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CN104862420B - Rpa‑侧流层析检测口蹄疫病毒气溶胶的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

Rpa‑侧流层析检测口蹄疫病毒气溶胶的引物、探针及试剂盒 Download PDF

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CN104862420B
CN104862420B CN201510293069.2A CN201510293069A CN104862420B CN 104862420 B CN104862420 B CN 104862420B CN 201510293069 A CN201510293069 A CN 201510293069A CN 104862420 B CN104862420 B CN 104862420B
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Abstract

本发明公开了一种RPA‑侧流层析检测口蹄疫病毒气溶胶的引物、探针及试剂盒，所述试剂盒中包含有由用于通过RPA技术检测口蹄疫病毒的通用型、分型引物和探针组成的引物探针液及其中通用引物和探针，本发明系首次采用RPA‑侧流层析技术建立快速检测牛FMDV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为FMDV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。采用本发明的引物和探针组合，通过RPA技术对FMDV气溶胶进行分型检测的方法，具有较高的灵敏度、特异性和重复性。

Description

RPA-侧流层析检测口蹄疫病毒气溶胶的引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术(Lateral FlowAssay)分型检测气溶胶中口蹄疫病毒的通用型和分型引物、探针及其试剂盒。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的发生在猪、牛、羊等偶蹄类动物上的急性、热性、高度接触性传染病，被世界动物卫生组织列为“A类烈性传染病”，一旦暴发，必须扑杀感染及接触感染的动物，造成巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。口蹄疫病毒有7个血清型和65个以上的血清亚型，血清型之间无交叉免疫现象，因而难以控制。我国为口蹄疫流行国家，主要流行O型、A型和Asia 1型口蹄疫。2005年我国大面积爆发了Asia 1型口蹄疫，2009年和2013年爆发了A型口蹄疫，近年来，均有O型口蹄疫的散发和流行，特别是随着我国养殖业集约化、规模化的迅猛发展，口蹄疫的传播风险也越来越大。
由于养殖动物高度密集，患病动物呼出、排泄大量的病原微生物，造成舍内高浓度微生物气溶胶的积聚，而且通过舍内外气体的交换，病原微生物随着大气传播、扩散，造成环境生物污染和传染病传播。口蹄疫病毒能在空气中形成气溶胶，病毒可随风散播到50～100公里外的地方，传播速度快，距离远，难于防御。因此，通过建立一种适用于口蹄疫病毒气溶胶的检测方法，将为口蹄疫预报预警提供配套技术。
目前应用于气溶胶病毒的检测方法主要有培养法和分子生物学方法，口蹄疫病毒的分离培养要求在生物安全三级以上实验室进行，并需要特殊的仪器设备和专业的技术人员，在分离过程中存在病毒扩散的危险，且耗时长。而PCR及其相关的技术可以检测口蹄疫病毒的核酸，但需要复杂的仪器设备，难以满足非实验室等现场环境下的检测要求。
重组酶聚合酶扩增(recombinase ploymerase amplification,RPA)技术是不同于PCR的核酸检测技术，RPA是在重组酶介导下模拟体内DNA的复制过程。重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物后，寻找到双链DNA同源序列，在单链DNA结合蛋白的作用下，模板DNA解链，引物与模板DNA配对，并在链置换DNA聚合酶的作用下复制、扩增，单个DNA模板分子得到大约1012扩增产物。它与PCR不同，不需要退火反应过程，可在37℃～42℃等温条件下，反应20余分钟即可得到扩增产物(Forget et al.,2012)。RPA可以与侧向流动免疫层析技术相结合，在RPA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的探针，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被nfo核酶识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的RPA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检测线。该方法检测时间短，5分钟左右就能目测结果，肉眼判读。
