RU2373942C2 - Способ лечения хронической и острой почечной недостаточности с помощью фетальных стволовых и прогениторных клеток - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, в частности к клеточной медицине и нефрологии, и касается лечения почечной недостаточности. Для этого получают донорский фетальный материал, кроме человеческого, содержащий монокультуру или смешанную культуру популяции клеток, включающий культуру стволовых клеток, состоящую из гемопоэтических и мезенхимальных клеток. Указанные клетки выделяют в виде суспензии из фетального костного мозга трубчатых костей и/или в виде культуры прогениторных клеток, из эпителиальных и мезенхимальных клеток из фетальных почек. Далее первичную клеточную суспензию указанных клеток культивируют до состояния монослоя в питательной ростовой среде DMEM/F-12 в соотношении 1:1 с добавлением 10% телячьей сыворотки и 0,02% гентамицина. Затем полученный клеточный донорский материал вводят объекту лечения в виде суспензии в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов от 5 до 20 млн клеток на 1 кг веса объекта лечения. За счет использования смешанной культуры костномозговых и мезенхимальных стволовых клеток фетальных почек способ обеспечивает эффективную нормализацию показателей функции почек при острой хронической или хронической почечной недостаточности в течение 4-11 дней после интрапаренхиматозного или внутривенного введения суспензии указанных клеток. 10 з.п. ф-лы, 4 табл.

Description

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения почечной недостаточности и особенно для лечения хронической и острой почечной недостаточности с помощью клеточного донорского материала, а конкретно с помощью фетальных стволовых и прогениторных клеток.

Острое и хроническое нарушение функции почек является частым состоянием, угрожающим жизни больного. При хронической почечной недостаточности (ХПН) возникает необходимость поддержания или полной замены функции поврежденного органа путем диализа или трансплантации почки.

Известны способы лечения больных, страдающих почечной недостаточностью, путем фильтрации крови. Кровь последовательно пропускают через гемофильтрационный элемент и гемодиализный элемент, а ультрафильтрат - через выпускной соединитель гемофильтрационного элемента и фильтр, предпочтительно с активированным углем не покрытым оболочкой, вводится в виде регенерированного ультрафильтрата в канал. Таким образом, очищенный ультрафильтрат используют в качестве реинфузионного раствора для повторного введения больному (RU 2086264, МПК 6 A61M 1/38, A61M 1/34, опубликовано 10.08.1997). Или путем комплексного воздействия бикарбонатного гемодиализа и гемодиафильтрации и с изолированной ультрафильтрацией крови, медикаментозной нефропротективной терапией и автоматизацией управления лечебным процессом за счет использования гемодиализной базы данных, компьютерной обработки и оперативного вычисления исходных данных, организации и использования наглядного графического изображения, таблиц, речевых комментариев и внедрения урологических объектов о пациентах, времени, количестве, дозах выдачи-приема и результатах действия назначаемых лекарственных средств с указанием диагнозов и фамилий пациентов (RU 2154499, МПК 7 A61M 1/34, опубликовано 20.08.2000).

Однако при проточном гемодиализе за один сеанс через диализатор пропускают до 200 л диализирующего раствора, который сливают, что требует большого расхода концентрата диализата и воды. Кроме того, наряду с токсинами из крови удаляется ряд полезных веществ, что приводит к возникновению различных осложнений и требует последующих дополнительных процедур по корректировке состава крови.

Проблемы детоксикации организма решаются в аппаратах «искусственная почка» способом, при котором в процессе циркуляции диализирующего раствора устанавливают время контакта диализирующего раствора с платинированным углем фильтра не менее 10 с, измеряют концентрацию гипохлорита натрия перед фильтром, поддерживая ее на уровне 50±10 мг/л путем регулирования плотности тока питания электролизера, устанавливая в начале сеанса максимальную ее величину, а затем снижая ее так, чтобы концентрация гипохлорита натрия оставалась в указанных допустимых пределах. Кроме того, для коррекции pH в исходный состав диализирующего раствора очистного контура включена дополнительно буферная добавка, например бикарбонат натрия в концентрациях от 3 до 5 мг/л (RU 2110283, МПК 6 A61M 1/14, опубликовано 10.05.1998).

