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CN104937095A - 肾细胞群及其用途 - Google Patents

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CN104937095A CN201380066171.8A CN201380066171A CN104937095A CN 104937095 A CN104937095 A CN 104937095A CN 201380066171 A CN201380066171 A CN 201380066171A CN 104937095 A CN104937095 A CN 104937095A
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Abstract

本发明涉及特征在于生物标志物的富集的异质哺乳动物肾细胞群以及制备和使用所述富集的异质哺乳动物肾细胞群的方法。

Description

肾细胞群及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年10月24日提交的名称为“Isolated Regenerative RenalCells and Uses Thereof”的美国临时专利申请序号61/718,150以及2013年9月11日提交的名称为“Renal Cell Populations and Uses Thereof”的美国临时专利申请序号61/876,616的优先权。
技术领域
本公开总体上涉及一种富集的异质哺乳动物肾脏来源的细胞群，鉴定所述细胞群的方法，所述细胞群用于制备再生医学治疗物的方法，并且本文提供了通过将所述富集的异质肾脏来源的细胞群施用至哺乳动物受试者来治疗肾脏疾病的方法。
发明背景
已经成功采用了胶原和明胶基生物材料用于各种组织工程应用(Rohanizadeh等J Mater Sci Mater Med 2008；19:1173-1182；Takemoto等Tissue Eng Part A 2008；14:1629-1638；Young等J Control Release 2005；109:256-274)。这两种大分子的特征在于优良的生物相容性和低抗原性(Cenni等J Biomater Sci Polym Ed 2000；11:685-699；Lee等Int J Pharm 2001；221:1-22；Waksman等J Immunol 1949；63:427-433)；然而，因为明胶通过胶原的水解而获得，所以明胶具有优于胶原的某些优点：(a)其容易获得并且易于使用；(b)提供关于分子量和水华(bloom)的选择(即控制物理性质)；以及(c)对于化学修饰更灵活并且更易于制造。此外，从生物角度看，明胶保持了类似于胶原的细胞相容性和细胞粘附性质(Engvall等Int J Cancer 1977；20:1-5；Kim等Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2009；108:e94-100)。
已经报道了各种方法用于交联这些大分子以达到延迟其生物降解，从而延长其体内停留(在组织工程应用中)或定制其药物释放能力(当用作药物载体时)的目的。已经公布了众多方法用于化学或光化学交联胶原或明胶(Adhirajan等J Microencapsul 2007；24:647-659；Chang等Macromol Biosci2007；7:500-507；Gagnieu等Biomed Mater Eng 2007；17:9-18；Kimura等JBiomater Sci Polym Ed 2010；21:463-476；Ma等J Biomed Mater Res A 2004；71:334-342；Vandelli等Int J Pharm 2001；215:175-184；Vandelli等J ControlRelease 2004；96:67-84)。这些方法中的大多数的目标为减小这些生物材料对酶促降解的易感性并且延长其体内停留时间(Chang等同上2007；Ma等同上2004)。通常采用其它交联方法来得到适合作为缓释药物、蛋白质或核酸载体的明胶或胶原基生物材料(Kimura同上2010；Vandelli同上2004；Kommareddy等Nanomedicine 2007；3:32-42；Sehgal等Expert Opin DrugDeliv 2009；6:687-695；Sutter等J Control Release 2007；119:301-312)。用于胶原和明胶以及其它组织工程相容性系统的广泛使用的交联剂类别是碳二亚胺(Adhirajan同上2007；Olde Damink等Biomaterials 1996；17:765-773；Pieper等Biomaterials 2000；21:581-593；Cornwell等Clin Podiatr Med Surg2009；26:507-523)。这些分子被称为零长度交联剂并且通过在存在于待交联的物质上的羧基与伯胺官能团之间介导酰胺键形成来起作用。此外，与其它常见交联剂(例如戊二醛)相比，碳二亚胺的细胞毒性更小(Lai等J Mater SciMater Med 2010；21:1899-1911)。戊二醛被用作呈CultispherTM珠粒形式的交联剂。Burg美国专利号6,991,652描述了用于可以被递送至受试者的细胞的含有三维支撑构建体的组织工程复合材料。
再生医学技术提供了慢性肾脏疾病(CKD)的下一代治疗选择。Presnell等WO/2010/056328和Ilagan等PCT/US2011/036347描述了分离的生物活性肾细胞(包括肾小管和产生促红细胞生成素(EPO)的肾细胞群)，和分离并且培养所述生物活性肾细胞的方法，以及利用所述细胞群治疗有需要的受试者的方法。
存在对适合用于在组织工程和再生医学应用中将活性剂例如生物活性细胞递送至有需要的受试者的治疗制剂的需要。
肾脏是进行许多功能以保持血液清洁和化学平衡的复杂器官。除了去除废物之外，肾脏释放三种重要的激素：
促红细胞生成素或EPO，其刺激骨髓制造红细胞
肾素，其调节血压；以及
钙三醇，维生素D的活性形式，其有助于维持骨和体内正常化学平衡所需的钙。
为了执行这些功能，肾脏包括众多不同的细胞类型。然而，再生反应不需要所有的肾细胞并且鉴定可用于诱发再生反应的细胞的组合已成为研究的主题。因此，仍存在对鉴定可用于本文所公开的治疗制剂的异质肾细胞群(即生物活性细胞)的方法的需要。
发明概述
本文公开了来自哺乳动物肾脏组织的异质哺乳动物肾细胞群。提供了用于分离和纯化哺乳动物肾脏来源的细胞群的方法。哺乳动物肾脏来源的细胞的独特群的特征在于表型特征，例如生物标志物表型。生物标志物表达表型在培养中的哺乳动物肾脏来源的细胞群多次传代之后仍被保留并且适合用于制备再生治疗物。
本文描述了一种特征在于特异性生物标志物的人肾细胞群的选择群及其用途。
人肾细胞的选择群允许使用较少数目的提供再生刺激的细胞。这个较少数目是有利的，因为它降低了不良免疫事件的概率以及提供再生刺激。选择的肾细胞群不需要大比例的有效作为再生刺激的干细胞。选择的肾细胞群可以从患病的肾脏中回收。
一方面，提供了用于鉴定和/或表征异质肾细胞群的方法。在一个实施方案中，异质肾细胞群特征在于其生物标志物的表型表达。在某些实施方案中，肾细胞通过允许检测异质肾细胞群上/异质肾细胞群中的生物标志物的一种或多种试剂来鉴定。可以通过任何适合的方法，例如基于免疫荧光显微术、流式细胞计量术、光纤扫描细胞计量术或激光扫描细胞计量术的那些方法来进行生物标志物的检测。在一个实施方案中，提供了鉴定适合用于植入和/或诱发再生反应的异质肾细胞群的方法，其包括以下步骤：
从哺乳动物肾脏样品中分离出细胞；
使所述分离的细胞暴露于一个或多个被标记的检测部分，其中每个被标记的检测部分针对不同的生物标志物并且用不同的标记进行标记；
确定表达每个所述生物标志物的细胞的百分率。
在一个实施方案中，细胞群是表达列于表12.2和表12.3中的两个或更多个生物标志物的SRC细胞群。在一个实施方案中，生物标志物具有如在表12.4中所提供的表达水平。在一个实施方案中，SRC细胞群对于GGT-1和CK18分别具有大于18％和80％的表达水平。
一方面，提供了含有活性剂(例如，生物活性细胞)的可注射治疗制剂。在一个实施方案中，可注射制剂包含生物活性细胞和温度敏感性细胞稳定化生物材料。在另一个实施方案中，温度敏感性细胞稳定化生物材料(i)在约8℃或以下维持大体上固态和/或(ii)在环境温度或以上维持大体上液态。在一个其它实施方案中，生物活性细胞包括如本文所描述的肾细胞。在另一个实施方案中，生物活性细胞被大体上均匀地分散在整个细胞稳定化生物材料的体积上。在其它实施方案中，生物材料在约8℃与约环境温度或以上之间具有固体到液体的过渡态。在一个实施方案中，大体上固态为凝胶态。在另一个实施方案中，细胞稳定化生物材料包括水凝胶。在一个其它实施方案中，水凝胶包括明胶。在其它实施方案中，明胶以约0.5％至约1％(w/v)存在于制剂中。在一个实施方案中，明胶以约0.75％(w/v)存在于制剂中。在另一个实施方案中，制剂还包含细胞活力剂。在一个其它实施方案中，细胞活力剂包括选自由以下组成的组的试剂(agent)：抗氧化剂、氧载体、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、免疫抑制剂、血管生成因子以及伤口愈合因子。在一些实施方案中，细胞活力剂为抗氧化剂。在一个实施方案中，抗氧化剂为6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酸。在另一个实施方案中，6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酸以约50μM至约150μM存在。在一个其它实施方案中，6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酸以约100μM存在。在一些实施方案中，细胞活力剂为氧载体。在一个实施方案中，氧载体为全氟化碳。在其它实施方案中，细胞活力剂为免疫调节剂。在一个实施方案中，细胞活力剂为免疫抑制剂。
另一方面，提供了含有生物活性肾细胞的可注射治疗制剂。在一个实施方案中，制剂包含生物活性肾细胞、约0.75％(w/v)明胶以及约100μM 6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酸，其中制剂(i)在约8℃或以下具有大体上固态和(ii)在环境温度或以上具有大体上液体。在另一个实施方案中，生物活性肾细胞被大体上均匀地分散在整个细胞稳定化生物材料的体积上。在一个其它实施方案中，生物材料在约8℃与约环境温度之间包括固体到液体的过渡态。在其它实施方案中，大体上固态为凝胶态。在一些实施方案中，制剂还包含细胞活力剂。在另一个实施方案中，细胞活力剂包括选自由以下组成的组的试剂：抗氧化剂、氧载体、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、血管生成因子以及伤口愈合因子。在一个实施方案中，细胞活力剂为氧载体。在另一个实施方案中，氧载体为全氟化碳。在一个其它实施方案中，细胞活力剂为免疫调节剂。在其它实施方案中，细胞活力剂为免疫抑制剂。
在一个其它方面中，本公开提供了本文所描述的制剂，其还包括生物相容性珠粒。在一个实施方案中，生物相容性珠粒包含生物材料。在另一个实施方案中，珠粒为交联的。在一个其它实施方案中，与未交联的生物相容性珠粒相比，交联的珠粒具有减小的对酶促降解的易感性。在其它实施方案中，交联的珠粒为碳二亚胺交联的珠粒。在一个实施方案中，碳二亚胺选自由以下组成的组：1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、DCC-N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)以及N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIPC)。在另一个实施方案中，碳二亚胺为1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)。在一个其它实施方案中，与未交联的珠粒相比，交联的珠粒具有减少的游离伯胺数目。在其它实施方案中，游离伯胺的数目可通过分光度光度计测量在约355nm处检测到。在一些实施方案中，珠粒用生物活性细胞接种。在一个实施方案中，生物活性细胞为肾细胞。在另一个实施方案中，制剂还包含额外的生物相容性珠粒，所述额外的生物相容性珠粒包含(i)在环境温度或以下维持大体上固态和(ii)在约37℃或以上维持大体上液态的温度敏感性生物材料。在一个其它实施方案中，珠粒的生物材料在环境温度与约37℃之间包括固体到液体的过渡态。在其它实施方案中，大体上固态为凝胶态。在一个实施方案中，珠粒的生物材料包括水凝胶。在另一个实施方案中，水凝胶包括明胶。在一个其它实施方案中，珠粒包含约5％(w/v)至约10％(w/v)的明胶。在一些实施方案中，额外的生物相容性珠粒为间隔珠粒。在其它实施方案中，间隔珠粒未用生物活性细胞接种。
另一方面，本公开的制剂含有由肾细胞群分泌的产物。在一个实施方案中，制剂包含由肾细胞群和/或生物活性细胞分泌的产物。在一个其它实施方案中，生物活性细胞为肾细胞。在另一个实施方案中，产物包括旁分泌因子、内分泌因子以及近分泌因子中的一种或多种。在一个其它实施方案中，产物包括囊泡。在其它实施方案中，囊泡包括微囊泡。在一个实施方案中，囊泡包括外来体。在另一个实施方案中，囊泡包含选自由以下组成的组的分泌产物：旁分泌因子、内分泌因子、近分泌因子以及RNA。
附图简述
图1为本文所描述的整个NKA制造方法的流程图。
图2A-D为提供图1中所描绘并且本文所描述的过程的进一步细节的流程图。
图3为从六个患者举例说明培养持续时间和细胞产率的变化。
图4为7％密度梯度下的SRC显带的图片。参考实施例5。
图5为描绘人SRC群中的肾细胞标志物表达的条形图。参考实施例12。
图6为描绘人SRC的酶促活性的条形图。参考实施例12。
图7A-D描绘了肾脏中的NKA注射：(a)插入到肾脏皮质中的针，(b)NKA递送，(c)肾脏中的多个递送点，以及(d)NKA的最终植入(示例性)。
发明详述
本文公开了用于活性剂如生物活性细胞的治疗制剂，以及制备所述治疗制剂的方法和用制剂治疗有需要的受试者的方法。生物活性细胞制剂可以适合用于生物活性肾细胞(BRC)的异质混合物或级分。生物活性肾细胞可为分离的肾细胞，包括肾小管和产生促红细胞生成素(EPO)的肾脏细胞。BRC细胞群可以包括富集的肾小管和产生EPO的细胞群。BRC可以来源于或其本身是来自健康个体的肾细胞级分。此外，提供了从不健康个体中获得的肾细胞级分，所述肾细胞级分当与健康个体的相应肾细胞级分相比时可能缺乏某些细胞组分，但仍保留治疗性质。本公开还提供了与健康个体相比缺乏细胞组分的治疗活性细胞群，在一个实施方案中所述细胞群可以从处于各种疾病状态的自体来源中分离出来并扩增。
虽然本文描述了生物活性细胞制剂，但本公开涵盖含有各种其它活性剂的制剂。其它适合的活性剂包括但不限于：细胞聚集体、非细胞生物材料、从生物活性细胞中分泌的产物、大分子和小分子治疗剂以及其组合。例如，一种类型的生物活性细胞可以与具有治疗分子或不具有治疗分子的基于生物材料的微载体或另一种类型的生物活性细胞组合，未附着的细胞可以与非细胞颗粒组合。
1.定义
除非另外定义，否则本文所使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员所通常理解的相同的含义。Principles of Tissue Engineering,第3版(由R Lanza,R Langer,&J Vacanti编著),2007为本领域技术人员提供了对本申请中所使用的许多术语的一般指导。本领域技术人员将认识到可以用于本发明的实践中的类似于或等效于本文所描述的那些方法和材料的许多方法和材料。实际上，本发明决不限于所描述的方法和材料。
如本文所使用的术语“细胞群”是指通过从适合的组织来源，通常从哺乳动物中直接分离出来而获得的许多细胞。分离的细胞群随后可以被体外培养。本领域普通技术人员将了解与本发明一起使用的用于分离和培养细胞群的各种方法以及适合在本发明中使用的细胞群中的各种细胞数目。细胞群可为来源于器官或组织(例如，肾脏)的未分级分离的异质细胞群。例如，异质细胞群可以从组织活检物或从完整器官组织中分离出来。或者，异质细胞群可以来源于产生自组织活检物或完整器官组织的哺乳动物细胞的体外培养物。未分级分离的异质细胞群还可以被称为非富集的细胞群。在一个实施方案中，细胞群含有生物活性细胞。
术语“自体器官”应该意指活受试者的器官。受试者可为健康的或不健康的。不健康的受试者可以患有与该特定器官相关的疾病。
术语“自体肾脏”应该意指活受试者的肾脏。受试者可为健康的或不健康的。不健康的受试者可以患有肾脏疾病。
术语“再生作用”应该意指为自体器官如肾脏提供益处的作用。作用可以包括但不限于减小对自体器官的损伤程度或改进自体器官功能的恢复或稳定。肾损伤可以呈纤维化、炎症、肾小球肥大等形式并且与受试者中的自体器官相关的疾病相关。
如本文所使用的术语“混合物”是指来源于未分级分离的异质细胞群的两种或更多种分离的、富集的细胞群的组合。根据某些实施方案，细胞群为肾细胞群。
“富集的”细胞群或制剂是指来源于起始器官细胞群(例如，未分级分离的异质细胞群)的细胞群，所述细胞群含有的特定细胞类型的百分率比起始群中的所述细胞类型的百分率更大。例如，起始肾脏细胞群可以富集目标第一细胞群、第二细胞群、第三细胞群、第四细胞群、第五细胞群等。如本文所使用，术语“细胞群”、“细胞制剂”和“细胞原型”可互换地使用。
一方面，如本文所使用的术语“富集的”细胞群是指来源于起始器官细胞群(例如，来自肾脏活检物或培养的哺乳动物肾脏细胞的细胞悬浮液)的细胞群，所述细胞群含有的能够产生EPO的细胞的百分率大于起始群中的能够产生EPO的细胞的百分率。例如，术语“B4”为来源于起始肾脏细胞群的细胞群，与起始群相比所述细胞群含有更大百分率的产生EPO的细胞、肾小球细胞以及血管细胞。细胞群可以富集一种或多种细胞类型并且消耗一种或多种其它细胞类型。例如，富集的产生EPO的细胞群可以相对于非富集的细胞群(即富集的细胞群所来源于其中的起始细胞群)中的间质成纤维细胞和肾小管细胞富集间质成纤维细胞并且消耗肾小管细胞和集合管上皮细胞。在引用EPO富集的或“B4”群的所有实施方案中，富集的细胞群为含有可以氧调节的方式产生EPO的细胞的异质细胞群，所述氧调节方式如通过从内源性天然EPO基因氧可调的EPO表达所显示。
另一方面，与来源于健康个体或受试者的起始肾脏细胞群相比，含有的特定细胞类型(例如，血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞)的百分率比起始群中的所述细胞类型的百分率更大的富集的肾细胞群还可以缺乏或缺少一种或多种特定细胞类型(例如，血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞)。例如，一方面术语“B4’”或“B4原初(prime)”为来源于起始肾脏细胞群的细胞群，所述细胞群取决于起始样本的疾病状态与健康个体相比缺乏或缺少一种或多种细胞类型，例如，血管的、肾小球的或内分泌的细胞类型。在一个实施方案中，B4’细胞群来源于患有慢性肾脏疾病的受试者。在一个实施方案中，B4’细胞群来源于患有病灶性节段性肾小球硬化(FSGS)的受试者。在另一个实施方案中，B4’细胞群来源于患有自身免疫性肾小球肾炎的受试者。另一方面，B4’为来源于包括所有细胞类型(例如，血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞)的起始细胞群的细胞群，后来使所述细胞群消耗或缺少一种或多种细胞类型(例如，血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞)。在另一个方面中，B4’为来源于包括所有细胞类型(例如，血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞)的起始细胞群的细胞群，后来所述细胞群富集一种或多种特定细胞类型(例如，血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞)。例如，在一个实施方案中，B4’细胞群可以富集血管细胞但消耗肾小球细胞和/或内分泌细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群可以富集肾小球细胞但消耗血管细胞和/或内分泌细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群可以富集内分泌细胞但消耗血管细胞和/或肾小球细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群可以富集血管细胞和内分泌细胞但消耗肾小球细胞。在优选的实施方案中，单独地或与另一种富集的细胞群例如B2和/或B3混合的B4’细胞群保留治疗性质。B4’细胞群例如被本文描述于例如实施例11-13的实施例中。
另一方面，富集的细胞群还可以是指如上所讨论的来源于起始肾脏细胞群的细胞群，所述细胞群含有的表达一种或多种血管、肾小球和近端肾小管标志物的细胞与一些产生EPO的细胞的百分率大于起始群中的表达一种或多种血管、肾小球和近端肾小管标志物的细胞与一些产生EPO的细胞的百分率。例如，术语“B3”是指来源于起始肾脏细胞群的细胞群，与起始群相比所述细胞群含有更大百分率的近端肾小管细胞以及血管细胞和肾小球细胞。在一个实施方案中，与起始群相比B3细胞群含有更大百分率的近端肾小管细胞，但与B2细胞群相比含有更小百分率的近端肾小管细胞。在另一个实施方案中，与起始群相比B3细胞群含有更大百分率的血管细胞和肾小球细胞标志物与一些产生EPO的细胞，但与B4细胞群相比含有更小百分率的血管细胞和肾小球细胞标志物与一些产生EPO的细胞。
另一方面，富集的细胞群还可以是指来源于如上所讨论的起始肾脏细胞群的细胞群，所述细胞群含有的表达一种或多种肾小管细胞标志物的细胞的百分率大于起始群中的表达一种或多种肾小管细胞标志物的细胞的百分率。例如，术语“B2”是指来源于起始肾脏细胞群的细胞群，与起始群相比所述细胞群含有更大百分率的肾小管细胞。此外，富集了表达一种或多种肾小管细胞标志物的细胞的细胞群(或“B2”)可以含有来自集合管系统的一些上皮细胞。虽然富集了表达一种或多种肾小管细胞标志物的细胞的细胞群(或“B2”)相对消耗了产生EPO的细胞、肾小球细胞和血管细胞，但与起始群相比富集的群可以含有更小百分率的这些细胞(产生EPO的细胞、肾小球细胞和血管细胞)。通常，消耗异质细胞群中的一种或多种细胞类型以使得相对于消耗前包含于异质细胞群中的细胞类型的比例经过消耗的细胞群含有更小比例的细胞类型。可以被消耗的细胞类型为任何类型的肾脏细胞。例如，在某些实施方案中，可以被消耗的细胞类型包括密度为<约1.045g/ml的集合管和肾小管系统的具有大粒度的细胞，称为“B1”。在某些其它实施方案中，可以被消耗的细胞类型包括密度为>约1.095g/ml的具有低粒度和活力的碎片和小细胞，称为“B5”。在一些实施方案中，富集了肾小管细胞的细胞群相对消耗了所有以下细胞：“B1”、“B5”、氧可调的表达EPO的细胞、肾小球细胞以及血管细胞。
如本文所使用的术语“低氧”培养条件是指其中相对于细胞在大气氧水平(约21％)下培养的标准培养条件，在培养系统中细胞受到降低的可获得的氧水平的培养条件。非低氧条件在本文中是指正常或含氧量正常的培养条件。
如本文所使用的术语“氧可调的”是指细胞基于细胞可获得的氧的量使基因表达(向上或向下)调节的能力。“低氧可诱导的”是指响应于氧张力减小的基因表达的上调(无论预先诱导或起始氧张力)。
如本文所使用的术语“生物材料”是指适合用于引入到活组织中的天然或合成的生物相容材料。天然的生物材料为由活系统制成或起源于活系统的材料。合成的生物材料为不是由活系统制成或不起源于活系统的材料。本文所公开的生物材料可为天然的和合成的生物相容材料的组合。如本文所使用，生物材料包括例如聚合物基质和支架。本领域普通技术人员将了解生物材料可以被构造为各种形式，例如像多孔泡沫、凝胶、液体、珠粒、固体，并且可以包括一种或多种天然的或合成的生物相容材料。在一个实施方案中，生物材料为能够变成水凝胶的溶液的液体形式。
术语“改进释放”或等效术语“控制释放”、“延迟释放”或“缓释”是指在施用至个体之后随着时间推移或在多于一个时间点上释放活性剂(如生物活性细胞)的制剂。取决于制剂可以在所希望的时间范围内(例如，数分钟、数小时、数天、数周或更长)发生的活性剂的改进释放与其中在施用之后立即可获得大体上整个剂量单位的标准制剂相反。对于组织工程和再生医学应用，优选的改进释放制剂在局部施用(例如，将活性剂直接施用至实体器官)之后提供多个时间点上的活性剂释放。例如，生物活性细胞的改进释放制剂将在施用之时立即提供细胞的初始释放并且在稍后的时间里提供细胞的稍后第二次释放。活性剂的第二次释放的时间延迟可为初始施用之后的数分钟、数小时或数天。通常，释放延迟的时段相应于活性剂的生物材料载体失去其结构完整性所花费的时段。活性剂的延迟释放开始，同样地完整性开始降解并且当完整性完全丧失时完成。本领域普通技术人员将了解其它适合的释放机制。
