CN104862331B - 一种可溶性表达马红球菌致病基因VapA蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种可溶性表达马红球菌致病基因VapA蛋白的方法，是将VapA基因克隆到PMAL‑C5x载体上，构建表达载体PMAL‑VapA，并将PMAL‑VapA转化至原核表达菌，通过IPTG在20℃下诱导获得；以上述方法获得的重组蛋白几乎全部以可溶表达的形式存在。将该重组蛋白纯化后，浓度可达2mg/mL，该重组蛋白具有良好的免疫原性，更适于临床治疗用高免血清抗体和疫苗的制备、临床诊断试剂的开发和应用以及马红球菌致病机理的研究。

Description

一种可溶性表达马红球菌致病基因VapA蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种可溶性表达马红球菌致病基因VapA蛋白的方法。

背景技术

马红球菌属于红球菌属，是一种人畜共患的条件性致病菌。该病原菌普遍存在于自然环境土壤中，调查表明，50～95％的农场土壤中存在该菌。马红球菌可感染人，导致呼吸道感染症状。该病也是幼龄马驹最常见的疾病之一，发病率可达80％。染病马驹一般呈慢性或亚急性支气管肺炎症状，有时伴发盲结肠和肠系膜淋巴结溃疡。

一直以来关于马红球菌的致病机制并不清楚，直至最近研究发现，导致该细菌毒性的关键是其是否含有一个致病性相关质粒。该质粒含有85～90kb的遗传编码DNA，可编码多个高免疫原性的毒性脂蛋白。其中，毒性相关蛋白A(VapA)为其主要表达蛋白。大量研究表明，马红球菌的毒性与VapA密切相关。目前，虽有部分重组VapA蛋白表达的报道，但其表达的蛋白多以包涵体的形式存在，较难应用于实际的医疗诊断和治疗产品的开发和应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是马红球菌致病基因VapA蛋白多以包涵体形式存在而无法获得应用的技术缺陷，提供一种可溶性表达马红球菌致病基因VapA蛋白的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种可溶性表达马红球菌致病基因VapA蛋白的方法，扩增VapA基因，并克隆到PMAL-C5x载体上，构建表达载体PMAL-VapA，将PMAL-VapA转化至原核表达菌，通过IPTG在20℃下诱导获得可溶性VapA蛋白。

马红球菌致病基因VapA蛋白是重要的毒性蛋白，现有技术中关于该蛋白研究较少。一般纯化出的马红球菌致病基因VapA蛋白多以包涵体的形式存在，从而限制了其实际应用。申请人通过大量探索发现：将VapA基因与PMAL-C5x载体相连，并配合20℃的诱导温度可以表达出大量可溶性表达的VapA蛋白。

本发明使用PMAL-C5x载体，它可以促进重组表达蛋白的可溶性表达，实验研究表明，包涵体形式表达重组蛋白影响其氨基酸折叠形成正常的蛋白质三级、四级拓扑结构的形成，进而影响重组表达蛋白的抗原性和生物活性。本研究首次采用PMAL-C5x为载体，对马红球菌的致病基因VapA进行了重组，获得重组质粒—PMAL-VapA。

另外，发明人通过实验发现，单单使用PMAL-C5x载体，对VapA蛋白的可溶性表达虽然有促进作用，但作用并不明显，还必须要配合低温诱导，才能够使VapA蛋白大量可溶性表达，发明人研究了多个诱导温度对VapA蛋白的表达影响，结果显示，只有在20℃时才能够获得大量的可溶性的VapA蛋白。

优选地，本发明所述原核表达菌在培养至OD₆₀₀值为0.5～0.7后，加入IPTG进行诱导；更优选地，原核表达菌在培养至OD₆₀₀值为0.6后，加入IPTG进行诱导

优选的，本发明所述IPTG诱导的浓度为0.3～0.7mM，诱导时间为8～12h。

更优选地，申请人发现所述原核表达菌在20℃培养下，IPTG诱导浓度为0.7mM，且诱导时间为8h时，VapA蛋白的表达量最高，且多为可溶性表达。

具体地，上述方法包括以下步骤：

S1.重组质粒PMAL-VapA的构建：设计SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所述引物扩增VapA基因，将VapA基因与pZeroBack/blunt载体相连构建质粒pZeroBack-VapA；最后将PMAL-c5x和测序正确的pZeroBack-VapA进行双酶切后构建表达载体PMAL-VapA；