Известны способы гемодиализа и гемодиафильтрации. Во-первых, необходимость наличия стерильного апирогенного замещающего раствора или нормотонического раствора, сбалансированного по электролитному составу в емкости по 4-5 литров, во-вторых - специального оборудования в виде аппарата «Искусственная почка» с объемным контролем ультрафильтрации, способного осуществлять последнюю со скоростью не менее 3000 мл/ч, в-третьих, для безопасной гемофильтрации обязательно наличие специальной системы, осуществляющей дозированную инфузию замещающего раствора (перфузионный насос), и контроль за процессом путем взвешивания емкостей с раствором в ходе всей процедуры. Необходимо также постоянно контролировать соответствие показателей инфузии и ультрафильтрации с учетом объема жидкости, накопившейся в междиализный период. При этом ошибки в 1,5-2 литра могут привести к серьезным осложнениям, связанным с гипер- и гиповолемией.

Однако потребности в этих видах лечения намного опережают возможности современной медицины как в России, так и в других развитых странах. После трансплантации почки больным с терминальной стадией ХПН часто развивается острая функциональная недостаточность трансплантата, что требует длительного проведения вспомогательного гемодиализа, утяжеляет течение послеоперационного периода, ухудшает условия диагностики кризов отторжения трансплантата и в конечном итоге негативно влияет на ближайшие и отдаленные результаты операции. Методов лечения этого состояния пока не разработано. При острой почечной недостаточности (ОПН) как ишемического, так и токсического генеза несмотря на выявление новых эффективных медикаментозных средств в экспериментальных исследованиях в последнее десятилетие не отмечается существенного прогресса в эффективности лечения этой тяжелой ситуации. В связи с этим ведутся исследования альтернативных методов вспомогательной или заместительной почечной терапии, в частности изучается возможность клеточной терапии с использованием различных типов стволовых клеток.

Известен способ терапевтической трансплантации фетальной ткани почки и печени человека на 49-56-й день гестации или свиньи на 28-29-й дни гестации под капсулу почки, в ткань почки, в переднюю камеру глаза, в сальник, в петли кишечника, в брюшную полость без или с дополнительным введением моноцитов периферической крови и иммунодепрессантов (публикация заявки США №20050226854, от 13.10.2005, «Therapeutic transplantation using developing, human or porcine, renal or hepatic, grafts»). Показано, что при пересадке мышам (иммунокомпетентным и иммунодефицитным), из пересаженных клеток формируется ткань почки с зонами, содержащими клубочки и канальцы, с прорастанием в нее сосудов и с образованием кист, содержащих первичную мочу. Однако новообразованная почечная ткань не интегрируется с мочевой системой почки реципиента, поэтому функциональный эффект данного метода сомнителен. В описании патента о функциональных последствиях применения данного способа не указывается. Для пересадки используется некультивированная фетальная ткань почки или печени и в связи с ее небольшими размерами она вряд ли сможет обеспечить улучшение функции почки взрослого человека, или же надо использовать ткань сразу из нескольких источников, что также проблематично. Кроме того, этот способ предусматривает использование иммунодепрессантных препаратов, которые обладают существенными побочными эффектами и могут вызывать серьезные осложнения, опасные для жизни пациента.

Известен также способ лечения острой и хронической сердечной недостаточности, нарушения функции печени, почек, эндокринных органов, предусматривающий получение стволовых клеток из моноцитов периферической крови взрослого человека путем их дедифференцировки при культивировании в питательной среде, содержащей макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-CSF) и интерлейкин-3 (IL-3) и их трансформации в зрелые клетки различных тканей (миоциты, адипоциты, нейроны и нейроглию, эндотелий, инсулин-продуцирующие клетки, кератиноциты) при культивировании с добавлением питательной среды, в которой культивировали тот или иной вид зрелых клеток от того же индивидуума (клетки-мишени) (публикация заявки США №20050233477, от 20.10.2005, «Dedifferentiated, programmable stem cells of monocytic orgin, and their production and use»). Недостатками метода является необходимость длительного культивирования выделенных стволовых клеток, многоэтапность культивирования, а также необходимость получения аутологичных зрелых соматических клеток пациента путем биопсии соответствующих ткани или органа.

