CN104263845A - 一种同时检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重PCR方法。本发明首先筛选出具有该病原体基因型特点的保守性基因片段，作为PCR检测的三个基因靶点，分别合成扩增这些靶点基因的引物；然后将3个基因片段的3对引物放在一个PCR反应体系，建立直接从样品中一次检测三种病原体的三重PCR检测方法。本发明一方面既可以准确检测病原体，还可以对混合感染状况进行分析，从而掌握其疫情流行发展趋势，起到一箭双雕的效果。另一方面其较常规PCR方法缩短了24小时的检测时间，达到了快速检测实际样品的目的，并降低了成本。

Description

一种同时检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重PCR方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的多重PCR检测方法，具体是一种能同时检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重PCR方法。

背景技术

猪呼吸道疾病已成为影响养猪业的重要群发性疾病之一。研究表明，猪呼吸道疾病是由一种或多种细菌、病毒混合感染引起的疾病。通常由病毒或支原体首先侵袭呼吸道，破坏防御屏障，各种气源性病菌如多杀性巴氏杆菌以及副猪嗜血杆菌等进入呼吸道和肺部而造成继发或混合感染。猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是的主要原发性病原之一，由于猪群感染MPS后难以治愈，且该病难以净化，避免接触MPS是最有效的预防措施，因此早期快速、准确地检测诊断十分必要。猪肺炎支原体是一种介于细菌和病毒之间的原核生物，其对培养条件要求较高，且在培养过程能够使PH值升高，通过酚红可以看到液体培养基变红，一般作为分离猪肺炎支原体的初步判断。然而这种检测费时且主观性强，难以达到准确诊断。另一个猪呼吸道常见病原体，猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)属革兰氏阴性菌，用印度墨汁等染料染色时可以看到清晰的荚膜，主要导致猪的出急性血性败血症、猪肺疫和萎缩性鼻炎，常与其他病毒和细菌呈混合感染或者继发感染。对巴氏杆菌的鉴定多采用形态观察、生理生化鉴定及其免疫学鉴定等传统的方法，这些方法耗时耗力且准确度差，因此仅仅依靠常规检验方法和临床经验很难对病原进行判断，进而会贻误动物疫病的防控的最佳时机；而副猪嗜血杆菌则是一种革兰氏阴性菌，能够引起猪纤维性浆膜炎、脑膜炎和关节炎等，且常与猪呼吸道疾病有关。副猪嗜血杆菌是比猪肺炎支原体还要难培养的病原菌之一，目前对其的分离检测要比养殖场实际感染率少20％以上，其通常与猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、猪繁殖与呼吸病毒等病原菌混合感染，由于其培养条件苛刻，限制了对其的研究。因此，建立一种灵敏快速的检测猪上述呼吸道三种常见病原体方法十分必要。

多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。其可在同一PCR反应体系中同时加入多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增，可用于同时检测多种病原体或鉴定出是哪一型病原体感染。

发明内容

鉴于以上三种病原体猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌均是猪场PRDC的常见重要病原体，且往往是混合感染。传统的诊断技术如细菌分离、免疫学试验等费时费力，不适于临床快速诊断，也不适于大规模的流行病学调查的现状，本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种直接从样品中一次检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重PCR检测方法。本发明方法简单，成本低廉，检测快速，效率高。

本发明本着一次检测就可以检出样品中三种病原体的目标，首先从已发表的文献中分别筛选出具有猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌三病原体基因型特点的保守性基因片段，作为PCR检测的三个基因靶点，分别合成扩增这些靶点基因的引物，将该3对引物放在一个PCR反应体系，通过各项参数调整优化，建立直接从样品中一次检测三种病原体的三重PCR检测方法；本发明还进一步改进现场样品前处理方法，通过缩短前处理时间，进一步达到利用该三重PCR方法快速检测实际样品的目的。

本发明是通过以下的技术方案实现的。

一种同时检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重PCR方法，具体步骤如下：

(1)筛选具有猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌三个病原体基因型特点的保守性基因片段，作为PCR检测的三个基因靶点，分别合成扩增上述靶点基因的引物；