S2.将PMAL-VapA转化入BL21菌中，测序鉴定为阳性之后，将菌液接种于培养基中，培养至OD₆₀₀值为0.5～0.7，加入IPTG诱导后，离心重悬菌体，破碎菌体，收集上清，获得可溶性VapA蛋白。

S3.上清通过直链淀粉树脂进行亲和层析，获得纯化后的蛋白。

更优选地，S2原核表达菌在培养至OD₆₀₀值为0.6后，加入IPTG进行诱导。

本发明还提供了上述方法得到的可溶性VapA蛋白。

进一步地，还提供上述VapA蛋白制备得到的免疫制剂；具体地，所述免疫制剂为抗免血清。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种可溶性表达马红球菌致病基因VapA蛋白的方法，是将VapA基因克隆到PMAL-C5x载体上，构建表达载体PMAL-VapA，并将PMAL-VapA转化至原核表达菌，通过IPTG在20℃下诱导获得；以上述方法获得的重组蛋白几乎全部以可溶表达的形式存在。将该重组蛋白纯化后，浓度可达2mg/mL，该重组蛋白具有良好的免疫原性，更适于临床治疗用高免血清抗体和疫苗的制备、临床诊断试剂的开发和应用以及马红球菌致病机理的研究。

附图说明

图1为VapA基因的PCR扩增图；其中，1：VapA；2：ddH₂O对照；M：2000bp的DNA分子量标准。

图2为重组克隆质粒pZeroBack-VapA的酶切鉴定；其中，1：pZeroBack-VapA重组质粒的EcoR I和Not I双酶切产物；M：5000bp的DNA分子量标准。

图3为重组表达质粒PMAL-VapA的测序鉴定结果；下划线部位分别为Not I与EcoRI的酶切位点序列。

图4为不同诱导温度对蛋白表达量的影响；其中，M：蛋白分子量标准；1：IPTG诱导前的蛋白表达；2-6：分别在10℃、15℃、20℃、28℃和37℃温度下诱导的蛋白表达。

图5为不同IPTG诱导时间对蛋白表达量的影响；其中，M：蛋白分子量标准；1-8分别为IPTG诱导0、2、4、8、12、16、20和24小时的蛋白表达。

图6为不同IPTG浓度对诱导蛋白表达量的影响；其中，M：蛋白分子量标准；1-7：IPTG浓度分别为：0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0和1.4mM。

图7为20℃下0.7mM IPTG诱导8h后表达的蛋白；其中，M：蛋白分子量标准；1：诱导前BL21细菌的蛋白表达；2：诱导后BL21细菌的蛋白表达；3转化空表达载体PMAL-C5x的BL21诱导前蛋白表达；4：转化空表达载体PMAL-C5x的BL21诱导后蛋白表达；5：转化空表达质粒PMAL-VapA的L21诱导前蛋白表达；6：转化表达质粒PMAL-VapA的BL21诱导后的蛋白表达；7：经亲和层析纯化后的VapA蛋白；8：诱导表达VapA蛋白的BL21菌液超声破碎上清(含可溶性表达蛋白)；9：诱导表达VapA蛋白的BL21菌液超声破碎沉淀(含包涵体表达蛋白)。

图8为不同温度诱导表达的VapA蛋白的状态分析；M：蛋白分子量标准；1：IPTG诱导前转化BL21(含PMAL-VapA)的蛋白表达；2和3分别为：20℃诱导表达产物的超声破碎上清(含可溶性表达蛋白)和沉淀(含包涵体表达蛋白)；4和5分别为：28℃诱导表达产物的超声破碎上清和沉淀；6和7分别为：37℃诱导表达产物的超声破碎上清和沉淀。

图9为纯化后VapA蛋白的Western-blot分析结果；其中，1：纯化的VapA蛋白；M：蛋白分子量标准。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1原核表达重组质粒PMAL-VapA的构建与鉴定

1、马红球菌的复苏与培养：购买保藏于美国菌种保藏中心，保藏号为ATCC 33701的马红球菌，按照规定操作流程复苏马红球菌。

2、引物设计：根据NCBI基因库中马红球菌致病基因VapA序列(JN990991.1)以及pZeroBack/blunt和PMAL-C5x载体酶切位点，运用OLigo6.0软件，设计一对带酶切位点的引物(由上海英维捷基生物技术有限公司合成)，引物序列如下：