Известен также способ лечения острой и хронической почечной недостаточности, а также полиорганной недостаточности и ускорения заживления ран при помощи введения аллогенных или аутологичных костномозговых стволовых клеток взрослого человека (комбинация или раздельное введение гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток), введения продифференцированных культивированием мезенхимальных костномозговых клеток (орган-специфических клеток-предшественников, например эндотелиальных, клубочковых, канальцевых) или гемангиобластов, а также введением стимуляторов выброса стволовых клеток (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, макрофагальный КСМ, фактор стимуляции стволовых клеток, интерлейкины-1,2,3,4,6,7,8,11,12, эритропоэтин и др.) (Международная заявка W02004090112. A61K 38/00, «STEM CELL, PRECURSOR CELL, OR TARGET CELL-BASED TREATMENT OF MULTI-ORGAN FAILURE AND RENAL DYSFUNCTION RELATED APPLICATIONS», опубликовано 21.10.2004). Недостатками данного способа является необходимость пункции костного мозга больного человека для получения собственных костномозговых гемопоэтических и мезенхимальных клеток. Необходим также длительный период культивирования для получения достаточного количества стволовых клеток, которые смоли бы обеспечить необходимый функциональный эффект, а при острой почечной или острой печеночной недостаточности такого периода времени, как правило, нет. При использовании чужеродных (аллогенных) гемопоэтических стволовых клеток высока вероятность развития реакции «трансплантат-против-хозяина» и это требует применения иммунодепрессантов, которые, как указывалось выше, сами по себе могут вызвать серьезные осложнения. В частности, наиболее распространенный в настоящее время иммунодепрессант циклоспорин в случае превышения дозы обладает выраженной нефротоксичностью, что делает его крайне опасным для больных с уже нарушенной функцией почек. Прекультивирование стволовых клеток для получения более дифференцированных клеток-предшественников требует многоэтапного культивирования, длительного периода времени и сложно в реализации.

Технической задачей изобретения является разработка способа лечения хронической и острой почечной недостаточности с помощью фетальных стволовых и прогениторных клеток, лишенного вышеуказанных недостатков способов-прототипов.

Поставленная техническая задача достигается тем, что в способе лечения хронической и острой почечной недостаточности, включающем получение донорского материала и введение его объекту лечения, получают донорский материал, содержащий моно- или смешанную культуру популяции клеток, включающей культуру стволовых клеток, состоящую из гемопоэтических и мезенхимальных клеток, выделенных в виде суспензии из фетального костного мозга трубчатых костей, и/или культуру прогениторных клеток, состоящую из эпителиальных и мезенхимальных клеток, выделенных в виде суспензии из фетальных почек, с последующим культивированием первичной клеточной суспензии этих клеток до состояния монослоя в питательной ростовой среде DMEM/F-12 в соотношении 1:1 с добавлением 10% телячьей сыворотки и 0,02% гентамицина; полученный клеточный донорский материал вводят объекту лечения в виде суспензии в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов от 5 до 20 млн клеток на 1 кг веса объекта лечения.

Способом по изобретению культивированные клетки (клеточный донорский материал) вводят объекту лечения с хронической почечной недостаточностью непосредственно в поврежденную почку или в почечную артерию, или системно (внутривенно).

Согласно способу по изобретению стволовые костномозговые клетки (из фетального костного мозга трубчатых костей) вводят в количестве 1 млн клеток на 1 кг веса в каждую почку, а прогениторные клетки из фетальных почек вводят в количестве 1 млн клеток на 1 кг веса в каждую почку.

Итак, способ по изобретению предполагает реализацию нескольких этапов, а именно, этапа получения донорского материала, этапа культивирования и этапа пересадки культивированных клеток объекту лечения.

В качестве донорского материала используют фетальные почки и фетальный костный мозг трубчатых костей, например, свиньи. Из фетальных почек различных сроков гестации получают суспензию эпителиальных и мезенхимальных клеток, которые в последующем культивируют в специальных условиях. Клетки культивируют на среде DMEM и F-12 (в соотношении 1:1) с добавлением 10% телячьей сыворотки и 0,02% гентамицина. Полученную суммарную культуру клеток почки выращивали до состояния монослоя в культуральных флаконах (25 см², Coming, USA) при 37°C в инкубаторе с влажной атмосферой, содержащей 5% CO₂.

Из костного мозга трубчатых костей получают суспензию гемопоэтических и мезенхимальных клеток путем их вымывания средой DMEM, содержащей 2 мМ ЭДТА в качестве антикоагулянта. Затем суспензию клеток наслаивают на раствор фиколла-урографина (плотность 1,077 г/мл) и центрифугируют 30 мин при 2000 об/мин. Отбирают фракцию мононуклеарных клеток на границе раздела фаз, ресуспендируют в среде и повторно центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. Полученный осадок ресуспендируют в полной питательной среде (DMEM и F-12 (в соотношении 1:1) с добавлением 10% телячьей сыворотки и 0,02% гентамицина) и высаживают на культуральные флаконы (25 см², Coming, USA). После прикрепления мезенхимальных клеток к пластику не прикрепившиеся клетки отмывали, а адгезивную культуру выращивали до состояния монослоя. Таким образом, получали культуру костномозговых мезенхимальных клеток (КМ-МСК). Клетки культивировали в последующем на среде DMEM и F-12 (в соотношении 1:1) с добавлением 10% телячьей сыворотки и 0,02% гентамицина до состояния монослоя в культуральных флаконах (25 см², Coming, USA) при 37°C в инкубаторе с влажной атмосферой, содержащей 5% CO₂.