(2)将3对引物放在一个PCR反应体系中，扩增靶点基因；

(3)通过琼脂糖凝胶电泳检测鉴定PCR扩增产物；其中：

扩增猪肺炎支原体的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；扩增猪多杀性巴氏杆菌的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示；扩增副猪嗜血杆菌的上游引物的序列如SEQID NO.5所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.6所示(见表1)。

表1 引物序列及PCR产物

本发明中，步骤(1)中，由于对引物的退火温度，片段长度等要求，最终选定的结果就为猪肺炎支原体(Mhp)的Sp36基因(948bp)、猪多杀性巴氏杆菌(PM)的KMT基因(457bp)、副猪嗜血杆菌的Trimeric autotransporter基因(291bp)。

本发明中，步骤(2)中，PCR反应体系如下：cDNA模板1μl，3对上、下游引物各0.5μl，PCR Mix 12.5μl，超纯水补充至50μl；PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s，58℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min。

本发明中，对实际待检测样品前处理时，选择猪多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体都适宜的TSB培养基，将现场采到组织样品直接接种在TSB液体培养基中培养12h后，取菌液提取猪被检病原体DNA样品，作为模板，进行三重PCR检测。。而常规的样品前处理则是先将组织样品在TSA固体平板上划线，一般要等24小时后才能长出菌落，然后将长出菌落再接种TSB液体培养基培养12小时后取菌液作为提取被检病原体DNA样品进行PCR检测。因此本发明较常规方法缩短了24小时的检测时间，能进一步达到快速检测实际样品的目的。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)较常规的PCR检测方法，本发明的多重PCR检测方法具有重复性好、特异性强及快速的特点，提高了检测效率。

(2)该方法体系既可以准确检测病原体，还可以对混合感染状况进行分析，从而掌握其疫情流行发展趋势,起到一箭双雕的效果；

附图说明

图1为副猪嗜血杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体三重PCR退火温度优化结果；其中：M：NDA 2000Marker；泳道1：55℃；泳道2：56℃；泳道3：57℃；泳道4：58℃；泳道5：59℃；泳道：6：60℃；泳道7：61℃；泳道8：62℃。

图2为副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌及猪肺炎支原体三重PCR特异性检测结果；其中：M：NDA 2000Marker；泳道1：沙门氏菌；泳道2：金黄色葡萄球菌；泳道3：链球菌；泳道4：大肠杆菌；泳道5：副猪嗜血杆菌；泳道6：巴氏杆菌；泳道7：猪肺炎支原体；泳道8：副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌及猪肺炎支原体。

图3为副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌及猪肺炎支原体三重PCR样品检测结果；其中：M：NDA 2000Marker；泳道1-15：样品。

具体实施方式

本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件。

实施例1检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重PCR方法退火温度优化

1样品前处理

将养猪场送检猪肺组织样品置于支原体液体培养基中，培养24h小时后取菌液作为提取猪肺炎支原体DNA样品；将养猪场送检猪肺组织样品在TSA培养基上划线，37℃培养24h后挑取单菌落接种于TSB培养基中，12h后取菌液作为提取猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌DNA样品。

2细菌DNA提取

本发明采用常规DNA提取方法，步骤如下：

2.1将上述菌液悬于1.5ml溶菌酶溶液(0.15mol/l NaCl,0.1mol/l Na₂EDTA，15mg/ml溶菌酶，pH＝8)；

2.2.37℃温浴2h；

2.3.加入1.5ml 10％SDS(0.1mol/l NaCl，0.5mol/l Tris，10％SDS，pH＝8)反复颠倒混匀10min，10000r/min离心10min，取上清；

2.4用等体积苯酚：氯仿：异戊醇各抽提1次，水相中加入40μl的3mol/l乙酸铵和3ml无水乙醇，-20℃沉淀DNA1h，12000r/min离心10min；

2.5收集DNA沉淀，用100μl TE溶解。

3三重PCR扩增反应体系建立

在PCR反应体系，特别是多重PCR反应体系中，退火温度是一个关键因素。本发明为了三重PCR体系中适合3对引物的退火温度，三重PCR反应体系如下：cDNA模板1μl，3对上、下游引物各0.5μl，PCR Mix 12.5μl，超纯水补充至50μl。PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s，设置55℃,56℃,57℃,58℃,59℃,60℃,61℃,62℃的退火温度梯度1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min，PCR结束后，取8μl产物作琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示三重PCR检测体系在退火温度58℃-60℃时能更好的扩增出预期的条带，选择58℃为本三重PCR体系的退火温度。