如本文所使用的术语“贫血”是指由于受试者的产生EPO的细胞不当产生功能性EPO蛋白、和/或将EPO蛋白不当释放到全身循环中、和/或骨髓中的成红细胞不能响应于EPO蛋白而引起的红细胞数目的不足和/或血红蛋白水平的降低。患有贫血的受试者不能维持红细胞稳态。通常，贫血可以在肾脏功能衰退或失去(例如，慢性肾衰竭)情况下发生，贫血与相对EPO缺乏相关，贫血与充血性心力衰竭相关，贫血与骨髓抑制疗法如化学疗法或抗病毒疗法(例如，AZT)相关，贫血与非骨髓性癌相关，贫血与病毒感染如HIV相关并且贫血与慢性疾病如自身免疫性疾病(例如，类风湿性关节炎)、肝脏疾病和多器官系统衰竭相关。
术语“EPO缺乏”是指用促红细胞生成素受体激动剂(例如，重组EPO或EPO类似物)可治疗的任何病状或病症，包括贫血。
如本文所使用的术语“器官相关疾病”是指导致器官丧失进行其功能的能力的与急性或慢性器官衰竭的任何阶段或程度相关的病症。
如本文所使用的术语“肾脏疾病”是指导致肾脏失去进行血液过滤和从血液中清除多余流体、电解质和废物的功能的能力的与急性或慢性肾衰竭的任何阶段或程度相关的病症。肾脏疾病还包括内分泌功能障碍如贫血(促红细胞生成素缺乏)和矿物质失衡(维生素D缺乏)。肾脏疾病起源于肾脏或可以次发于各种病状，包括(但不限于)心脏衰竭、高血压、糖尿病、自身免疫性疾病或肝脏疾病。肾脏疾病可为在对肾脏急性损伤之后发展的慢性肾衰竭的病状。例如，通过局部缺血和/或暴露于毒物而对肾脏的损伤可以引起急性肾衰竭；急性肾脏损伤之后未完全恢复可以导致发展慢性肾衰竭。
术语“治疗”是指对于肾脏疾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷进行的治疗性治疗和预防性或保护性措施，其中目标是为了逆转、预防或减缓(减轻)目标病症。有治疗需要的那些人包括已经患有肾脏疾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷的那些人以及倾向于患有肾脏疾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷的那些人或在其体内待预防肾脏疾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷的那些人。如本文所使用的术语“治疗”包括稳定和/或改进肾脏功能。
如本文所使用的术语“体内接触”是指在由富集的细胞群和自体器官分泌的产物之间在体内的直接接触。例如，由富集的肾细胞群(或含有肾细胞/肾细胞级分的混合物或构建体)分泌的产物可以在体内接触自体肾脏。直接体内接触本质上可为旁分泌、内分泌或近分泌。所分泌的产物可为本文所描述的不同产物的异质群。
如本文所使用的术语“核糖核酸”或“RNA”是指其中每个单元由含氮碱基、核糖和磷酸构成的核苷酸单元的链。RNA可以呈单链或双链形式。RNA可为囊泡的一部分、在囊泡内或与囊泡相关。囊泡可为外来体。RNA包括但不限于：mRNA、rRNA、小RNA、snRNA、snoRNA、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)以及非编码RNA。RNA优选地为人RNA。
术语“构建体”是指沉积在由一种或多种合成的或天然存在的生物相容材料构成的支架或基质的表面之上或之中的一个或多个细胞群。一个或多个细胞群可以被涂覆有生物材料、沉积于生物材料上、包埋于生物材料中、附着至生物材料上、接种于或捕获于生物材料中，所述生物材料由一种或多种合成的或天然存在的生物相容生物材料、聚合物、蛋白质或肽构成。一个或多个细胞群可以在体外或在体内与生物材料或支架或基质组合。通常，用来形成支架/生物材料的一种或多种生物相容材料被选择以指导、促进或容许其上沉积的至少一个细胞群形成多细胞、三维的组织结构。用来产生构建体的一种或多种生物材料还可以被选择以指导、促进或容许构建体或构建体的细胞组分的分散和/或与内源性宿主组织的结合，或被选择以指导、促进或容许构建体或构建体的细胞组分的存活、移植、耐受或功能性性能。
术语“标志物”或“生物标志物”一般是指DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物或基于糖脂的分子标志物，所述标志物或生物标志物在培养的细胞群中的表达或存在可以通过标准方法(或本文所公开的方法)来检测并且与培养的细胞群中的作为特定细胞类型的一种或多种细胞一致。所述生物标志物包括但不限于列于表X和表Y中的基因。标志物可为由细胞表达的多肽或染色体上可鉴定的物理位置，如基因、限制性内切酶识别位点或编码由天然细胞表达的多肽的核酸(例如，mRNA)。标志物可为称为“基因表达标志物”的基因的一个表达区，或不具有已知编码功能的DNA的一些区段。生物标志物可为细胞来源的(例如，分泌的)产物。
术语“生物标志物签名”、“签名”、“生物标志物表达签名”或“表达签名”在本文中可互换地使用并且是指其表达作为包括例如生物活性肾细胞的细胞群的例如上皮、肾小管等的细胞类型的指标的一种生物标志物或生物标志物的组合。生物标志物签名可以用作细胞群在提供用于本文的方法和制造中使用的适合性的指标。在一些实施方案中，生物标志物签名为“基因签名”。术语“基因签名”与“基因表达签名”可互换地使用并且是指其表达作为例如上皮、肾小管等的细胞类型的指标的一种多核苷酸或多核苷酸的组合。在一些实施方案中，生物标志物签名为“蛋白质签名”。术语“蛋白质签名”与“蛋白质表达签名”可互换地使用并且是指其表达作为例如上皮、肾小管等的细胞类型的指标的一种多肽或多肽的组合。
术语“表达的水平”或“表达水平”可互换地使用并且一般是指生物样品中的多核苷酸或氨基酸产物或蛋白质的量，或表达多核苷酸或氨基酸产物或蛋白质的细胞的百分率。“表达”及其语法变体是指多核苷酸或氨基酸产物或蛋白质以可检测的量存在于生物样品中。例如，作为可检测(在背景或对照值以上)的蛋白质可以被称为表达蛋白质。类似地，如果样品中的一部分细胞表达蛋白质，样品可以被称为表达蛋白质。在替代实施方案中，样品可以被称为具有与表达蛋白质的细胞的百分率相关的表达水平，例如，如果样品中60％的细胞表达蛋白质，则表达水平为60％。
可互换地使用的术语“差异表达的基因”、“差异基因表达”及其同义词是指相对于其在第二细胞或细胞群中的表达在第一细胞或细胞群中的表达被激活至更高或更低水平的基因。所述术语还包括在培养中的第一或第二细胞的传代过程中其表达随着时间推移在不同阶段上被激活至更高或更低水平的基因。还应该理解，差异表达的基因可以在核酸水平或蛋白质水平下被激活或抑制，或可以受到选择性剪接(alternative splicing)以产生不同的多肽产物。所述差异可以通过例如mRNA水平、表面表达、分泌或多肽的其它分配方面的变化来证明。差异基因表达可以包括两个或更多个基因或其基因产物之间的表达比较，或两个或更多个基因或其基因产物之间的表达比率比较，或甚至相同基因的两个不同加工的产物的比较，所述比较在第一细胞与第二细胞之间不同。差异表达包括例如第一细胞和第二细胞之中的基因或其表达产物上的时间或细胞表达模式的差异。出于本公开的目的，当在第一细胞和第二细胞中的给定基因的表达之间存在差异时认为存在“差异基因表达”。相对于施用之后来自患者的细胞(第二细胞)中的表达，标志物的差异表达可以存在于施用细胞群、混合物或构建体之前来自患者的细胞(第一细胞)中。
术语“抑制”、“下调”、“表达不足”和“降低”可互换地使用并且意指相对于一个或多个对照例如像一个或多个阳性和/或阴性对照，基因的表达或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的RNA分子或等效RNA分子的水平或一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的活性降低。在来自施用细胞群体、混合物或构建体之前的患者的细胞中相对于来自施用后的患者的细胞可存在表达不足。。
术语“上调”或“过表达”用来意指相对于一个或多个对照例如像一个或多个阳性和/或阴性对照，基因的表达或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的RNA分子或等效RNA分子的水平或一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的活性升高。在来自施用细胞群体、混合物或构建体后的患者的细胞中相对于来自施用前的患者的细胞存在过表达。
术语“受试者”应该意指任何单个人受试者，包括适于治疗、正经历或已经经历器官相关疾病如肾脏疾病、贫血或EPO缺乏的一种或多种体征、症状或其它指标的患者。所述受试者包括但不限于最近被诊断或先前被诊断和现在正经历再发生或复发或无论什么原因处于肾脏疾病、贫血或EPO缺乏危险中的受试者。受试者可以先前已经被治疗肾脏疾病、贫血或EPO缺乏，或没有如此治疗。
术语“患者”是指希望治疗的任何单个动物，更优选地哺乳动物(包括例如像狗、猫、马、兔、动物园动物、奶牛、猪、绵羊以及非人灵长类动物那样的非人动物)。最优选地，本文中的患者为人。
术语“样品”或“患者样品”或“生物样品”应该一般意指从受试者或患者、体液、身体组织、细胞系、组织培养物或其它来源中获得的任何生物样品。所述术语包括组织活检物，例如像肾脏活检物。所述术语包括培养的细胞，例如像培养的哺乳动物肾脏细胞。用于从哺乳动物中获得组织活检物和培养的细胞的方法为本领域众所周知的。如果单独使用术语“样品”，仍应该意指“样品”为“生物样品”或“患者样品”，即术语可互换地使用。
术语“测试样品”是指来自已经通过本文所公开的方法治疗的受试者的样品。测试样品可以起源于哺乳动物受试者中的各种来源，包括但不限于血液、精液、血清、尿、骨髓、粘液、组织等。
术语“对照”或“对照样品”是指其中阴性或阳性结果被预期帮助校正测试样品中的结果的阴性或阳性对照。适合的对照包括但不限于已知表现正常红细胞稳态的指标特征的样品、已知表现贫血的指标特征的样品、从已知不是贫血的受试者中获得的样品以及从已知是贫血的受试者中获得的样品。适合用于本文所提供的方法的额外对照包括但不限于来源于已经用已知调节红细胞生成的药物剂(例如，重组EPO或EPO类似物)治疗的患者的样品。此外，对照可为在通过本文所公开的方法治疗之前从受试者中获得的样品。额外的适合的对照可为从已知具有肾脏疾病的任何类型或阶段的受试者中获得的测试样品和来自已知不具有肾脏疾病的任何类型或阶段的受试者的样品。对照可为正常健康匹配的对照。本领域技术人员将了解适合用于本文的其它对照。
“再生预后”、“再生性预后”或“预后再生”一般是指预报或预测施用或植入本文所描述的细胞群、混合物或构建体的可能的再生进程或结果。对于再生预后，预报或预测可以由以下的一种或多种来告知：在植入或施用之后改进功能性器官(例如，肾脏)、在植入或施用之后发展功能性肾脏、在植入或施用之后发展改进的肾脏功能或能力以及在植入或施用之后由自体肾脏来表达某些标志物。
“再生器官”是指在植入或施用如本文所描述的细胞群、混合物或构建体之后的自体器官。再生器官通过各种指标来表征，包括但不限于自体器官的功能或能力的发展、自体器官的功能或能力的改进以及某些标志物在自体器官中的表达。本领域普通技术人员将了解其它指标可以适合用于表征再生器官。
“再生肾脏”是指在植入或施用如本文所描述的细胞群、混合物或构建体之后的自体肾脏。再生肾脏通过各种指标来表征，包括但不限于自体肾脏的功能或能力的发展、自体肾脏的功能或能力的改进以及某些标志物在自体肾脏中的表达。本领域普通技术人员将了解其它指标可以适合用于表征再生肾脏。
术语“细胞聚集体”或“球状体”是指与呈单层生长相反的被培养以允许3D的细胞聚集体或集合体。应该指出术语“球状体”不暗含聚集体为几何球形。聚集体可以被高度组织成具有完好的形态或它可为无组织的团块；它可以包括单一细胞类型或多于一种细胞类型。细胞可为原代分离物或永久细胞系或这两者的组合。在本定义中包括类器官和器官型培养物。
术语“环境温度”是指本公开的制剂将被施用至受试者的温度。通常，环境温度为受控温度环境的温度。环境温度在约18℃至约30℃范围内。在一个实施方案中，环境温度为约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃。
当本文使用时词语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂如核酸探针或抗体并且促进其缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记可以本身是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语意图涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体的直接标记探针或抗体以及通过与直接标记的另一种试剂反应的间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体检测一级抗体和用生物素末端标记DNA探针以使得它可以用荧光标记的链霉抗生素蛋白来检测。
术语“检测”包括任何方法的检测，包括直接和间接检测。
“试剂盒”为包含至少一种试剂的任何制品(例如，包装或容器)，所述试剂例如用于治疗肾脏疾病的药剂或用于特异性检测如本文所公开的生物标志物基因或蛋白质的探针。制品优选地作为用于进行本文所公开的方法的单位推广、分发或出售。
2.细胞群
本公开的制剂可以含有富集了特异性生物活性组分或细胞类型和/或消耗了特定非活性或不希望的组分或细胞类型的用于治疗肾脏疾病(即，提供肾脏功能的稳定和/或改进和/或再生)的分离的异质肾脏细胞群及其混合物，所述分离的异质肾脏细胞群及其混合物先前描述于Presnell等U.S.2011-0117162和Ilagan等PCT/US2011/036347中，所述专利的全部内容以引用的方式并入本文。制剂可以含有与健康个体相比缺乏细胞组分但保留治疗性质(即，提供肾脏功能的稳定和/或改进和/或再生)的分离的肾细胞级分。本文所描述的细胞群、细胞级分和/或细胞的混合物可以来源于健康个体、患有肾脏疾病的个体或如本文所描述的受试者。
本公开提供了适合与各种生物活性细胞群一起使用的制剂，所述生物活性细胞群包括但不限于分离的细胞群、细胞级分、混合物、富集的细胞群、细胞聚集体以及其任何组合。在一个实施方案中，生物活性细胞群为生物活性肾细胞。
生物活性细胞群
本公开涵盖适合用于待施用至有需要的受试者中的靶器官或组织的生物活性细胞群的治疗制剂。生物活性细胞群一般是指当施用至受试者时潜在地具有治疗性质的细胞群。例如，当施用至有需要的受试者时，生物活性肾细胞群可以在受试者中提供肾脏功能的稳定和/或改进和/或再生。治疗性质可以包括再生作用。
生物活性细胞群包括但不限于干细胞(例如，多能的、多潜能的、寡能的或单能的)如胚胎干细胞、羊膜干细胞、成人干细胞(例如，造血、乳房、肠、间充质、胎盘、肺、骨髓、血液、脐带、内皮、牙髓、脂肪、神经、嗅觉、神经峭、睾丸)、诱导的多能干细胞；基因修饰的细胞；以及来源于身体任何来源的细胞群或组织外植体。本公开的制剂还可以与以下细胞群或细胞一起使用：如在2011年6月9日提交的Basu等PCT/US11/39859中所描述的肾脂肪来源的细胞群；和在2011年5月3日提交的Ludlow等U.S.2010-0131075和Ludlow等PCT/US11/35058中描述的脂肪来源的或外周血来源的平滑肌细胞；或如在Atala U.S.6,576,019中所描述的膀胱来源的泌尿道上皮的或平滑肌细胞，所述专利中的每一个均以引用的方式整体并入本文。生物活性细胞群本质上可为分离的、富集的、纯化的、均质的或异质的。本领域普通技术人员将了解适合用于本公开的制剂的其它生物活性细胞群。
在一个实施方案中，细胞的来源与所期望的靶器官或组织相同。例如，肾细胞可以源自待用于被施用至肾脏的制剂的肾脏。在另一个实施方案中，细胞的来源不与所期望的靶器官或组织相同。例如，表达促红细胞生成素的细胞可以源自待用于被施用至肾脏的制剂的肾脂肪。
一方面，本公开提供了含有富集了生物活性组分和消耗了非活性或不希望的组分以提供比起始群优越的治疗结果和再生结果的异质肾细胞群的某些亚级分的制剂。例如，本文所描述的生物活性肾细胞(例如，单独地或混合地消耗了例如B1和B5的非活性或不希望的组分的B2、B4和B3)可为待用于稳定和/或改进和/或再生肾脏功能的制剂的一部分。
另一方面，制剂含有单独地或当与其它生物活性亚级分(例如，B2和/或B3)混合时保留治疗性质(例如，肾脏功能的稳定和/或改进和/或再生)的消耗或缺少一种或多种细胞类型(例如，血管、内分泌或内皮细胞类型)的特定亚级分B4(即，B4’)。在一个优选的实施方案中，生物活性细胞群为B2。在某些实施方案中，B2细胞群与B4或B4’混合。在其它实施方案中，B2细胞群与B3混合。在其它实施方案中，B2细胞群与B3和B4、或B3和/或B4的特定细胞组分混合。
B2细胞群特征在于表达肾小管细胞标志物，所述肾小管细胞标志物选自由以下的一种或多种组成的组：巨蛋白(megalin)、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17成员RAS癌基因家族(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含有FXYD结构域的离子转运调节因子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换因子)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)、和钙蛋白酶-8(Capn8)以及集合管标志物水通道蛋白-4(Aqp4)。B2比B3和/或B4的粒状更大和更多，并且因此具有约1.045g/ml与约1.063g/ml之间(啮齿动物)、约1.045g/ml与1.052g/ml之间(人)以及约1.045g/ml与约1.058g/ml之间(犬)的浮力密度。
B3细胞群特征在于表达血管、肾小球和近端肾小管标志物与一些产生EPO的细胞，与B2和B4相比具有介于中间的大小和粒度，并且因此具有约1.063g/ml与约1.073g/ml之间(啮齿动物)、约1.052g/ml与约1.063g/ml之间(人)以及约1.058g/ml与约1.063g/ml之间(犬)的浮力密度。B3特征在于表达选自由以下的一种或多种组成的组的标志物：水通道蛋白7(Aqp7)、含有FXYD结构域的离子转运调节因子2(Fxyd2)、溶质载体家族17(磷酸钠)成员3(Slc17a3)、溶质载体家族3成员1(Slc3a1)、紧密连接蛋白2(claudin 2)(Cldn2)、新天冬氨酸蛋白酶A天冬氨酸肽酶(Napsa)、溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)成员2(Slc2a2)、丙氨酰(膜)氨基肽酶(Anpep)、跨膜蛋白27(Tmem27)、酰基-CoA合成酶中链家族成员2(Acsm2)、谷胱甘肽过氧化物酶3(Gpx3)、果糖-1,6-二磷酸酶1(Fbp1)以及丙氨酸-乙醛酸转氨酶2(Agxt2)。B3还特征在于血管表达标志物血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和肾小球表达标志物肾小球足细胞裂隙膜蛋白(podocin)(Podn)。
B4细胞群特征在于表达含有以下的一种或多种的血管标志物集合：PECAM、VEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146；含有以下的一种或多种的肾小球标志物集合：肾小球足细胞裂隙膜蛋白(Podn)和肾小球足细胞特异性蛋白(Nephrin)(Neph)；以及与未分级分离(UNFX)相比的氧可调EPO富集的群B2和B3。B4还特征在于表达以下标志物的一种或多种：趋化因子(C-X-C基序)受体4(Cxcr4)、B型内皮素受体(Ednrb)、V型胶原α2(Col5a2)、钙粘蛋白5(Cdh5)、纤溶酶原激活物组织(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入结构域蛋白受体(Kdr)、富含酸性半胱氨酸的分泌蛋白质(骨粘连蛋白)(Sparc)、丝甘聚糖(serglycin)(Srgn)、TIMP金属肽酶抑制剂3(Timp3)、维尔姆斯瘤1(Wt1)、无翼型MMTV整合位点家族成员4(Wnt4)、G蛋白信号传导4的调节因子(Rgs4)、血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)以及促红细胞生成素(Epo)。B4还特征在于与B2或B3相比粒状细胞更小、更少，具有约1.073g/ml与约1.091g/ml之间(啮齿动物)、约1.063g/ml与约1.091g/mL之间(人和犬)的浮力密度。
B4’细胞群被定义为具有1.063g/mL与1.091g/mL之间的浮力密度并且表达以下标志物的一种或多种：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、肾小球足细胞裂隙膜蛋白、肾小球足细胞特异性蛋白、EPO、CK7、CK8/18/19。在一个实施方案中，B4’细胞群特征在于表达含有以下的一种或多种的血管标志物集合：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146。在另一个实施方案中，B4’细胞群特征在于表达内分泌标志物EPO。在一个实施方案中，B4’细胞群特征在于表达含有以下的一种或多种的肾小球标志物集合：肾小球足细胞裂隙膜蛋白(Podn)和肾小球足细胞特异性蛋白(Neph)。在某些实施方案中，B4’细胞群特征在于表达含有以下的一种或多种的血管标志物集合：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a并且特征在于表达内分泌标志物EPO。在另一个实施方案中，B4’还特征在于与B2或B3相比粒状细胞更小、更少，具有约1.073g/ml与约1.091g/ml之间(啮齿动物)、约1.063g/ml与约1.091g/mL之间(人和犬)的浮力密度。
一方面，本公开提供了含有分离的、富集的B4’人肾细胞群的制剂，所述B4’人肾细胞群包含密度为1.063g/mL与1.091g/mL之间的产生促红细胞生成素(EPO)的细胞、血管细胞和肾小球细胞中的至少一种。在一个实施方案中，B4’细胞群特征在于表达血管标志物。在某些实施方案中，B4’细胞群特征不在于表达肾小球标志物。在一些实施方案中，B4’细胞群能够进行氧可调的促红细胞生成素(EPO)表达。
在一个实施方案中，制剂含有B4’细胞群但不包括B2细胞群，所述B2细胞群包含密度为1.045g/mL与1.052g/mL之间的肾小管细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群制剂不包括B1细胞群，所述B1细胞群包含密度为<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群制剂不包括B5细胞群，所述B5细胞群包含密度>1.091g/ml的具有低粒度和活力的碎片和小细胞。
在一个实施方案中，含有B4’细胞群的制剂不包括：B2细胞群，所述B2细胞群包含密度为1.045g/mL与1.052g/mL之间的肾小管细胞；B1细胞群，所述B1细胞群包含密度为<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞；以及B5细胞群，所述B5细胞群包含密度为>1.091g/ml的具有低粒度和活力的碎片和小细胞。在一些实施方案中，B4’细胞群可以来源于患有肾脏疾病的受试者。
一方面，本公开提供了含有包含第一细胞群B2和第二细胞群B4’的人肾细胞混合物的制剂，所述第一细胞群B2包含密度为1.045g/mL与1.052g/mL之间的分离的、富集的肾小管细胞群，所述第二细胞群B4’包含密度为约1.063g/mL与1.091g/mL之间的产生促红细胞生成素(EPO)的细胞和血管细胞但消耗肾小球细胞，其中混合物不包括B1细胞群或B5细胞群，所述B1细胞群包含密度为<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，所述B5细胞群包含密度为>1.091g/ml的具有低粒度和活力的碎片和小细胞。在某些实施方案中，B4’细胞群特征在于表达血管标志物。在一个实施方案中，B4’细胞群特征不在于表达肾小球标志物。在某些实施方案中，B2还包含集合管上皮细胞。在一个实施方案中，制剂含有能够进行受体介导的白蛋白摄取的细胞的混合物。在另一个实施方案中，细胞的混合物能够进行氧可调的促红细胞生成素(EPO)表达。在一个实施方案中，混合物含有能够在体外和在体内产生和/或刺激产生透明质酸(HA)的高分子量物质的表达HAS-2的细胞。在所有实施方案中，第一细胞群和第二细胞群可以来源于肾脏组织或培养的肾脏细胞(Basu等Lipids in Health and Disease,2011,10:171)。
