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CN114591841B - 一株驴源马红球菌及其在制备灭活疫苗中的应用 - Google Patents

一株驴源马红球菌及其在制备灭活疫苗中的应用 Download PDF

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CN114591841B
CN114591841B CN202210196725.7A CN202210196725A CN114591841B CN 114591841 B CN114591841 B CN 114591841B CN 202210196725 A CN202210196725 A CN 202210196725A CN 114591841 B CN114591841 B CN 114591841B
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Abstract

本发明公开了一株驴源马红球菌及其在制备灭活疫苗中的应用；本发明从多例病死驴的化脓性肺炎肺脏样品中，通过细菌分离、鉴定和小鼠致病性试验，筛选出一株具有强致病性的驴源马红球菌。本发明还公开了驴源马红球菌在制备灭活疫苗中的应用，包括：菌株培养、菌液灭活获、加入佐剂，获得灭活疫苗。本发明的灭活疫苗安全性高，无毒性，工艺简单可靠。使用本申请制备的驴源马红球菌灭活疫苗用于驴群马红球菌的防治，免疫后产生的抗体效价高，能有效地减少驴源马红球菌感染小鼠致死的情况发生，可以避免药物带来的耐药性以及药物残留。

Description

一株驴源马红球菌及其在制备灭活疫苗中的应用
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，具体为一株驴源马红球菌及其在制备灭活疫苗中的应用。
背景技术
马红球菌(Rhodococcus equi，R.equi)是马群聚居地常见的一种存在于土壤中的兼性细胞内寄生的革兰氏阳性球杆菌，小于6月龄的驴驹发病率较高，且其致死率可达80％以上，病理表现为慢性或亚急性支气管肺炎和广泛性肺部脓肿，有时伴发盲结肠和肠系膜淋巴结溃疡。在临床表现上，早期病原在肺部扩散缓慢，驴驹对进行性肺功能丧失有强大的补偿能力。临床表现不明显，仅仅包括温和的发热或轻微的呼吸频率增加，诊断较为困难。当疾病进展到肺炎时，可出现厌食、昏睡、发热、心动过速、发生化脓性肺炎，呼吸迫促，鼻翼扩张、腹氏呼吸、鼻腔流脓液性分泌物，以后转为脓性，多因脓毒败血症而死。马红球菌感染驴驹导致的支气管肺炎、呼吸道症状甚至死亡不仅严重地影响驴驹的生产性能还导致驴驹的淘汰或死亡，给养驴场造成巨大的经济损失。研究调查发现，马红球菌感染在我国山东及新疆地区驴场频发，是危害我国驴产业发展的重要病原。目前，我国还没有针对马红球菌病的商品化疫苗，该病的防治主要还是依赖于药物，然而药物使用的种种弊端也日益凸显，如耐菌株的产生和药物残留等。因此，进行马红球菌病疫苗的研制用于预防和控制该病具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株驴源马红球菌及其在制备灭活疫苗中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一株驴源马红球菌的分离方法，包括以下步骤：
(1)无菌采集驴化脓性肺炎肺脏样品，接种至脱纤维绵羊血脑心浸液琼脂平板，在30-40℃，培养20-25h后，选取适中的菌落在脱纤维绵羊血脑心浸液琼脂平板上连续纯化3次，即为纯化培养物；
(2)将单个革兰氏阳性菌接种至脑心浸液肉汤中分别培养6h和12h，取步骤S1的纯化培养物在载玻片上制成涂片，对涂片进行革兰氏染色后，观察其形态，根据形态变化选取菌株后与马红球菌的相应序列进行比对，筛选后，即为一株驴源马红球菌。