F：AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGAAGACCCTGCACAAGACGGTCTC(下划线为NotI酶切位点)

R：CCGGAATTCCTAAGCGTTGTGCCAACTACCCGAG(下划线为EcoR I酶切位点)。

3、VapA基因的PCR扩增与克隆

3.1.参照Fast HiFideLity PCR Kit说明扩增VapA基因，反应体系如表1。

表1 PCR反应体系

试剂	体积
		Fast HiFideLity PoLymerase	1uL
5×Fast HiFideLity PCR Buffer	10uL
		20×Fast PCR Enhancer	2.5uL
DEPC水	33.5uL
		引物F	1uL
引物R	1uL
		ATCC 33701菌液	1uL
总体积	50uL

反应程序：94℃预变性2min；(94℃变性30s；55℃退火30s；68℃延伸30s)共运行30个循环，68℃终延伸5min，最后4℃保存，结果如图1。

参照天根生化科技有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANgeL MidiPurification Kit)的使用说明书进行PCR产物的回收、纯化，方法如下：

(1)准备好1.5mL的EP管，将PCR扩增后的产物用1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)进行电泳，在紫外线照射下，切下含有目的基因(563bp)的凝胶，并放入准备好的EP管中，称取重量。

(2)柱平衡步骤：向吸附柱CA2(吸附柱当天经过了前处理)中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL。12,000rpm离心1min。倒掉收集管中的废液，并将吸附柱CA2重新放回收集管中。

(3)向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL PN溶液)，置于50℃水浴温育。其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解，如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些PN溶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)，胶块完全溶解后将溶液温度降至室温再上柱。

(4)将步骤(3)所得溶液加入步骤(2)平衡后的吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)。于室温放置2min后，12,000rpm离心60s。倒掉收集管中的废液，并将吸附柱CA2放入收集管中。吸附柱容积为800μL，若样品体积大于800μL可分批加入。

(5)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW(使用前需先检查是否已加入无水乙醇)，静置2～5min。12,000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，并将吸附柱CA2放入收集管中。

(6)重复操作步骤(5)。

(7)将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2min，将收集管中的漂洗液PW去除。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

(8)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40uLddH₂O，室温放置2min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液，将离心得到的溶液重新加回吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将DNA溶液收集到离心管中。DNA产物保存在-20℃，以防DNA降解。

3.2.PCR产物与pZeroBack/blunt载体的连接

参照零背景快速连接试剂盒(ZeroBack Fast Ligation Kit)说明书，连接反应体系如下：取pZeroBack/blunt载体0.3uL、T4 DNA Ligase 0.5uL、2×Reaction Buffer 5uL、ddH₂O 2.2uL、目的PCR纯化产物2uL放入EP管中混匀，并于22℃条件下反应5min，结束后置于冰上，进行后序转化实验。

3.3.大肠杆菌感受态的制备：采用氯化钙/甘油法制备，具体步骤如下：

(1)LB平板挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜，再以1：100接种于100mL LB液体培养基，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.4～0.6。

(2)将培养液分装至50mL无菌离心管，冰上放置l0min，4℃、3,000g离心10min。

(3)弃上清，加入预冷的0.05M CaCl₂l0mL，轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30min，4℃、3,000g离心5min。

(4)弃上清，加预冷含15％甘油的0.05M CaCl₂ 2mL，轻轻悬浮细胞，分装成100或者200uL的小份，贮存于-80℃冰箱中。

3.4.连接产物转化DH5α感受态细胞：本研究采用热休克法将3.2获得的连接产物转入大肠杆菌细胞中，包括以下步骤：

(1)从-80℃冰箱取一小份感受态细胞悬液，立即放于冰上解冻。

(2)加入适量目的质粒或连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min。

(3)42℃水浴热击60s，迅速置于冰上冷却3～5min。

(4)加入1mL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养60min；

(5)3000rpm离心5min后，去掉上清液至只剩余100uL后，重悬菌体，将其涂布于含相应抗生素的筛选平板上，正面向上放置于37℃恒温培养箱中待菌液完全被培养基吸收后倒置平板，培养12～16h。

用灭菌的10uL枪头挑取可疑菌落于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃震荡培养12～16h，取适量菌液作PCR鉴定，PCR扩增体系如表2。

表2 PCR扩增体系

试剂	体积
		2×Taq PCR star Mix	10uL
引物F	1uL
		引物R	1uL
DEPC 水	7uL
		菌液	1uL

PCR反应程序：94℃预变性5min；(94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸1min)共运行30个循环，70℃终延伸10min，最后4℃保存。