Полученные культуры фетальных стволовых (КМ-МСК) и/или прогениторных (клеток почки) клеток используют для введения реципиенту с хронической или острой почечной недостаточностью с помощью различных способов.

Способ по изобретению иллюстрируется нижеследующим конкретным примером, не ограничивающим изобретение.

ПРИМЕР 1

Из фетальных почек, например, свиньи путем механической дезагрегации получают суспензию эпителиальных и мезенхимальных клеток, которые в последующем культивируют на среде DMEM и F-12 (в соотношении 1:1) с добавлением 10% телячьей сыворотки и 0,02% гентамицина до состояния монослоя в культуральных флаконах (25 см², Corning, USA) при 37°C в инкубаторе с влажной атмосферой, содержащей 5% CO₂. Из трубчатых костей вымывают гемопоэтические и мезенхимальные клетки средой DMEM, содержащей 2 мМ ЭДТА в качестве антикоагулянта. Полученную суспензию клеток наслаивают на раствор фиколла-урографина (плотность 1,077 г/мл) и центрифугируют 30 мин при 2000 об/мин. Отбирают фракцию мононуклеарных клеток на границе раздела фаз, ресуспендируют в среде и повторно центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. Полученный осадок ресуспендируют в полной питательной среде (DMEM и F-12 (в соотношении 1:1) с добавлением 10% телячьей сыворотки и 0,02% гентамицина) и высаживают на культуральные флаконы (25 см², Coming, USA). После прикрепления мезенхимальных клеток к пластику не прикрепившиеся клетки отмывают, а адгезивную культуру выращивают до состояния монослоя. Для культивирования используют клетки с жизнеспособностью выше 90%, что определяют с помощью витальных красителей трипанового синего и пропидия йодида.

Для введения реципиенту используют первичную не пассированную культуру клеток как в случае почечных клеток, так и в случае КМ-МСК.

Для введения клетки адгезивной культуры диссоциируют раствором 0,25% трипсин-ЭДТА. Полученную суспензию отмывают от диссоциирующих агентов центрифугированием в среде DMEM 5 мин при 2000 об/мин. Полученный осадок клеток ресуспендируют в среде DMEM и подсчитывают количество жизнеспособных клеток (жизнеспособность клеток должна быть не менее 98%). Полученную суспензию вновь центрифугируют 5 мин при 2000 об/мин и разводят физиологическим раствором до концентрации, необходимой для введения объекту лечения.

В зависимости от вида патологии (ХПН или ОПН) и от ее выраженности (стадия ХПН, тяжесть ОПН) для введения используют монокультуру одного из типа клеток или суммарную культуру с мезенхимальными и эпителиальными клетками.

Введение клеточной взвеси объекту лечения может производиться разными путями. Наиболее оптимальным способом введения является интрапаренхиматозное введение клеток непосредственно в поврежденный орган. Это может быть произведено во время открытой операции на почке или эндоскопически путем пункции почки под ультразвуковым или рентгеновским контролем. Возможно внутривенное введение суспензии клеток в периферическую или центральную вену, а также внутриартериальное введение непосредственно в почечную артерию.

Терапевтический диапазон количества вводимых клеток составляет - от 5 до 20 млн клеток. Оптимальной дозой является - 10-15 млн клеток (для почечных клеток и КМ-МСК).

ПРИМЕР 2

Эффективность терапии ХПН при интрапаренхиматозном введении культивированных КМ-МСК и почечных фетальных клеток

У крыс с резко уменьшенным объемом функционирующей паренхимы почки выявлялись признаки функциональной недостаточности этого органа, которые сохранялись на протяжении всех 1,5 месяцев наблюдения (табл.1). Происходило достоверное повышение концентрации креатинина, мочевины и калия в крови при снижении клиренса эндогенного креатинина и реабсорбции натрия в почечных канальцах.