在一个实施方案中，制剂含有能够在体内递送时提供再生刺激的混合物。在其它实施方案中，混合物能够在体内递送时减少肾小球过滤、肾小管再吸收、尿产生和/或内分泌功能的衰退，稳定或改进肾小球过滤、肾小管再吸收、尿产生和/或内分泌功能。在一个实施方案中，B4’细胞群来源于患有肾脏疾病的受试者。
一方面，本公开提供了含有分离的、富集的B4’人肾细胞群的制剂，所述B4’人肾细胞群包含密度为1.063g/mL与1.091g/mL之间的产生促红细胞生成素(EPO)的细胞、血管细胞和肾小球细胞中的至少一种。在一个实施方案中，B4’细胞群特征在于表达血管标志物。在某些实施方案中，B4’细胞群特征不在于表达肾小球标志物。不被表达的肾小球标志物可为肾小球足细胞裂隙膜蛋白。在一些实施方案中，B4’细胞群能够进行氧可调的促红细胞生成素(EPO)表达。
在一个实施方案中，含有B4’细胞群的制剂不包括B2细胞群，所述B2细胞群包含密度为1.045g/mL与1.052g/mL之间的肾小管细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群制剂不包括B1细胞群，所述B1细胞群包含密度为<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群制剂不包括B5细胞群，所述B5细胞群包含密度>1.091g/ml的具有低粒度和活力的碎片和小细胞。
在一个实施方案中，含有B4’细胞群的制剂不包括：B2细胞群，所述B2细胞群包含密度为1.045g/mL与1.052g/mL之间的肾小管细胞；B1细胞群，所述B1细胞群包含密度为<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞；以及B5细胞群，所述B5细胞群包含密度为>1.091g/ml的具有低粒度和活力的碎片和小细胞。在一些实施方案中，B4’细胞群可以来源于患有肾脏疾病的受试者。
一方面，本公开提供了含有包含第一细胞群B2和第二细胞群B4’的人肾细胞混合物的制剂，所述第一细胞群B2包含密度为1.045g/mL与1.052g/mL之间的分离的、富集的肾小管细胞群，所述第二细胞群B4’包含密度为约1.063g/mL与1.091g/mL之间的产生促红细胞生成素(EPO)的细胞和血管细胞但消耗肾小球细胞，其中混合物不包括B1细胞群或B5细胞群，所述B1细胞群包含密度为<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，所述B5细胞群包含密度为>1.091g/ml的具有低粒度和活力的碎片和小细胞。在某些实施方案中，B4’细胞群特征在于表达血管标志物。在一个实施方案中，B4’细胞群特征不在于表达肾小球标志物。在某些实施方案中，B2还包含集合管上皮细胞。在一个实施方案中，细胞的混合物能够进行受体介导的白蛋白摄取。在另一个实施方案中，细胞的混合物能够进行氧可调的促红细胞生成素(EPO)表达。在一个实施方案中，混合物含有能够在体外和在体内产生和/或刺激产生透明质酸(HA)的高分子量物质的表达HAS-2的细胞。在所有实施方案中，第一细胞群和第二细胞群可以来源于肾脏组织或培养的肾脏细胞。
另一方面，本公开提供含有异质肾细胞群的制剂，所述异质肾细胞群包含细胞级分或富集的细胞群(例如，B1、B2、B3、B4(或B4’)以及B5)的组合。在一个实施方案中，组合具有约1.045g/ml与约1.091g/ml之间的浮力密度。在一个其它实施方案中，组合具有小于约1.045g/ml与约1.099g/ml或约1.100g/ml之间的浮力密度。在另一个实施方案中，组合具有如通过在密度梯度上分离(例如，通过离心)所确定的浮力密度。在另一个实施方案中，细胞级分的组合含有消耗了B1和/或B5的B2、B3以及B4(或B4’)。在一些实施方案中，细胞级分的组合含有B2、B3、B4(或B4’)以及B5但消耗了B1。一旦消耗B1和/或B5，组合可以随后在制备包含B2、B3以及B4(或B4’)细胞级分的组合的制剂之前在体外培养。
本公开的发明人已经出乎预料地发现体外培养消耗B1的B2、B3、B4以及B5的组合导致B5消耗。在一个实施方案中，在至少一次、两次、三次、四次或五次传代之后B5被消耗。在一个其它实施方案中，在本文所描述的条件下传代的B2、B3、B4以及B5细胞级分组合提供了B5百分率为传代细胞群的小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％或小于约0.5％的传代细胞群。
在另一个实施方案中，B4’为细胞级分的组合的一部分。在一个其它实施方案中，体外培养消耗B5是在低氧条件下。
在一个实施方案中，制剂含有能够在体内递送时提供再生刺激的混合物。在其它实施方案中，混合物能够在体内递送时减少肾小球过滤、肾小管再吸收、尿产生和/或内分泌功能的衰退，稳定或改进肾小球过滤、肾小管再吸收、尿产生和/或内分泌功能。在一个实施方案中，B4’细胞群来源于患有肾脏疾病的受试者。
在一个优选的实施方案中，制剂含有包含与B3和/或B4组合的B2的混合物。在另一个优选的实施方案中，混合物包含与B3和/或B4’组合的B2。在其它优选的实施方案中，混合物由以下组成或基本上由以下组成：(i)与B3和/或B4组合的B2；或(ii)与B3和/或B4’组合的B2。
含有B4’细胞群的混合物可以含有也从非健康受试者中获得的B2和/或B3细胞群。非健康受试者可为与从其中获得B4’级分相同的受试者。与B4’细胞群相反，从非健康受试者中获得的B2和B3细胞群与来源于健康个体的起始肾脏细胞群相比通常不缺少一种或多种特定细胞类型。
如在Presnell等WO/2010/056328中所描述，已经发现B2和B4细胞制剂能够通过透明质酸合酶-2(HAS-2)(更确切地在B2细胞群中富集的标志物)的作用在体外和在体内表达透明质酸(HA)的较高分子量物质。在5/6Nx模型中用B2处理显示减少了纤维化，伴随有体内强烈的表达HAS-2表达以及在处理的组织内预期产生高分子量HA。显著地，不进行处理的5/6Nx模型导致具有限制的HAS-2检测的纤维化以及很少产生高分子量HA。不希望受理论约束，假设主要由B2产生(并且在一定程度上由B4产生)的HA的这种抗炎性高分子量物质与细胞制剂协同作用于减少肾纤维化和帮助肾再生。因此，本公开包括含有本文所描述的生物活性肾细胞连同包含透明质酸的生物材料一起的制剂。本公开还涵盖通过由植入的细胞直接产生或刺激产生来提供再生刺激的生物材料组分。
一方面，本公开提供了含有用于在有需要的受试者中治疗肾脏疾病、贫血和/或EPO缺乏的分离的异质产生EPO的肾脏细胞的制剂。在一个实施方案中，细胞群来源于肾脏活检物。在另一个实施方案中，细胞群来源于全肾脏组织。在一个其它实施方案中，细胞群来源于产生自肾脏活检物或全肾脏组织的哺乳动物肾脏细胞的体外培养物。在所有实施方案中，这些群为未分离分级的细胞群，在本文中又称为非富集的细胞群。
另一方面，本公开提供了含有分离的产生促红细胞生成素(EPO)的肾脏细胞群的制剂，所述分离的产生促红细胞生成素(EPO)的肾脏细胞群被进一步富集以使得富集的亚群中的产生EPO的细胞的比例相对于起始或初始细胞群中的产生EPO的细胞的比例更大。在一个实施方案中，相对于包含在未富集的初始群中的间质成纤维细胞和肾小管细胞，富集的产生EPO的细胞级分含有更大比例的间质成纤维细胞和更小比例的肾小管细胞。在某些实施方案中，相对于包含在未富集的初始群中的肾小球细胞、血管细胞和集合管细胞，富集的产生EPO的细胞级分含有更大比例的肾小球细胞和血管细胞以及更小比例的集合管细胞。在所述实施方案中，这些群在本文中称为“B4”细胞群。
另一方面，本公开提供了含有与一种或多种额外的肾脏细胞群混合的产生EPO的肾脏细胞群的制剂。在一个实施方案中，产生EPO的细胞群为富集了产生EPO的细胞的第一细胞群，例如B4。在另一个实施方案中，产生EPO的细胞群为没有富集产生EPO的细胞的第一细胞群，例如B2。在另一个实施方案中，第一细胞群与第二肾脏细胞群混合。在一些实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞，这可以通过肾小管细胞表型的存在来显示。在另一个实施方案中，肾小管细胞表型可以通过一种肾小管细胞标志物的存在来指示。在另一个实施方案中，肾小管细胞表型可以通过一种或多种肾小管细胞标志物的存在来指示。肾小管细胞标志物包括但不限于巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17成员RAS癌基因家族(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含有FXYD结构域的离子转运调节因子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换因子)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)以及钙蛋白酶-8(Capn8)。在另一个实施方案中，第一细胞群与数种类型的肾脏细胞中的至少一种混合，所述肾脏细胞包括但不限于间质来源的细胞、肾小管细胞、集合管来源的细胞、肾小球来源的细胞和/或来源于血液或脉管系统的细胞。
本公开的制剂可以包括产生EPO的肾脏细胞群，所述产生EPO的肾脏细胞群含有呈与B2和/或B3的混合物形式或呈富集的细胞群形式例如B2+B3+B4/B4’含有B4或B4’。
一方面，制剂含有产生EPO的肾脏细胞群，所述产生EPO的肾脏细胞群特征在于EPO表达和对氧的生物响应性以使得培养系统的氧张力减小引起诱导EPO表达。在一个实施方案中，产生EPO的细胞群富集产生EPO的细胞。在一个实施方案中，当细胞群在一定条件下培养时诱导EPO表达，在所述条件中与在可获得的氧的正常大气(大约21％)水平下培养的细胞群相比细胞在培养系统中受到降低的可获得的氧水平。在一个实施方案中，相对于在正常氧条件下培养的产生EPO的细胞，培养于较低氧条件中的产生EPO的细胞表达更高水平的EPO。通常，在可获得的氧的降低水平(又称为低氧培养条件)下培养细胞意指相对于在可获得的氧的正常大气水平(又称为正常或含氧量正常的培养条件)下培养细胞，减少的氧水平降低。在一个实施方案中，低氧细胞培养条件包括在约小于1％氧、约小于2％氧、约小于3％氧、约小于4％氧或约小于5％氧下培养细胞。在另一个实施方案中，正常或含氧量正常的培养条件包括在约10％氧、约12％氧、约13％氧、约14％氧、约15％氧、约16％氧、约17％氧、约18％氧、约19％氧、约20％氧或约21％氧下培养细胞。
在一个其它实施方案中，获得了EPO表达的诱导或增加并且可以通过在约小于5％可获得的氧下培养细胞和比较在大气(约21％)氧下培养的细胞的EPO表达水平来观察。在另一个实施方案中，在能够通过一种方法表达EPO的细胞培养物中获得EPO诱导，所述方法包括其中细胞培养物在大气氧(约21％)下培养一段时间的第一培养阶段和其中可获得的氧水平降低并且在约小于5％可获得的氧下培养所述细胞的第二培养阶段。在另一个实施方案中，响应于低氧条件的EPO表达通过HIF1α来调节。本领域普通技术人员将了解本领域中已知的其它氧操纵培养条件可以用于本文所描述的细胞。
一方面，制剂含有特征在于生物响应(例如，EPO表达)于灌注条件的富集的产生EPO的哺乳动物细胞群。在一个实施方案中，灌注条件包括瞬时的、间歇的或连续的流体流动(灌注)。在一个实施方案中，当其中培养细胞的培养基以通过流动将动力转移至细胞这样一种方式间歇或连续循环或搅拌时机械诱导EPO表达。在一个实施方案中，受到瞬时的、间歇的或连续的流体流动的细胞以它们在为形成所述三维结构提供构架和/或间隙的材料之中或之上呈三维结构存在这样一种方式培养。在一个实施方案中，细胞在多孔珠粒上培养并且借助于摇床、轨道式平台或旋转烧瓶受到间歇的或连续的流体流动。在另一个实施方案中，细胞在三维支架上培养并且放入装置中，因此支架是固定的并且定向地流体流动通过或穿过支架。本领域普通技术人员将了解本领域中已知的其它灌注培养条件可以用于本文所描述的细胞。
细胞聚集体
在一个其它方面中，本公开的制剂含有细胞聚集体或球状体。在一个实施方案中，细胞聚集体包含本文所描述的生物活性细胞群。在另一个实施方案中，细胞聚集体包含生物活性肾细胞，例如像肾细胞混合物、富集的肾细胞群以及肾细胞级分的组合。
在某些实施方案中，本公开的生物活性肾细胞可以呈如本文进一步所描述的3D形式培养。在一些实施方案中，术语“类器官”是指具有与自体肾脏一致的表型和/或功能的细胞积聚。在一些实施方案中，类器官包含各种谱系的混合的细胞群，所述细胞群通常在给定的组织中在体内发现。在一些实施方案中，本公开的类器官通过任何方法在体外形成，因此本公开的细胞形成聚集体，所述聚集体反过来可以形成球状体、类器官或其组合。在一些实施方案中，所述聚集体、球状体或类器官采用与具体器官一致的结构。在一些实施方案中，所述聚集体、球状体或类器官表达通常由具体器官的细胞表达的表面标志物。在一些实施方案中，所述聚集体、球状体或类器官产生通常由具体器官的细胞表达的化合物或材料。在某些实施方案中，本公开的细胞可以在天然底物例如明胶上培养。在其它实施方案中，本公开的细胞可以在合成底物例如PGLA上培养。
非活性细胞群
如本文所描述，富集了生物活性组分和消耗了非活性或不希望的组分的异质肾细胞群的某些亚级分提供比起始群优越的治疗结果和再生结果。在优选的实施方案中，通过本公开提供的制剂含有消耗了B1和/或B5细胞群的细胞群。例如，以下物质可以被消耗B1和/或B5：B2、B3和B4(或B4’)中的两种或更多种的混合物；B2、B3和B4(或B4’)的富集的细胞群。
B1细胞群包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，其中细胞群具有小于约1.045g/m的浮力密度。B5细胞群由具有低粒度和活力的碎片和小细胞构成并且具有大于约1.091g/ml的浮力密度。
分离和培养细胞群的方法
一方面，本公开的制剂含有已经从肾脏组织中分离出来和/或培养的细胞群。本文提供了用于分开和分离肾细胞组分的方法，所述肾细胞组分例如将在用于治疗使用(包括治疗肾脏疾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷以及肾小球过滤缺陷)的制剂中使用的富集的细胞群。在一个实施方案中，细胞群从新鲜消化的(即，机械或酶促消化的)肾脏组织中分离出来或从哺乳动物肾脏细胞的异质体外培养物中分离出来。
制剂可以含有肾细胞的异质混合物，所述肾细胞的异质混合物在密度梯度上分离在B4(包括B4’)和B2和/或B3级分中提供增强的细胞分布和组成之前已经在低氧培养条件下培养。对于从患病和未患病的肾脏中分离出来的肾细胞观察到从B2中将氧依赖型细胞富集在B4中。不希望受理论约束，这可能由于以下现象的一种或多种：1)在低氧培养周期过程中特定细胞组分选择性存活、死亡或增殖；2)响应于低氧培养的细胞粒度和/或大小改变，因此影响密度梯度分离过程中的浮力密度和后续定位的改变；以及3)响应于低氧培养周期的细胞基因/蛋白质表达的改变，因此导致任何给定的梯度级分内的细胞的差异特征。因此，在一个实施方案中，制剂含有低氧抗性的富集了肾小管细胞的细胞群，例如B2。
用于分开和分离细胞群的示例性技术包括基于包含在目标群内的不同细胞类型的不同比重在密度梯度上分离。任何给定的细胞类型的比重可以通过细胞内的粒度程度、细胞内水体积以及其它因素来影响。一方面，本公开提供了用于在多个种类包括但不限于人、犬和啮齿动物上分离细胞制剂(例如，B2和B4，包括B4’)的最佳梯度条件。在一个优选的实施方案中，密度梯度用来获得来源于异质肾细胞群的新型富集的肾小管细胞级分群，即B2细胞群。在一个实施方案中，密度梯度用来获得来源于异质肾细胞群的新型富集的产生EPO的细胞级分群，即B4细胞群。在其它实施方案中，密度梯度用来获得富集的肾脏的肾小管细胞、肾小球细胞以及内皮细胞的亚群。在一个实施方案中，产生EPO的细胞和肾小管细胞分离自红细胞和细胞碎片。在一个实施方案中，产生EPO的细胞、肾小球细胞和血管细胞分离自其它细胞类型和分离自红细胞和细胞碎片，同时肾小管细胞和集合管细胞的亚群伴随地分离自其它细胞类型和分离自红细胞和细胞碎片。在一个其它实施方案中，内分泌细胞、肾小球细胞和/或血管细胞分离自其它细胞类型和分离自红细胞和细胞碎片，同时肾小管细胞和集合管细胞的亚群伴随地分离自其它细胞类型和分离自红细胞和细胞碎片。
一方面，本公开的制剂含有通过部分地使用基于以下描述的某些重要特征包含60％非离子碘化化合物碘克沙醇水溶液的(Axis-Shield)密度梯度培养基产生的细胞群。然而，本领域技术人员将认识到可以使用包括用于分离本公开的细胞群的必要特征的任何密度梯度或其它方法，例如使用本领域中已知的细胞表面标志物的免疫分离。本领域技术人员还应该认识到可以利用通过密度梯度(大小和粒度)有助于分离细胞亚群的相同细胞特征来通过流式细胞计量术(前向散射＝通过流式细胞计量术的大小反射，并且侧向散射＝粒度反射)分离细胞亚群。重要地，密度梯度培养基应该针对目标特定细胞具有低毒性。虽然密度梯度培养基应该针对目标特定细胞具有低毒性，本公开涵盖对目标细胞的选择过程起作用的梯度培养基的使用。不希望受理论约束，可看出由包含碘克沙醇的梯度回收的本文所公开的细胞群为碘克沙醇抗性的，如在负载和回收步骤之间存在细胞明显损失，从而表明在梯度条件下暴露于碘克沙醇导致某些细胞消除。在碘克沙醇梯度之后在特定带中出现的细胞对碘克沙醇和/或密度梯度暴露的任何不良作用有抗性。因此，还涵盖了对用于本文所描述的制剂的细胞群的分离和/或选择中的轻度至中度肾毒素的额外造影剂的使用。此外，密度梯度培养基还应该不结合人血浆中的蛋白质或不利地影响目标细胞的重要功能。
另一方面，本公开提供了含有使用荧光激活细胞分选(FACS)已经富集了和/或消耗了肾脏细胞类型的细胞群的制剂。在一个实施方案中，肾脏细胞类型可以使用BD FACSAriaTM或等效物来富集和/或消耗。
另一方面，制剂含有使用磁性细胞分选已经富集了和/或消耗了肾脏细胞类型的细胞群。在一个实施方案中，肾脏细胞类型可以使用Miltenyi系统或等效物来富集和/或消耗。
另一方面，制剂可以包括已经受到三维培养的肾细胞群。一方面，培养细胞群的方法为通过连续灌注。在一个实施方案中，当与静态培养的细胞群相比时，通过三维培养和连续灌注培养的细胞群显示更大的细胞性和互连性。在另一个实施方案中，当与所述细胞群的静态培养物相比时，通过三维培养和连续灌注培养的细胞群显示更大的EPO表达以及增强的肾小管相关基因如上皮细胞钙粘蛋白的表达。在另一个实施方案中，与静态培养的细胞群相比，通过连续灌注培养的细胞群显示更大的葡萄糖和谷氨酰胺消耗水平。
如本文所描述，低氧或含氧量低的条件可以在制备用于提供用于本文的制剂的细胞群的方法中使用。然而，制备细胞群的方法可以在不需要低氧调节的步骤情况下使用。在一个实施方案中，可以使用含氧量正常的条件。
本领域普通技术人员将了解本领域中已知的其它分离和培养的方法可以用于本文所描述的细胞。
3.生物材料
各种生物材料可以与活性剂组合以提供本公开的治疗制剂。生物材料可以呈任何适合的形状(例如，珠粒)或形式(例如，液体、凝胶等)。如在Bertram等美国公布申请20070276507(以引用的方式整体并入本文)中所描述，聚合物基质或支架可以被成形为任何数目的希望的构型以满足任何数目的总体系统、几何或空间限制。在一个实施方案中，本公开的基质或支架可为三维的并且被成形为符合器官或组织结构的尺寸和形状。例如，在使用聚合物支架用于治疗肾脏疾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷中，可以使用三维(3-D)基质。可以使用各种不同形状的3-D支架。自然地，聚合物基质可以被成形具有不同大小并且成形为符合具有不同大小的患者。聚合物基质还可以用其它方式被成形为适应患者的特殊需求。在另一个实施方案中，聚合物基质或支架可为生物相容的多孔聚合物支架。支架可以由各种合成材料或天然存在的材料形成，包括但不限于开孔聚乳酸纤维素醚、纤维素、纤维素酯、氟化聚乙烯、酚、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并噁唑、聚碳酸酯、聚氰基芳基醚、聚酯、聚酯碳酸酯、聚醚、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚醚酮、聚醚砜、聚乙烯、聚氟烯烃、聚酰亚胺、聚烯烃、聚噁二唑、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、聚硫化物、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚氨酯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、再生纤维素、硅酮、脲甲醛、胶原、明胶、藻酸盐、层粘连蛋白、纤连蛋白、蚕丝、弹力蛋白、藻酸盐、透明质酸、琼脂糖或其共聚物或物理共混物。支架构型可以在液体混悬液至柔软的多孔支架至刚性形状固定的多孔支架范围内。在一个实施方案中，构型为能够变成水凝胶的溶液的液体形式。
水凝胶可以由各种聚合物材料形成并且有用于各种生物医学应用。水凝胶可以被物理描述为亲水聚合物的三维网络。取决于水凝胶的类型，它们含有不同百分率的水，但总体上不溶解于水。尽管它们的含水量高，但由于存在亲水残基水凝胶能够额外地结合大量的液体。水凝胶在不改变其胶状结构的情况下大幅度溶胀。根据所使用的聚合物的性质和产品的额外专门仪器，可以确切地修改水凝胶的基本物理特征。
优选地，水凝胶由生物惰性和与哺乳动物组织生理相容的聚合物、生物来源的材料、合成来源的材料或其组合制成。水凝胶材料优选地不诱导炎性反应。可以用来形成水凝胶的其它材料的实例包括(a)改性的藻酸盐、(b)通过暴露于一价阳离子而成凝胶的多糖(例如吉兰糖胶和角叉菜胶)、(c)作为非常粘的液体或为触变型并且通过结构的缓慢演化随时间推移形成凝胶的多糖(例如，透明质酸)、(d)明胶或胶原以及(e)聚合物水凝胶前体(例如，聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物和蛋白质)。美国专利号6,224,893B1提供了适合用于制备水凝胶的各种聚合物和所述聚合物的化学性质的详细描述。
支架或生物材料特征可以使得细胞能够附着支架或生物材料并且与支架或生物材料相互作用，和/或可以提供细胞可以被捕获到其中的多孔间隙。在一个实施方案中，多孔支架或生物材料允许细胞的一个或多个群或混合物添加或沉积在呈多孔支架构造的生物材料上(例如，通过细胞附着)和/或支架的孔隙内(例如，通过细胞捕获)。在另一个实施方案中，支架或生物材料允许或促进支架内的细胞与细胞和/或细胞与生物材料的相互作用以形成如本文所描述的构建体。
在一个实施方案中，生物材料由呈水凝胶形式的透明质酸(HA)构成，所述水凝胶形式包含大小在5.1kDA至>2×106kDa范围内的HA分子。在另一个实施方案中，生物材料由呈多孔泡沫形式的透明质酸构成，所述多孔泡沫形式也包含大小在5.1kDA至>2×106kDa范围内的HA分子。在另一个实施方案中，生物材料由基于聚乳酸(PLA)的泡沫构成，所述泡沫具有开孔结构并且孔隙大小为约50微米至约300微米。在另一个实施方案中，特定细胞群(优选地B2而且B4)直接提供和/或通过透明质酸合酶-2(HAS-2)刺激合成高分子量透明质酸，尤其在肾内植入之后。
本文所描述的生物材料还可以被设计或调适成响应于某些外部条件，例如体外或体内。在一个实施方案中，生物材料为温度敏感性的(例如，体外或体内)。在另一个实施方案中，生物材料被调适成响应于暴露在酶促降解中(例如，体外或体内)。生物材料对外部条件的响应可为如本文所描述的微调的。所描述的制剂的温度敏感性可以通过调节生物材料在制剂中的百分率来改变。例如，明胶在溶液中的百分率可以被调适成调节最终制剂(例如，液体、凝胶、珠粒等)中的明胶的温度敏感性。或者，生物材料可以被化学交联以提供对酶促降解的更大抗性。例如，碳二亚胺交联剂可以用来化学交联明胶珠粒从而提供减小的对内源性酶的易感性。
一方面，由生物材料产生的对外部条件的反应涉及失去生物材料的结构完整性。虽然以上提供了对酶促降解的温度敏感性和抗性，但在不同生物材料中存在可以发生失去材料完整性的其它机制。这些机制可以包括但不限于热力学(例如，相转变如溶解、扩散(例如，使离子交联剂从生物材料扩散到周围组织中))、化学、酶促、pH(例如，对pH敏感的脂质体)、超声以及对光不稳(光穿透)。生物材料失去结构完整性的确切机制将改变，但通常在植入时或植入后触发机制。
本领域普通技术人员将了解本领域中已知的其它类型的合成材料或天然存在的材料可以用来形成本文所描述的支架。
一方面，本文所描述的构建体由以上提到的支架或生物材料制成。
4.构建体