较为优化的方案，步骤(2)中，选取菌株的形态变化为：球状变为杆状的革兰氏阳性球菌。
较为优化的方案，所述一株驴源马红球菌的保藏编号为CGMCCNO.24180，所述一株驴源马红球菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
较为优化的方案，分离出的一株驴源马红球菌用于制备一株驴源马红球菌灭活疫苗。
较为优化的方案，一株驴源马红球菌灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1：取一株驴源马红球菌，接种至脑心浸液培养基中，在30-40℃，180rpm培养20-25h，即为驴源马红球菌菌液；
S2：将灭活剂加入至驴源马红球菌菌液中，在30-40℃，180rpm灭活20-25h，即为驴源马红球菌灭活菌液；
S3：将佐剂与驴源马红球菌灭活菌液混合均匀，即为驴源马红球菌灭活疫苗。
较为优化的方案，所述驴源马红球菌灭活疫苗中驴源马红球菌的抗原含量为2×1010CFU/mL--2.5×1010CFU/mL。
较为优化的方案，步骤S2中，灭活剂为甲醛；步骤S3中，佐剂为铝胶佐剂。
较为优化的方案，步骤S3中，佐剂与驴源马红球菌的体积比为(1-3)：(1-3)。
较为优化的方案，一株驴源马红球菌灭活疫苗应用于驴的养殖过程中。
首先，本发明提供了一株驴源马红球菌，该菌株对驴的致病性强，制备的灭活疫苗安全，且该灭活疫苗具有良好的免疫保护性。本发明提供的一株驴源马红球菌是从多例病死驴的化脓性肺炎肺脏样品中，通过细菌分离和鉴定以及动物回归试验，筛选出的对驴具有致病性的驴源马红球菌SD1，该菌株于2021年12月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.24180，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址为中国，北京，中国科学院微生物研究所。
其次，本申请将一株驴源马红球菌用于制备一种驴源马红球菌灭活疫苗，制备的驴源马红球菌灭活疫苗中驴源马红球菌SD1的抗原含量不低于2×1010CFU/mL。如果将马群中的马红球菌制成灭活疫苗用于驴的养殖过程中，会存在效果差异，因为对于驴而言，驴驹对于分离自驴的马红球菌相比于分离自马的马红球菌更加易感，即被感染的风险相对较高。分离自驴的马红球菌与分离自马的马红球菌对于本动物可以激活的免疫原性也有不同程度的差异。在分别使用驴源与马源不同来源细菌免疫驴驹后，驴驹在面对更易感染驴的细菌时，驴源分离株疫苗产生的保护效力会高于使用马源分离株疫苗。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：本发明从多例病死驴的化脓性肺炎肺脏样品，通过细菌分离和鉴定以及动物回归试验，筛选出一株对驴具有致病性的驴源马红球菌SD1，本发明的灭活疫苗制备方法简单，安全性好，能有效地预防驴源马红球菌SD1感染的发生。此外，驴源马红球菌灭活疫苗的制备可以用于驴群中马红球菌的防治，使该病的防治方式增多，可以避免药物防治带来的耐药性以及药物残留，无毒性，工艺可靠。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：一株驴源马红球菌，包括以下步骤：
S1：纯化：无菌采集病死驴化脓性肺炎肺脏样品，每份样品分别划线接种于5％(V/V)脱纤维绵羊血脑心浸液琼脂平板，37℃培养24小时，挑取中等大小、边缘整齐、光滑湿润、圆形凸起的菌落，在5％(V/V)脱纤维绵羊血脑心浸液琼脂平板上连续纯化3次，获得纯化培养物；