但目前对于RPA技术的研究尚处于起步阶段，国内外还没有将RPA技术应用于FMDV气溶胶检测的报道。与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46～52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。
发明内容
针对RPA-侧流层析技术应用于FMDV气溶胶检测领域的空白，本发明提供了一种RPA-侧流层析检测口蹄疫病毒气溶胶的引物、探针及试剂盒，该试剂盒使用准确、快速、简便。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种RPA-侧流层析检测口蹄疫病毒气溶胶的通用引物和探针，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。
正向引物FMDV-F：5’-GAGTACATTGAGAAACCAAACATCACCACA-3’，(SEQ ID No.1)；
反向引物FMDV-R：5’-【Biotin】GGCGTAGGGTCCTTCAGCTTGTGGTTGT-3’，(SEQ IDNo.2)；
探针序列FMDV-P：5’-【FAM】TCTGGAGACTAGTGGTGCCAGCACTGTTA【dSpacer】TTTCAGAGAGATAACTCTCC【C3-spacer】-3’；(SEQ ID No.3)。
一种RPA-侧流层析检测A型FMDV的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ IDNo.4所示，反向引物序列如SEQ ID No.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示。
正向引物A-F：5’-CACCTGAGGCAGCACTGGACAACACGAGCAA-3’；(SEQ ID No.4)
反向引物A-R：5’-【Biotin】GCACGAGGAGTTCTTGGATCTCCGTGGCTC-3’；(SEQ IDNo.5)
探针序列A-P：5’-【FAM】CACTGGACAACACGAGCAACCCCACTGCTTA【dSpacer】TATAAAGCACCGTTCACA【C3-spacer】-3’；(SEQ ID No.6)。
一种RPA-侧流层析检测Asia 1型FMDV的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQID No.7所示，反向引物序列如SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示。
正向引物Asia1-F：5’-CGAATCAGCAGACCCAGTTACCACCACAGT-3’；(SEQ ID No.7)
反向引物Asia1-R：5’-【Biotin】GAGAAGTAGTACGTCGCAGACCGAAGTAGCG-3’；(SEQ IDNo.8)
探针序列Asia1-P：5’-【FAM】ACCCGCCTGGCACTCCCTTACACCGCTCCCC【dSpac er】ACCGTATGCTTGCAACAGT【C3-spacer】-3’；(SEQ ID No.9)。
一种RPA-侧流层析检测O型FMDV的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ IDNo.10所示，反向引物序列如SEQ ID No.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示。
正向引物Asia1-F：5’-CAACACCACCAACCCAACGGCGTACCATAA-3’；(SEQ ID No.10)
反向引物Asia1-R：5’-【Biotin】TTGATGGCACCGTAGTTGAAAGAAGTAGGC-3’；(SEQ IDNo.11)
探针序列Asia1-P：5’-【FAM】CGTACCATAAGGCGCCGCTTACCCGGCTTA【dSpacer】ATTGCCCTACACGGCACCA【C3-spacer】-3’；(SEQ ID No.12)。
本发明还提供了一种检测口蹄疫病毒的试剂盒，该试剂盒中包含有由RPA-侧流层析检测口蹄疫病毒的通用型、分型引物和探针组成的引物探针液。
所述引物探针液的组成为：正向引物和反向引物终浓度均为0.4μmol/L，检测探针的终浓度为0.12μmol/L，扩增FMDV通用型、A型、Asia 1型和O型核苷酸序列片段分别为SEQID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16。
进一步的，该检测口蹄疫病毒的试剂盒中还包括有：标准阳性质粒、缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试纸条；
所述阳性标准质粒，通用型的为T-3A，用于FMDV检测的阳性对照；阳性质粒T-A，用于A型FMDV检测的阳性对照；阳性质粒T-A1，用于Asia 1型FMDV检测的阳性对照；阳性质粒T-O，用于O型FMDV检测的阳性对照；上述阳性质粒用于检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。
用于构建通用型、A型、Asia 1型和O型的FMDV的阳性标准质粒引物序列如下：
FMDV-F：5’-TTCTTTGAGGGAATGGTGCA-3’(SEQ ID No:17)；