一方面，本公开提供了含有可植入构建体的制剂，所述可植入构建体具有用于在有需要的受试者中治疗肾脏疾病、贫血或EPO缺乏的本文所描述的一个或多个细胞群。在一个实施方案中，构建体由生物相容材料或生物材料、支架或基质构成，所述支架或基质基本上由一种或多种合成的或天然存在的生物相容材料和通过附着和/或捕获沉积在支架表面上或包埋于支架表面中的本文所描述的一个或多个细胞群或细胞的混合物组成。在某些实施方案中，构建体由生物材料和本文所描述的一个或多个细胞群或细胞的混合物构成，所述一个或多个细胞群或细胞的混合物涂覆有生物材料组分、沉积于生物材料组分上、沉积于生物材料组分中、附着至生物材料组分上、捕获于生物材料组分中、包埋于生物材料组分中、接种有生物材料组分或与生物材料组分组合。本文所描述的任何细胞群(包括富集的细胞群或其混合物)可以与基质组合使用以形成构建体。
一方面，制剂含有由如本文所描述的被设计或调适成响应于外部条件的生物材料构成的构建体。因此，细胞群与构建体中的生物材料的缔合性质将取决于外部条件而变化。例如，细胞群与温度敏感性生物材料的缔合随着温度而改变。在一个实施方案中，构建体含有细胞群和在约8℃或更低具有大体上固态并且在约环境温度或以上具有大体上液态的生物材料，其中在约8℃或更低时细胞群悬浮于生物材料中。
然而，在约环境温度或以上时细胞群大体上自由移动穿过生物材料体积。与流体中的细胞相比，在较低温度下使细胞群悬浮于大体上固相为细胞(如为贴壁依赖性细胞)提供稳定性优点。此外，使细胞悬浮于大体上固态提供了一个或多个以下益处：i)防止细胞沉降；ii)允许细胞呈悬浮状态保持锚定至生物材料上；iii)允许细胞保持更均匀地分散在整个生物材料体积中；iv)防止细胞聚集体形成；以及v)在制剂的储存和运输过程中为细胞提供更好的保护。可以在施用至受试者之前保留所述特征的制剂是有利的，至少因为制剂中的细胞的总体健康将更好并且将施用更均匀且一致的剂量的细胞。
在另一个实施方案中，构建体的沉积的细胞群或细胞组分为富集了氧可调的产生EPO的细胞的第一肾脏细胞群。在另一个实施方案中，第一肾脏细胞群含有除了氧可调的产生EPO的细胞之外的肾小球细胞和血管细胞。在一个实施方案中，第一肾脏细胞群为B4’细胞群。在一个其它实施方案中，构建体的沉积的细胞群或细胞组分包括第一富集的肾细胞群和第二肾细胞群。在一些实施方案中，第二细胞群没有富集氧可调的产生EPO的细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞并且含有集合管上皮细胞。在其它实施方案中，肾小管细胞特征在于表达一个或多个肾小管细胞标志物，所述肾小管细胞标志物可以包括但不限于巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17成员RAS癌基因家族(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含有FXYD结构域的离子转运调节因子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换因子)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)以及钙蛋白酶-8(Capn8)。
在一个实施方案中，沉积在生物材料或支架上或与生物材料或支架组合以形成构建体的细胞群来源于各种来源，如自体来源。非自体来源也适合于使用，包括但不限于同种异体的、同基因的(自体的或等基因的)来源。
本领域普通技术人员将了解存在数种用于沉积或以另外的方式使细胞群与生物材料组合以形成构建体的适合的方法。
一方面，构建体适合用于在本文所描述的使用方法中使用。在一个实施方案中，构建体适合用于施用至有治疗任何病因的肾脏疾病、贫血或任何病因的EPO缺乏需要的受试者。在其它实施方案中，构建体适合用于施用至有改善或恢复红细胞稳态需要的受试者。在另一个实施方案中，构建体适合用于施用至有改进的肾脏功能需要的受试者。
在另一个方面中，本公开提供了用于植入到有改进的肾脏功能需要的受试者中的构建体，所述构建体包含：a)包含一种或多种生物相容合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽的生物材料；以及b)包含第一细胞群B2和第二细胞群B4’的来源于患有肾脏疾病的受试者的哺乳动物肾细胞的混合物，所述第一细胞群B2包含密度为1.045g/mL与1.052g/mL之间的分离的、富集的肾小管细胞群，所述第二细胞群B4’包含密度为1.063g/mL与1.091g/mL之间的产生促红细胞生成素(EPO)的细胞和血管细胞但消耗了肾小球细胞，所述第二第二细胞群B4’涂覆有生物材料、沉积在生物材料之上或之中、捕获于生物材料中、悬浮于生物材料中、包埋于生物材料中和/或以另外的方式与生物材料组合。在某些实施方案中，混合物不包括B1细胞群或B5细胞群，所述B1细胞群包含密度为<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，所述B5细胞群包含密度>1.091g/ml的具有低粒度和活力的碎片和小细胞。
在一个实施方案中，构建体包括特征在于表达血管标志物的B4’细胞群。在一些实施方案中，B4’细胞群特征不在于表达肾小球标志物。在某些实施方案中，混合物能够进行氧可调的促红细胞生成素(EPO)表达。在所有实施方案中，混合物可以来源于哺乳动物肾脏组织或培养的肾脏细胞。
在一个实施方案中，构建体包括呈适合用于捕获和/或附着混合物的三维(3-D)多孔生物材料构造的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括呈适合用于包埋、附着、悬浮或涂覆哺乳动物细胞的液体或半液体凝胶构造的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括被构造由呈水凝胶形式的透明质酸(HA)的主要高分子量物质构成的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括由呈多孔泡沫形式的透明质酸的主要高分子量物质构成的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括由孔隙为约50微米至约300微米之间的基于聚乳酸的泡沫构成的生物材料。在还另一个实施方案中，构建体包括一个或多个细胞群，所述细胞群可以来源于对有改进的肾脏功能需要的受试者而言自体的肾脏样品。在某些实施方案中，样品为肾脏活检物。在一些实施方案中，受试者患有肾脏疾病。在又其它实施方案中，细胞群来源于非自体肾脏样品。在一个实施方案中，构建体提供红细胞稳态。
5.肾细胞的表型表征
在过程中的任何阶段分离的细胞可以特征在于其表型。在一个实施方案中，细胞为已经富集的异质肾细胞群。在一个另外的实施方案中，富集的异质肾细胞群已经在低氧条件下被培养至少24小时。在一个又另外的实施方案中，富集的异质肾细胞群已经受到密度梯度。
可以通过许多方法(许多方法为本领域中已知的并且被熟练技术人员所理解)来分析样品中各种生物标志物的存在(例如，表达)和/或水平/量，所述方法包括但不限于免疫组织化学(“IHC”)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定、ELISA、ELIFA、荧光激活细胞分选(“FACS”)、MassARRAY、蛋白质组学、生物化学酶促活性测定、原位杂交、DNA印迹分析、RNA印迹分析、全基因组测序、聚合酶链反应(“PCR”)(包括定量实时PCR(“qRT-PCR”)以及其它扩增类型检测方法，例如像支链DNA、SISBA、TMA等)、RNA-Seq、FISH、微阵列分析、基因表达谱分析和/或基因表达系列分析(“SAGE”)以及可以由蛋白质、基因和/或组织阵列分析进行的各种各样测定中的任一种。用于评估基因和基因产物的状态的通常方案例如见于Ausubel等编著,1995,Current Protocols In Molecular Biology,第2单元(RNA印迹法),第4单元(DNA印迹法),第15单元(免疫印迹法)和第18单元(PCR分析)中。还可以使用如从Rules Based Medicine或Meso Scale Discovery中可获得的那些多重免疫测定。
一方面，提供了检测异质肾细胞样品中两种或更多种生物标志物存在的方法，方法包括在容许抗体结合其同源配体(即，生物标志物)的条件下使样品与涉及生物标志物的抗体接触，并且例如通过检测在抗体与生物标志物之间是否形成复合物来检测结合的抗体存在。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物的存在的检测为通过免疫组织化学。
在某些实施方案中，本文所提供的任何抗体有用于检测异质肾细胞样品中生物标志物的存在。如本文所使用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含SRC样品。
在某些实施方案中，异质肾细胞使用允许检测生物标志物的一种或多种试剂来鉴定，所述生物标志物选自AQP1、AQP2、AQP4、钙结合蛋白、钙调节蛋白、CD117、CD133、CD146、CD24、CD31(PECAM-1)、CD54(ICAM-1)、CD73、CK18、CK19、CK40至CK67、CK7、CK8、CK8/18、CK8/18/19、连接蛋白43、Cubilin、CXCR4(融合素)、DBA、E-钙粘蛋白(CD324)、EPO(促红细胞生成素)、GGT1、GLEPP1(肾小球上皮蛋白1)、结合球蛋白、Itgb1(整联蛋白β1)、KIM-1/TIM-1(肾脏损伤分子-1/含T-细胞免疫球蛋白和粘蛋白的分子)、MAP-2(微管相关蛋白2)、巨蛋白、N-钙粘蛋白、肾小球足细胞特异性蛋白、NKCC(Na-K-Cl-协同转运蛋白)、OAT-1(有机阴离子转运蛋白1)、骨桥蛋白、Pan-钙粘蛋白、PCLP1(足细胞蛋白样1分子)、肾小球足细胞裂隙膜蛋白、SMA(平滑肌α-肌动蛋白)、突触极蛋白、THP(塔霍二氏蛋白)、波形蛋白以及αGST-1(α谷胱甘肽S-转移酶)。在某些实施方案中，通过单克隆抗体或多克隆抗体来检测生物标志物。
在一个实施方案中，可检测的标记包含放射性原子以形成放射缀合物。各种放射性同位素可供用于产生放射缀合物。实例包括211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb以及Lu的放射性同位素。当放射缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁法研究的放射性原子，例如99Tc-m(亚稳的同核异构体)或123I；或用于核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，mri)的自旋标记，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
在一次测试中使用多于一个可检测标记(包括染料)的情况下，优选的是选择可检测标记以使得每个标记可以被单独地检测而没有实质上干扰存在于样品中的任何其它可检测信号。例如，可检测标记(包括染料)可为在检测条件下显示不同颜色的不同荧光分子。
可以通过任何适合的方法，例如基于免疫荧光显微术、流式细胞计量术、光纤扫描细胞计量术或激光扫描细胞计量术的那些方法来进行检测。
在一些实施方案中，通过评估细胞中的mRNA来确定细胞中的生物标志物的表达。用于评估细胞中的mRNA的方法为众所周知的并且包括例如使用互补DNA探针的杂交测定(如使用特异于一个或多个基因的标记的核糖探针的原位杂交、RNA印迹法以及相关技术)和各种核酸扩增测定(如使用特异于一个或多个基因的互补引物的RT-PCR和其它扩增类型检测方法，例如像支链DNA、SISBA、TMA等)。在一些实施方案中，将测试样品中的生物标志物的表达与参比样品相比。例如，测试样品可为患病组织样品并且参比样品可以来自正常组织。
可以使用RNA斑点印迹法或PCR分析方便地测定来自哺乳动物的样品的mRNA。另外，所述方法可以包括允许人们确定生物样品中的靶mRNA水平的一个或多个步骤(例如，通过同时检验“管家”基因如肌动蛋白家族成员的比较对照mRNA序列水平)。任选地，可以确定扩增的靶cDNA的序列。
任选的方法包括通过微阵列技术检验或检测组织或细胞样品中的mRNA如靶mRNA的方案。使用核酸微阵列，来自测试和对照样品的测试和对照mRNA样品被逆转录并且标记以产生cDNA探针。然后将探针与固定在固体载体上的核酸阵列杂交。阵列被构造以使得阵列的每个成员的序列和位置为已知的。例如，其表达与能够诱发再生反应的细胞群相关的基因选择可以被排列于固体载体上。标记的探针与具体阵列成员的杂交指示探针来源于其中的样品表达所述基因。
根据一些实施方案，通过观察前面提到的基因的蛋白质表达水平来测量存在和/或水平/量。在某些实施方案中，所述方法包括在容许结合生物标志物的条件下使生物样品与针对本文所描述的生物标志物的抗体接触，并且检测抗体与生物标志物之间是否形成复合物。
在某些实施方案中，使用IHC和染色方案检验样品中生物标志物蛋白质的存在和/或水平/量。已经显示细胞IHC染色为确定或检测样品中的蛋白质存在的可靠方法。一方面，使用一种方法来确定生物标志物水平，所述方法包括：(a)使用抗体进行样品(如肾细胞样品)的IHC分析；以及b)确定样品中的生物标志物水平。在一些实施方案中，相对于参考值确定IHC染色强度。
可以与额外的技术如形态染色和/或荧光原位杂交组合来进行IHC。两种IHC一般方法可供使用；直接测定和间接测定。根据第一种测定，直接确定抗体与靶抗原的结合。这种直接测定使用了标记的试剂，如荧光标签或酶标记的一级抗体，所述标记的试剂可以在不需要进一步抗体相互作用的情况下可视化。在通常的间接测定中，未缀合的一级抗体与抗原结合并且然后标记的二级抗体与一级抗体结合。在二级抗体被缀合至酶促标记时，添加生色底物或荧光底物以提供抗原的可视化。信号扩增因为数个二级抗体可以与一级抗体上的不同表位反应而发生。
用于IHC的一级和/或二级抗体通常将用可检测的部分标记。许多标记为可供使用的，所述标记一般可以被分成以下几类：(a)放射性同位素，如35S、14C、125I、3H和131I；(b)胶体金颗粒；(c)荧光标记，包括但不限于稀土金属螯合物(铕螯合物)、德克萨斯红、罗丹明、荧光素、单酰、丽丝胺、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白或商业上可获得的荧光团如SPECTRUM ORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或以上任何一种或多种的衍生物；(d)各种酶底物标志物可供使用并且美国专利号4,275,149提供了这些中的一些的综述。酶促标记的实例包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。
酶底物组合的实例包括例如辣根过氧化物酶(HRP)与过氧化氢酶作为底物；碱性磷酸酶(AP)与对硝基苯磷酸酯作为生色底物；以及β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如，对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物(例如，4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶)。对于这些的一般综述，参见美国专利号4,275,149和4,318,980。
在一个示例性方法中，可以在足够形成抗体-生物标志物复合物的条件下使样品与特异于生物标志物的抗体接触，并且然后检测复合物。可以采用许多方式来检测生物标志物的存在，如通过用于测定各种各样组织和样品(包括血浆或血清)的蛋白质印迹法和ELISA工序。使用这样一种测定形式的广范围的免疫测定技术为可供使用的，参见例如美国专利号4,016,043、4,424,279和4,018,653。这些包括非竞争类型以及在传统竞争结合测定中的单位测定和双位测定或“夹心”测定。这些测定还包括检测标记的抗体与靶生物标志物的结合。
组织或细胞样品中的选择的生物标志物的存在和/或水平/量还可以通过功能测定或基于活性的测定方式来检验。例如，如果生物标志物为酶，人们可以进行本领域中已知的测定来确定或检测组织或细胞样品中的给定的酶促活性的存在。
在某些实施方案中，针对所测定的生物标志物的量的差异和所使用的样品的品质可变性以及测定运行之间的可变性对样品归一化。所述归一化可以通过检测和结合某些归一化的生物标志物(包括众所周知的管家基因如ACTB)的水平来完成。或者，归一化可以基于所有测定的基因或其较大的子集的平均或中值信号(全面归一化方法)。在基因对基因(gene-by-gene)的基础上，将存在于参比集中的量与测量的归一化的受试者肿瘤mRNA或蛋白质的量比较。对于每个受试者的每个测试的肿瘤的每种mRNA或蛋白质的归一化的表达水平可以被表示为在参比集中测量的表达水平的百分率。在待分析的具体受试者样品中测量的存在和/或表达水平/量将落在可以通过本领域中众所周知的方法来确定的一定范围内的某个百分位数上。
在实施方案中，细胞角蛋白选自CK8、CK18、CK19以及其组合。在某些实施方案中，细胞角蛋白为CK8、CK18、CK19、CK8/CK18、CK8/CK19、CK18/CK19或CK8/CK18/CK19，其中“/”是指与其相邻的细胞角蛋白的组合。在所有实施方案中，细胞角蛋白具有大于约80％、约85％、约90％或约95％的表达水平。
在实施方案中，GGT为GGT-1。在所有实施方案中，GGT具有大于约10％、约15％、约18％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％的表达水平。
6.使用方法
另一方面，本公开的制剂可以被施用用于治疗疾病。例如，生物活性细胞可以被施用至自体器官作为本文所描述的制剂的一部分。在一个实施方案中，生物活性细胞可以源自作为施用的受试者的自体器官或来自并非靶自体器官的来源。
一方面，本公开提供了用于在有制剂需要的受试者中治疗肾脏疾病、贫血或EPO缺乏的方法，所述制剂含有本文所描述的肾脏细胞群和肾脏细胞的混合物。在一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用含有组合物的制剂，所述组合物包括富集了产生EPO的细胞的第一肾脏细胞群。在另一个实施方案中，第一细胞群富集产生EPO的细胞、肾小球细胞以及血管细胞。在一个实施方案中，第一肾脏细胞群为B4’细胞群。在另一个实施方案中，组合物可以还包括一个或多个额外的肾脏细胞群。在一个实施方案中，额外的细胞群为没有富集产生EPO的细胞的第二细胞群。在另一个实施方案中，额外的细胞群为没有富集产生EPO的细胞、肾小球细胞或血管细胞的第二细胞群。在另一个实施方案中，组合物还包括沉积于生物材料中、沉积于生物材料上、包埋于生物材料中、涂覆有生物材料、悬浮于生物材料中或捕获于生物材料中以形成如本文所描述的用于治疗本文所描述的疾病或病症的可植入构建体的肾脏细胞群或肾脏细胞的混合物。在一个实施方案中，细胞群被单独地或与其它细胞或生物材料(例如，水凝胶、多孔支架或天然的或合成的肽或蛋白质)组合使用以刺激急性或慢性疾病状态中的再生。
另一方面，通过本文所公开的方法对受试者中的肾脏疾病的有效治疗可以通过红细胞生成和/或肾脏功能的各种指标来观察。在一个实施方案中，红细胞稳态的指标包括但不限于血细胞比容(HCT)、血红蛋白(HB)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、红细胞计数(RBC)、网织红细胞数目、网织红细胞％、平均红细胞体积(MCV)以及红细胞分布宽度(RDW)。在一个其它实施方案中，肾脏功能的指标包括但不限于血清白蛋白、白蛋白与球蛋白比率(A/G比率)、血清磷、血清钠、肾脏大小(通过超声可测量的)、血清钙、磷与钙比率、血清钾、蛋白尿、尿肌酐、血清肌酐、血液尿素氮(BUN)、胆固醇水平、甘油三酯水平以及肾小球过滤率(GFR)。此外，一般健康和康乐的若干指标包括但不限于体重增加或减轻、存活、血压(平均全身血压、舒张压或收缩压)以及身体耐力性能。
在另一个实施方案中，通过稳定肾脏功能的一个或多个指标来证明使用生物活性肾细胞制剂的有效治疗。通过与尚未经过本文的方法治疗的受试者中的相同指标比较观察到经过提供用于本文的方法治疗的受试者中的指标变化来表现肾脏功能的稳定。或者，可以通过与治疗之前的相同受试者中的相同指标比较观察到经过本文的方法治疗的受试者中的指标变化来表现肾脏功能的稳定。第一指标的变化可为数值增加或减小。在一个实施方案中，由本公开提供的治疗可以包括使受试者中的血液尿素氮(BUN)水平稳定，其中在受试者中观察到的BUN水平与患有类似疾病状态、尚未经过本公开的方法治疗的受试者相比更低。在一个其它实施方案中，治疗可以包括使受试者中的血清肌酐水平稳定，其中在受试者中观察到的血清肌酐水平与患有类似疾病状态、尚未经过本公开的方法治疗的受试者相比更低。在另一个实施方案中，治疗可以包括使受试者中的血细胞比容(HCT)水平稳定，其中在受试者中观察到的HCT水平与患有类似疾病状态、尚未经过本公开的方法治疗的受试者相比更高。在另一个实施方案中，治疗可以包括使受试者中的红细胞(RBC)水平稳定，其中在受试者中观察到的RBC水平与患有类似疾病状态、尚未经过本公开的方法治疗的受试者相比更高。本领域普通技术人员将了解本文所描述的或本领域中已知的一种或多种额外的指标可以被测量以确定对受试者中的肾脏疾病的有效治疗。
另一方面，本公开涉及用于在受试者中提供红细胞稳态的方法的制剂。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)向受试者施用制剂，所述制剂含有如本文所描述的肾细胞群(例如B2或B4’)或肾细胞的混合物(例如，B2/B4’和/或B2/B3)或富集的肾细胞群；以及(b)相对于对照中的指标水平，在来自受试者的生物样品中确定红细胞生成指标的水平为不同的，其中指标水平的差异(i)指示受试者响应于施用步骤(a)或(ii)指示受试者中的红细胞稳态。在另一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)向受试者施用制剂，所述制剂包含如本文所描述的肾细胞群或肾细胞的混合物；以及(b)相对于对照中的指标水平，在来自受试者的生物样品中确定红细胞生成指标的水平为不同的，其中指标水平的差异(i)指示受试者响应于施用步骤(a)或(ii)指示受试者中的红细胞稳态。在另一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)提供生物材料或生物相容聚合物支架；(b)以本文所描述的方式将本公开的肾细胞群或肾细胞混合物沉积于生物材料或支架之上或之内以形成可植入构建体；(c)制备含有构建体的制剂；(d)将构建体植入到受试者中；以及(e)相对于对照中的指标水平，在来自受试者的生物样品中确定红细胞生成指标的水平为不同的，其中指标水平的差异(i)指示受试者响应于施用步骤(a)或(ii)指示受试者中的红细胞稳态。
另一方面，本公开涉及用于为有需要的受试者提供肾脏功能稳定和红细胞稳态恢复的方法的制剂，所述受试者患有肾脏功能缺陷和贫血和/或EPO缺乏。在一个实施方案中，所述方法包括施用含有如本文所描述的肾细胞群或肾细胞混合物的制剂的步骤，所述肾细胞群或肾细胞混合物含有以下细胞类型中的至少一种：肾小管来源的细胞、肾小球来源的细胞、间质来源的细胞、集合管来源的细胞、基质组织来源的细胞或来源于脉管系统的细胞。在另一个实施方案中，群或混合物含有产生EPO的细胞和肾小管上皮细胞，肾小管细胞已经通过以下标志物中的至少一种来鉴定：巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17成员RAS癌基因家族(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含有FXYD结构域的离子转运调节因子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换因子)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)以及钙蛋白酶-8(Capn8)。在这个实施方案中，将通过与未治疗的受试者或与受试者的治疗前指标相比肾脏功能的至少一种指标改进伴随红细胞生成的至少一种指标改进来表现对受试者的治疗。
一方面，本公开提供了通过施用如本文所描述的富集了产生EPO的细胞的肾细胞群或含有富集了产生EPO的细胞的细胞群的肾细胞混合物用于以下方法的制剂：(i)治疗肾脏疾病、贫血或EPO缺乏；(ii)稳定肾脏功能；(iii)恢复红细胞稳态或(iv)其任何组合，其中施用的有益作用比施用没有富集产生EPO的细胞的细胞群的作用更大。在另一个实施方案中，富集的细胞群提供了改进水平的血清血液尿素氮(BUN)。在另一个实施方案中，富集的细胞群提供了改进的蛋白质在血清中的保留。在另一个实施方案中，富集的细胞群提供了改进水平的血清胆固醇和/或甘油三酯。在另一个实施方案中，富集的细胞群提供了改进水平的维生素D。在一个实施方案中，与未富集的细胞群相比，富集的细胞群提供了改进的磷与钙比率。在另一个实施方案中，与未富集的细胞群相比，富集的细胞群提供了改进水平的血红蛋白。在一个另外实施方案中，与未富集的细胞群相比，富集的细胞群提供了改进水平的血清肌酐。在另一个实施方案中，与未富集的细胞群相比，富集的细胞群提供了改进水平的血细胞比容。在一个另外实施方案中，与未富集的细胞群相比，富集的细胞群提供了改进水平的红细胞数目(RBC#)。在一个实施方案中，使改进水平的血细胞比容恢复至95％正常健康水平。在一个另外实施方案中，与未富集的细胞群相比，富集的细胞群提供了改进的网织红细胞数目。在其它实施方案中，与未富集的细胞群相比，富集的细胞群提供了改进的网织红细胞百分率。在又其它实施方案中，与未富集的细胞群相比，富集的细胞群提供了改进水平的红细胞体积分布宽度(RDW)。在另一个实施方案中，与未富集的细胞群相比，富集的细胞群提供了改进水平的血红蛋白。在另一个实施方案中，富集的细胞群在骨髓中提供红细胞生成反应，以使得髓细胞性接近正常并且髓样细胞与红细胞样细胞比率接近正常。
