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CN104849472A - 用于原位检测核酸的超灵敏方法 - Google Patents

用于原位检测核酸的超灵敏方法 Download PDF

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CN104849472A
CN104849472A CN201510204485.0A CN201510204485A CN104849472A CN 104849472 A CN104849472 A CN 104849472A CN 201510204485 A CN201510204485 A CN 201510204485A CN 104849472 A CN104849472 A CN 104849472A
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hrp
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CN201510204485.0A
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吴兴永
王晖瑜
苏楠
王力翀
罗宇龄
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Advanced Cell Diagnostics Inc
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Advanced Cell Diagnostics Inc
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Abstract

本文公开了基于方法和常规ISH信号放大方法的组合的用于原位检测一种或多种目标核酸的方法。这种新方法产生了高信号强度并同时保持了信号放大的低背景噪声。可以一致地重复产生结果并且所述方法能够容易地用于常规临床诊断使用。此外，本发明涉及用于一种或多种目标核酸的灵敏检测的试剂盒，其包含测定和通用ISH信号放大测定的组分。

Description

用于原位检测核酸的超灵敏方法
相关申请的引用
本申请是申请日为2011年10月21日，申请号为201180062037.1，发明名称为“用于原位检测核酸的超灵敏方法”的中国发明专利申请的分案申请。本申请要求于2010年10月21日提交的代理人卷号no.12790-021-888的标题为“用于原位检测核酸的超灵敏方法(ULTRA SENSITIVE METHODFOR IN SITU DETECTION OF NUCLEIC ACIDS)”的美国临时专利申请第61/405,503号(Wu等人)和2010年11月10日提交的代理人卷号no.12790-022-888的标题为“用于原位检测核酸的超灵敏方法(ULTRASENSITIVE METHOD FOR IN SITU DETECTION OF NUCLEIC ACIDS)”的美国临时专利申请第61/412,276号(Wu等人)的优先权和权益。这些申请中的每一个均出于各种目的以其全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及核酸化学和生物化学测定。更具体地，本发明涉及用于原位检测样品中核酸分析物的方法。
背景技术
原位杂交(ISH)是一种允许检测和定位保存形态的单个细胞、组织学组织切片或染色体制备中的特定核酸分子的技术。在1969年首次描述了这种技术，并且该技术基于核苷酸探针与细胞中DNA或RNA的特异性目标序列的互补杂交。其可以是内源DNA、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、病毒序列或细菌序列。用报告分子标记所加入的探针，并且通过荧光(荧光原位杂交，FISH)或显色(显色原位杂交，CISH)使结合位点可见。
在人类全基因组测序完成后，近年来在公共数据库和非公共数据库中已注释了成千上万个新的人基因序列。由于它相对容易、快速并且廉价地设计并合成了用于检测细胞中任何新基因的特定序列的反义探针，因此这为ISH打开了新的大门。通过ISH可以获得基因的组织特异性和细胞类型特异性表达模式以及表达水平，这将为分析基因功能提供有价值的信息。
然而，由于ISH技术的灵敏度和特异性较差而不能检测细胞中低拷贝数的DNA或RNA靶标，这会限制它们的应用。将ISH应用于临床标准是特别困难的，其中使用福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)来保存临床组织样品是世界上最常使用的方法。FFPE法良好地保存了组织形态，但是通过甲醛的交联固定会导致目标序列与检测探针的可接近性较差，探针分子与其他分子或结构之间的化学或物理相互作用较差，以及对核酸(尤其是mRNA)的损伤。
为了克服ISH的限制并扩展它在诊断病理学中的应用，已开发了几种策略以改善ISH的灵敏度。最近，Advanced Cell Diagnostics,Inc.开发出了称为的新型ISH信号放大方法(美国专利第7,709,198号)。这种测定包括独特设计的低聚捕获探针以及由预扩增子(preamplifier)、扩增子(amplifier)和标记探针组成的信号放大系统，从而使得能够在不放大背景信号的情况下显著放大信号，并能够对几乎任何基因进行单个RNA分子检测。在图1中示意地说明了技术的示例性实施方式并且将在本申请的第二部分中详细说明。
在用于检测目标核酸的典型测定中，待检测其表达的目标mRNA从细胞中释放并被到固体表面(例如，微量滴定板的孔)上。还提供了一组两个或更多个捕获探针和信号产生多聚体。所述捕获探针与目标核酸和信号产生多聚体两者杂交，并因此将信号产生多聚体捕获至目标核酸。所述信号产生多聚体包含标记探针(LP)。但是更通常地，除标记探针外，所述信号产生多聚体包含预扩增子和/或扩增子。所述标记探针能够结合至提供可检测信号的标记颗粒或分子。标记探针具有使得能够连接多个标记颗粒或分子的较大分子结构，其提供了比单个标记颗粒或分子更强的信号。因此，改善了核酸检测的灵敏度和特异性。