FMDV-R：5’-GGTTGTTTCTCCACGGGTTT-3’(SEQ ID No:18)。
A-VP1-F：5’-CTGAGGCAGCACTGGACAAC-3’(SEQ ID No:19)；
A-VP1-R：5’-CGCACGAGGAGTTCTTGGAT-3’(SEQ ID No:20)。
A1-VP1-F：5’-GGCGAATCAGCAGACCCAGTT-3’(SEQ ID No:21)；
A1-VP1-R：5’-CTCCTGTTTACGGCGGTCTT-3’(SEQ ID No:22)。
O-VP1-F：5’-TGCCACTTACTATTTCGCTGAT-3’(SEQ ID No:23)；
O-VP1-R：5’-GATGGTTTCCACCAGTTTGG-3’(SEQ ID No:24)。
所述阳性质粒T-3A是由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18扩增的核苷酸序列片段(SEQ ID NO.25)与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒；所述阳性质粒T-A是由SEQ IDNO.19和SEQ ID NO.20扩增的核苷酸序列片段(SEQ ID NO.26)与pEASY-T3载体相连接后得到的A型FMDV的重组质粒；所述阳性质粒T-A1是由SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22扩增的核苷酸序列片段(SEQ ID NO.27)与pEASY-T3载体相连接后得到的Asia 1型FMDV的重组质粒；所述阳性质粒T-O是由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24扩增的核苷酸序列片段(SEQ IDNO.28)与pEASY-T3载体相连接后得到的O型FMDV的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。
所述无菌双蒸水可作为阴性对照或补足反应体系用，其制备方法为双蒸水经高压灭菌后，分装到灭菌的小管中。
所述的缓冲液、酶扩增八联管、反应驱动液、产物稀释液于市场购买得到。
具体的，一种检测口蹄疫病毒的试剂盒，每50μL扩增体系中含有缓冲液29.5μL、FMD V各种型相应的引物探针液4.6μL、无菌双蒸水12.4μL、待测样本cDNA或以阳性标准质粒为阳性对照分别为1μL或以无菌双蒸水为空白对照1μL、反应驱动液2.5μL。
本发明还提供一种应用RPA技术并结合侧流层析技术分型检测FMDV的方法，步骤如下：
(1)提取待测样本的总RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA；
(2)设计用于口蹄疫病毒检测的通用引物和探针，以cDNA为模板，进行RPA扩增，扩增条件为：38℃水浴4min后，混匀，再38℃水浴20min；
(3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测，当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有口蹄疫病毒核酸；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有口蹄疫病毒核酸；
(4)然后对检测的FMDV阳性样本分别进行A型、Asia 1型、O型的分型检测：分别设计用于口蹄疫病毒A型、Asia 1型、O型的检测引物和探针，以相应血清型cDNA为模板，分别进行RPA扩增，扩增条件为：38℃水浴4min后，混匀，再38℃水浴20min；
(5)应用侧流层析试纸条进行分型FMDV RPA扩增产物检测，当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为相应血清型病毒阳性，表明样本中含有相应血清型FMDV核酸；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含相应血清型FMDV核酸。
本发明的有益效果：
(1)本发明系首次采用RPA-侧流层析技术建立快速检测牛FMDV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为FMDV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。
(2)采用本发明的引物和探针组合，通过RPA技术对FMDV气溶胶进行分型检测的方法，具有较高的灵敏度、特异性和重复性。
本发明选用的口蹄疫病毒3A基因引物是经大量实验筛选获得的，特异性好，与牛、猪的其他病毒包括牛肠道病毒、牛流热病毒、牛病毒性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、猪疱疹病毒、猪瘟病毒等病毒无交叉反应。
RPA能够将痕量的核酸模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物；本发明所建立检测方法可检测5TCID50的FMDV病毒。