另一方面，本公开提供了通过施用富集的细胞群用于以下方法的制剂：(i)治疗肾脏疾病、贫血或EPO缺乏；(ii)稳定肾脏功能；(iii)恢复红细胞稳态；或(iv)其任何组合，其中施用本文所描述的肾细胞群或肾细胞群混合物的有益作用特征在于当与施用重组EPO(rEPO)所提供的有益作用相比时红细胞稳态改进。在一个实施方案中，与施用重组EPO蛋白相比时，在施用至有需要的受试者时群或混合物提供改进的红细胞稳态(如通过血细胞比容、血红蛋白或RBC#所确定)。在一个实施方案中，与重组EPO相比，群或混合物在施用时提供比对照中的血细胞比容低或高不大于约10％的改进水平的血细胞比容、RBC或血红蛋白。在一个另外实施方案中，单一剂量或递送的群或混合物在施用时在治疗的受试者中提供红细胞稳态改进(如通过血细胞比容、血红蛋白或RBC#增加所确定)持续一段时间，所述时段明显超过单一剂量或递送的重组EPO蛋白提供红细胞稳态改进的时段。在另一个实施方案中，群或混合物在本文所描述的剂量下施用时不引起比匹配的健康对照中的正常水平大约110％的血细胞比容、血红蛋白或RBC#。在一个另外实施方案中，与在本文所描述的剂量下递送的重组EPO蛋白相比，群或混合物在本文所描述的剂量下施用时提供优越的红细胞稳态(如通过血细胞比容、血红蛋白或RBC#所确定)。在另一个实施方案中，在约100IU/kg、约200IU/kg、约300IU/kg、约400IU/kg或约500IU/kg的剂量下递送重组EPO。本领域普通技术人员将了解本领域中已知的重组EPO的其它剂量可为适合的。
本公开的另一个实施方案涉及含有至少一个细胞群(包括本文所描述的富集的细胞群或其混合物，或本文所描述的可植入构建体、或如本文所描述的分泌的产物)的制剂用于制备用来在有需要的受试者中治疗肾脏疾病、贫血或EPO缺乏、在有需要的受试者中提供红细胞稳态、在有需要的受试者中改进肾脏功能或为自体肾脏提供再生作用的药剂的用途。
本公开的另一个实施方案涉及基于具体证实的治疗属性选择特定细胞亚群的用于治疗特定病因的肾脏疾病的含有特定富集的细胞群(本文所描述的)的制剂。
在另一个方面中，本公开提供了用于在有需要的受试者中治疗肾脏疾病的方法的制剂，所述方法包括：向受试者施用包含哺乳动物肾细胞的混合物的制剂，所述哺乳动物肾细胞混合物包含第一细胞群B2和第二细胞群B4’，所述第一细胞群B2包含密度为1.045g/mL与1.052g/mL之间的分离的、富集的肾小管细胞群，所述第二细胞群B4’包含密度为约1.063g/mL与1.091g/mL之间的产生促红细胞生成素(EPO)的细胞和血管细胞但消耗肾小球细胞，其中混合物不包括B1细胞群或B5细胞群，所述B1细胞群包含密度为<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，所述B5细胞群包含密度为>1.091g/ml的具有低粒度和活力的碎片和小细胞。在某些实施方案中，所述方法包括相对于对照中的指标水平，在来自受试者的测试样品中确定肾脏功能指标的水平为不同的，其中指标水平的差异指示受试者中的一种或多种肾脏功能的衰退减少、稳定或改进。在一个实施方案中，在方法中使用的B4’细胞群特征在于表达血管标志物。在某些实施方案中，在方法中使用的B4’细胞群特征不在于表达肾小球标志物。在一个实施方案中，在方法中使用的细胞混合物能够进行氧可调的促红细胞生成素(EPO)表达。在某些实施方案中，待经过本公开的方法治疗的肾脏疾病伴随有促红细胞生成素(EPO)缺少。在某些实施方案中，EPO缺乏为贫血。在一些实施方案中，在受试者中EPO缺乏或贫血次发于肾衰竭。在一些其它实施方案中，EPO缺乏或贫血次发于选自由以下组成的组的病症：慢性肾衰竭、原发性EPO缺乏、化学疗法或抗病毒疗法、非骨髓性癌、HIV感染、肝脏疾病、心脏衰竭、类风湿性关节炎或多器官系统衰竭。在某些实施方案中，在方法中使用的组合物还包含生物材料，所述生物材料包含一种或多种生物相容合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽，其中混合物涂覆有生物材料、沉积于生物材料之上或之中、捕获于生物材料中、悬浮于生物材料中、包埋于生物材料中和/或以另外的方式与生物材料组合。在某些实施方案中，在本公开的制剂中使用的混合物来源于哺乳动物肾脏组织或培养的哺乳动物肾脏细胞。在其它实施方案中，混合物来源于对有需要的受试者而言自体的肾脏样品。在一个实施方案中，样品为肾脏活检物。在其它实施方案中，制剂含有来源于非自体肾脏样品的混合物。
在另一个方面中，本公开提供了含有本文所描述的细胞制剂和混合物或本公开的可植入构建体的制剂用于制备有用于在有需要的受试者中治疗肾脏疾病、贫血或EPO缺乏的药剂的用途。
另一方面，本公开提供了在用于在有需要的受试者中再生自体肾脏的方法中使用的制剂。在一个实施方案中，所述方法包括将本文所描述的细胞群、混合物或构建体施用或植入至受试者的步骤。再生自体肾脏可以特征在于许多指标，包括但不限于发展自体肾脏中的功能或能力、改进自体肾脏中的功能或能力以及表达自体肾脏中的某些标志物。在一个实施方案中，发展的或改进的功能或能力可以基于上述的红细胞稳态和肾脏功能的各种指标来观察。在另一个实施方案中，再生肾脏特征在于差异表达一个或多个干细胞标志物。干细胞标志物可为以下的一种或多种：SRY(性别决定区Y)-box 2(Sox2)；未分化的胚胎细胞转录因子(UTF1)；来自小鼠的结节同系物(NODAL)；凸素(Prominin)1(PROM1)或CD133(CD133)；CD24以及其任何组合(参见Ilagan等PCT/US2011/036347，所述专利以引用的方式整体并入本文)。在另一个实施方案中，与对照相比，干细胞标志物的表达被上调。
本文所描述的细胞群(包括富集的细胞群及其混合物以及含有所述富集的细胞群及其混合物的构建体)可以用来为自体肾脏提供再生作用。可以通过细胞本身和/或通过从细胞中分泌的产物来提供作用。再生作用可以特征在于以下的一个或多个：上皮-间充质转化减少(所述上皮-间充质转化可以经过TGF-β信号传导衰减)；肾纤维化减少；肾炎症减少；自体肾脏中的干细胞标志物差异表达；植入细胞和/或天然细胞向肾损伤(例如，肾小管损伤)部位迁移；在肾损伤(例如，肾小管损伤)部位上移植植入细胞；稳定肾脏功能的一个或多个指标(如本文所描述)；红细胞稳态恢复(如本文所描述)以及其任何组合。
7.监测再生的方法
另一方面，本公开提供了用于在向受试者施用或植入含有本文所描述的细胞群、混合物或构建体的制剂之后监测自体肾脏再生的预后方法。在一个实施方案中，所述方法包括检测从受试者中获得的测试样品和对照样品中的标志物表达水平的步骤，其中与对照样品相比测试样品中更高水平的标志物表达被预后用于受试者中的自体肾脏再生。在另一个实施方案中，所述方法包括检测样品中的一个或多个干细胞标志物的表达。干细胞标志物可以选自Sox2；UTF1；NODAL；CD133；CD24以及其任何组合(参见Ilagan等PCT/US2011/036347的实施例11)。检测步骤可以包括相对于对照样品确定测试样品中干细胞标志物的表达上调或更高，其中更高水平的表达被预后用于受试者的自体肾脏的再生。在一个其它实施方案中，检测干细胞标志物的mRNA表达。在其它实施方案中，mRNA表达的检测可以经过基于PCR的方法，例如qRT-PCR。原位杂交还可以用于检测mRNA表达。在另一个实施方案中，还可以使用抗干细胞标志物剂来检测干细胞标志物的多肽表达。在一个其它实施方案中，所述试剂为对抗标志物的抗体。在另一个实施方案中，使用免疫组织化学或蛋白质印迹来检测干细胞标志物多肽表达。本领域普通技术人员将了解用于检测标志物的mRNA和/或多肽表达的其它方法。
另一方面，本公开提供了用于在植入或施用本文所描述的含有细胞群、混合物或构建体的制剂之后对患者预后评估的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：检测从所述受试者中获得的测试样品中的标志物表达的水平；(b)相对于对照样品(或对照参考值)，相对于标志物表达的水平确定测试样品中的表达水平；以及(c)基于标志物表达水平的确定预测患者的再生预后，其中与对照样品(或对照参考值)相比测试样品中更高水平的标志物表达被预后用于受试者中的再生。
在一个其它方面中，本公开提供了用于在向受试者施用或植入含有本文所描述的细胞群、混合物或构建体的制剂之后监测自体肾脏再生的预后方法，其中使用了非侵入方法。作为组织活检物的替代，可以从体液(例如，尿)的检验中评价接受治疗的受试者中的再生结果。已经发现从受试者来源的尿来源中获得的微泡含有某些组分，包括但不限于受用本公开的细胞群治疗所影响的最终来源于肾细胞群的特定蛋白质和miRNA。这些组分可以包括涉及干细胞复制和分化、凋亡、炎症和免疫调节的因子。微泡相关miRNA/蛋白质表达模式的时间分析允许在接受本公开的细胞群、混合物或构建体的受试者肾脏内连续监测再生结果。
可以分析流入受试者尿中的这些肾脏来源的囊泡和/或肾脏来源的囊泡的腔内含物的指示再生结果的标志物。
在一个实施方案中，本公开提供了评价肾脏疾病(KD)患者是否响应于用治疗制剂的治疗的方法。方法可以包括与对照样品中的囊泡的量相比或相对于对照样品中的囊泡的量确定或检测从用治疗剂治疗的KD患者中获得的测试样品中的囊泡或其腔内含物的量的步骤，其中与对照样品中的囊泡或其腔内含物的量相比测试样品中的囊泡或其腔内含物的量更高或更低指示治疗的患者对用治疗剂的治疗的响应性。
本公开还提供了监测用治疗剂的治疗在KD患者中的功效的方法。在一个实施方案中，所述方法包括与对照样品中的囊泡或其腔内含物的量相比或相对于对照样品中的囊泡或其腔内含物的量确定或检测从用治疗剂治疗的KD患者中获得的测试样品中的囊泡的量的步骤，其中与对照样品中的囊泡或其腔内含物的量相比测试样品中的囊泡或其腔内含物的量更高或更低指示用治疗剂的治疗在KD患者中的功效。
本公开提供了鉴定试剂对治疗肾脏疾病(KD)有效的患者亚群的方法。在一个实施方案中，所述方法包括与从对照样品中获得的样品中的囊泡或其腔内含物的量相比确定试剂的功效与在来自患者亚群的样品中存在囊泡或其腔内含物的量之间的相互关系的步骤，其中与对照样品中的囊泡或其腔内含物的量相比来自患者亚群的样品中的囊泡的量更高或更低指示试剂对治疗患者亚群中的KD有效。
确定或检测步骤可以包括分析可能存在于测试样品(例如，尿)中的miRNA或其它分泌的产物的量。
非侵袭性预后方法可以包括在施用或植入本文所描述的细胞群、混合物或构建体之前和/或之后从受试者中获得尿样品的步骤。可以使用标准技术(包括但不限于离心以去除不希望的碎片)使囊泡和其它分泌的产物从尿样品中分离出来(Zhou等2008.Kidney Int.74(5):613-621；Skog等美国公布专利申请号20110053157，所述每个参考文献均以引用的方式整体并入本文)。
本公开涉及在治疗之后检测受试者中的再生结果的非侵入方法。方法涉及检测来自治疗的受试者的尿中的囊泡或其腔内含物。腔内含物可为一种或多种miRNA。检测单独miRNA的组合或小组可以适合用于所述预后方法。示例性组合包括以下的两种或更多种：miR-24；miR-195；miR-871；miR-30b-5p；miR-19b；miR-99a；miR-429；let-7f；miR-200a；miR-324-5p；miR-10a-5p以及其任何组合。在一个实施方案中，miRNA的组合可以包括2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种或更多种单独的miRNA。本领域普通技术人员将了解其它miRNA和miRNA的组合可以适合用于所述预后方法。额外的miRNA的来源包括曼彻斯特大学生命科学院托管和维护的http://mirbase.org上的miRBase。
本领域技术人员将了解用于检测再生的预后方法可以适合用于使用除了本文所描述的细胞群和构建体以外的本领域中已知的其它治疗剂治疗的受试者。
在一些实施方案中，测定步骤包括出于以下目的使用由适合的处理器执行的软件程序：(i)测量测试样品和对照中的标志物表达(或囊泡或囊泡内含物)的差异水平；和/或(ii)分析从测量测试样品和对照中的标志物表达的差异水平中获得的数据。适合的软件和处理器为本领域中众所周知的并且为商业上可获得的。程序可以嵌入到存储于有形介质(如CD-ROM、软盘、硬盘驱动器、DVD或与处理器相关的存储器)上的软件中，但本领域普通技术人员将容易了解整个程序或其部分可以替代地由除了处理器以外的装置执行和/或以众所周知的方式嵌入到固件和/或专用硬件中。
在测定步骤之后，通常记录测量结果、发现、诊断、预测和/或治疗建议并且传达至例如技术人员、医师和/或患者。在某些实施方案中，计算机将用来使所述信息传达至当事人员如患者和/或主治医师。在一些实施方案中，将进行测定或在与传达结果或诊断的国家或管辖区域不同的国家或管辖区域中分析测定结果。
在一个优选的实施方案中，在完成测定和产生预后和/或预测之后尽可能快地使基于在具有标志物表达差异水平的测试受试者中测量的标志物表达水平的预后、预测和/或治疗建议传达至受试者。结果和/或相关的信息可以通过受试者的治疗医师传达至受试者。或者，结果可以通过任何传达方法(包括书写、电子传达形式如电子邮件或电话)直接传达至测试受试者。传达可以通过使用计算机来促进，如在电子邮件通信的情况下。在某些实施方案中，可以产生含有预后测试的结果和/或从测试得出的结论和/或基于测试的治疗建议的传达，并且使用将对电信领域熟练技术人员而言熟知的计算机硬件和软件的组合自动递送至受试者。卫生保健方向的通信系统的一个实例被描述于美国专利号6,283,761中；然而，本公开不限于利用这个具体通信系统的方法。在本公开的方法的某些实施方案中，所有或一些方法步骤(包括测定样品、预后和/或预测再生以及传达测定结果或预后)可以在不同的(例如外国的)管辖区域中进行。
另一方面，本文所描述的预后方法为关心植入或施用再生成功的相关人员提供信息。
在所有实施方案中，向有如本文所描述的这种治疗需要的受试者提供再生肾脏的方法可以包括如本文所描述的预后评估再生的植入后步骤。
8.生物活性细胞制剂
本文所描述的制剂并入了具有为待施用至受试者的活性剂(如生物活性肾细胞)产生有利环境的性质的生物材料。在一个实施方案中，制剂含有第一生物材料，所述第一生物材料从活性剂与生物材料一起配制时直到施用至受试者的时间点提供有利环境。在一个其它实施方案中，有利环境涉及在施用至受试者之前具有悬浮于大体上固态的生物活性细胞与流体中的细胞(如本文所描述)的优点。在另一个实施方案中，第一生物材料为温度敏感性生物材料。温度敏感性生物材料可以(i)在约8℃或以下具有大体上固态，以及(ii)在环境温度或以上具有大体上液态。在一个实施方案中，环境温度为约室温。
另一方面，制剂含有与第二生物材料组合的生物活性细胞，所述第二生物材料从配制时直到施用至受试者之后的时间点为组合的细胞提供有利环境。在一个实施方案中，由第二生物材料提供的有利环境涉及施用生物材料中的细胞的优点，所述生物材料保持结构完整性直到施用至受试者时并且在施用之后持续一段时间。在一个实施方案中，植入之后的第二生物材料的结构完整性为数分钟、数小时、数天或数周。在一个实施方案中，结构完整性为小于一个月、小于一周、小于一天或小于一小时。相对短期的结构完整性提供在不作为并入的元件与其放置到其中的组织或器官的相互作用的障碍或阻碍情况下可以使用控制的处理、放置或分散来将活性剂和生物材料递送至组织或器官中的靶位置的制剂。
在另一个实施方案中，第二生物材料为具有与第一生物材料不同的易感性的温度敏感性生物材料。第二生物材料可以(i)在约环境温度或以下具有大体上固态，以及(ii)在约37℃或以上具有大体上液态。在一个实施方案中，环境温度为约室温。
在一个实施方案中，第二生物材料为交联的珠粒。如本文所描述，交联的珠粒可以取决于交联的程度具有微调的体内停留时间。在另一个实施方案中，交联的珠粒包含生物活性细胞并且如本文所描述对酶促降解有抗性。
本公开的制剂可以包括与活性剂(例如，生物活性细胞)组合的第一生物材料，具有或不具有与活性剂(例如，生物活性细胞)组合的第二生物材料。在制剂包含第二生物材料时，它可为温度敏感性的珠粒和/或交联的珠粒。各种代表性制剂被提供于以下实施例中(还参见图3-7)。
本文所描述的生物活性细胞制剂、混合物和/或构建体可以呈生物活性细胞制剂施用。一方面，制剂包含细胞和为本文所描述的生物活性细胞制剂、混合物和/或构建体提供稳定性的一种或多种生物材料。在一个实施方案中，生物材料为取决于温度可以维持至少两个不同相或状态的温度敏感性生物材料。生物材料能够在第一温度下维持第一状态、在第二温度下维持第二状态和/或在第三温度下维持第三状态。第一、第二或第三状态可为大体上固体、大体上液体或大体上半固体或半液体状态。在一个实施方案中，生物材料在第一温度下具有第一状态并且在第二温度下具有第二状态，其中第一温度为低于第二温度。
在一个其它实施方案中，温度敏感性生物材料的状态为在约8℃或以下的温度下大体上固态。在其它实施方案中，在约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃或约8℃下维持大体上固态。在一个实施方案中，大体上固态具有凝胶的形式。在其它实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在环境温度或以上为大体上液态。在一个实施方案中，在约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃或约37℃下维持大体上液态。在一个实施方案中，环境温度为约室温。
在另一个实施方案中，温度敏感性生物材料的状态为在约环境温度或以下的温度下大体上固态。在一个实施方案中，环境温度为约室温。在另一个实施方案中，在约17℃、约16℃、约15℃、约14℃、约13℃、约12℃、约11℃、约10℃、约9℃、约8℃、约7℃、约6℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃或约1℃下维持大体上固态。在一个实施方案中，大体上固态具有珠粒的形式。在另一个实施方案中，温度敏感性生物材料的状态为在约37℃或以上的温度下大体上液态。在一个其它实施方案中，在约37℃、约38℃、约39℃或约40℃下维持大体上固态。
温度敏感性生物材料可以呈溶液的形式、珠粒的形式、或呈本文所描述的和/或本领域普通技术人员已知的其它适合的形式提供。本文所描述的细胞群和制剂可以涂覆有温度敏感性生物材料、沉积于温度敏感性生物材料上、包埋于温度敏感性生物材料中、附着至温度敏感性生物材料、接种于温度敏感性生物材料中、悬浮于温度敏感性生物材料中或捕获于温度敏感性生物材料中。或者，温度敏感性生物材料可以在不具有任何细胞的情况下提供，例如像呈间隔珠粒的形式。
在其它实施方案中，温度敏感性生物材料具有第一状态与第二状态之间的过渡态。在一个实施方案中，过渡态为约8℃温度与约环境温度之间的固体到液体的过渡态。在一个实施方案中，环境温度为约室温。在一个其它实施方案中，固体到液体的过渡态发生在以下的一个或多个温度下：约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃以及约18℃。
温度敏感性生物材料在给定温度可具有以厘泊(cP)为单位测量的某种粘度。在一个实施方案中，生物材料在25℃下具有约1cP至约5cP、约1.1cP至约4.5cP、约1.2cP至约4cP、约1.3cP至约3.5cP、约1.4cP至约3.5cP、约1.5cP至约3cP、约1.55cP至约2.5cP或约1.6cP至约2cP的粘度。在另一个实施方案中，0.75％(w/v)溶液在37℃下具有约1.0cP至约1.15cP的粘度。在37℃下的粘度可为约1.0cP、约1.01cP、约1.02cP、约1.03cP、约1.04cP、约1.05cP、约1.06cP、约1.07cP、约1.08cP、约1.09cP、约1.10cP、约1.11cP、约1.12cP、约1.13cP、约1.14cP或约1.15cP。在一个其它实施方案中，生物材料为明胶溶液。明胶以约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％或约1％(w/v)存在于溶液中。在一个实例中，生物材料为PBS中的0.75％(w/v)明胶溶液。在一个实施方案中，0.75％(w/v)溶液在25℃下具有约1.6cP至约2cP的粘度。在一个实施方案中，0.75％(w/v)溶液在37℃下具有约1.07cP至约1.08cP的粘度。明胶溶液可以提供于PBS、DMEM或另一种适合的溶剂中。
一方面，生物活性细胞制剂还包括细胞活力剂。在一个实施方案中，细胞活力剂选自由以下组成的组：抗氧化剂、氧载体、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、血管生成因子、伤口愈合因子以及从生物活性细胞中分泌的产物。
抗氧化剂特征在于能够抑制其它分子氧化。抗氧化剂包括但不限于以下的一种或多种：6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酸类胡萝卜素、黄酮类化合物、异黄酮、泛醌、谷胱甘肽、硫辛酸、超氧化物歧化酶、抗坏血酸、维生素E、维生素A、混合的类胡萝卜素(例如，β胡萝卜素、α胡萝卜素、γ胡萝卜素、黄体素、番茄红素、八氢番茄红素、六氢番茄红素以及虾青素)、硒、辅酶Q10、吲哚-3-甲醇、原花色素、白藜芦醇、槲皮素、儿茶素、水杨酸、姜黄素、胆红素、草酸、植酸、硫辛酸、香草酸、多酚、阿魏酸、茶黄素以及其衍生物。本领域普通技术人员将了解用于本公开的其它适合的抗氧化剂。
氧载体为特征在于能够携带和释放氧的试剂。它们包括但不限于全氟化碳和含有全氟化碳的药物。适合的基于全氟化碳的氧载体包括但不限于全氟溴辛烷(C8F17Br)；perfluorodichorotane(C8F16C12)；全氟溴癸烷；全氟溴烷(perfluobron)；全氟萘烷；全氟三丙胺(perfluorotripopylamine)；全氟甲基环哌啶；(全氟萘烷&全氟三丙胺)；(全氟萘烷&全氟甲基环哌啶)；(全氟溴癸烷和全氟溴烷)；OcycyteTM(全氟(叔丁基环己烷))。本领域普通技术人员将了解用于本公开的其它适合的基于全氟化碳的氧载体。
免疫调节因子包括但不限于骨桥蛋白、FAS配体因子、白细胞介素、β转化生长因子、血小板来源的生长因子、丛生蛋白、转铁蛋白、活化后可调节的正常T细胞表达分泌的蛋白质(RANTES)、纤溶酶原激活物抑制剂–1(Pai-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、α-1微球蛋白以及β-2-微球蛋白。本领域普通技术人员将了解用于本公开的其它适合的免疫调节因子。
抗炎剂或免疫抑制剂(以下描述的)也可为制剂的一部分。本领域普通技术人员将了解用于本发明制剂和/或治疗的其它适合的抗氧化剂。
细胞募集因子包括但不限于单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和CXCL-1。本领域普通技术人员将了解用于本发明制剂和/或治疗的其它适合的细胞募集因子。
细胞附着因子包括但不限于纤连蛋白、前胶原、胶原、ICAM-1、结缔组织生长因子、层粘连蛋白、蛋白聚糖、特异性细胞粘附肽如RGD和YSIGR。本领域普通技术人员将了解用于本发明制剂和/或治疗的其它适合的细胞附着因子。
血管生成因子包括但不限于基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、血管内皮生长因子F(VEGF)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、组织抑制剂或金属蛋白酶-1(TIMP-1)血管内皮生长因子F(VEGF)、血管生成素-2(ANG-2)。本领域普通技术人员将了解用于本发明制剂和/或治疗的其它适合的血管生成因子。
伤口愈合因子包括但不限于角化细胞生长因子1(KGF-1)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、钙结合蛋白、丛生蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、三叶因子3。本领域普通技术人员将了解用于本发明制剂和/或治疗的其它适合的伤口愈合因子。
来自本文所描述的生物活性细胞的分泌的产物也可以作为细胞活力剂被添加至生物活性细胞制剂。