Таблица 1 Показатели функции почки у крыс до и после моделирования ХПН
Показатели	Интактные крысы	2 нед. после моделирования	6 нед. после моделирования
Креатинин крови (мкмоль/л)	46±2	106±8***	76±5**
Мочевина крови (ммоль/л)	4,4±0,1	5,3±0,4*	5,9±0,4*
Натрий крови (моль/л)	141±1	141±2	142±1
Калий крови (моль/л)	6,5±0,2	7,8±0,4*	8,2±0,5*
Клиренс креатинина (мл/мин/кг)	3,32±0,12	1,77±0,05***	1,93±0,07***
Реабсорбция натрия (%)	99,64±0,05	99,35±0,12*	99,24±10*

В контрольной серии опытов введение физиологического раствора в поврежденную почку приводило к достоверному ухудшению всех функциональных показателей к 4 суткам после инъекции, функция несколько улучшалась к 11 суткам, но в дальнейшем все показатели оставались нарушенными, свидетельствуя о сохранении ХПН (табл.2).

В серии опытов с введением культуры фетальных почечных клеток уже через 4 суток отмечается снижение концентрации креатинина и мочевины крови, повышение клиренса креатинина и нормализация реабсорбции натрия. К 11-12 суткам все показатели функции почки нормализуются и сохраняются на нормальных или субнормальных значениях до 39-40 дня (табл.2). В более отдаленные сроки (61-72 дня) у 3 из 4 крыс сохраняются нормальные показатели, а у 1 произошел рецидив ХПН.

При введении КМ-МСК через 4 суток отмечено некоторое возрастание уровней креатинина и мочевины крови несмотря на рост клиренса креатинина и реабсорбции натрия. При этом прирост этих показателей был меньше, чем в серии с введением культуры почечных клеток к этому сроку наблюдения. В дальнейшем показатели функции почки постепенно улучшались с нормализацией большинства показателей к 11-12 дню и сохранением нормальных или субнормальных значений до 39-40-го дня (табл.2). В отдаленном периоде (на 72-е сутки) у 1 из 2 крыс отмечен рецидив ХПН, а у другой - сохраняются нормальные показатели почечной функции.

Обращает на себя внимание стабильный рост диуреза у крыс, которым вводили фетальные стволовые и прогениторные клетки, что коррелировало с возрастанием клубочковой фильтрации, оцененной по клиренсу эндогенного креатинина.

Хотя концентрация натрия в крови в целом была стабильной, но на 11-12-й дни в сериях с введением стволовых клеток отмечалась достоверная гипонатриемия, несмотря на то что реабсорбция натрия к этому сроку практически нормализовалась. По всей видимости, такая динамика связана с резким ростом профильтрованной фракции натрия в связи с повышенным диурезом, что ведет к повышенной экскреции натрия несмотря на нормальные показатели его реабсорбции в процентном отношении. Так, профильтрованная фракция натрия в серии с введением фетальных почечных клеток возросла с 267±16 до 417±22 мкмоль/мин (p<0,01), а в серии с введением КМ-МСК - с 284±18 до 677±35 мкмоль/мин (p<0,001). Экскретируемая фракция натрия при этом возросла с 0,52±0,04 до 0,69±0,05 мкмоль/мин (p<0,05) в серии с введением фетальных почечных клеток и с 0,78±0,05 до 1,01±0,06 мкмоль/мин (p<0,05), то есть на 33% и 29% соответственно.

Быстрое возрастание клиренса креатинина, отражающее рост клубочковой фильтрации, после введения стволовых и прогениторных клеток в сочетании с диуретическим эффектом, возможно, связаны с гемодинамической перестройкой внутриорганного сосудистого русла, в первую очередь сосудов клубочков, видимо, под влиянием гуморальных факторов, выделяемых введенными клетками. Трудно связать столь быстрые изменения с какими-либо структурными перестройками в ткани почки.

При сравнении динамики основных показателей, характеризующих выделительную функцию почки, видно, что восстановление почечной функции после пересадки культуры клеток фетальной почки происходит несколько быстрее, чем после пересадки культуры мезенхимальных стволовых клеток, но в дальнейшем существенной разницы между этими группами не наблюдалось.