3.5.阳性菌液保存和质粒的提取

将PCR鉴定为阳性的菌液送广州华大基因生物技术有限公司进行序列测定，通过互联网NCBI基因库下载致病性马红球菌VapA基因片段，使用lasergene MegAlign软件对测序结果进行序列比对。

将测序正确的阳性菌液部分加入终浓度为30％的灭菌甘油，放入-80℃保存；部分进行扩大培养，参照天根生化科技有限公司快速质粒小提试剂盒(TIANprep Rapid MiniPlasmid Kit)的使用说明书进行质粒抽提，具体步骤如下：

(1)取1～4mL过夜培养的菌液，加入离心管中，于12,000rpm下离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入150uL溶液P1(请先检查是否已加入RNase A和TIANRed)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

(3)向离心管中加入150μL溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解。此时菌液变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

(4)向离心管中加入350μL溶液P5，立即快速地上下颠倒混匀12～20次，充分混匀，此时将出现絮状沉淀；12,000rpm离心2min。

(5)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。吸附柱CP3在12,000rpm下离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(6)向吸附柱CP3中加入300μL漂洗液PWT(检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(7)将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心1min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

(8)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～100uL洗脱缓冲液TB，12000rpm离心30s将质粒溶液收集到离心管中。

(9)利用限制性内切酶EcoR I和Notl I对抽提到的质粒进行双酶切鉴定(如图2)，获得一条3.2kb左右的条带和一条560bp左右的条带，表明VapA基因已成功连接到pZeroBack/blunt载体中。将该质粒命名为pZeroBack-VapA。

4、原核表达重组质粒PMAL-VapA的构建与鉴定

将原核表达载体PMAL-c5x和已经测序正确的阳性重组质粒pZeroBack-VapA分别用限制性内切酶EcoRI、Not I进行双酶切处理，酶切体系如表3。

表3 酶切反应体系

混匀表3中的酶切体系后，置于37℃水浴2～4h。将载体PMAL-C5x和重组质粒pZeroBack-VapA的酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，具体回收步骤参照3.1。

将回收的PMAL-c5x以及VapA基因利用T4DNA连接酶于16℃连接仪中过夜连接，并将PMAL-VapA转入原核表达菌BL21，经菌液PCR以及测序鉴定，结果如图3。测序结果与参考VapA基因序列完全一致，且含有正确的EcoRI和NotI酶切位点。将该原核表达重组质粒命名为PMAL-VapA。

实施例2可溶性MBP-VapA重组蛋白的表达及最佳诱导条件的确定

将转化PMAL-VapA质粒阳性的BL21菌液按1：100比例接种于(含氨苄青霉素50μg/ml)LB液体培养基中，于37℃摇床中200r/min振荡培养。至菌液OD₆₀₀值为0.6左右时，按下列方法进行MBP-VapA重组蛋白的优化表达。

1.诱导表达温度的确定

加入浓度为1mM的IPTG，并分别于10℃、15℃、20℃、28℃和37℃的条件下震荡培养至恰当的诱导时间取样。样本于4000r/min离心10min，弃上清，取沉淀，并将沉淀用原体积1/10的去离子水重悬，按常规方法进行SDS-PAGE，检测融合蛋白的表达。用BandScan(5.0版)软件分析泳道内蛋白含量，以确定最佳诱导表达温度。结果表明(如图4)，随着温度的由10℃的增加，VapA(59kDa)的表达量逐渐增加，并在15℃和20℃诱导时达到最大，随后降低。BandScan分析显示，在10℃、15℃、20℃、28℃和37℃的条件下诱导VapA蛋白的表达分别占总泳道蛋白量的9.1％、15.3％、16.6％、7.2％、2.7％，表明20℃诱导表达VapA的量最大。

2.IPTG诱导时间的确定

重复诱导实验，当转化菌液OD₆₀₀值达0.6左右时，加入浓度为1mM的IPTG，20℃诱导表达，分别在0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h和24h后取样。样本经4000r/min离心10min，弃上清，并将沉淀用原体积1/10的去离子水重悬，进行SDS-PAGE检测，并经BandScan分析，确定IPTG最佳诱导时间。结果(如图5)显示，随诱导时间的延长VapA表达量逐渐增加，并于诱导8h时达到最大表达量。其BandScan分析显示，IPTG诱导0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h和24h的VapA蛋白表达量分别占总泳道蛋白量的0％、14.3％、21.3％、31.4％、31.5％、26.5％、21.2％和12.3％。结果表明，IPTG的最佳诱导时间是8h。