在一个其它方面中，制剂包含本文所描述的温度敏感性生物材料和含有生物材料的生物相容性珠粒群。在一个实施方案中，珠粒为交联的。交联可以使用本领域普通技术人员已知的任何适合的交联剂来实现，所述交联剂例如像碳二亚胺；醛(例如糠醛、丙烯醛、甲醛、戊二醛、甘油醛)、基于琥珀酰亚胺的交联剂{二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)、二硫代二(琥珀酰亚胺丙酸酯)、乙二醇二(磺基琥珀酰亚胺琥珀酸酯)、乙二醇二(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(EGS)、二(磺基琥珀酰亚胺基)戊二酸酯(BS2G)、双琥珀酰亚胺酒石酸酯(DST)}；环氧化物(乙二醇二缩水甘油醚、1,4丁二醇二缩水甘油醚)；糖类(葡萄糖和醛糖)；磺酸和对甲苯磺酸；羰二咪唑；京尼平；亚胺；酮；叠氮磷酸二苯酯(DDPA)；对苯二甲酰氯；六水合硝酸铈(III)；微生物转谷氨酰胺酶以及过氧化氢。本领域普通技术人员将了解用于本发明方法、制剂和/或治疗的其它适合的交联剂和交联方法。
在一个实施方案中，珠粒为碳二亚胺交联的珠粒。碳二亚胺交联的珠粒可以用选自由以下组成的组的碳二亚胺交联：1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、DCC-N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)以及N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIPC)。用较低浓度EDC处理的珠粒被预期具有较高数量的游离伯胺，而用高浓度交联剂处理的样品将具有接合在酰胺键中的大多数伯胺。在335nm处分光光度计可检测的由伯胺与苦基磺酸之间的共价键合形成的橙色强度与样品中存在的伯胺数目成比例。当归一化每毫克存在于样品中的蛋白质时，可以观察到存在的游离胺数目与用于交联的EDC初始浓度之间的逆相关。这个结果指示由在反应中使用的碳二亚胺量所决定的差异珠粒交联。通常，与未交联的珠粒相比，交联的珠粒表现出减少的游离伯胺数目。游离伯胺的数目可在约335nm处通过分光光计计测量检测到。
与未交联的生物相容性珠粒相比，交联的珠粒具有减小的对酶促降解的易感性，从而提供具有可微调体内停留时间的珠粒。例如，交联的珠粒对内源性酶有抗性，如胶原酶。提供交联的珠粒为集中开发和产生有利于以下的一种或多种的生物材料的递送系统的一部分：(a)将附着细胞递送至希望的部位并且产生用于天然组织和血管供应再生和向内生长的间隙；(b)能够持续处于足够长以允许细胞建立、运行、重塑其微环境并且分泌其自身的细胞外基质(ECM)的部位上；(c)促进移植的细胞与周围组织整合；(d)能够以大体上固体形式植入细胞；(e)不提供组织向内生长或递送的细胞/材料与宿主组织整合的明显障碍的短期结构完整性；(f)以大体上固体形式的局部体内递送，从而防止植入过程中组织内的细胞分散；(g)与悬浮于流体中的细胞相比贴壁依赖性细胞的稳定性和活力改进；以及(h)当细胞i)以大体上固体形式(例如，附着至珠粒)和ii)以大体上液体形式(例如，悬浮于流体中)递送时的双相释放曲线。
在一个实施方案中，本公开提供了含有明胶的交联的珠粒。未交联的明胶珠粒不适合用于生物活性细胞制剂，因为它们快速地失去完整性并且细胞从注射部位散逸。相反，高度交联的明胶珠粒可以在注射部位处持续很长时间并且可以阻碍重新ECM分泌、细胞整合和组织再生。本公开允许微调交联的珠粒的体内停留时间。为了定制生物材料的生物降解性，使用不同交联剂浓度的碳二亚胺同时对于所有样品而言总体反应条件保持恒定。例如，可以通过从约0至约1M变化交联剂浓度来微调碳二亚胺交联的珠粒的酶促敏感性。在一些实施方案中，浓度为约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约41mM、约42mM、约43mM、约44mM、约45mM、约46mM、约47mM、约48mM、约49mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM或约100mM。交联剂浓度还可为约0.15M、约0.2M、约0.25M、约0.3M、约0.35M、约0.4M、约0.45M、约0.5M、约0.55M、约0.6M、约0.65M、约0.7M、约0.75M、约0.8M、约0.85M、约0.9M、约0.95M或约1M。在另一个实施方案中，交联剂为1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)。在一个实施方案中，EDC交联的珠粒为明胶珠粒。
交联的珠粒可以具有有利于接种、附着或包封的某些特征。例如，珠粒可以具有多孔表面和/或可为大体上空心的。孔隙的存在提供了增加的细胞附着表面，从而与非多孔或平滑的表面相比允许更多数目的细胞附着。此外，孔隙结构可以支持宿主组织与多孔珠粒整合，从而支持重新组织形成。珠粒具有可以拟合成相应于一般颗粒分布样式的威布尔曲线图(Weibull plot)的大小分布。在一个实施方案中，交联的珠粒的平均直径为小于约120μm、约115μm、约110μm、约109μm、约108μm、约107μm、约106μm、约105μm、约104μm、约103μm、约102μm、约101μm、约100μm、约99μm、约98μm、约97μm、约96μm、约95μm、约94μm、约93μm、约92μm、约91μm或约90μm。交联的珠粒的特征取决于铸造方法而改变。例如，其中使用了空气流来雾化液体明胶溶液并且用薄层色谱法试剂喷雾器(ACEGlassware)将其喷洒到液氮中的方法被用来提供具有前面提到的特征的珠粒。本领域技术人员将了解调节铸造方法的参数为定制珠粒的不同特征(例如，不同大小分布)提供机会。
在使用细胞培养技术配制之前在体外评价交联的珠粒的细胞相容性，在所述细胞培养技术中珠粒用相应于最终生物活性细胞制剂的细胞培养。例如，在制备生物活性肾细胞制剂之前用原代肾细胞培养珠粒并且活/死细胞测定用来证实细胞相容性。在某些制剂中，生物相容的交联珠粒与溶液体积的约5％(w/w)至约15％(w/w)的溶液中的温度敏感性生物材料组合。交联的珠粒可以溶液体积的约5％(w/w)、约5.5％(w/w)、约6％(w/w)、约6.5％(w/w)、约7％(w/w)、约7.5％(w/w)、约8％(w/w)、约8.5％(w/w)、约9％(w/w)、约9.5％(w/w)、约10％(w/w)、约10.5％(w/w)、约11％(w/w)、约11.5％(w/w)、约12％(w/w)、约12.5％(w/w)、约13％(w/w)、约13.5％(w/w)、约14％(w/w)、约14.5％(w/w)或约15％(w/w)存在。
另一方面，本公开提供了含有历经大约数分钟、数小时或数天的时段降解的生物材料。这与集中植入固体材料，然后所述固体材料历经数天、数周或数月缓慢降解的大量工作相反。
另一方面，本公开提供了具有用生物活性细胞晶种的生物相容交联珠粒连同递送基质一起的制剂。在一个实施方案中，递送基质具有以下特征的一种或多种：生物相容性、可生物降解/可生物再吸收、在植入到受试者之前和过程中大体上固态、在植入之后失去结构完整性(大体上固体)以及支持细胞活力的细胞相容环境。在植入过程中能够保持植入的颗粒(例如，交联的珠粒)间隔开的递送基质增强了天然组织向内生长。如果不存在递送基质，那么在植入过程中细胞化的珠粒的压缩可以导致用于足够组织向内生长的空间不够。递送基质促进固体制剂的植入。此外，结构完整性的短持续时间意指植入之后很快，基质不提供组织向内生长或递送的细胞/材料与宿主组织整合的明显障碍。递送基质提供本文所描述的制剂的定位，因为插入固体单元帮助防止递送的材料在植入过程中在组织内分散。对于基于细胞的制剂，与悬浮于流体中的细胞相比固体递送基质改进了贴壁依赖性细胞的稳定性和活力。
在一个实施方案中，递送基质为没有接种有细胞的生物相容性珠粒群。在另一个实施方案中，未晶种的珠粒分散在整个单独细胞晶种的珠粒之间和分散于单独细胞晶种的珠粒之间中。在移植之前和紧接在移植之后未晶种的珠粒用作细胞晶种的珠粒之间的“间隔珠粒”。间隔珠粒含有在第一温度下具有大体上固态并且在第二温度下具有大体上液态的温度敏感性生物材料，其中第一温度低于第二温度。例如，间隔珠粒含有在约环境温度或以下具有大体上固态并且在约37℃下具有大体上液态的生物材料，如本文所描述的生物材料。在一个实施方案中，环境温度为约室温。在另一个其它实施方案中，生物材料为明胶溶液。明胶溶液以约4％、约4.5％、约5％、约5.5％、约6％、约6.5％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％、约10％、约10.5％或约11％(w/v)存在。明胶溶液可以提供于PBS、细胞培养基(例如，DMEM)或另一种适合的溶剂中。
一方面，本公开提供了含有以大体上固体形式(例如，间隔珠粒)植入并且然后在植入到身体中之后液化/融化或以另外的方式失去结构完整性的生物材料。这与集中使用可以呈液体注射的材料，然后所述材料在身体中固化的大量工作相反。
可以在配制之前在体外评价间隔珠粒的对温度的易感性。可以标记间隔珠粒并且与未标记的非温度敏感性珠粒混合。然后在37℃下孵育混合物以观察物理转变的变化。随时间观察到更高温度下的标记的温度敏感性珠粒的形状损失。例如，温度敏感性明胶珠粒可以用阿辛蓝染料制备以用作物理转变的标志物。使蓝色明胶珠粒与Cultispher S珠粒(白色)混合、负载到导管中，然后挤出并且在37℃下用1X PBS(pH 7.4)孵育。接着在不同时间点下用显微镜观察蓝色明胶珠粒的形状损失。在30min之后蓝色明胶珠粒的物理状态变化为可见的，随孵育时间延长变得更明显。由于材料的粘性，珠粒没有完全分散。
本文所描述的生物活性细胞制剂可以用来制备用于注射到肾脏中的基于肾细胞的制剂。然而，本领域普通技术人员将了解制剂将适合用于许多其它类型的生物活性细胞群。例如，本公开涵盖了用于注射到任何实体器官或组织中的生物活性细胞的制剂。
一方面，本文所描述的生物活性细胞制剂将含有设定数目的细胞。在一个实施方案中，用于制剂的细胞的总数为约104、约105、约106、约107、约108或约109。在一个实施方案中，用于本文所描述的制剂的细胞的剂量可以基于靶器官或组织的评估的质量或功能质量来计算。在某些实施方案中，生物活性细胞制剂含有基于将为通过制剂治疗的受试者的宿主器官的重量相应于许多细胞的剂量。例如，生物活性肾细胞制剂基于对人肾脏而言约150克的平均重量。在一个实施方案中，每克(g)肾脏的细胞数为约600个细胞/g至约7.0×107个细胞/g。在一些实施方案中，每克肾脏的细胞数为约600个细胞/g、约1000个细胞/g、约1500个细胞/g、约2000个细胞/g、约2500个细胞/g、约3000个细胞/g、约3500个细胞/g、约4000个细胞/g、约4500个细胞/g、约5000个细胞/g、约5500个细胞/g、约6000个细胞/g、约6500个细胞/g、约7000个细胞/g、约7500个细胞/g、约8000个细胞/g、约8500个细胞/g、约9000个细胞/g、约9500个细胞/g或约10,000个细胞/g。
在其它实施方案中，每克肾脏的细胞数为约1.5×104个细胞/g、约2.0×104个细胞/g、约2.5×104个细胞/g、约3.0×104个细胞/g、约3.5×104个细胞/g、约4.0×104个细胞/g、约4.5×104个细胞/g、约5.0×104个细胞/g、约5.5×104个细胞/g、约6.0×104个细胞/g、约6.5×104个细胞/g、约7.0×104个细胞/g、约7.5×104个细胞/g、约8.0×104个细胞/g、约9.5×104个细胞/g。
在其它实施方案中，每克肾脏的细胞数为约1.0×105个细胞/g、约1.5×105个细胞/g、约2.0×105个细胞/g、约2.5×105个细胞/g、约3.0×105个细胞/g、约3.5×105个细胞/g、约4.0×105个细胞/g、约4.5×105个细胞/g、约5.0×105个细胞/g、约5.5×105个细胞/g、约6.0×105个细胞/g、约6.5×105个细胞/g、约7.0×105个细胞/g、约7.5×105个细胞/g、约8.0×105个细胞/g、约8.5×105个细胞/g、约9.0×105个细胞/g或约9.5×105个细胞/g。
在其它实施方案中，每克肾脏的细胞数为约1.0×106个细胞/g、约1.5×106个细胞/g、约2.0×106个细胞/g、约2.5×106个细胞/g、约3.0×106个细胞/g、约3.5×106个细胞/g、约4.0×106个细胞/g、约4.5×106个细胞/g、约5.0×106个细胞/g、约5.5×106个细胞/g、约6.0×106个细胞/g、约6.5×106个细胞/g、约7.0×106个细胞/g、约7.5×106个细胞/g、约8.0×106个细胞/g、约8.5×106个细胞/g、约9.0×106个细胞/g、约9.5×106个细胞/g、1.0×107个细胞/g或约1.5×107个细胞/g。
可以选择细胞的总数用于制剂并且可以调节制剂的体积以达到合适的剂量。
在一些实施方案中，制剂可以含有作为单一剂量或单一剂量+额外剂量的向受试者施用的细胞剂量。在其它实施方案中，剂量可以通过本文所描述的构建体的方式提供。本文所描述的肾细胞群或肾细胞群的混合物的治疗有效量可以在受试者安全接受的最大细胞数至肾脏疾病治疗(例如，稳定、减小衰退率或改进一种或多种肾脏功能)所必需的最小细胞数范围内。
本文所描述的肾细胞群或其混合物的治疗有效量可以被悬浮于药学上可接受的载体或赋形剂中。这样一种载体包括但不限于基础培养基+1％血清白蛋白、盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、胶原、藻酸盐、透明质酸、纤维蛋白胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、羧甲基纤维素以及其组合。制剂应该适合施用模式。
因此，本公开提供了含有肾细胞群或其混合物(例如，单独地或与B3和/或B4或B4’细胞群混合的B2细胞群)的制剂用于制造在受试者中治疗肾脏疾病的药剂的用途。在一些实施方案中，药剂还包含重组多肽，如生长因子、趋化因子或细胞因子。在另外的实施方案中，药剂包含人肾脏来源的细胞群。用来制造药剂的细胞可为使用提供用于本文所描述的方法的任何变体的分离的、衍生的或富集的。
根据常规工序呈适用于施用至人类的药物组合物形式配制肾细胞制剂或其混合物或组合物。通常，用于静脉内施用、动脉内施用或在肾脏被膜内施用的组合物例如为无菌等渗水性缓冲液中的溶液。在必要时，组合物还可以包括改善注射部位处的任何疼痛的局部麻醉剂。通常，成分单独地供应或以单位剂型混合在一起，例如呈密封容器(如指示活性剂的量的安瓿)中的冷冻保存的浓缩物。当组合物待通过输注施用时，它可以用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶来分配。在组合物通过注射施用时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿以使得成分可以在施用之前被混合。
药学上可接受的载体部分地通过所施用的具体组合物以及通过用来施用组合物的具体方法来确定。因此，存在各种各样的适合的药物组合物的制剂(参见，例如Alfonso R Gennaro(编),Remington:The Science and Practice ofPharmacy,先前为Remington's Pharmaceutical Sciences第20版,Lippincott,Williams&Wilkins,2003，所述参考文献以引用的方式整体并入本文)。药物组合物通常配制为无菌、大体上等渗并且完全遵循美国食品药品管理局的所有药品生产质量管理规范(GMP)条例。
一方面还提供了药物制剂，所述药物制剂包含肾细胞制剂(例如，单独地或与B3和/或B4或B4’细胞制剂组合的B2细胞制剂)以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，制剂包含104至109个哺乳动物肾脏来源的细胞。
改进释放制剂
一方面，本公开的制剂呈改进释放制剂提供。通常，改进释放特征在于在施用时初始释放第一活性剂，接着至少一次额外的后续释放第二活性剂。第一活性剂和第二活性剂可为相同的或它们可为不同的。在一个实施方案中，制剂为相同制剂中的多种组分提供改进释放。在另一个实施方案中，改进释放制剂含有作为第一组分的一部分的活性剂，所述第一组分允许活性剂在整个制剂体积中自由移动从而容许在施用时在靶部位处立即释放。第一组分可为具有大体上液相和大体上固相的温度敏感性生物材料，其中第一组分为施用时以大体上液相。在一个实施方案中，活性剂以大体上液相这样使得它在整个制剂体积中大体上自由移动，并且因此在施用时立即释放至靶部位。
在另一个实施方案中，改进释放制剂具有作为第二组分的一部分的活性剂，其中活性剂附着至第二组分、沉积于第二组分上、涂覆有第二组分、包埋于第二组分中、接种于第二组分上或捕获于第二组分中，这在施用至靶部位之前和之后持续。第二组分含有活性剂能够缔合的结构元件，从而防止在施用时活性剂从第二组分中立即释放。例如，第二组分以大体上固体形式(例如，生物相容性珠粒)提供，所述固体形式可以被交联以防止或延迟体内酶促降解。在一个实施方案中，以大体上固相的活性剂在施用之前和之后在制剂内保持其结构完整性并且因此在施用时它不会立即将活性剂释放至靶部位。用于改进释放制剂的适合的载体已经在本文中描述，但是本领域普通技术人员将了解适用于本文的其它载体。
在一个实施方案中，制剂提供递送的元件(包括细胞、纳米颗粒、治疗分子等)的初始快速递送/释放，接着是后来的元件的延迟释放。本公开的制剂可以被设计用于所述双相释放曲线，其中待递送的试剂以未附着形式(例如，溶液中的细胞)和附着形式(例如，连同珠粒或另一种适合的载体一起的细胞)提供。当初始施用时，没有阻碍的试剂被立即提供至递送部位，而有阻碍的试剂的释放被延迟直到载体(例如，珠粒)的结构完整性丧失，这时先前附着的试剂被释放。如下所讨论，本领域普通技术人员将了解释放的其它适合的机制。
可以基于活性剂的性质调节延迟释放的时间。例如，生物活性细胞制剂的延迟释放的时间可为大约数秒、数分钟、数小时或数天。在一些情况下，大约数周的延迟可为适当的。对于其它活性剂，如小分子或大分子，制剂的延迟释放的时间可为大约数秒、数分钟、数小时、数天、数周或数月。也可能制剂含有提供不同时间延迟释放特征的不同生物材料。例如，具有第一活性剂的第一生物材料可具有第一释放时间并且具有第二活性剂的第二生物材料可具有第二释放时间。第一活性剂和第二活性剂可为相同的或不同的。
如本文所讨论，延迟释放的时段可通常相应于失去生物材料的结构完整性的时段。然而，本领域普通技术人员将了解延迟释放的其它机制。例如，活性剂可不依赖于任何特定生物材料的降解时间随时间连续释放，例如药物从聚合物基质中扩散。此外，生物活性细胞可迁移远离含有生物材料和生物活性细胞的制剂到达天然组织。在一个实施方案中，生物活性细胞从生物材料(例如，珠粒)上迁移出来到达天然组织。
可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。可以通过在制剂中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)而带来可注射制剂的延长吸收。用于制备所述制剂的许多方法被授予专利或通常为本领域技术人员所已知。参见，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编著,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。适用于多肽试剂的控制释放或延迟释放的额外方法被例如描述于美国专利号6,306,406和6,346,274以及例如描述于美国专利申请号US20020182254和US20020051808，所有所述专利以引用的方式并入本文。
9.施用方法和途径
本公开的生物活性细胞制剂可以单独地或与其它生物活性组分组合施用。制剂适合用于将合并的组织工程元件注射或植入至实体器官的内部以再生组织。此外，制剂用于将组织工程元件注射或植入至中空器官的壁以再生组织。
一方面，本公开提供了将本文所描述的生物活性细胞制剂提供至有需要的受试者的方法。在一个实施方案中，生物活性细胞的来源可为自体的或同种异体的、同基因的(自体的或等基因的)以及其任何组合。在其中来源不为自体的情况下，方法可以包括施用免疫抑制剂。适合的免疫抑制剂药物包括但不限于硫唑嘌呤、环磷酰胺、咪唑立宾、环孢素、他克莫司水合物、苯丁酸氮芥、氯苯扎利二钠、金诺芬(auranofin)、前列地尔(alprostadil)、胍立莫司盐酸盐、biosynsorb、莫罗单抗(muromonab)、阿法赛特(alefacept)、喷司他丁(pentostatin)、达利珠单抗(daclizumab)、西罗莫司(sirolimus)、麦考酚酸莫酯、来氟米特(leflonomide)、巴利昔单抗(basiliximab)、链道酶α、bindarid、克拉屈滨(cladribine)、吡美莫司(pimecrolimus)、伊洛白介素(ilodecakin)、西利珠单抗(cedelizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、依维莫司(everolimus)、阿尼莫司(anisperimus)、加维莫单抗(gavilimomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、氯法拉滨(clofarabine)、雷帕霉素(rapamycin)、西普利珠单抗(siplizumab)、柴苓汤(saireito)、LDP-03、CD4、SR-43551、SK&F-106615、IDEC-114、IDEC-131、FTY-720、TSK-204、LF-080299、A-86281、A-802715、GVH-313、HMR-1279、ZD-7349、IPL-423323、CBP-1011、MT-1345、CNI-1493、CBP-2011、J-695、LJP-920、L-732531、ABX-RB2、AP-1903、IDPS、BMS-205820、BMS-224818、CTLA4-1g、ER-49890、ER-38925、ISAtx-247、RDP-58、PNU-156804、LJP-1082、TMC-95A、TV-4710、PTR-262-MG以及AGI-1096(参见美国专利号7,563,822)。本领域普通技术人员将了解其它适合的免疫抑制剂药物。
本公开的治疗方法涉及递送本文所描述的生物活性细胞制剂。在一个实施方案中，将细胞直接施用至预期益处的部位为优选的。有需要的受试者还可以通过使自体肾脏与本文所描述的生物活性细胞制剂连同从一个或多个富集的肾细胞群中分泌的产物一起和/或含有所述一个或多个富集的肾细胞群的混合物或构建体体内接触来治疗。
使自体肾脏与分泌的产物体内接触的步骤可以通过使用/施用含有来自细胞培养基(例如，调节的培养基)的分泌的产物群的制剂或通过植入能够体内分泌产物的富集的细胞群和混合物或构建体来完成。体内接触的步骤为自体肾脏提供了再生作用。
根据本说明书，许多用于将细胞和/或分泌产物施用给受试者的方法对于本领域技术人员来说是显然的。此类技术包括细胞至受试者的靶部位内的注射。
细胞和/或分泌的产物可被插入到递送装置或媒介物中，所述递送装置或媒介物促进通过注射或植入到受试者中来引入。在某些实施方案中，递送媒介物可以包括天然材料。在某些其它实施方案中，递送媒介物可以包括合成材料。在一个实施方案中，递送媒介物提供了模拟或恰好符合器官构造的结构。在其它实施方案中，递送媒介物本质上为流体样的。所述递送装置可以包括用于将细胞和流体注射到受体受试者身体中的管，例如导管。在一个优选的实施方案中，管额外地具有针(例如，注射器)，穿过所述针，细胞可以在希望的位置上被引入到受试者中。在一些实施方案中，哺乳动物肾脏来源的细胞群被配制用于经过导管施用到血管中(其中术语“导管”意图包括用于将物质递送至血管的任何各种管样系统)。或者，细胞可以被插入到生物材料或支架中或插入于生物材料或支架上，包括但不限于纺织品，如机织物、针织物、编织物、网状织物；和非织造物、穿孔膜、海绵和泡沫；以及珠粒，如实心或多孔珠粒、微粒、纳米颗粒等(例如Cultispher-S明胶珠粒-Sigma)。细胞可以被制备用于呈各种不同形式递送。例如，细胞可以被悬浮于溶液或凝胶中。细胞可以与药学上可接受的载体或稀释剂混合，在所述药学上可接受的载体或稀释剂中细胞保持有活力。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、缓冲水溶液、溶剂和/或分散介质。所述载体和稀释剂的使用为本领域中众所周知的。溶液优选地为无菌的和流体，并且将通常为等渗的。优选地，溶液在制造和储存条件下为稳定的并且通过使用例如对羟基苯甲酸、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等保存对抗微生物如细菌和真菌的污染作用。本领域技术人员将了解在递送细胞群及其混合物中使用的递送媒介物可以包括以上提到的特征的组合。