4结果

图1为副猪嗜血杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体三重PCR退火温度优化结果，设置55℃-62℃的退火温度进行梯度实验，结果显示三重PCR检测体系在退火温度58℃-60℃时能更好的扩增出预期的条带(泳道4-6)，选择58℃为本三重PCR体系的退火温度。

实施例2猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重PCR方法体系特异性

特异性是PCR反应体系又一个关键的因素。本发明为了确保所建立的三重PCR体系的特异性，利用大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌2型等作为对照，验证该体系的特异性，以体系只能扩增出猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌目的基因片段，而对照组不能扩增出片段为特异性合格。

1样品前处理

首先将实验室保存的沙门氏菌、大肠杆菌在LB培养基上划线，37℃培养过夜后挑单克隆菌落接种于2mL LB液体培养基中，12h后取沙门氏菌、大肠杆菌菌液作为对照PCR模板；将实验室保存的副猪嗜血杆菌、链球菌2型在TSA培养基上划线，副猪嗜血杆菌37℃烛罐培养24h后挑取单菌落接种于TSB培养基中，12h后取链球菌2型菌液作为对照PCR模板。猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌按照实施例1进行培养。

2细菌DNA提取

同实施例1。

3三重PCR扩增反应体系建立

三重PCR反应体系如下：cDNA模板1μl，3对上、下游引物各0.5μl，PCR Mix12.5μl，超纯水补充至50μl。PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s，58℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min，PCR结束后，取8μl产物作琼脂糖凝胶电泳分析。

4结果

副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌及猪肺炎支原体三重PCR特异性检测结果见图2。可见该三重PCR体系只能检出副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌及猪肺炎支原体单独或混合感染(泳道5-8)，特异性强。

实施例3三重PCR检测实际样品中猪多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌

1样品前处理

选择猪多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌都比较适宜的TSB培养基，将现场采到组织样品，无菌操作直接接种在TSB液体培养基中培养12h后，取菌液提取猪被检病原体DNA样品，作为模板，进行三重PCR检测。

2细菌DNA提取

同实施例1。

3三重PCR扩增反应

三重PCR反应体系如下：cDNA模板1μl，3对上、下游引物各0.5μl，PCR Mix12.5μl，超纯水补充至50μl。PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s，58℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min，PCR结束后，取8μl产物作琼脂糖凝胶电泳分析。

4结果

副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌及猪肺炎支原体三重PCR样品检测结果如图3所示。由结果看出，该三重PCR检测体系可以直接检出组织样品中单独感染的巴氏杆菌、猪肺炎支原体及副猪嗜血杆菌的单独及混合感染。

Claims (4)

1.一种同时检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重PCR方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)筛选具有猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌三个病原体基因型特点的保守性基因片段，作为PCR检测的三个基因靶点，分别合成扩增上述靶点基因的引物；

(2)将3对引物放在一个PCR反应体系中，扩增靶点基因；

(3)通过琼脂糖凝胶电泳检测鉴定PCR扩增产物；其中：

扩增猪肺炎支原体的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；

扩增猪多杀性巴氏杆菌的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示；

扩增副猪嗜血杆菌的上游引物的序列如SEQ ID NO.5所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的三重PCR方法，其特征在于，步骤(1)中，猪肺炎支原体的保守性基因片段为Sp36基因，猪多杀性巴氏杆菌的保守性基因片段为KMT基因，副猪嗜血杆菌的保守性基因片段为Trimeric autotransporter基因。

3.根据权利要求1所述的三重PCR方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR反应体系如下：cDNA模板1μl，3对上、下游引物各0.5μl，PCR Mix 12.5μl，超纯水补充至50μl；PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s，58℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min。

4.根据权利要求1所述的三重PCR方法，其特征在于，对实际待检测样品前处理时，选择猪多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体都适宜的TSB培养基，将现场采到组织样品直接接种在TSB液体培养基中培养12h后，取菌液提取猪被检病原体DNA样品，作为模板，进行三重PCR检测。