3.IPTG诱导浓度的确定

按上述最佳诱导方法，当转化菌液OD₆₀₀值达0.6左右时，分别用终浓度为0mM、0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM和1.4mM的IPTG于20℃诱导表达8h后取样。样品以4000r/min离心10min，弃上清。收集菌体沉淀并用原体积1/10的去离子水重悬，进行SDS-PAGE检测并经BandScan分析，确定IPTG最佳诱导浓度。结果(如图6)显示，肉眼观察VapA蛋白的表达不随IPTG诱导浓度的变化而变化。但是，BandScan分析显示VapA蛋白表达量在IPTG浓度分别为0mM、0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM和1.4mM时，分别占总泳道蛋白量的0％、26.9％、31.3％、30.3％、32.4％、27.9％和24.8％。显示为随着IPTG诱导浓度的增加而增加，至0.7mM达到最高而后下降。标明该IPTG诱导VapA表达的最佳浓度为0.7mM。

4.重组表达的VapA蛋白状态的鉴定

申请人通过实验发现，IPTG诱导VapA重组蛋白的表达时，不同的温度对其表达的VapA蛋白的状态具有一定的影响。采用最佳IPTG浓度和诱导时间分别在20℃、28℃和37℃温度条件下对表达的VapA蛋白进行检测。取样菌液样本于4000r/min离心10min，弃上清，取沉淀。用原体积的1/10的上样缓冲液将沉淀重悬，并用超声在冰浴的条件下破碎细胞10min。经4℃离心，12000r/min 20min。按常规方法进行SDS-PAGE，检测上清(含可溶性表达的蛋白)和沉淀(含包涵体表达的蛋白)中蛋白的表达。

试验结果(如图8)显示，诱导前、20℃诱导表达产物的超声破碎上清和沉淀、28℃诱导表达产物的超声破碎上清和沉淀、以及37℃诱导表达产物超声破碎上清和沉淀内VapA蛋白表达量分别占总泳道蛋白量的0％、8.9％、10.1％、2.4％、5.3％、0％和5.6％。以上诱导表达产物经紫外分光度计检测，浓度分别为：3.0、8.3、1.5、5.3、3.2、6.5、2.7mg/mL。表明，20℃诱导表达条件下目的蛋白的表达量最大且绝大部分为可溶性表达。同时，在最佳诱导条件下，多次进行诱导表达，将产物超声波裂解细菌的上清及沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定表明重组蛋白绝大部分以可溶性的形式存在(图7)。

5.可溶性重组VapA蛋白的非变性纯化

将含有阳性质粒(PMAL-VapA)的BL21菌液按1：100的比例接种于200ml LB液体培养基(含氨苄青霉素50μg/ml)中，于37℃振荡培养至OD₆₀₀大约0.6左右时，加入浓度为0.7mM的IPTG，20℃诱导8h，使用NEB公司Amylose Resin产品(E8021)对表达蛋白进行纯化。参照说明书进行，具体操作如下：

(1)蛋白粗提

将诱导蛋白表达后菌液，4000g离心10min，收集菌体。用柱子缓冲液20mL重悬(柱子缓冲液用量为原菌液体积的1/10)，储存于-20℃。纯化蛋白时，将其置于冷水中化冻，并于冰水浴中，以4s的破碎，5s的间隔，进行超声破碎细胞。持续超声破碎直到所释放的蛋白质达到最大量，菌悬液变澄清为止。

将破碎后菌液在4℃，12000rpm条件下离心20min，获取的上清即为蛋白粗提物。

(2)亲和层析

a.柱子的准备：将1mL amylose介质填充于规格为1.0x10cm的柱子中。用5倍柱子体积的柱子缓冲液冲洗柱子。

b.上柱：介质的量决定融合蛋白质的量，每毫升柱床体积可结合6～8mg融合蛋白质，根据目的蛋白的表达量估算上样体积。控制最大线性流速为24cm/h，即0.3mL/min。流速计算方式为：线性流速(cm/h)×πr＝体积流速(mL/h)。

c.洗脱：用10倍介质体积的柱子缓冲液洗柱子，然后用10倍介质体积的柱子洗脱液洗脱目的蛋白，以每组分1mL收集10个组分，使用微量分光光度计测量每组分目的蛋白的量，1-6号收集液分别为：2.3、1.7、1.5、1.2、0.7和0.3mg/ml，7-10号收集液蛋白浓度为0。