Таблица 2 Влияние пересадки фетальных клеток на функцию почек при ХПН
Показатель	Серия	До инъекции клеток	Через 4 суток	Через 11-12 суток	Через 20-21 суток	Через 39-40 суток	Через 61-72 суток
Креатинин крови (мкмоль/л)	Физ. раствор	72±4	164±7	64±3	112±5	86±3	-
	Фетальные клетки почки	80±4	72±3	55±2	60±2	63±2	149±45
	КМ-МСК	74±3	107±4	68±2	50±1	56±2	80±7
Мочевина крови (ммоль/л)	Физ. раствор	8,0±0,2	9,4±0,3	5,7±0,2	8,1±0,3	7,2±0,1	-
	Фетальные клетки почки	6,7±0,2	5,0±0,1	3,9±0,1	4,6±0,1	4,6±0,1	8,8±2,3
	КМ-МСК	5,2±0,1	5,7±0,1	5,0±0,1	3,6±0,1	4,2±0,1	6,0±0,9
Натрий крови(ммоль/л)	Физ. раствор	142±1	143±2	136±1	142±1	142±1	-
	Фетальные клетки почки	140±1	141±2	123±8	142±2	141±1	143±1
	КМ-МСК	142±1	142±1	134±5	143±1	142±2	142±1
Калий крови (ммоль/л)	Физ. раствор	8,6±0,2	8,2±0,2	9,6±0,3	8,5±0,2	9,2±0,3	-
	Фетальные клетки почки	8,3±0,2	8,5±0,3	8,00,2	8,5±0,3	9,3±0,3	8,7±0,2
	КМ-МСК	8,0±0,4	8,3±0,3	7,9±0,2	8,4±0,3	8,2±0,2	9,1±0,1
Диурез (мл)	Физ. раствор	22,1±4,2	28,2±3,6	43,5±7,4	45,3±4,2	25,4±3,2	-
	Фетальные клетки почки	15,4±3,1	15,5±3,9	20,5±3,1	16,9±2,2	27,5±3,3	20,4±1,4
	КМ-МСК	18,6±3,7	18,5±5,1	25,1±5,9	28,3±2,8	27,3±4,1	10,5±2,1
Клиренс креатинина (мл/мин)	Физ. раствор	1,74±0,06	0,96±0,23	3,92±0,36	1,66±0,19	1,54±0,16	-
	Фетальные клетки почки	1,88±0,08	2,45±0,37	3,39±0,55	2,63±0,11	2,76±0,17	3,09±0,51
	КМ-МСК	2,09±0,12	2,54±0,71	5,05±0,43	2,78±0,36	3,37±0,32	1,77±0,69
Реабсорбция натрия (%)	Физ. раствор	99,41±0,03	99,54±0,02	99,50±	99,23±	99,07±	-
	Фетальные клетки почки	99,37±0,04	99,76±0,05	99,63±0,04	99,60±0,02	99,36±0,04	98,96±0,42
	КМ-МСК	99,11±0,21	99,31±0,22	99,78±0,01	99,51±0,02	99,57±0,02	99,40±0,08
Экскреция креатинина (мкмоль/сут)	Физ. раствор	232±27	274±34	277±31	188±16	192±13	-
	Фетальные клетки почки	197±54	249±25	269±23	201±10	249±11	318±32
	КМ-МСК	204±31	242±23	286±39	269±35	270±24	188±51

ПРИМЕР 3

Эффективность терапии ОПН при интрапаренхиматозном введении культивированных фетальных КМ-МСК

В контрольной серии опытов, в которой крысам после 90-минутной тепловой ишемии единственной почки интрапаренхиматозно вводили физиологический раствор, все крысы погибли при явлениях уремии на 2-3 сутки после моделирования ОПН. В серии опытов с введением культуры клеток фетальной почки умерло 5 из 6 оперированных крыс, причем гибель животных происходила на 1-2 сутки. После пересадки фетальных КМ-МСК ни одна из 5 крыс не умерла от уремии. Одна крыса погибла на 9-е сутки по неизвестной причине при улучшающихся показателях функции почки.

Показатели функционального состояния ишемизированной почки у единственной выжившей крысы в серии с интрапаренхиматозным введением культуры клеток фетальной почки оставались нарушенными до 39-го дня наблюдения. На этом сроке клиренс креатинина и реабсорбция натрия сохранялись на субнормальных значениях. К 80-му дню функция почки полностью нормализовалась.

В серии с введением мезенхимальных стволовых клеток достоверно лучшие показатели функционального состояния ишемизированной почки отмечались уже на ранних сроках (с 4-го дня постишемического периода) (табл.3). В более отдаленном периоде функция ишемизированной почки у 1 из 3 длительно выживших крыс нормализовалась через 20-21 день, а у остальных 2 - к 39-м суткам. Нормальные показатели сохранялись до 80-х суток (максимальный срок наблюдения).