(2)本发明的RPA技术并结合侧流层析技术检测FMDV气溶胶的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和现场的口蹄疫病毒快速筛查检测。
(3)检测速度快：与常规PCR相比，不必经过变性、退火、延伸三个步骤，RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。
(4)不需要复杂的仪器设备，适用于现场检测。本发明所建立检测方法可以在常温等温条件下扩增、试纸条可视化检测，不要PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、电泳槽等复杂的仪器设备，而且RPA不需复杂的样品处理，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。
附图说明
图1为FMDV通用型的RPA引物、探针组的筛选结果，其中1为引物3A-F、3A-R和探针3A-P组，2为引物A-F、3A-R1和探针3A-P组，3为A-F、3A-R2和探针3A-P组，4为A-F、3A-R3和探针3A-P组；a为FMDV cDNA，b为阴性对照；
图2为FMDV A型的RPA引物、探针组的筛选结果，其中1为引物A-F、A-R和探针A-P组，2为引物A-F、A-R1和探针A-P组，3为A-F、A-R2和探针A-P组，a为A型FMDV cDNA，b为阴性对照；
图3为Asia1型FMDV RPA引物、探针组的筛选结果，其中1为引物A1-F、A1-R和探针A1-P组，2为引物A1-F、A1-R1和探针A1-P组，3为A1-F、A1-R3和探针A1-P组，4为A1-F、A1-R4和探针A1-P组，5为A1-F1、A1-R2和探针A1-P1组，6为A1-F1、A1-R5和探针A1-P1组；a为Asia1型FMDV cDNA，b为阴性对照；
图4为FMDV O型RPA引物、探针组的筛选结果，其中1为引物O-F、O-R和探针O-P组，2为引物O-F、O-R1和探针O-P组，3为O-F、O-R2和探针O-P组，4为O-F、O-R3和探针O-P组，5为O-F、O-R和探针O-P1组，6为O-F、O-R1和探针O-P1组；a为FMDV cDNA，b为阴性对照；
图5为通用型和分型RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏性试验，其中1为1×105TCID50、2为1×104TCID50、3为1×103TCID50、4为1×102TCID50、5为1×101TCID50、6为5TCID50。a为通用型、b为A型、c为Asia 1型、d为O型；
图6为通用型和分型RPA侧流层析试纸条检测方法的特异性试验，其中1为O型口蹄疫病毒；2为A型口蹄疫病毒；3为Asia 1型口蹄疫病毒；4为牛肠道病毒；5为牛流热病毒；6为牛病毒性腹泻病毒；7为水疱性口炎病毒；8为牛传染性鼻气管炎病毒；9为猪疱疹病毒；10为猪瘟病毒；11为ddH2O。a为通用型、b为A型、c为Asia 1型、d为O型；
图7为组装试剂盒的灵敏性检测，均为5TCID50，其中，1为通用型、2为A型、3为Asia1型、4为O型；
图8为气溶胶样本的RPA侧流层析检测试剂盒的检测结果，其中阳性样本1、3、4、7、9、10、13为A型FMDV气溶胶收集液，2为Asia 1型FMDV气溶胶收集液，5、6、8、11、12为O型FMDV气溶胶收集液，14-16分别为阴性的气溶胶，17为ddH2O。a为通用型、b为A型、c为Asia 1型、d为O型。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
TwistAmp nfo Kits购自TwistDX公司，Genline Hybridetect-1lateral flowstrips购自Milenia GmbH(Germany)，反转录试剂盒(Code No.：D2639A)购自宝生物工程(大连)有限公司，磁珠法提取病毒DNA/RNA试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；通用检测引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。
一、阳性标准质粒的制备
1.引物的设计与合成
通过对GeneBank中口蹄疫病毒3A基因进行序列比对，确定保守区域，设计1对通用引物，为序列表中的SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，可对口蹄疫病毒7个血清型检测，扩增出PCR片段，用于阳性标准质粒的构建；分别对GeneBank中A型、Asia 1型、O型FMDV VP1基因进行序列比对，分别设计各血清型的VP1引物，A型引物为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20，Asia 1型引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22，O型引物为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24，分别扩增出PCR片段，用于阳性标准质粒的构建；所有引物由上海生工生物技术有限公司合成。
2.口蹄疫病毒cDNA的制备