施用含有分离的肾细胞群(例如，单独地或与B4’和/或B3混合的B2细胞群)的制剂的模式包括但不限于全身、肾内(例如，实质的)、静脉内或动脉内注射以及在预期的活动部位上直接注射到组织中。待使用的额外施用模式包括经过直接剖腹手术、经过直接腹腔镜检查、经腹或经皮的单次或多次注射。待使用的还又额外的施用模式包括例如逆行性输注和输尿管肾盂输注。施用的手术方法包括一步工序，如但不限于肾部分切除和构建体植入、肾部分切除、肾盂部分切除、用网膜±腹膜血管化、多病灶活检针迹线圆锥或棱锥至圆柱体和肾极样置换；以及两步工序，包括例如用于重新移植的类器官内部生物反应器。在一个实施方案中，含有细胞混合物的制剂经过相同途径同时递送。在另一个实施方案中，包含控制的混合物的每个细胞组合物被单独地递送至特定位置或经过特定方法同时或以时间控制的方式，通过本文所描述的一种或多种方法。
可以从关于细胞活性(例如EPO产生)的现有信息中确定人中的适当细胞植入剂量或从临床前研究中进行的剂量研究中推断。从体外培养和体内动物实验中，可以定量细胞的量并且用于计算植入的材料的适当剂量。此外，可以监测患者以确定是否可以进行额外的植入或相对应地减少植入的材料。
可以将一种或多种其它组分添加至细胞群及其混合物中，包括选择的细胞外基质组分，如本领域中已知的一种或多种类型的胶原或透明质酸和/或生长因子、富含血小板的血浆以及药物。
本领域普通技术人员将了解适合用于本文所描述的分泌的产物的各种制剂和施用方法。
10.制品和试剂盒
本公开还包括试剂盒，所述试剂盒包含本文所公开的聚合物基质和支架及相关材料和/或细胞培养基和使用说明书。使用说明书可以含有例如用于培养细胞或施用细胞和/或细胞产物的说明书。在一个实施方案中，本公开提供了包含本文所描述的支架和说明书的试剂盒。在另一个实施方案中，试剂盒包括用于检测标志物表达的试剂、用于使用所述试剂的试剂以及使用说明书。这个试剂盒可以用于在植入或施用本文所描述的细胞群、混合物或构建体之后确定受试者中的自体肾脏的再生预后的目的。试剂盒还可以用来确定本文所描述的细胞群、混合物或构建体的生物治疗功效。
另一个实施方案为含有对治疗有需要的受试者有用的生物活性细胞的制品。制品包含容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插入物。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由各种材料如玻璃或塑料形成。容器容纳有效于治疗病状的组合物并且可以具有无菌进入端口(例如容器可为溶液袋或具有被注射针可穿刺的止挡件的小瓶)。制剂中的至少一种活性剂为提供用于本文的生物活性细胞群。标记或包装插入物指示制剂用于治疗具体病状。标记或包装插入物将还包括用于向患者施用制剂的说明书。还涵盖了本文所描述的包含组合疗法的制品和试剂盒。包装插入物是指习惯上包括于治疗产品的商业包装中的说明书，所述说明书含有关于指征、用法、剂量、施用、禁忌症和/或涉及所述治疗产品使用的警告的信息。在一个实施方案中，包装插入物至少制剂用于治疗疾病或病症，例如像肾脏疾病或病症。它可以还包括从商业和使用者立场来看希望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针以及注射器。还提供对各种目的例如对评价再生结果有用的试剂盒。可以提供含有用于尿来源的囊泡和/或其内含物例如本文所描述的核酸(如miRNA)、囊泡、外来体等的检测剂的试剂盒。检测剂包括但不限于核酸引物和探针以及用于体外检测希望的靶标的抗体。与制品一样，试剂盒包含容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插入物。容器容纳包含至少一种检测剂的组合物。可以包括额外的容器，所述额外的容器含有例如稀释剂和缓冲液或对照检测剂。标记或包装插入物可以提供组合物以及用于预期的体外、预后或诊断使用的说明书的描述。
11.报告
本公开的方法在出于商业目的实践时一般产生再生预后的报告或总结。本公开的方法将产生包括在任何施用或植入含有本文所描述的细胞群、混合物或构建体的制剂之前和之后预测再生的可探测进程或结果的报告。报告可以包括与预后有关的任何指标的信息。本公开的方法和报告可以还包括在数据库中存储报告。或者，方法可以进一步在数据库中产生受试者记录并且用数据填充记录。在一个实施方案中，报告为纸质报告，在另一个实施方案中，报告为听觉报告，在另一个实施方案中，报告为电子记录。可以想到为医师和/或患者提供报告。报告的接收可以还包括建立网络连接至包括数据和报告的服务器计算机并且从服务器计算机中请求数据和报告。提供用于本文的方法还可以全部或部分自动化。
在本文中说明性描述的发明适合地可以在不存在本文没有确切公开的任何元件或多个元件、限制或多个限制的情况下实践。因此，例如，在本文的每个例子中，任何术语“包含”、“基本上由……组成”以及“由……组成”可以用任一其它两个术语替换。因此，对于使用一个术语的本发明的一个实施方案，本发明还包括其中用这些术语中的另一个替换这些术语之一的另一个实施方案。在每个实施方案中，术语具有其确立的意义。因此，例如，一个实施方案可以涵盖“包含”许多组分的制剂，另一个实施方案将涵盖“基本上由所述组分组成”的制剂，并且第三实施方案将涵盖“由所述组分组成”的制剂。已经采用的术语和表达被用作描述的术语并非限制的术语，并且不意图于在使用所述术语和表述时排除表示和描述的特征的任何等效物或其部分，但应该认识到各种修改在所要求的本发明的范围内为可能的。因此，应该理解虽然本发明通过优选的实施方案和任选特征被确切地公开，但本文公开的概念的任何修改和变体可以为本领域技术人员所采用，并且所述修改和变体被认为在所附权利要求所定义的本发明的范围内。
前面写出的描述被认为足以使本领域技术人员实践本发明。仅出于说明目的提供以下实施例，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。事实上，除了本文所表示和描述的那些之外，本发明的各种修改将通过前面的描述对于本领域技术人员而言变得清楚并且处于所附权利要求的范围内。
本说明书中引用的所有专利、专利申请以及参考文献特此以引用的方式整体并入。
实施例
实施例1
溶液的制备
本实施例提供了在以下实施例中使用的用于分离和表征异质肾细胞群的各种培养基制剂和溶液的组成以及再生疗法产品的制造。
表1.1培养基和溶液
杜氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline,DPBS)用于所有细胞洗涤。
实施例2
异质未分级分离的肾细胞群的分离
本实施例说明了从人中分离出未分级分离的(UNFX)异质肾细胞群。进行初始组织解离以产生来自人肾脏组织的异质细胞悬浮液。
经过肾脏活检法得到的肾组织为异质肾细胞群提供源材料。可以使用包含皮质、皮质髓质交界处或髓质组织中的一个或多个的肾组织。优选使用皮质髓质交界处组织。从CKD肾脏中需要避免疤痕组织的多个活检核心(最小2个)。在计划植入最终NKA之前大约4周由临床研究者在临床部位从患者中获得肾组织。将组织转运于实施例1的组织转运培养基中。
然后用实施例1的组织洗涤溶液洗涤组织以便在加工组织用于细胞提取之前减少带进的生物负荷(bioburden)。
切碎肾组织，称重并且用实施例1的消化溶液解离。用杜氏改良型伊格尔培养基(D-MEM)+10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen,Carlsbad CA)中和所得到的细胞悬浮液，洗涤并且重新悬浮于无血清、无补充剂的角化细胞培养基(KSFM)(Invitrogen)中。然后使细胞悬浮液受到15％(w/v)碘克沙醇(OptiPrepTM,Sigma)梯度以便在以实施例1的肾细胞生长培养基中的25,000个细胞/cm2的密度下组织培养物处理的聚苯乙烯烧瓶或培养皿上开始培养之前去除红细胞和碎片。例如，细胞可以150ml的50:50培养基中的25×106个细胞/烧瓶铺放于T500Nunc烧瓶上。
实施例3
分离的肾细胞群的细胞扩增
肾细胞扩增取决于所接受的组织的量并且取决于从带进的组织中成功分离出肾细胞。分离的细胞可以被深低温保藏，如果需要的话(参见下文)。肾细胞生长动力学可由于从单独患者中分离出来的细胞的固有变异性而在样品与样品之间变化。
开发适应细胞回收范围的明确细胞扩增过程，所述细胞回收范围由带进组织的变异性产生表3.1。肾细胞的扩增涉及使用明确细胞培养工序在肾细胞生长培养基表1.1中在封闭培养器皿(例如，T-烧瓶、Cell Factories、)中的连续传代。
开发用于人临床试验的无BPE培养基以消除与使用BPE相关的固有风险。在无BPE培养基中评估细胞生长、表型(CK18)和细胞功能(GGT和LAP酶促活性)并且与在动物研究中使用的含BPE的培养基比较。在两种培养基中肾细胞生长、表型和功能是相同的。(数据未示出)
表3.1从人肾脏活检物中的细胞回收
一旦在初始T-烧瓶(第0代)中观察到细胞生长并且不存在污染的可视标志，替换培养基并且此后每2-4天更换图2B。通过在显微镜下目测培养物来评价细胞以证实肾细胞形态。培养物从特征上显示紧凑的铺面或卵石外观，由于细胞群聚在一起。这些形态特征在扩增过程中改变并且可以不存在于每代中。在整个细胞扩增中所采用的培养器皿中使用各种汇合水平下的细胞图像库来评估细胞培养汇合。
当培养器皿为至少50％汇合时通过胰蛋白酶消化传代肾细胞图2B。将脱离的细胞收集到含有肾细胞生长培养基的器皿中，计数并且计算细胞活力。在每个细胞代中，在足够数目的培养器皿中以500-4000个细胞/cm2晶种细胞以便使细胞数扩增至配制NKA所需要的数目图2B。在5％CO2环境下在37℃孵育器中放入培养器皿。如上所述，监测细胞形态和汇合并且每2-4天替换组织培养基。表3.2列出在来自人供体的六种肾脏活检物的细胞分离和扩增过程中所观察到的人肾细胞的活力。
表3.2培养中的人肾细胞的细胞活力
传代(n＝6) 细胞活力(平均值％) 范围(％)
P0 88 84-93
P1 91 80-98
P2 94 92-99
P3 98 97-99
来自不同患者的组织的固有变异性引起培养中的细胞产率不同。因此，严格明确细胞传代时间或每代中所需要的培养器皿的数目和类型以达到靶细胞数为不实际的。通常肾细胞经历2或3代；然而，培养的持续时间和细胞产率可以取决于细胞生长速率而改变。这在图3中举例说明，其中示出来自6位患者的培养持续时间和细胞产率(计算)。
使细胞脱离用于收获或用具有EDTA的0.25％胰蛋白酶传代。经过台盼蓝排阻评价活力并且使用血细胞计数器或使用自动化计数系统(Nexcelom Bioscience,Lawrence MA)手动进行计数。
实施例4
培养的细胞的深低温保藏
通常扩增的肾细胞被深低温保藏以便适应来自单独患者的细胞生长的固有变异性并且以便按照预先确定的临床方案递送产品(图2B)。深低温保藏的细胞还在需要另一种NKA的事件中提供细胞的备用来源(例如，由于患者疾病、未预料的过程事件等引起的延迟)。建立已经用来深低温保藏细胞并且当解冻时恢复有活力、功能性的细胞的条件。
对于深低温保藏，将细胞悬浮至最终浓度为深低温保藏溶液中的约50×106个细胞/mL(参见实施例1)并且分配到小瓶中。将含有约50×106个细胞/mL的1mL小瓶放入控制速率冷冻器的冷冻室中并且在预先编程的速率下冷冻。冷冻之后，将细胞转移至液氮冷冻器用于半成品储存。
实施例5
SRC细胞群的制备
根据方案可以从由深低温保藏的细胞生长的最终培养器皿中或直接从扩增培养物中制备选择的肾细胞(SRC)图2B。
如果使用深低温保藏的细胞，将细胞解冻并且放于组织培养器皿上用于最后一个扩增步骤。当最终培养器皿为大约50％-100％汇合时，细胞已准备好加工用于SRC分离。NKA的培养基交换和最终洗涤使最终产品中的任何残余深低温保藏溶液稀释。
一旦最终细胞培养器皿达到至少50％汇合，将培养器皿转移至设定为37℃下的5％CO2环境中的2％氧的低氧孵育器并且培养过夜。参见图2C。细胞可以被容纳于设定至2％氧的氧控制的孵育器中持续长达48小时。暴露于更多生理上相关的低氧(2％)环境改进了细胞分离效率并且使得检测更多低氧诱导的标志物如VEGF。
在细胞已经暴露于低氧条件持续足够时间(例如，过夜至48小时)之后，用具有EDTA的0.25％胰蛋白酶(Invitrogen)脱离细胞。经过台盼蓝排阻评价活力并且使用血细胞计数器或使用自动化计数系统(NexcelomBioscience,Lawrence MA)手动进行计数。用DPBS洗涤细胞一次并且重新悬浮至DPBS中的约850×106个细胞/mL。
基于细胞浮力密度使用密度梯度离心来分离收获的肾细胞群。用单步7％碘克沙醇密度梯度溶液(OptiPrep；60％(w/v)的OptiMEM溶液；参见实施例1)分离肾细胞悬浮液。
制备7％OptiPrep梯度溶液并且在使用之前测量指示希望的密度的折射率(折射率1.3456+/-0.0004)。将收获的肾细胞层积于梯度溶液的顶部上。在离心管或细胞处理器(例如，COBE 2991)中，在室温下在800g下离心密度梯度持续20min(不间断)。细胞级分在离心之后以明显的沉淀物收集表现出浮力密度大于大约1.045g/mL的图4。排除并丢弃维持浮力密度小于1.045g/mL的细胞。
将SRC沉淀物重新悬浮于DPBS中(图2C)。通过4次DPBS洗涤和1次明胶溶液步骤使最终产品中的残余OptiPrep、FBS、培养基以及辅助材料的带出物最小化。
实施例6
具有治疗潜力的细胞可以从正常肾脏组织和患慢性病的肾脏组织中分离出 来并且增殖
本研究的目的为通过高内涵分析(HCA)确定人NKA细胞的功能表征。高内涵成像(HCI)提供了使用两个或更多个荧光探针(多路技术)在许多样品上对多个亚细胞事件进行同时成像。高内涵分析(HCA)提供了对高内涵图像中捕获的多个细胞参数的同时定量测量。简单地说，使用标准活检工序独立地从取自患有晚期慢性肾脏疾病(CKD)的五个人肾脏和三个非CKD人肾脏中产生未分级分离的(UNFX)培养物(Aboushwareb等,World J Urol 26,295,2008)并且维持。在UNFX离体传代(2)之后，收获细胞并且受到密度梯度方法(如Basu等,WO 2012/064369的实施例2中所描述)以产生亚级分，包括亚级分B2、B3和/或B4。
从非CKD和CKD人供体获得人肾脏组织，如Ilagan等的PCT/US2011/036347的表10.1中所概述。Ilagan等PCT/US2011/036347的图4示出HK17和HK19样品的组织病理学特征。从所有非CKD(3/3)和CKD(5/5)肾脏中建立离体培养物。界定目标区域(ROI)的人NKA细胞中的白蛋白转运的高内涵分析(HCA)示于Ilagan等PCT/US2011/036347的图5(人NKA细胞中的白蛋白转运的HCA)中。来源于非CKD和CKD肾脏的NKA细胞中的白蛋白转运的定量比较示于Ilagan等PCT/US2011/036347的图6中。如在Ilagan等PCT/US2011/036347的图6中所示，白蛋白转运在CKD来源的NKA培养物中未被削弱。肾小管富集的B2亚级分与肾小管细胞消耗的B4亚级分之间的标志物表达的比较分析示于Ilagan等PCT/US2011/036347的图7(CK8/18/19)中。
肾小管富集的B2亚级分与肾小管细胞消耗的B4亚级分之间的白蛋白转运的比较功能分析示于Ilagan等PCT/US2011/036347的图8中。亚级分B2富集近端小管细胞并且因此表现出增强的白蛋白转运功能。
白蛋白摄取：用含有1X抗霉菌剂/抗生素和2mM谷氨酰胺的无酚红、无血清、低葡萄糖DMEM(pr-/s-/lg DMEM)替换在24孔胶原IV板(BDBiocoatTM)中生长成汇合的细胞的培养基持续18-24小时。在临测定之前，用pr-/s-/lg DMEM+10mM HEPES、2mM谷氨酰胺、1.8mM CaCl2以及1mM MgCl2洗涤细胞并且孵育30分钟。使细胞暴露于25μg/mL罗丹明-缀合的牛白蛋白(Invitrogen)持续30min，用冰冷PBS洗涤以停止胞吞并且用含有25μg/mL Hoechst核染料的2％低聚甲醛立即固定。对于抑制实验，在白蛋白添加之前10分钟添加1μM受体相关蛋白(RAP)(Ray Biotech,Inc.,NorcrossGA)。用BD PathwayTM 855高内涵生物成像器(Becton Dickinson)进行显微镜成像和分析(参见Kelley等Am J Physiol Renal Physiol.2010年11月；299(5):F1026-39.Epub 2010年9月8日)。
综上所述，HCA得到细胞水平数据并且可以显示出由其它测定(即，基因或蛋白质表达)不可检测的群动力学。用于测量白蛋白转运(HCA-AT)功能的可定量离体HCA测定可以被利用表征作为人NKA原型的组分的人肾小管细胞。HCA-AT实现了细胞功能的比较评估，示出白蛋白转运竞争细胞保留在来源于人CKD肾脏的NKA培养物中。还示出NKA培养物的特定亚级分B2和B4在表型和功能上不同，其中B2表示具有增强白蛋白转运活性的肾小管细胞富集的级分。来自人CKD的B2细胞亚群为表型上和功能上类似于在体内显示功效的啮齿动物B2细胞(如上所示)。
实施例7
在梯度之前低氧培养影响带分布、组成和基因表达
为了确定氧条件对表型B2和B4的分布和组成的影响，使来自不同物种的新肾脏细胞制剂在梯度步骤之前暴露于不同氧条件中。使用在Kelley等,2010(同上)中所描述的用于大鼠细胞分离和培养开始的标准工序建立啮齿动物新肾脏增大(NKA)细胞制剂(RK069)。在21％(大气)氧条件中培养所有烧瓶2-3天。更换培养基并且然后将一半烧瓶重新位于设定为2％氧的氧控制的孵育器中，同时保持剩下来的烧瓶处于21％氧条件下持续额外的24小时。然后使用同上描述的标准酶促收获工序从每组条件收获细胞。根据标准工序制备逐级梯度并且分别收获“含氧量正常”(21％氧)和“低氧”(2％氧)培养物并且并排施加相同逐级梯度。虽然在这两种条件中产生4个带和1个沉淀物，但在整个梯度上细胞分布在21％和2％氧培养的批次中为不同的(表7.1)。确切地说，在低氧情况下B2产率增加，伴随有B3减少。此外，在产自低氧培养的细胞的所得到的梯度中B4特异性基因(如促红细胞生成素)的表达增强(Presnell等WO/2010/056328的图73)。
使用在Basu等WO 2012/064369中所描述的用于狗细胞分离和培养的标准工序(类似于啮齿动物分离和培养工序)建立犬NKA细胞制剂(DK008)。在21％(大气)氧条件中培养所有烧瓶持续4天，然后将子组烧瓶转移至低氧(2％)持续24小时，同时维持子组烧瓶处于21％下。随后，收获每组烧瓶并且受到相同逐级梯度。类似于大鼠结果，低氧培养的狗细胞不同于大气氧培养的狗细胞分布在整个梯度上(表7.1)。再次，在梯度之前在低氧暴露情况下B2的产率增加，同时伴随至B3中的分布减少。
表7.1.
以上数据显示预先梯度暴露于低氧增强了B2组分以及特定特化细胞(产生促红细胞生成素的细胞、血管细胞以及肾小球细胞)分布成B4。因此，低氧培养接着如在Basu等同上所描述的密度-梯度分离为在不同物种中产生‘B2’和‘B4’细胞群的有效方法。
实施例8
从自身免疫性肾小球肾炎患者样品中分离出来的未分级分离的肾细胞混合 物的表征
如上所述，从自身免疫性肾小球肾炎患者样品中分离出未分级分离的肾细胞混合物。为了确定从肾脏组织分离和扩增的特定肾细胞亚群的无偏基因型组成，采用定量实时PCR(qRTPCR)分析(Brunskill等,Dev.Cell.2008年11月；15(5):781-791)来鉴定细胞亚级分之中的差异细胞类型特异性和途径特异性基因表达模式。如在Ilagan等PCT/US2011/036347的表6.1中所示，HK20为自身免疫性肾小球肾炎患者样品。如在Ilagan等PCT/US2011/036347的表6.2中所示，产自HK20的细胞为缺乏肾小球细胞，如通过qRTPCR所确定。
实施例9
从局灶性节段性肾小球硬化症的病例中分离出来的治疗相关肾生物活性细 胞群的遗传表征
为了确定从肾脏组织分离和扩增的特定肾细胞亚群的无偏基因型组成，采用定量实时PCR(qRTPCR)分析(Brunskill等,同上2008)来鉴定细胞亚级分之中的差异细胞类型特异性和途径特异性基因表达模式。评估来源于局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)的病例的人制剂HK023(其中大部分肾小球已经被破坏)在收获时在B4级分中存在肾小球细胞的情况。简单地说，使用标准活检工序单独地从取自肾脏的(4)核心活检物中产生未分级分离的(UNFX)培养物(Aboushwareb等,World J Urol 26,295,2008)并且维持。在UNFX离体传代(2)之后，根据Basu等WO2012/064369的实施例6收获细胞并且受到密度梯度方法以产生亚级分(包括亚级分B4)，基于在啮齿动物、狗以及其它人样本中进行的工作已知所述亚级分富集内分泌细胞、血管细胞以及肾小球细胞。
分别从每个单独的HK023的UNFX样品中收集B4级分，所述级分表现为具有浮力密度为1.063g/mL–1.091g/mL之间的独特细胞带。从每个样品中分离RNA并且通过定量实时PCR检验肾小球足细胞裂隙膜蛋白(肾小球细胞标志物)和PECAM(内皮细胞标志物)的表达。如从来自严重FSGS的病例的活检产生的样品中所预期，肾小球足细胞裂隙膜蛋白(+)肾小球细胞在B4级分中的存在与肾小球足细胞裂隙膜蛋白在2/4样品中不能被检测到不一致。相反，PECAM+血管细胞一致存在于4/4的活检起始的培养物的B4级分中。因此，B4级分可以在1.063-1.091g/mL密度范围下分离，甚至从患有严重疾病状态的人肾脏中分离出来。
表9.1用于检测从FSGS的病例中分离出来的亚级分B4中的肾小球细胞和血管细胞的肾小球足细胞裂隙膜蛋白和PECAM的表达。
HK023/活检物 RQ(肾小球足细胞裂隙膜蛋白)/B4 RQ(PECAM)/B4
#1/p2 0.188 0.003
#2/p2 未检测到 0.02
#3/p2 40.1 0.001
#4/p2 未检测到 0.003
此外，如在Ilagan等PCT/US2011/036347的表7.2中所示，人样品(HK018)显示在密度梯度离心之后由qRTPCR得到的未检测到的肾小球足细胞裂隙膜蛋白(肾小球标志物)。
实施例10
使用荧光激活细胞分选(FACS)富集/消耗有活力的肾脏细胞类型的
使用荧光激活细胞分选(FACS)从分离的原代肾脏组织中可以富集一种或多种分离的肾脏细胞和/或可以消耗一种或多种特定肾脏细胞类型。
试剂：70％乙醇；洗涤缓冲液(PBS)；50:50肾脏细胞培养基(50％DMEM高葡萄糖)：50％角化细胞-SFM；台盼蓝0.4％；针对肾脏内皮细胞靶向肾脏细胞群的一级抗体如CD31和针对肾脏肾小球细胞的肾小球足细胞特异性蛋白。匹配的同种型特异性荧光二级抗体；染色缓冲液(0.05％BSA的PBS溶液)。
工序：在用于清洗生物学安全工作橱(BSC)的标准工序之后，可以从T500T/C处理的烧瓶中获得来自原代分离或培养的细胞的肾脏细胞的单一细胞悬浮液并且重新悬浮于肾脏细胞培养基中并且放于冰上。然后使用台盼蓝排阻方法确定细胞计数和活力。对于从异质群中肾脏细胞富集/消耗例如肾小球细胞或内皮细胞，获得具有至少70％活力的10与50×106之间的活细胞。然后用起始浓度为1μg/0.1ml染色缓冲液/1×106个细胞(如果需要的话为滴度)的特异于靶细胞类型的一级抗体染色异质肾脏细胞群。靶抗体可为缀合的如CD31PE(特异于肾脏内皮细胞)或未缀合的如肾小球足细胞特异性蛋白(特异于肾脏肾小球细胞)。
然后在冰上或在4℃下对细胞进行避光染色，进行30分钟。在孵育30分钟之后，通过在300xg下离心洗涤细胞持续5min。然后将沉淀物重新悬浮于PBS或染色缓冲液中，这取决于是否需要缀合的同种型特异性二级抗体。如果用荧光染料缀合的一级抗体标记细胞，将细胞重新悬浮于2mlPBS/107个细胞中并且进行到FACS aria或等效的细胞分选器。如果细胞不用荧光染料缀合的抗体标记，那么细胞用起始浓度为1ug/0.1ml/106个细胞的同种型特异性荧光染料缀合的二级抗体标记。
然后在冰上或在4℃下对细胞进行避光染色，进行30min。在孵育30分钟之后，通过在300xg下离心洗涤细胞持续5min。在离心之后，在浓度为5×106/ml PBS下将沉淀物重新悬浮于PBS中并且然后将4ml/12×75mm转移至无菌管中。
根据制造商的说明书制备FACs Aria用于活细胞无菌分选(BD FACs AriaUser Manual)。将样品管负载到FACs Aria中并且在获取开始之后调整PMT电压。使用特定波长使用荧光强度绘制门以选择肾脏特定细胞类型。绘制另一个门以选择阴性群。一旦已经绘制希望的门以包封阳性靶群和阴性群，使用制造商的说明书分选细胞。
在一个15ml锥形管中收集阳性靶群并且在另一个15ml锥形管中的阴性群用1ml肾脏细胞培养基填充。在收集之后，通过流式细胞计量术分析来自每个管的样品以确定纯度。通过在300xg下离心来洗涤收集的细胞持续5min并且将沉淀物重新悬浮于肾脏细胞培养基中用于进一步分析和实验。
实施例11
使用磁性细胞分选富集/消耗肾脏细胞类型
从分离的原代肾脏组织中可以富集一种或多种分离的肾脏细胞和/或可以消耗一种或多种特定肾脏细胞类型。