S2：分离：取步骤S1的纯化培养物，均匀地涂布在载玻片上制备成涂片，经革兰氏染色后显微镜观察细菌形态，选取单个革兰氏阳性菌，接种至脑心浸液肉汤中分别培养6h和12h后，利用革兰氏染色观察形态变化，选取菌体形态有由球状变为杆状的革兰氏阳性球菌，备用；
S3：鉴定：提取步骤S2筛选的菌株的基因组DNA，利用16s rDNA引物扩增分离菌的16S rDNA基因，16S rDNA的PCR扩增细菌16S rDNA的通用引物为：F27：5’-agagttgatcctggctcag－3’，R1492：5’－aaggaggtgatccaaccgca－3’；PCR反应体系为25μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL、ddH2O 9μL、上下游引物各(10mmol/L)1μL、模板1.5μL；反应程序为95℃5min、95℃变性40s、56℃退火40s、72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸8min；PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察结果；PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，回收的目的片段送长春库美生物科技有限公司测序，将所得序列与Gen Bank中的马红球菌的相应序列进行比对，筛选获得菌株；
S4：将步骤S3鉴定的得到的驴源马红球菌进行生长曲线测定：
挑取5％(V/V)脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板新鲜培养的马红球菌菌落，将菌落接种至脑心浸液肉汤培养基，选取大小均一的菌落，此操作重复3次，3支锥形瓶分别编号A、B、C组；0-12h每2小时对3组进行取样，13-48h每小时对3组进行取样，49-68h每4小时对3组进行取样，取样后测定细菌悬液的光密度，并进行倍比稀释，涂布于BHI-血琼脂培养基平板计细菌活菌数目；根据平板计数结果对应OD600nm数据绘制马红球菌生长曲线；根据曲线可见培养至21h-40h为平稳期，平稳期初期细菌总数达到最大，新增细菌数量与死亡数量平衡，能量代谢和生命合成功能正常，选择平稳期早期细菌，即为一株驴源马红球菌SD1。
对实施例1的一株驴源马红球菌进行性能检测：
1、传代稳定性检测：将一株驴源马红球菌培养至对数生长期，在5％(V/V)脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板划线于37℃培养24h，挑取单菌落，置于脑心浸液肉汤培养基，37℃、180rpm/min培养24h，得到2代菌液，以此类推，直至传代50次。每传1代进行一次镜检，每传5代进行一次生化检测。传代完成后，菌株形态无变化，生化鉴定与原代菌株完全符合，氧化酶阴性，不发酵糖类，不产生靛基质，不液化明胶。分解尿素，产生触酶，可以还原硝酸盐。所以本株驴源马红球菌具有良好的稳定性。
2、半数致死量测定：选取SPF BALB/C小鼠，50只，体重约18g，雌性将小鼠随机分为5组，其中4个实验组，1个对照组，每组10只，雌性，菌液按照5×109-5×106CFU/0.2mL。采用腹腔注射，用培养20h的菌液等容量不等浓度接种小鼠，对照组注射等量生理盐水。攻毒后，连续观察10d。本株驴源马红球菌可以导致小鼠感染直至死亡，当接种计量为5×109CFU，接种小鼠在4h后出现发病症状，12h内小鼠出现死亡，72h内小鼠全部死亡，死亡率为100％，表明本株驴源马红球菌可以造成小鼠的死亡。根据Reed-Muench法，计算出SD1对小鼠的LD50值为1.58×108CFU/只。
实施例2：一种驴源马红球菌灭活疫苗，包括以下步骤：
S1：取实施例1的一株驴源马红球菌SD1以体积比为0.1％接种到500mL脑心浸液培养基，在37℃180rpm培养24h，即为驴源马红球菌菌液；