参照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，分别提取A型、Asia 1型、O型FMDV RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA。
3.阳性质粒的制备
以上述方法制备的cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系为50μL：10×PCR BufferII(Mg2+Plus)5μL、2.5mM dNTP Mixture 8μL、rTaq 0.5μL(5U/μL)、cDNA模板2μL，分别加入10μmol/L的引物FMDV-F和FMDV-R各2μL，灭菌超纯水加至50μL。反应程序为94℃预变性3min，然后94℃20s，55℃40s，72℃20s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
通用型FMDV的PCR扩增产物为376bp，A型、Asia 1型、O型FMDV的PCR扩增产物分别为250bp、594bp、538bp。经1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收，克隆至pEAST-T3载体连接，转化，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，分别用相应通用型和分型引物进行菌落PCR验证。将阳性重组菌摇菌培养，试剂盒提取质粒DNA，送交上海生工生物工程有限公司测序，将测序正确的重组菌摇菌培养，提取质粒DNA，获得阳性质粒，分别命名为T-FMDV、T-A、T-A1、T-O。
二、口蹄疫病毒RPA侧流层析试纸条检测方法的优化与建立
1.RPA引物与探针的设计
RPA扩增的关键在于扩增引物和探针的设计。有关RPA引物和探针设计相关数据少，目前尚无用于设计的软件或成熟的原则。PCR引物并不适用于RPA，RPA引物比一般PCR引物长约30-35个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度；而引物长度增加容易形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加。因此，用于RPA扩增的引物需要经过大量的实验进行筛选与优化。
一般情况下引物、探针的设计需参考以下因素：(1)GC含量在40％～60％；(2)尽量避免引物内部出现二级结构；(3)避免引物出现重复序列。
RPA探针的长度一般46～52个碱基，尽量避免与引物重叠、形成异二聚体。探针5’端标记FAM基团，中间THF替代G或C(dSpacer)，且dSpacer两侧尽量避免G、C，dSpacer修饰与5’端至少30碱基，与3’端至少15碱基，3’端C3-spacer修饰。
本实施例针对FMDV 3A基因的保守区和A型、Asia 1型、O型FMDV的VP1基因分别设计了一系列的RPA通用型和分型引物与探针，具体见表1。
表1针对口蹄疫病毒不同基因保守区设计的RPA引物与探针
备注：@表示Biotin修饰；*表示FAM标记；阴影表示dSpacer，为THF替换碱基；&表示C3-spacer修饰。
2.利用RPA扩增反应筛选引物和探针
取107TCID50的A型、Asia 1型、O型FMDV，试剂盒提取RNA，反转录cDNA，以cDNA为模板用于PRA方法扩增FMDV的不同基因序列。具体步骤：
(1)于离心管管底中分别加入各检测基因的上下游引物各2.1μL(10μmol/L)，LF探针0.6μL(10μmol/L)，缓冲液29.5μL，模板cDNA 1μL，用ddH2O补足到体积47.5μL，吹打混匀；每对引物探针组均设立阴性对照。
(2)将47.5μL缓冲液转移到含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp nfo八联反应管中，经移液器反复吹打直至完全溶解。
(3)向每个反应管液体内加入2.5μL的醋酸镁(280mmol/L)溶液，混匀后反应即刻发生。
(4)将反应管放入38℃的恒温水浴锅中，处理4min。
(5)反应4min后，取出反应管，再次混匀后继续放入38℃的恒温水浴锅中反应20min。
(6)取检测管，在其中加入扩增产物1μL和49μL的产物稀释液，混合均匀后，放入检测试纸条，3～5min后，通过试纸条的显色进行判读。
3.引物和探针的筛选结果
表1所示的通用型及A型、Asia 1型、O型FMDV分型引物探针组经RAP扩增后，经过试纸条检测，如图1、2、3、4所示，通用型3A-F、3A-R、3A-P引物探针组，A型A-F、A-R、A-P引物探针组，Asia1型的A1-F、A1-R、A1-P引物探针组，O型的O-F、O-R、O-P引物探针组，这4组引物探针组的RPA产物为阳性，试纸条在检测区和质控区出现条带，而阴性对照RPA产物在检测区未出现条带，仅质控区出现条带。而其他引物探针组的检测组和阴性对照组RPA产物均在检测区出现条带，通过将下游引物与相应的探针混合后进行试纸条检测，发现在检测区出现阳性条带，表明这些引物探针组形成了引物-探针异二聚体，因而使试纸条呈现阳性反应，因此，这些引物探针组不能应用于RPA的检测。
4.RPA扩增反应体系的优化