Как и в опытах с ХПН, на 11-12 сутки постишемического периода отмечено снижение концентрации натрия в крови, но в этой серии это было связано со снижением реабсорбции натрия в почечных канальцах при явлениях полиурии.

Таблица 3 Влияние пересадки фетальных стволовых клеток на динамику функции почки у крыс с постишемической ОПН
Показатель	Серия	4 сутки	11-12 сутки	20-21 сутки	39 сутки	80 сутки
Креатинин крови (мкмоль/л)	Контроль	600	-	-	-	-
	Фетальные клетки почки	490	460	70	60	50
	КМ-МСК	266±64	135±8	60±3	55±2	40
Мочевина крови (ммоль/л)	Контроль	24,2	-	-	-	-
	Фетальные клетки почки	20,1	18,4	6,3	4,5	4,0
	КМ-МСК	14,0±2,1	10,4±1,1	4,6±0,5	3,6±0,1	3,1
Натрий крови (ммоль/л)	Контроль	137	-	-	-	-
	Фетальные клетки почки	139	99	141	141	144
	КМ-МСК	140±1	125±3*	142±1	141±1	145
Калий крови (ммоль/л)	Контроль	9,8	-	-	-	-
	Фетальные клетки почки	7,8	-	9,5	9,9	9,0
	КМ-МСК	8,6±0,3	7,6±0,3	6,1±0,4	7,2±0,1	9,2
Диурез (мл)	Контроль	21	-	-	-	-
	Фетальные клетки почки	22,5	23,5	22,5	17,0	12,5
	КМ-МСК	26,1±3,7	29,2±0,9	29,5±2,6	15,3±1,1	14,0
Клиренс креатинина (мл/мин)	Контроль	0,02	-	-	-	-
	Фетальные клетки почки	0,35	0,54	2,65	2,66	4,10
	КМ-МСК	0,84±0,11	1,93±0,09	2,60±0,18	3,39±0,05	5,22
Реабсорбция натрия (%)	Контроль	75,34	-	-	-	-
	Фетальные клетки почки	-	97,87	99,05	99,35	99,76
	КМ-МСК	97,06±0,88	99,72±0,02	99,32±0,04	99,56±0,01	99,79
Экскреция креатинина (мкмоль/кг/сут)	Контроль	17	-	-	-	-
	Фетальные клетки почки	248	345	249	230	276
	КМ-МСК	297±33	350±39	208±27	269±16	288

ПРИМЕР 4

Эффективность терапии ХПН при внутривенном введении культивированных КМ-МСК и почечных фетальных клеток

Исходное функциональное состояние почек (до начала клеточной терапии) в 1-й и 2-й сериях опытов представлено в таблице. Более выраженные изменения всех показателей отмечены в 1-й серии. Они соответствовали компенсированной стадии ХПН по классификации Н.А. Лопаткина. Во 2-й серии все показатели также были достоверно хуже, чем у интактных крыс, и их состояние оценили, как латентную стадию ХПН (табл.4).

Таблица 4 Функциональное состояние почек при ХПН в 1-й и 2-й сериях опытов
	Креатинин крови (мкмоль/л)	Мочевина крови (моль/л)	Клиренс креатинина (мл/мин/кг)	Реабсорбция натрия (%)
Интактные крысы	46±2	4,4±0,1	3,32±0,12	99,64±0,05
1 -я серия	85±3***	6,7±0,4**	1,74±0,05***	99,09±0,8*
2-я серия	75±4**	5,8±0,5*	2,33±0,07**	99,24±0,10*

Введение крысам 1-й серии как культивированных КМ-МСК, так и культивированных почечных клеток (ПК) приводило к постепенному улучшению всех функциональных параметров. Динамика восстановления была быстрее в опытах с использованием ПК. В этих экспериментах уже через 2 недели происходила нормализация всех функциональных показателей, и они держались в пределах нормы более 2 месяцев. В более отдаленные сроки отмечено некоторое повышение концентрации креатинина крови, снижение клиренса креатинина и реабсорбции натрия, однако эти показатели сохранялись на субнормальных значениях. В экспериментах с введением КМ-МСК улучшение функционального состояния почек происходило медленнее: для достижения нормальных или субнормальных значений требовалось более 1 месяца. Однако в дальнейшем все показатели за исключением реабсорбции натрия держались в нормальных пределах весь срок наблюдения. Последний показатель сохранялся на субнормальном уровне.