S2：在驴源马红球菌菌液中加入甲醛至体积终浓度为0.25％，在37℃180rpm灭活20h，即为驴源马红球菌灭活菌液；
S3：在驴源马红球菌灭活菌液中加入铝胶佐剂磐石益格，混合均匀，铝胶佐剂与驴源马红球菌的体积比为1:3，吸附24h，分装后密封，4℃保存，即为驴源马红球菌灭活疫苗。
实施例3：一种驴源马红球菌灭活疫苗，包括以下步骤：
S1：取实施例1的一株驴源马红球菌SD1以体积比为0.1％接种到500mL脑心浸液培养基，在30℃180rpm培养24h，即为驴源马红球菌菌液；
S2：在驴源马红球菌菌液中加入甲醛至体积终浓度为0.25％，在30℃180rpm灭活20h，即为驴源马红球菌灭活菌液；
S3：在驴源马红球菌灭活菌液中加入铝胶佐剂磐石益格，混合均匀，铝胶佐剂与驴源马红球菌的体积比为1:3，吸附24h，分装后密封，4℃保存，即为驴源马红球菌灭活疫苗。
实施例4：一种驴源马红球菌灭活疫苗，包括以下步骤：
S1：取实施例1的一株驴源马红球菌SD1以体积比为0.1％接种到500mL脑心浸液培养基，在35℃180rpm培养24h，即为驴源马红球菌菌液；
S2：在驴源马红球菌菌液中加入甲醛至体积终浓度为0.25％，在35℃180rpm灭活20h，即为驴源马红球菌灭活菌液；
S3：在驴源马红球菌灭活菌液中加入铝胶佐剂磐石益格，混合均匀，铝胶佐剂与驴源马红球菌的体积比为1:3，吸附24h，分装后密封，4℃保存，即为驴源马红球菌灭活疫苗。
实施例5：一种驴源马红球菌灭活疫苗，包括以下步骤：
S1：取实施例1的一株驴源马红球菌SD1以体积比为0.1％接种到500mL脑心浸液培养基，在40℃180rpm培养24h，即为驴源马红球菌菌液；
S2：在驴源马红球菌菌液中加入甲醛至体积终浓度为0.25％，在40℃180rpm灭活20h，即为驴源马红球菌灭活菌液；
S3：在驴源马红球菌灭活菌液中加入铝胶佐剂磐石益格，混合均匀，铝胶佐剂与驴源马红球菌的体积比为1:3，吸附24h，分装后密封，4℃保存，即为驴源马红球菌灭活疫苗。
实施例6：一种驴源马红球菌灭活疫苗，包括以下步骤：
S1：取实施例1的一株驴源马红球菌SD1以体积比为0.1％接种到500mL脑心浸液培养基，在37℃180rpm培养24h，即为驴源马红球菌菌液；
S2：在驴源马红球菌菌液中加入甲醛至体积终浓度为0.25％，在37℃180rpm灭活20h，即为驴源马红球菌灭活菌液；
S3：在驴源马红球菌灭活菌液中加入铝胶佐剂磐石益格，混合均匀，铝胶佐剂与驴源马红球菌的体积比为1:1，吸附24h，分装后密封，4℃保存，即为驴源马红球菌灭活疫苗。
实施例7：一种驴源马红球菌灭活疫苗，包括以下步骤：
S1：取实施例1的一株驴源马红球菌SD1以体积比为0.1％接种到500mL脑心浸液培养基，在30℃180rpm培养24h，即为驴源马红球菌菌液；
S2：在驴源马红球菌菌液中加入甲醛至体积终浓度为0.25％，在30℃180rpm灭活20h，即为驴源马红球菌灭活菌液；
S3：在驴源马红球菌灭活菌液中加入铝胶佐剂磐石益格，混合均匀，铝胶佐剂与驴源马红球菌的体积比为1:1，吸附24h，分装后密封，4℃保存，即为驴源马红球菌灭活疫苗。
实施例8：一种驴源马红球菌灭活疫苗，包括以下步骤：
S1：取实施例1的一株驴源马红球菌SD1以体积比为0.1％接种到500mL脑心浸液培养基，在38℃180rpm培养24h，即为驴源马红球菌菌液；
S2：在驴源马红球菌菌液中加入甲醛至体积终浓度为0.25％，在38℃180rpm灭活20h，即为驴源马红球菌灭活菌液；
S3：在驴源马红球菌灭活菌液中加入铝胶佐剂磐石益格，混合均匀，铝胶佐剂与驴源马红球菌的体积比为1:1，吸附24h，分装后密封，4℃保存，即为驴源马红球菌灭活疫苗。
实施例9：一种驴源马红球菌灭活疫苗，包括以下步骤：