首先，将四组引物探针组：通用型3A-F、3A-R、3A-P引物探针组，A型A-F、A-R、A-P引物探针组，Asia1型的A1-F、A1-R、A1-P引物探针组，O型的O-F、O-R、O-P引物探针组，按表2所示，进行RPA反应的引物和探针使用量的优化，优化结果表明，上下游引物各为2μL、探针为0.6μL，效果较好。另外，还针对醋酸镁的使用量设置了7个浓度梯度。在RPA反应体系中加入浓度为280mM/μL醋酸镁的量分别为0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL和3μL，结果显示，醋酸镁用量过少将导致扩增的失败，反应体系中加入1μL及以上醋酸镁可以得到的扩增产物，并且产物随着醋酸镁量的增加而增加，但添加2.5μL和3μL的醋酸镁差别不明显。最终确定反应体系中加入2.5μL醋酸镁。
经优化后的RPA反应体系为：上下游引物各2.0μL(10μmol/L)，探针0.6μL(10μmol/L)，缓冲液29.5μL，模板cDNA 1μL，用ddH2O 12.4μL，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp nfo八联反应管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μL的醋酸镁(280mmol/L)启动反应。38℃4min，混匀后，再38℃20min。
表2RPA反应引物和探针使用量组合优化表
三、口蹄疫病毒RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏度、重复性、特异性检测
1.RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏度分析及重复性检测
将滴度为107TCID50/100μL的口蹄疫病毒液用PBS进行10倍系列稀释后，应用试剂盒提取病毒的RNA，反转录cDNA；以优化的RPA条件分别进行利用四组引物探针组(通用型3A-F、3A-R、3A-P引物探针组，A型A-F、A-R、A-P引物探针组，Asia1型的A1-F、A1-R、A1-P引物探针组，O型的O-F、O-R、O-P引物探针组)进行RPA扩增，反应体系为：上下游引物各2.0μL(10μmol/L)，探针0.6μL(10μmol/L)，缓冲液29.5μL，模板cDNA 1μL，用ddH2O 12.4μL，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp nfo八联反应管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μL的醋酸镁(280mmol/L)启动反应。38℃4min，混匀后，再38℃20min。
上述四组引物探针组的每个梯度的模板浓度做三个重复，通过RPA侧流层析试纸条检测，验证RPA侧流层析试纸条方法的批内重复性；另外，每间隔2d重复一次，共进行3次重复，验证RPA侧流层析试纸条方法的批间重复性。所获得的RPA产物分别进行侧流层析试纸条检测。结果表明，四组引物探针组均能检测到5TCID50的cDNA(图5)。
2.RPA侧流层析试纸条检测方法的特异性分析
参照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取牛传染性鼻气管炎病毒和猪疱疹病毒的DNA；提取牛肠道病毒、牛流热病毒、牛病毒性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、猪瘟病毒RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA。
按照上述步骤建立的四组引物探针组(通用型3A-F、3A-R、3A-P引物探针组，A型A-F、A-R、A-P引物探针组，Asia1型的A1-F、A1-R、A1-P引物探针组，O型的O-F、O-R、O-P引物探针组)的RPA方法进行特异性试验，分别以A型、O型、Asia1型口蹄疫病毒的cDNA、牛传染性鼻气管炎病毒DNA、牛肠道病毒cDNA、牛流热病毒cDNA、牛病毒性腹泻病毒cDNA、水疱性口炎病毒cDNA、猪瘟病毒cDNA、猪疱疹病毒的DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，进行RPA扩增，试验重复3次。
所有的RPA产物进行侧流层析试纸条检测，如图6所示，1：O型口蹄疫病毒；2：A型口蹄疫病毒；3：Asia 1型口蹄疫病毒；4：标准阳性质粒；5：牛肠道病毒；6：牛流热病毒；7：牛病毒性腹泻病毒；8：水疱性口炎病毒；9：猪瘟病毒；10：猪疱疹病毒；11：牛传染性鼻气管炎病毒；12：ddH2O。从图中可以看出，通用型3A-F、3A-R、3A-P引物探针组，A型A-F、A-R、A-P引物探针组，Asia1型的A1-F、A1-R、A1-P引物探针组，O型的O-F、O-R、O-P引物探针组，这四组引物探针组扩增FMDV特异性好，与其它检测病毒无交叉反应。因此，经优选出的FMDV通用引物探针组和分型引物探针组，用于建立检测FMDV的通用型和分型RPA侧流层析试纸条方法，适用于鉴定未知样本口蹄疫病毒的分型。
四、RPA侧流层析检测试剂盒的组装与灵敏度、重复性试验