Во 2-й серии опытов, в которой использовались крысы с менее значимыми нарушениями функционального состояния почки, соответствующего латентной стадии ХПН, вызывали обострение почечной недостаточности дополнительным 40-минутным ишемическим воздействием, что имитировало потенциальное обострение ХПН после операции на почке с пережатием почечных сосудов, например при нефролитотомии. Взвесь стволовых клеток вводили через несколько минут после восстановления кровотока в почке.

В контрольной серии опытов, где крысам вводили физиологический раствор, все животные погибли от уремии в пределах 5 дней. В обеих опытных сериях выживаемость крыс составила 100%.

Оценивая динамику функциональных показателей почки после внутривенного введения стволовых клеток, мы отметили благоприятный эффект обоих вариантов клеточной терапии. Основные функциональные показатели постепенно восстанавливались после 2-недельного латентного периода, во время которого отмечено даже некоторое повышение концентрации креатинина и мочевины в крови. Их динамика (за исключением канальцевой реабсорбции натрия) в опытах с введением ПК и КМ-МСК была примерно одинаковой. Через 1-1,5 месяца происходила нормализация этих показателей, но через 2-2,5 месяца отмечено временное возрастание уровней креатинина и мочевины в крови при снижении клиренса креатинина. В более отдаленном периоде 3-4 месяца функция почек вновь улучшалась с нормализацией этих параметров. Реабсорбция натрия после введения ПК нормализовалась уже через 4 дня, но в дальнейшем отмечена тенденция к постепенному ухудшению этого показателя и в отдаленном периоде он стойко держался на нижней границе нормы или на субнормальных значениях. В опытах с введением КМ-МСК реабсорбция натрия в почечных канальцах оставалась сниженной в пределах 2 недель, но позднее нормализовалась и сохранялась на нормальном уровне в течение 2-2,5 месяцев. В более отдаленном периоде отмечено стойкое снижение этого показателя.

При сравнении результатов экспериментов 1-й и 2-й серий видно, что введение ПК оказалось более эффективным в плане сроков наступления терапевтического эффекта в опытах со стабильной ХПН (1-я серия) по сравнению с экспериментами, где вызывали обострение ХПН дополнительным ишемическим воздействием (2-я серия). Динамика функциональных показателей при введении крысам КМ-МСК в 1-й и 2-й сериях была схожа. Терапевтический эффект наступал лишь через 2 недели.

В обеих сериях отмечено транзиторное ухудшение функциональных показателей через 2-2,5 месяца, причина которого пока неясна.

Обращает на себя внимание, что фильтрационная функция почечных клубочков при клеточной терапии восстанавливается более полно, чем реабсорбционная функция почечных канальцев как после введения ПК, так и после введения КМ-МСК. Реабсорбция натрия после периода нормализации в отдаленном периоде вновь снижается до субнормальных цифр.

Claims (11)

1. Способ лечения хронической и острой почечной недостаточности, включающий получение донорского материала и введение его объекту лечения, отличающийся тем, что получают донорский фетальный материал, кроме человеческого, содержащий монокультуру или смешанную культуру популяции клеток, включающей культуру стволовых клеток, состоящую из гемопоэтических и мезенхимальных клеток, выделенных в виде суспензии из фетального костного мозга трубчатых костей и/или культуру прогениторных клеток, состоящую из эпителиальных и мезенхимальных клеток, выделенных в виде суспензии из фетальных почек, с последующим культивированием первичной клеточной суспензии этих клеток до состояния монослоя в питательной ростовой среде DMEM/F-12 в соотношении 1:1 с добавлением 10% телячьей сыворотки и 0,02% гентамицина, и полученный клеточный донорский материал вводят объекту лечения в виде суспензии в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов от 5 до 20 млн клеток на 1 кг веса объекта лечения.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивированные клетки вводят объекту лечения с хронической почечной недостаточностью.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что культивированные клетки вводят непосредственно в поврежденную почку.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что культивированные клетки вводят в почечную артерию.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что культивированные клетки вводят внутривенно.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивированные клетки вводят объекту лечения с острой почечной недостаточностью.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что культивированные клетки вводят непосредственно в поврежденную почку.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что культивированные клетки вводят в почечную артерию.

9. Способ по п.6, отличающийся тем, что культивированные клетки вводят внутривенно.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что стволовые костно-мозговые клетки вводят в количестве 1 млн клеток на 1 кг веса в каждую почку.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что прогениторные почечные клетки вводят в количестве 1 млн клеток на 1 кг веса в каждую почку.