S1：取实施例1的一株驴源马红球菌SD1以体积比为0.1％接种到500mL脑心浸液培养基，在37℃180rpm培养24h，即为驴源马红球菌菌液；
S2：在驴源马红球菌菌液中加入甲醛至体积终浓度为0.25％，在37℃180rpm灭活20h，即为驴源马红球菌灭活菌液；
S3：在驴源马红球菌灭活菌液中加入铝胶佐剂磐石益格，混合均匀，铝胶佐剂与驴源马红球菌的体积比为3:1，吸附24h，分装后密封，4℃保存，即为驴源马红球菌灭活疫苗。
实施例10：一种驴源马红球菌灭活疫苗，包括以下步骤：
S1：取实施例1的一株驴源马红球菌SD1以体积比为0.1％接种到500mL脑心浸液培养基，在35℃180rpm培养24h，即为驴源马红球菌菌液；
S2：在驴源马红球菌菌液中加入甲醛至体积终浓度为0.25％，在35℃180rpm灭活20h，即为驴源马红球菌灭活菌液；
S3：在驴源马红球菌灭活菌液中加入铝胶佐剂磐石益格，混合均匀，铝胶佐剂与驴源马红球菌的体积比为3:1，吸附24h，分装后密封，4℃保存，即为驴源马红球菌灭活疫苗。
实施例11：一种驴源马红球菌灭活疫苗，包括以下步骤：
S1：取实施例1的一株驴源马红球菌SD1以体积比为0.1％接种到500mL脑心浸液培养基，在40℃180rpm培养24h，即为驴源马红球菌菌液；
S2：在驴源马红球菌菌液中加入甲醛至体积终浓度为0.25％，在40℃180rpm灭活20h，即为驴源马红球菌灭活菌液；
S3：在驴源马红球菌灭活菌液中加入铝胶佐剂磐石益格，混合均匀，铝胶佐剂与驴源马红球菌的体积比为3:1，吸附24h，分装后密封，4℃保存，即为驴源马红球菌灭活疫苗。性能检测：
(一)驴源马红球菌灭活疫苗的安全性检测：
1、无菌检测：取0.2mL实施例2-实施例11制备的灭活疫苗，均匀地涂布于含5％(V/V)脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板上，37℃倒置培养5日。实施例2-实施例11结果均为阴性，说明制备的驴源马红球菌灭活疫苗无细菌污染。
2、动物安全性检测：
①取24只健康的6-8周龄BALB/c小鼠，雌性，平均分为4组，每组6只。试验组：分别经腹腔注射0.2mL实施例2～实施例11制备的三种比例的灭活疫苗；对照组：经腹腔注射0.2mL灭菌脑心浸液培养基。试验期14天。试验期间，试验组和对照组小鼠均健康活泼，无死亡，采食和饮水正常，说明实施例2-实施例11制备的灭活疫苗安全。经体重监测，免疫各组各阶段体重变化均无显著差异，但实施例2组小鼠体重变化最为平稳。
②取24只健康的6-8周龄BALB/c小鼠，雌性，平均为3组，每组8只。疫苗一组：腿部肌肉注射实施例2～实施例11制备的灭活疫苗0.1mL；疫苗二组：腿部肌肉注射实施例2～实施例11制备的灭活疫苗各0.2mL；对照组：不做处理。试验期21天。试验期间，疫苗一组、疫苗二组和对照组的试验鼠均健康活泼，采食和饮水正常，也未观察到疫苗注射引起的局部的和全身的不良反应，说明实施例2-实施例11制备的灭活疫苗安全可靠。
(二)驴源马红球菌灭活疫苗的免疫效果
1、疫苗免疫后的抗体消长规律：选取驴源马红球菌阴性和抗驴源马红球菌抗体阴性的BALB/c小鼠10只，平均分为2组。免疫组：5只试验鼠，雌性，6-8周龄时腿部肌肉注射本发明的疫苗0.1mL，初次免疫14日后第二次免疫本发明的疫苗0.1mL，二次免疫21日后第三次免疫本发明的疫苗0.1mL；对照组：5只试验鼠，雌性，6-8周龄时腿部肌肉注射生理盐水0.1mL，初次免疫14日后第二次免疫生理盐水0.1mL，二次免疫21日后第三次免疫生理盐水0.1mL，分别于第二次免疫后第7天、14天、21天和和第三次免疫后第7天、14天断尾采集全血，分离血清，以超声破碎的驴源马红球菌菌悬液为包被抗原，通过间接ELISA试验测定实验鼠血清中的抗体效价。