将引物3A-F和3A-R各200μL、探针3A-P 60μL混合，分装50μL/管，作为通用型检测的引物探针液；将引物A-F和A-R各200μL、探针A-P 60μL混合，分装50μL/管，作为A型FMDV检测的引物探针液；将引物A1-F和A1-R各200μL、探针A1-P 60μL混合，分装50μL/管，作为Asia1型检测的引物探针液；将引物O-F和O-R各200μL、探针O-P 60μL混合，分装50μL/管，作为O型FMDV检测的引物探针液；标准阳性质粒T-FMDV、T-A、T-A1、T-O分别分装，分装50μL/管，作为阳性对照；然后与缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、侧流免疫层析试纸条、产物稀释液组装成RPA侧流层析检测试剂盒。
利用所组装的RPA侧流层析检测试剂盒，按实施例3中的5TCID50口蹄疫病毒进行灵敏度检测，反应体系为：引物探针液4.6μL，缓冲液29.5μL，模板cDNA 1μL，ddH2O 12.4μL，将上述混合液加入到酶扩增八联管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μL的反应驱动液启动反应。38℃4min，混匀后，38℃20min。做三个重复，取1μL的RPA扩增产物用49μL的产物稀释液稀释，侧流免疫层析试纸条进行检测。结果表明，所组装的RPA侧流层析检测试剂盒可检测到的5TCID50口蹄疫病毒cDNA，试验重复3次，结果见图7。
五、气溶胶样本的检测
1.气溶胶样品采集
选择奶牛场的不同区域(奶牛舍、运动场、挤奶厅等)，应用MS-I型空气微生物采样箱，通过多功能微生物采样器(青岛，MS-1型)的Porton采样器采集空气样品。首先安装三脚架，采样器放置高度为距地面1.5m，然后将10mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS)注入Proton采样器，同时滴加一滴橄榄油，放入三脚固定支架内固定。将Porton冲击式稳流器的一端接到主机入气口上，另一端用橡胶管连接到Proton采样器的出气口上。采样流量为5～35L/min，采样时间为30min。采样结束后将采样器内的采集液收集到15mL离心管保存用于检测。
2.磁珠法快速提取总RNA
(1)在1.5mL无核酸酶的离心管中加入20μL蛋白酶K、3μL Carrier RNA和15μL磁珠悬液G，加入300μL缓冲液RLCK，再加入200μL气溶胶吸收液，移液器混匀。
(2)室温孵育10min，期间每3min上下颠倒混匀，使磁珠与核酸充分混合。
(3)将离心管置于磁力架上1min，小心去除液体，加入500μL漂洗液PW I，混匀，磁力架上静置30sec，去除液体；再加入500μL漂洗液PW II，混匀，磁力架上静置30sec，去除液体；然后再重复用PW I和PW II各洗1次，磁力架静置30sec，尽量去除液体。
(4)将离心管置于磁力架，晾干5-10min。
(5)取下离心管，加入50μL无RNAase的双蒸水，震荡混匀，56℃孵育2min，磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新管中，置于冰上备用。
3.反转录制备cDNA
参照反转录试剂盒说明书进行反转录，5×RT buffer 2μL、随机引物1μL、AMV反转录酶1μL、粗提的RNA 6μL。30℃10min，42℃30min，95℃5min，将反应管置于冰上。
4.临床样本的检测
待测样本为经本实验室利用荧光定量方法检测过气溶胶样本13份和3份阴性样本。利用磁珠法快速提取总RNA，反转录cDNA。以提取的16份样本的cDNA分别为模板，以阳性质粒为阳性对照、ddH2O为阴性对照，利用实施例4组装的RPA侧流层析检测试剂盒先进行FMDV通用型的检测；检测阳性后再进行分型RPA检测。反应体系如下：引物探针液4.6μL，缓冲液29.5μL，模板cDNA 1μL，ddH2O 12.4μL，将上述混合液加入到酶扩增八联管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μL的反应驱动液启动反应。38℃4min，混匀后，38℃20min。取1μL的RPA扩增产物用49μL的产物稀释液稀释，侧流免疫层析试纸条进行检测。若试纸条的检测区出现阳性检测条带，则待测样本中含有相应血清型检测的FMDV；若试纸条的检测区未出现阳性检测条带，待测样本中没有相应血清型检测的FMDV。
经RPA侧流层析检测试剂盒检测，呈FMDV阳性的样本13份，呈阴性的样本3份，其中A型为7份，Asia1型为1份，O型为5份，见图8。其中a为通用型引物探针组、b为A型引物探针组、c为Asia 1型引物探针组、d为O型引物探针组。17为ddH2O。将此结果与SYBR Green I荧光定量PCR检测结果对照，结果完全一致。

Claims (6)

1.一种检测口蹄疫病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含由RPA-侧流层析检测口蹄疫病毒气溶胶的通用型引物和探针、检测A型FMDV的引物和探针、检测Asia 1型FMDV的引物和探针和检测O型FMDV的引物和探针组成的引物探针液；
所述RPA-侧流层析检测口蹄疫病毒气溶胶的通用型引物和探针，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示；
