实施方案，本发明的寡聚物包含可结合与SEQ ID NO:1-2042中任一个的位置1-7、2-7、1-8或2-8互补的RNA序列的更高亲和力区域，或可结合包含SEQ ID NO:1-2042中任一个的位置1-7、2-7、1-8或2-8的RNA序列的更低亲和力区域，其中各位置是从5'末端开始计数的。
具有增强的选择性的寡聚物是最优选的。
表1.人微小RNA序列
在一个实施方案中，所述寡聚物不包含能结合与SEQ ID NO:1051的位置2-7互补的RNA序列的更低亲和力区域。
在另一个实施方案中，所述寡聚物不与SEQ ID NO:1-2041中任一个(在其全长上)互补。
本发明的特别优选的寡聚物具有10-20个单体的长度，并且由如下区域组成：
·包含至少25％的BNA单体的更高亲和力区域，
·6-10个连续单体的更低亲和力区域，其包含少于25％的BNA单体，其中所述更低亲和力区域的5'末端处的2个单体和所述更低亲和力区域的3'末端处的2个单体是非BNA单体，
·并且其中所述寡聚物不包含5个连续DNA单体的区域。
在本实施方案中，更高亲和力区域和更低亲和力区域(如上文中定义的)的不同亲和力由所述更高亲和力区域中BNA单体的密度高于所述更低亲和力区域中BNA单体的密度来保证。
优选地，更高亲和力区域由至少4个单体，更优选至少5、6、7或8个单体组成。
优选地，更高亲和力区域中BNA单体的密度为更低亲和力区域中BNA单体的密度的至少2倍。甚至更优选地，其密度为至少3倍，诸如4倍或5倍。
在一个优选实施方案中，更低亲和力区域根本不包含任何BNA单体。
更高亲和力区域优选包含至少33％(更高亲和力区域中每3个单体有1个BNA单体)、50％(每2个单体有1个BNA)、67％(每3个单体有2个BNA)、(每4个单体有3个BNA)、75％或100％BNA单体。
优选地，至少一个核苷酸间连键是硫代磷酸酯连键。在另一个实施方案中，所有核苷酸间连键是硫代磷酸酯连键。
在一个相关实施方案中，所述寡聚物的更低亲和力区域由8-10个连续单体组成，并且所述寡聚物的其余单体为BNA单体。
通常地，所述寡聚物的5'末端和所述寡聚物的3'末端为BNA单体。
所述寡聚物可以甚至具有12-18个单体或13-17个单体。
优选地，更低亲和力区域可与微小RNA的种子序列碱基配对或可与微小RNA的种子序列的RNA互补序列碱基配对。人微小RNA是优选的。
实施例
实施例1
在本实施例中，测量各种寡聚物对目标靶以及对脱靶RNA的亲和力。最后，测量寡聚物对由共有序列组成的靶RNA的亲和力。
使用的靶RNA首先是：
(135-Hcvtarg)5'GAUGGGGGCGACACUCCACCAUGAAU
其中共有序列加以下划线。
与该靶RNA互补的寡聚物的序列：
CUGUGAGGUGGUAC-5’
并且当彼此结合时：
靶: 5'GAUGGGGGCGACACUCCACCAUGAAU
||||||||||||||
HCV寡聚物 CUGUGAGGUGGUAC5'
首先，使用下列寡聚物，其中更低亲和力区域加以下划线：
(123-HCVtm，均匀修饰的)：
lClAmUmGlGmUlGlGmAlGmUmGlTlC
(124-HCVtm，与共有序列互补的更低亲和力区域)：
lClAlTlGlGlTmGmGmAmGmUmGlUlC
(125-HCV，与共有序列互补的tm更低亲和力区域)：
lClAlTlGlGmUmGmGmAmGmUmGmUlC
(126-HCVtm，与共有序列互补的更低亲和力区域)：
lClAlTlGlGmUmGmGuAmGmUmGmUlC
(127-HCVtm，与共有序列互补的更低亲和力区域)：
lClAmUmGlGmUmGmGmAmGmUmGlTlC
(128-HCVtm，与共有序列互补的更高亲和力区域)：
mCmAmUmGmGlTlGlGlAlGlTlGlTmC。
m表示2'O-甲基RNA
l表示LNA(BNA)
u表示解锁核酸(unlocked nucleic acid，UNA)