结果：第二次免疫后试验鼠血清中驴源马红球菌的抗体效价相对稳定，抗体效价能维持在1:3200以上；第三次免疫后试验鼠血清中的驴源马红球菌的抗体效价较快上升，第三次免疫后第14天的抗体效价能维持在1:1.28×104以上的较高水平。
2、疫苗的免疫保护效力：选取驴源马红球菌阴性和抗驴源马红球菌抗体阴性的BALB/c小鼠10只，平均分为2组。免疫组：5只试验鼠，雌性，6-8周龄时腿部肌肉注射本发明的疫苗0.1mL，初次免疫14日后第二次免疫本发明的疫苗0.1mL，二次免疫21日后第三次免疫本发明的疫苗0.1mL；对照组：5只试验鼠，雌性，6-8周龄时腿部肌肉注射生理盐水0.1mL，初次免疫14日后第二次免疫生理盐水0.1mL，二次免疫21日后第三次免疫生理盐水0.1mL。在第三次免疫21日后，对各组小鼠进行2×LD50攻菌量感染。计算整个试验期间实验鼠由驴源马红球菌感染引起的死亡率。
实验鼠死亡率(％) 正常对照组死亡率(％)
实施例2 40 100
实施例3 42 100
实施例4 41 100
实施例5 40 100
实施例6 38 100
实施例7 42 100
实施例8 41 100
实施例9 40 100
实施例0 40 100
实施例11 43 100
结果：疫苗组试验鼠死亡率均为40％左右；而正常对照组试验鼠发病率为100％。结果表明，本发明的驴源马红球菌灭活疫苗对驴源马红球菌的感染具有良好的预防效果。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明实施例公开的技术方案和实施例中公开的技术细节，仅是示例性说明本发明的发明构思，并不构成对本发明实施例技术方案的限定，凡是对本发明实施例公开的技术细节所做的常规改变、替换或组合等，都与本发明具有相同的发明构思，都在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一株驴源马红球菌，其特征在于，所述一株驴源马红球菌的保藏编号为CGMCCNO.24180，所述一株驴源马红球菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的一株驴源马红球菌的应用，其特征在于，所述的一株驴源马红球菌用于制备一株驴源马红球菌灭活疫苗。
3.一株驴源马红球菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取权利要求1所述的一株驴源马红球菌，接种至脑心浸液培养基中，在30-40℃，180rpm培养20-25h，即为驴源马红球菌菌液；
S2：将灭活剂加入至驴源马红球菌菌液中，在30-40℃，180rpm灭活20-25h，即为驴源马红球菌灭活菌液；
S3：将佐剂与驴源马红球菌灭活菌液混合均匀，即为驴源马红球菌灭活疫苗。
4.根据权利要求3所述的一株驴源马红球菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述驴源马红球菌灭活疫苗中驴源马红球菌的抗原含量为2×1010 CFU/mL--2.5×1010 CFU/mL。
5.根据权利要求3所述的一株驴源马红球菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S2中，灭活剂为甲醛；步骤S3中，佐剂为铝胶佐剂。
6.根据权利要求3所述的一株驴源马红球菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S3中，佐剂与驴源马红球菌的体积比为1～3：1～3。
7.一株驴源马红球菌灭活疫苗，其特征在于，由权利要求3～6任一项所述的一株驴源马红球菌灭活疫苗的制备方法制备得到。
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