纯化后蛋白液用SDS-PAGE检测，使用Bandscan软件对SDS-PAGE图片进行分析重组VapA蛋白的纯度，为83.7％。

6.重组VapA蛋白的抗原性分析

用Western blot对纯化的重组VapA蛋白的抗原性进行检测，具体步骤如下：

(1)将VapA蛋白的SDS-PAGE的置于转印平皿中，剪一张与SDS-PAGE凝胶一样大小的6张3mm滤纸及1张硝酸纤维素膜，浸泡于转移缓冲液中大约15min左右，以驱除留于滤膜上的气泡。

(2)阳极朝上，阴极在底部，上下各是3张滤纸，PAGE凝胶一定要在NC膜上面被滤纸包裹，并保证无气泡。

(3)安装电转移，以恒定电流150mA转移30min。

(4)加10ml封闭液(含8％～10％脱脂奶粉的TBS)，4℃封闭过夜。

(5)然后吸掉封闭液，用TBST洗三次，每次5min。

(6)以1：100稀释的抗马红球菌VapA蛋白的马阳性血清(Gluck Equine ResearchCenter馈赠)作为一抗，37℃作用2h

(7)弃反应液体，用TBST共洗15min，每次5min。

(8)最后再用羊抗马IgG Fab'2-HRP酶标二抗(LSBio公司)37℃条件下作用1h，同样洗3次，最后再拍照保存。Western-blot检测结果(如图9)显示，纯化的重组蛋白(59kDa)可被抗马红球菌VapA蛋白的马阳性血清特异性识别，表明，该重组蛋白具有良好的免疫源性。

因VapA蛋白在马红球菌中的表达量并不高，与直接从马红球菌中提纯VapA蛋白(Julien Cauchard，2004)相比，本发明采用非致病菌作为表达菌具生产更加安全、高效的特点；其次，与人工氨基酸合成VapA蛋白(Julien Cauchard，2006)相比，本发明所述方法表达的VapA氨基酸序列可通过天然细菌蛋白加工工厂完成正常的折叠、加工和修饰过程，形成更接近于马红球菌VapA蛋白的自然结构形态。最后，与已报导的VapA蛋白的表达方法相比，本方法表达出的蛋白为可溶性蛋白，而非包涵体蛋白。本发明方法表达的可溶性VapA蛋白具有更好的蛋白活性和免疫源性，而且，WB验证所表达的VapA具有较高的活性。另外，虽然以包涵体蛋白形式表达的重组蛋白量通常较大，但因其加工处理过程繁琐且需经变性方式纯化，并不适用于工业生产的应用。相比之下，本发明采用非变形方法纯化对VapA重组蛋白活性影响较小且过程简单、易操作，更适用于商业化大批量生产。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种可溶性表达马红球菌致病基因VapA蛋白的方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 引物F

<400> 1

aaggaaaaaa gcggccgcat gaagaccctg cacaagacgg tctc 44

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 引物R

<400> 2

ccggaattcc taagcgttgt gccaactacc cgag 34

Claims (3)

1.一种可溶性表达马红球菌致病基因VapA蛋白的方法，其特征在于，扩增VapA基因，并克隆到pMAL-c5x载体上，构建表达载体pMAL-VapA，将pMAL-VapA转化至原核表达菌，通过IPTG在20℃下诱导获得可溶性VapA蛋白；具体包括以下步骤：

S1. 重组质粒pMAL-VapA的构建：用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所述引物扩增VapA基因，将扩增产物与pZeroBack/blunt载体相连构建质粒pZeroBack-VapA；最后将pMAL-c5x和测序正确的pZeroBack-VapA进行双酶切后构建表达载体pMAL-VapA；

S2. 将pMAL-VapA 转化入BL21菌中，测序鉴定为阳性之后，将菌液接种于培养基中，培养至OD₆₀₀值为0.5～0.7后，加入IPTG诱导后，离心重悬菌体，破碎菌体，收集上清，获得可溶性VapA蛋白；

所述VapA基因的序列为GenBank JN990991.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，IPTG诱导的浓度为0.3～0.7mM，诱导时间为8～12h。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，IPTG诱导的浓度为0.7mM，诱导时间为8h。