试剂：70％乙醇、洗涤缓冲液(PBS)、50:50肾脏细胞培养基(50％DMEM高葡萄糖)：50％角化细胞-SFM、台盼蓝0.4％、运行缓冲液(PBS，2mM EDTA，0.5％BSA)、冲洗缓冲液(PBS，2mM EDTA)、清洗溶液(70％v/v乙醇)、Miltenyi FCR阻断试剂、特异于IgG同种型的Miltenyi微珠、靶抗体如CD31(PECAM)或肾小球足细胞特异性蛋白或二级抗体。
工序：在用于清洗生物学安全工作橱(BSC)的标准工序之后，获得来自原代分离或培养的肾脏细胞的单一细胞悬浮液并且重新悬浮于肾脏细胞培养基中。使用台盼蓝排阻方法确定细胞计数和活力。对于从异质群中肾脏细胞富集/消耗例如肾小球细胞或内皮细胞，获得具有至少70％活力的至少106个高达至4×109个活细胞。
基于目标靶细胞确定用于富集/消耗方法的最佳分离。对于使用肾小球足细胞特异性蛋白抗体富集小于10％目标频率例如肾小球细胞，使用MiltenyiautoMACS或等效的仪表程序POSSELDS(灵敏模式下的双阳性选择)。对于消耗大于10％目标频率，使用Miltenyi autoMACS或等效的仪表程序DEPLETES(灵敏模式下的消耗)。
通过将1μg/106个细胞/0.1ml的PBS连同0.05％BSA添加于15ml锥形离心管中，接着在4℃下孵育15分钟来用靶特异性一级抗体标记活细胞，例如对于肾小球细胞为肾小球足细胞特异性蛋白重组多克隆抗体。
在标记之后，通过添加1-2ml缓冲液/107个细胞，接着在300xg下离心5min来洗涤细胞以去除未结合的一级抗体。在洗涤之后，添加1ug/106/0.1ml的PBS连同0.05％BSA的同种型特异性二级抗体如鸡抗-兔PE，接着在4℃下孵育15分钟。
在孵育之后，通过添加1-2ml缓冲液/107个细胞，接着在300xg下离心5min来洗涤细胞以去除未结合的二级抗体。去除上清液，并且将细胞沉淀物重新悬浮于60μl缓冲液/107总细胞中，接着添加20μl的FCR阻断试剂/107总细胞，然后使其充分混合。
添加20μl的直接MACS微珠(如抗PE微珠)并且混合然后在4℃下孵育15min。
在孵育之后，通过添加10-20倍标记体积缓冲液来洗涤细胞并且在300xg下离心细胞悬浮液持续5min并且将细胞沉淀物重新悬浮于500μl-2ml缓冲液/108个细胞中。
根据制造商的说明书，清洗autoMACS系统并且使用autoMACS准备制备用于磁性细胞分离。在出口端口下放置新的无菌收集管。选择autoMACS细胞分离程序。对于选择，选择POSSELDS程序。对于消耗，选择DEPLETES程序。
将标记的细胞插入在摄取端口处，然后开始程序。在细胞选择或消耗之后，收集样品并且放于冰上直到使用。通过流式细胞计量术证实消耗的或选择的样品的纯度。
实施例12
富集的异质肾细胞群的表型表征
以下实施例详细描述了使用流式细胞计量术来表征实施例5的选择的异质人肾细胞。异质肾细胞群基本上由众所周知其再生潜力的肾上皮细胞组成。其它实质(血管)细胞和基质(集合管)细胞可以稀少地存在于自体细胞群中。
使用流式细胞计量术通过表达分析肾细胞标志物来监测细胞表型。细胞的表型分析基于使用特异于被分析的细胞类型的抗原标志物。流式细胞计量术分析提供了样品群中的细胞的定量测量，所述细胞表达被分析的抗原标志物。
在文献中已经报道了有用于表型表征肾细胞的各种标志物：(i)细胞角蛋白；(ii)转运膜蛋白(水通道蛋白和cubilin)；(iii)细胞结合分子(粘附蛋白、分化簇以及凝集素)；以及(iv)代谢酶(谷胱甘肽)。因为存在于来源于全肾脏消化物的培养物中的大多数细胞为上皮细胞和内皮细胞，所以所检验的标志物集中在表达特异于这两组的蛋白质上。
细胞角蛋白为由许多类型上皮细胞表达至不同程度的中间丝蛋白的家族。由上皮细胞表达的细胞角蛋白的子集取决于上皮类型。例如，细胞角蛋白7、细胞角蛋白8、细胞角蛋白18和细胞角蛋白19均由肾脏的正常简单上皮表达并且保留泌尿生殖道以及消化道和呼吸道。组合的这些细胞角蛋白负责上皮细胞的结构完整性。这个组合表示酸性(I型)和碱性(II型)角蛋白家族并且丰富表达存在于肾细胞中(Oosterwijk等,J Histochem Cytochem,38(3):385-392,1990)。用于本文中的优选细胞角蛋白为CK8、CK18、CK19以及其组合。
水通道蛋白为允许水穿过细胞之中和之外同时防止离子和其它溶质穿过的转运膜蛋白。存在在文献中描述的十三种水通道蛋白，其中这些水通道蛋白中的六种存在于肾脏中(Nielsen等,J Histochem Cytochem,38(3):385-392,2002)。通过对调节水流量施加严格控制的水通道蛋白2负责对水具有高穿透性的肾收集管上皮细胞的血浆膜，因此容许水在渗透梯度的方向上流动(Bedford等,J Am Soc Nephrol,14(10):2581-2587,2003；Takata等,HistochemCell Biol,130(2):197-209,2008；Tamma等,Endocrinology,148(3):1118-1130,2007)。水通道蛋白1为近端肾小管的特征(Baer等,Cells Tissues Organs:184(1),16-22,2006；Nielsen等,2002,同上)。
cubilin为转运膜受体蛋白。当它与蛋白质巨蛋白共同定位时，它们在一起促进cubilin结合的配体如白蛋白的内化。cubilin位于肠和肾脏的上皮内(Christensen,.Am J Physiol Renal Physiol,280(4):F562-573,2001)。
CXCR4为用作SDF1的趋化因子受体的转运膜蛋白。当配体结合时，细胞内钙水平增加并且MAPK1/MAPK3激活增加。CXCR4被组成型表达于肾脏中并且在肾脏发展和肾小管发生中起重要作用(Ueland等,Dev Dyn,238(5):1083-1091,2009)。
钙粘蛋白为钙依赖型细胞粘附蛋白。它们被分为四组(其中E-钙粘蛋白存在于上皮组织中)并且涉及调节移动性和增殖。E-钙粘蛋白为跨膜糖蛋白，其已经被发现位于构成肾脏中的远端肾小管的上皮细胞的粘附蛋白交界处(Prozialeck等,BMC Physiol,4:10,2004；Shen等,Mod Pathol,18(7):933-940,2005)。
DBA(二花扁豆凝集素)为在肾集合管结构的表面上携带的α-N-乙酰基半乳糖胺结合凝集素(细胞结合蛋白)，并且被认为和用作发展肾集合管和远端肾小管的一般标志物(Michael等,J Anat 210(1):89-97,2007；Lazzeri等,JAm Soc Nephrol 18(12):3128-3138,2007)。
分化抗原簇31(CD31；又称为血小板内皮细胞粘附分子，PECAM-1)为由选定的免疫细胞以及内皮细胞群表达的细胞粘附蛋白。在内皮细胞中，这种蛋白质聚集在细胞边缘处(DeLisser,1997)。分化抗原簇146(CD146)涉及与肌动蛋白细胞骨架相关的细胞间交界处的内皮细胞的细胞粘附和内聚。由血管内皮和平滑肌强烈表达的CD146目前用作用于内皮细胞谱系的标志物(Malyszko等,J Clin Endocrinol Metab,89(9):4620-4627,2004)，并且为CD31的犬等效物。
γ-谷氨酰转肽酶(GGT)为催化谷胱甘肽的γ-谷氨酰部分转移至可为氨基酸、肽或水的受体以形成谷氨酸的代谢酶。这种酶还在合成和降解谷胱甘肽和转移氨基酸穿过细胞膜方面起作用。GGT存在于许多组织的细胞膜中，包括肾脏的近端肾小管细胞(Horiuchi等,Eur J Biochem,87(3):429-437,1978；Pretlow等,J Histochem Cytochem,35(4):483-487,1987；Welbourne等,Am JPhysiol,277(4Pt 2):F501-505,1999)。表12.1提供了如通过流式细胞计量术所检测的表达这些标志物的肾细胞的特定类型的列表。
表12.1用于SRC表征的表型标志物
抗原标志物 反应性
CK8/18/19 上皮细胞，近端肾小管和远端肾小管
CK8 上皮细胞，近端肾小管
CK18 上皮细胞，近端肾小管
CK19 上皮细胞，集合管，远端肾小管
CK7 上皮细胞，集合管，远端肾小管
CXCR4 上皮细胞，近端肾小管和远端肾小管
E-钙粘蛋白 上皮细胞，远端肾小管
Cubilin 上皮细胞，近端肾小管
水通道蛋白1 上皮细胞，近端肾小管，降细支
GGT1 胎儿和成人肾脏细胞，近端肾小管
水通道蛋白2 肾集合管细胞，远端肾小管
DBA 肾集合管细胞，远端肾小管
CD31 肾脏内皮细胞(大鼠)
CD146 肾脏内皮细胞(犬，人)
研究实施例5的SRC细胞的特异性生物标志物的表型。
对于免疫表型：将特异性抗体添加至100毫升细胞悬浮液中并且在黑暗中在4℃下孵育混合物持续30-45分钟。在孵育之后，用PBS洗涤细胞并且离心以去除过量抗体。将细胞重新悬浮至细胞/毫升PBS并且通过流式细胞计量术分析。用FACSAria流式细胞仪(Becton Dickinson)和FlowJo软件(Treestar,Inc.)进行流式细胞分析。用来表征表面标志物表型的抗体示于表12.2和表12.3中。在所有实验中使用同种型特异性一级抗体阴性对照。适当的同种型匹配的对照用来门控阴性群。
表12.2.在IND中报道的NKA中的人SRC的表型小组
缩写：Gt，山羊；Ms，小鼠；mAb，单克隆抗体；pAb，多克隆抗体；Rb，兔。
表12.3.用于评估人SRC的额外表型标志物
从贴壁培养物的初始组织解离或胰蛋白酶化中产生细胞悬浮液并且通过流式细胞计量术分析以鉴定细胞组分。所采用的抗体列于表12.2和表12.3(以上)中。在所有实验中使用同种型特异性一级抗体阴性对照。用FACSAria流式细胞仪(Becton Dickinson)和FlowJo软件(Treestar,Inc.)分析标记的细胞。适当的同种型匹配的对照用来门控阴性群。在4℃下过夜孵育之后，使细胞成沉淀，用Triton缓冲液(0.2％Triton X-100的PBS溶液)洗涤两次，重新悬浮于含有缀合至荧光染料Alexa A647(Invitrogen)的二级抗体山羊抗小鼠IgG2A的1mL DBPS中，并且孵育额外的30分钟。然后洗涤细胞并且重新悬浮于1mL PBS中用于使用FACSAria和FlowJo软件根据制造商说明书来分析。作为阴性对照，与缀合至相同荧光染料的同种型匹配的单克隆抗体平行孵育细胞。
图5(表型分布)示出绘制成群中的每个表型的百分率值的这些标志物在SRC群中的定量表达。
CK8/18/19为跨物种检测的最一致表达的肾细胞蛋白。GGT1和水通道蛋白-1(AQP1)被一致表达，但在不同水平下。还在中等水平下观察到DBA、水通道蛋白2(AQP2)、E-钙粘蛋白(CAD)、CK7以及CXCR4，虽然具有更多变异性，并且在表达上CD31/146和Cubilin最低。表12.4提供了SRC中的表型的选择的标志物、范围和平均百分率值以及用于其选择的基本原理。
表12.4选择用于SRC的表型分析的标志物
*集合管上皮细胞基于其浮力密度在SRC中被预期为较低的
SRC基因表达
还测试了通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)从人肾细胞培养物中分离的SRC的基因表达特征(包括水通道蛋白2、E-钙粘蛋白、cubulin、VEGF以及CD31的那些基因表达特征)的蛋白质产生。表12.5中的基因型标志物表示可能预期存在于肾细胞培养物中的细胞群。NCAD、Cubilin和CYP2R1为肾小管上皮细胞的标志物，AQP2和ECAD为集合管和远端肾小管的标志物。肾小球足细胞裂隙膜蛋白和肾小球足细胞特异性蛋白为足细胞的标志物。VEGF和CD31为内皮标志物。VEGF和EPO为氧响应基因，其中相关的mRNA存在于各种不同组织和细胞类型中。
所使用的基因探针从TaqMan中获得。在70％-90％汇合下收获第2代人肾细胞。根据用于从动物细胞中纯化总RNA的方案使用Qiagen的RNeasyPlus Mini Kit从细胞中纯化RNA。根据制造商的说明书使用Invitrogen的VILOTM cDNA合成试剂盒从体积等于1.4μg的RNA中产生cDNA。用于SRC群(n＝3)的平均qPCR数据示于表12.5中。
结果表明肾小管上皮细胞群存在，如通过相对较高水平的NCAD、Cubilin和CYP2R1表达所证明。远端集合管肾小管和远端肾小管标志物AQP2和ECAD为相对低的并且CD31(内皮标志物)甚至为更低的(表12.5)。
表12.5人SRC的基因表达分析
基于早期基因型评估已经选择了表型标志物和功能性标志物。VEGF基因表达水平为高的并且水通道蛋白2基因表达水平为低的，其与蛋白质分析数据一致(表12.4和表12.6)。
SRC酶促活性
通过PrestoBlue的代谢和VEGF和KIM-1的产生来显示有活力的细胞和SRC功能存在。
SRC积极地分泌可以通过分析调节的培养基来检测的蛋白质。通过细胞代谢PrestoBlue和分泌VEGF(血管内皮生长因子)和KIM-1(肾脏损伤分子-1)的能力来评价细胞功能。
可以在NKA中通过其代谢PrestoBlue的能力来监测有活力的功能细胞。PrestoBlue细胞活力试剂为基于改性的刃天青的测定试剂，其为细胞可渗透的非荧光蓝色染料。在进入足以有活力增殖的细胞中时，染料经过涉及脱氢酶的天然细胞过程还原成可以通过荧光或吸光度测量的亮红色荧光团。
生物分子VEGF和KIM-1表示从提议作为肾脏损伤和功能的灵敏性和特异性分析非临床生物标志物的那些中的分子的选择(Sistare,2010；Warnock,2010)。在体内，这些标志物指示肾小管功能、损伤和/或修复，并且在体内为公认的肾小管上皮细胞培养物的特征。KIM-1为锚定在肾近端肾小管细胞的膜中的细胞外蛋白，其用作识别和吞噬在损伤和细胞更新过程中流出的凋亡细胞。由肾脏细胞组成型表达的VEGF为促进细胞分裂、迁移、内皮细胞存活以及血管芽生的关键血管生成和促存活因子。SRC已经被表征为组成型表达的VEGF mRNA(表12.5)和积极地产生蛋白质(表12.6)。这些蛋白质可以在暴露于肾细胞和SRC的培养基中检测到。表12.6呈现来自肾细胞和SRC培养物的存在于调节的培养基中的VEGF和KIM-1量。将肾细胞培养至接近汇合。测试来自过夜暴露于肾细胞培养物和SRC的调节的培养基的VEGF和KIM-1。
表12.6通过人肾细胞和SRC产生VEGF和KIM-1
还通过测量存在于肾脏近端肾小管中的两种特异性酶GGT(γ-谷氨酰转肽酶)和LAP(亮氨酸转氨酶)(Chung,1982,J Cell Biol 95(1):118-126)的活性来评估SRC的细胞功能(预配制)。测量细胞中的这些酶的活性的方法利用了溶液中的酶特异性底物，当这些酶添加至表达活性酶的细胞中时被裂解，释放生色产物(Nachlas,1960J Biophys Biochem Cytol 7:261-264；Tate,1974ProcNatl Acad Sci USA 71(9):3329-3333)。测量细胞暴露的溶液的吸光度并且所述吸光度为相对于从活性酶中产生的裂解产物的量。针对GGT所利用的底物为L-谷氨酸γ-对硝基苯胺(γ-p-nitroanalide)盐酸盐并且对于LAP为L-亮氨酸对硝基苯胺。图6示出在从人供体(BP1-BP4)中产生的六个SRC样品中的LAP和GGT活性。
SRC表征的总结
在细胞扩增过程中通过将培养观察与图像文库中的图像比较来监测细胞形态。在每个细胞代中监测细胞生长动力学。细胞生长被预期为患者与患者之间可变的。通过台盼蓝染料排阻和/或PrestoBlue代谢来监测SRC计数和活力。SRC特征在于CK18、GGT1的表型表达。此外，可以监测AQP2表达。PrestoBlue的代谢和VEGF和KIM-1的产生用作有活力和功能性SRC存在的标志物。可以用基因表达特征和用LAP和GGT测量酶促活性来进一步阐明SRC功能。
实施例13
生物材料制备
用于NKA的生物材料(明胶溶液)经由两个关键参数来表征：
浓度–使用分光光度计通过在280nm处的吸光度来测量明胶溶液的浓度。从吸光度与浓度的校正曲线确定明胶浓度。
反转测试–反转测试提供了明胶溶液在2℃-8℃下形成和维持凝胶的能力并且在室温下凝胶液化的视觉评价。
其它生物材料特征的阐明
用于NKA中的生物材料可以被进一步表征流变性质和粘性。将仅出于证实目的进行流变性和粘性测试并且意图用于从其它供应者获得的生物材料的膨胀特征。
可以通过使用Couette细胞型流变仪首先在4℃下测量生物材料的流变性质，然后在25℃下。在每个温度下使样品平衡至少30分钟。在较低温度下的可接受的储能模量(G’>10)反映溶液在2℃-8℃的NKA运输和转运温度下形成和维持凝胶的能力。在较高温度下的可接受的耗能模量(G”<10)反映递送和植入NKA所需要的在室温下凝胶液化的能力。
使用锥板式粘度计在37℃和200s-1-300s-1的剪切速率下测量生物材料的粘度。具有1.05-1.35cP范围内粘度的溶液可以通过18-27号针有效递送。
在用于NKA配制的准备中，将明胶溶解于DPBS至指定的浓度(0.88％±0.12％w/v)以形成明胶溶液(图2D)。通过0.1μm过滤器无菌过滤明胶溶液并且分装到管中。在冷冻或配制NKA之前取得样品用于释放明胶溶液。凝胶化的水凝胶被冰箱储存或冷冻呈准备配制的散状材料(图2D)。
实施例14
NKA配制
使用台盼蓝染料排阻计数来自实施例5的洗涤的SRC。使明胶溶液从冷储存中移除并且通过加温使其液化至26℃-30℃。离心含有需要的细胞数的SRC悬浮液体积并且重新悬浮于液化的明胶溶液用于最终洗涤步骤。离心这个悬浮液并且将SRC沉淀物重新悬浮于足够的明胶溶液中以在配制的NKA中实现所得到的100×106个细胞/mL的SRC浓度(图2D)。
NKA被呈现于无菌单次使用的10mL注射器中。从100×106个SRC/mL的NKA浓度和3.0×106个SRC/g肾脏重量的目标剂量(通过MRI所估算)中计算最终体积。
实施例15
NKA填充和凝胶化
将NKA产品无菌地填充到BSC中的NKA包装中的注射器中用于组织加工和细胞培养操作(图2D)。进行动态空气取样持续填充过程的持续时间，包括有活力和无活力的取样。
配制的NKA被包含于50mL无菌离心管中。将无菌插管附接至10mL转移注射器。经过插管从50mL管中手动地将NKA抽到转移注射器中。去除插管并且将转移注射器连接至NKA包装管线末端处的锁紧套口接头。通过压下转移注射器上的活塞将NKA转移至NKA包装中的注射器。将最小8.5mL的产品转移至NKA包装中的注射器。通过倒置注射器并且缓慢压下活塞来去除捕获于注射器中的空气。在填充完成之后，用RF密封件密封NKA包装上的管线。将转移注射器中的剩余产品返回至50mL管中。从50mL管中取得品质控制(释放测试)样品。旋转NKA包装持续最小2小时以保持细胞处于悬浮同时冷却至2℃-8℃以形成最终凝胶化的NKA(图2D)。
对于凝胶化发生需要快速冷却以使得细胞不在明胶溶液中沉降。当它放入冰箱条件中时监测注射器中的明胶溶液的温度。观察到快速温度下降。1小时之后，温度已经下降至最终温度4.4℃的正负0.3℃范围内。
明胶溶液的冷却使凝胶化过程开始，但对于形成的凝胶稳定需要有限时间以使得SRC在储存时将保持悬浮于凝胶中。使含有配制的NKA的注射器旋转过夜或持续1.25小时并且然后保持直立过夜。随后，去除内含物并且在四个不同产品部分中测量细胞浓度。分析表明在四个部分中不存在差异，因此一旦NKA在冷温度下旋转持续最小1.25小时就没有可测量的细胞沉降发生(数据未示出)。
实施例16
NKA包装和运输
NKA连同适当的文件一起被包装到NKA运输器中。运输器被设计成在转运至临床部位过程中维持2℃-8℃的温度范围。冷却的(凝胶化的)配制的产品贮藏期限为3天。
与NKA包装一起包括温度记录仪以监测运输过程中的温度。通过品质组针对记录在运输/接收登记本中的独特患者身份来证实NKA的批号。经过快递或类似的安全转运使NKA运输器运输至临床部位。
实施例17
NKA(SRC细胞群)的植入
本实施例显示出选择的异质人肾细胞的再生性质。
NKA递送系统
NKA递送系统基本上由与细胞递送相容的插管(针)和注射器组成。不同供应者使用术语插管或针以描述细胞递送产品。出于这种描述，术语插管和针可互换使用。所提出的临床试验利用了与用于适应人大小和解剖的动物研究中相同的递送系统(插管和注射器)。使用了腹腔镜检查外科手术。
NKA递送系统的主要部件为插管。使用了与NKA相容的插管。
NKA植入
在用于植入的准备中，就在注射到肾脏之前允许NKA加温至室温以液化产品。
NKA经过与细胞递送相容的针或插管和注射器被靶向用于注射到肾脏皮质中。使用穿刺针(插管)穿透肾脏被膜允许递送针/插管引入到肾脏皮质中。将含有NKA的注射器附接至递送针并且将NKA注射到多个部位中进入肾脏皮质。图7中的示意图示出使用与细胞递送和分布到实体器官中相容的针将NKA注射到肾脏中的概念。
将NKA直接递送到肾脏皮质中。患者中的NKA递送使用了标准化的腹腔镜检查手术。
应该理解本文所描述的实施例和实施方案仅出于说明目的，并且将建议本领域技术人员根据它们进行各种修改或变化，并且它们被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。出于所有目的，本文所引用的所有出版物、专利和专利申请特此以引用的方式整体并入。

Claims (19)

1.一种富集的异质哺乳动物肾细胞群，其表达生物标志物GGT-1和细胞角蛋白。
2.根据权利要求1所述的细胞群，其中所述生物标志物通过单克隆抗体或多克隆抗体来检测。
3.根据权利要求1所述的细胞群，其中大于18％的所述细胞表达GGT-1。
4.根据权利要求1所述的细胞群，其中所述细胞角蛋白选自CK8、CK18、CK19以及其组合。
5.根据权利要求4所述的细胞群，其中所述细胞角蛋白的所述表达水平大于80％。
6.根据权利要求1所述的细胞群，其中所述细胞角蛋白通过多克隆抗体来检测。
7.根据权利要求1所述的细胞群，其中所述细胞群表达AQP。
8.根据权利要求1所述的细胞群，其中小于40％的所述细胞表达AQP2。
9.根据权利要求7所述的细胞群，其中所述AQP2通过单克隆抗体来检测。
10.根据权利要求1所述的细胞群，其中所述哺乳动物为人。
11.一种鉴定适合用于植入和/或诱发再生反应的异质肾细胞群的方法，其包括以下步骤
从哺乳动物肾脏样品中分离出细胞
使所述分离的细胞暴露于一个或多个被标记的检测部分，其中每个被标记的检测部分针对不同的生物标志物并且用不同的标记进行标记
确定表达每个所述不同生物标志物的细胞的百分率。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述生物标志物选自AQP1、AQP2、AQP4、钙结合蛋白(Calbindin)、钙调节蛋白(Calponin)、CD117、CD133、CD146、CD24、CD31(PECAM-1)、CD54(ICAM-1)、CD73、CK18、CK19、CK40至CK67、CK7、CK8、CK8、CK18、CK19、CK8、CK18和CK19的组合、连接蛋白43、Cubilin、CXCR4(融合素)、DBA、E-钙粘蛋白(CD324)、EPO(促红细胞生成素)、GGT1、GLEPP1(肾小球上皮蛋白1)、结合球蛋白、Itgb1(整联蛋白β1)、KIM-1/TIM-1(肾脏损伤分子-1/含T-细胞免疫球蛋白和粘蛋白的分子)、MAP-2(微管相关蛋白2)、巨蛋白(Megalin)、N-钙粘蛋白、肾小球足细胞特异性蛋白(Nephrin)、NKCC(Na-K-Cl-协同转运蛋白)、OAT-1(有机阴离子转运蛋白1)、骨桥蛋白、Pan-钙粘蛋白、PCLP1(足细胞蛋白(podocalyxin)样1分子)、肾小球足细胞裂隙膜蛋白(Podocin)、SMA(平滑肌α-肌动蛋白)、突触极蛋白(Synaptopodin)、THP(塔霍二氏蛋白(tamm-horsfallprotein))、波形蛋白(Vimentin)、αGST-1(α谷胱甘肽S-转移酶)以及其组合。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述被标记的检测部分为抗体。
14.一种治疗哺乳动物中的肾脏疾病的方法，其包括向所述患者施用异质肾细胞群，其中所述细胞群表达选自由以下组成的组的两种或更多种生物标志物：GGT-1、AQP2和细胞角蛋白。
15.一种治疗哺乳动物中的肾脏疾病的方法，其包括向所述患者施用异质肾细胞群，其中所述细胞群内的细胞对于GGT-1和CK18分别具有大于18％和80％的表达水平。
16.一种治疗哺乳动物中的肾脏疾病的方法，其包括向所述患者施用异质肾细胞群，其中所述细胞群内的细胞以表12.4中的表达水平表达GGT-1、AQP2和CK18。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述细胞群在基质上培养。
18.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述细胞群悬浮于明胶基生物材料中。
19.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述哺乳动物为人。
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