所述检测A型FMDV的引物和探针，其正向引物序列如SEQ ID No.4所示，反向引物序列如SEQ ID No.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示；
所述检测Asia 1型FMDV的引物和探针，其正向引物序列如SEQ ID No.7所示，反向引物序列如SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示；
所述检测O型FMDV的引物和探针，其正向引物序列如SEQ ID No.10所示，反向引物序列如SEQ ID No.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针液的组成为：正向引物和反向引物终浓度均为0.4μmol/L，探针的终浓度为0.12μmol/L，扩增FMDV通用型、A型、Asia 1型和O型核苷酸序列片段分别为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括有：标准阳性质粒、缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试纸条。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述标准阳性质粒为：通用型的阳性质粒T-3A、A型FMDV的阳性质粒T-A、Asia 1型FMDV的阳性质粒T-A1和O型FMDV的阳性质粒T-O；
所述通用型的阳性质粒T-3A，是由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18扩增的核苷酸序列片段与pEASY-T3载体相连接后得到的阳性质粒；所述扩增的核苷酸序列片段的序列如SEQ IDNO.25所示；
A型FMDV的阳性质粒T-A，由SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20扩增的核苷酸序列片段与pEASY-T3载体相连接后得到；所述扩增的核苷酸序列片段的序列如SEQ ID NO.26所示；
Asia 1型FMDV的阳性质粒T-A1，由SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22扩增的核苷酸序列片段与pEASY-T3载体相连接后得到；所述扩增的核苷酸序列片段的序列如SEQ ID NO.27所示；
O型FMDV的阳性质粒T-O，是由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24扩增的核苷酸序列片段与pEASY-T3载体相连接后得到；所述扩增的核苷酸序列片段的序列如SEQ ID NO.28所示。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，每50μL扩增体系中含有缓冲液29.5μL、FMDV各种型相应的引物探针液4.6μL、无菌双蒸水12.4μL、待测样本cDNA 1μL、反应驱动液2.5μL；设阳性和阴性对照，相应的反应体系分别用1μL标准阳性质粒或无菌双蒸水代替待测样本cDNA。
6.一种非诊断目的的应用RPA技术并结合侧流层析技术分型检测FMDV的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)提取待测样本的总RNA，反转录获得cDNA；
(2)设计用于口蹄疫病毒检测的通用引物和探针，以cDNA为模板，进行RPA扩增，扩增条件为：38℃水浴4min后，混匀，再38℃水浴20min；
(3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测；
(4)然后对检测的FMDV阳性样本分别进行A型、Asia 1型、O型的分型检测：分别设计用于口蹄疫病毒A型、Asia 1型、O型的检测引物和探针，以相应血清型cDNA为模板，分别进行RPA扩增，扩增条件为：38℃水浴4min后，混匀，再38℃水浴20min；
(5)应用侧流层析试纸条进行分型FMDV RPA扩增产物检测；
步骤(2)中，用于口蹄疫病毒检测的通用引物和探针，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示；
步骤(4)中，用于口蹄疫病毒A型检测的引物和探针，其正向引物序列如SEQ ID No.4所示，反向引物序列如SEQ ID No.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示；
用于口蹄疫病毒Asia 1型检测的引物和探针，其正向引物序列如SEQ ID No.7所示，反向引物序列如SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示；
用于口蹄疫病毒O型检测的引物和探针，其正向引物序列如SEQ ID No.10所示，反向引物序列如SEQ ID No.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示。
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