在中等盐浓度即100mM NaCl,0.1mM EDTA,10mM NaH2PO4,5mM Na2HPO4,pH 7.0)中，使用1.0μM浓度的寡聚物和互补RNA，以及在低盐浓度，即在10mM NaCl而非100mM NaCl中测量解链温度。
表2:
寡聚物 Tm,100mM NaCl Tm,10mM NaCl
123-HCVtm >90 86
124-HCVtm >90 84
125-HCVtm >90 80
126-HCVtm 79 65
127-HCVtm >90 79
128-HCVtm >85 83
对于高盐中的测量值，仅126HCVtm显示具有更低的tm值，这与降低亲和力的UNA单体的存在相符。
对于低盐中的测量值，tm值与LNA单体的含量良好相关，并且再次地看到一个UNA单体显著地降低亲和力。
接下来，测量另一个寡聚物序列(Aldo A)对相同靶RNA的亲和力。该另一个寡聚物与靶RNA的相同共有序列互补，但在所述序列的其余部分有差异：
靶： 5'GAUGGGGGCGACACUCCACCAUGAAU
|1||||||||
Aldo寡聚物: GUUGUGAGGUCCGG
l表示潜在的G:U碱基对。
这些测量中使用的寡聚物是：
更低亲和力区域加以下划线
(129-Aldo，均匀修饰的)
lGlGmClCmUlGmGlAmGmUlGmUlTlG
(130-Aldotm，与共有序列互补的更低亲和力区域)
lGlGlClClTmGmGmAmGmUmGlTlTlG
(131-Aldotm，与共有序列互补的更低亲和力区域)
lGlGlClCmUmGmGmAmGmUmGmUlTlG
(133-Aldotm，与共有序列互补的更高亲和力区域)
mGmGmCmClTlGlGlAlGlTlGlTmUmG
表3:
寡聚物 Tm,100mM NaCl
129-Aldotm 77
130-Aldotm 70
131-Aldotm 66
133-Aldotm 83
在该组测量值中，HCV靶可被看作与寡聚物的目标靶共享共有靶的脱靶。再次地，解链温度与LNA的含量总体上相关。此外，可看到当互补区中LNA的含量增加时，亲和力增加。当非互补区中LNA密度更高时，解链温度降低，参见寡聚物131。
接下来，测量寡聚物对互补的8个核苷酸共有RNA的亲和力。寡聚物对该8个核苷酸的共有RNA的亲和力可被看作是所述寡核苷酸对包含所述共有序列、但在和所述共有序列相邻的区域中不与所述寡聚物互补的脱靶的亲和力的测量。
共有RNA是:
5'ACACUCCA
表4:
寡聚物 Tm,100mM NaCl
123-HCVtm 77
124-HCVtm 59
125-HCVtm 48
126-HCVtm 无转换
127-HCVtm 60
128-HCVtm 82
129-Aldotm 73
130-Aldotm 66
131-Aldotm 55
132-Aldotm 84
如所看到的，更少的脱靶结合(更具特异性的寡聚物)可通过降低互补区域中的LNA含量来设计。
如果将相同设计原理用于设计针对包含共有序列的其它靶序列的反义寡聚物，通常可实现增强的特异性。
因此，本发明的教导，包括上述实验中的发现，应当具有一般适用性而不限定于某些序列/靶。

Claims (5)

1.一种结合RNA的10-20个单体的寡聚物，其由如下区域组成：
·6-10个连续单体的更低亲和力区域，其中不包含BNA单体；
·至少4个单体的更高亲和力区域，其包含至少25％的BNA单体，并且所述更高亲和力区域是由连续的单体构成或者由位于所述更低亲和力区域侧翼的两个亚区组成，
·其中所述寡聚物不包含5个连续DNA单体的区域，并且
·其中所述更低亲和力区域能够与微小RNA的种子序列碱基配对，或能够与微小RNA的种子序列的RNA互补序列碱基配对。
2.权利要求1的寡聚物，其中至少一个核苷酸间连键是硫代磷酸酯连键。
3.权利要求1的寡聚物，其中所述寡聚物的5'末端和所述寡聚物的3'末端是BNA单体。
4.权利要求1－3中任一项的寡聚物，其由12-18个单体组成。
5.权利要求1的寡聚物，其中所述微小RNA是人微小RNA。
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