然而，单独利用仍不能可靠地检测以往的其中RNA被显著降解的福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织切片中的一些低拷贝基因。另外，使用当前的技术不能使单个RNA分子以40×放大显象。期望进一步增强检测信号以使得能够更稳健地检测任何RNA分子，包括显著降解的RNA分子，并允许对所检测的RNA信号以10×放大容易地显像。
在本申请中，我们描述了新型ISH信号放大测定以通过将两种信号放大方法合并到一个系统中来扩展ISH在诊断病理学中的应用。该系统具有三种形式：(1)与生物素-(抗生蛋白链菌素)抗生物素蛋白组合，(2)与抗体组合，(3)与酪胺信号放大(TSA)组合。所有这些方法能够利用技术优越的特异性和三种放大方法的放大能力。我们出人意料地发现上述三种组合信号放大方法能够显著放大与样品中目标核酸的存在有关的信号并同时具有优异的信噪比。
基于两种分子对彼此具有非常高的亲合力，并且一个抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素分子可以结合四个生物素分子这一事实，生物素-抗生物素蛋白(或生物素-抗生蛋白链菌素)是一种公知的信号放大系统。抗体在免疫组织化学和ISH中被广泛用于信号放大。TSA基于通过过氧化物酶活性的多个半抗原酪胺分子的沉积。酪胺是酚类化合物。在存在少量过氧化氢的情况下，固定化辣根过氧化物酶(HRP)将标记的底物转化为存活期短的(short-lived)、反应性极强的中间体。然后，在过氧化物酶结合位点处或附近，活化的底物分子极快速地与蛋白质的富电子部分(如酪氨酸)反应并与其共价结合。以这种方式，能够在杂交位点原位引入结合至酪胺的大量额外的半抗原分子。随后，可以直接或间接地使沉积的酪胺-半抗原分子显象。
已在ISH中使用了所有这些信号放大方法并获得了不同程度的成功，但是通常对于日常诊断病理学而言，信号强度和/或信噪比还不够好。就TSA而言，具体地，当在ISH中单独使用时，产生了大量的背景噪声。每一天和每个实验室的一致性还达不到所期望的要求。
考虑到上述情况，需要以高强度和高特异性地放大核酸的方法。对于这种方法，还需要其具有高度的一致性。本发明提供了这些和其他特征，可通过阅读以下内容显而易见。
发明内容
本发明将的信号放大方法与常规ISH信号放大方法组合为超敏感方法以检测、定量和鉴别样品中的一种或多种目标核酸。由于其独特的成对捕获探针设计，测定提供了优越的特异性。通过将常规ISH信号放大方法(例如基于TSA的信号放大)添加至测定，该组合方法实现了高信号强度和低背景值。本发明所公开的信号放大方法和系统相对易于使用并且产生一致的结果。所要求保护的方法能够容易地适合于在常规临床诊断程序中使用。
在本发明的一种优选实施方式中，平衡了所公开的信号放大方法的特异性和灵敏性。通过适度减小中信号放大的倍数实现了这种平衡。在本发明的一种实施方式中，一个预扩增子被设计为结合1至16个扩增子。在一种优选的实施方式中，一个预扩增子被设计为结合2至10个扩增子。在另一种更优选的实施方式中，一个预扩增子被设计为结合2至5个扩增子。
在检测样品中目标核酸的优选实施方式中，首先提供包含或怀疑包含所述目标核酸的样品，以及能够与所述目标核酸杂交的至少一组两个或更多个捕获探针、能够杂交至该两个或更多个捕获探针的组的信号产生多聚体(其中所述信号产生多聚体包含标记探针)、和能够结合至所述标记探针的信号放大探针(其中所述信号放大探针包含标记物)。在所述方法中，首先将目标核酸杂交至两个或更多个捕获探针的组，然后将所述信号产生多聚体捕获至所述两个或更多个捕获探针的组，并借此将所述信号产生多聚体捕获至所述目标核酸。然后，将所述信号放大探针捕获至所述标记探针，并借此捕获至所述信号产生多聚体。在最后一步中，检测信号放大探针中标记物的存在、不存在或量。
在一种实施方式中，所述信号放大探针包含：能够结合至所述标记探针的生物素分子，能够结合至所述生物素分子的抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素分子，以及结合至辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)或荧光团并且能够结合至抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素分子的另外的生物素分子。
在另一种实施方式中，所述信号放大探针包含：能够结合至所述标记探针的HRP、AP、二硝基苯基(DNP)或荧光团分子，能够结合至所述HRP、AP、DNP或荧光团分子的一种或多种第一抗体，以及结合至HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或荧光团并且能够结合所述一种或多种第一抗体的一种或多种第二抗体。
在另一种实施方式中，所述信号放大探针包含：能够结合至所述标记探针的HRP分子、多个能够与所述HRP分子反应的酪胺-生物素或酪胺-荧光团分子、以及能够可见地检测所述酪胺-生物素或酪胺-荧光团分子的检测标记物。所述检测标记物是抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP和显色底物的组合或抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-AP和显色底物的组合。所述显色底物选自：二氨基联苯胺(DAB)和固红。
在一种实施方式中，所述信号产生多聚体包含能够杂交至两个或更多个捕获探针的组的标记探针。在另一种实施方式中，所述信号产生多聚体包含标记探针和杂交至所述标记探针的扩增子。所述扩增子能够杂交至所述两个或更多个捕获探针的组。在一种优选的实施方式中，所述信号产生多聚体包含标记探针、杂交至所述标记物的扩增子和杂交至一种或多种扩增子的预扩增子。所述预扩增子能够杂交至所述两个或更多个捕获探针的组。
所述目标核酸可以是任何类型的，例如，DNA、cDNA、RNA、mRNA、rRNA、miRNA、siRNA和/或等等。
在一种实施方式中，可以在进行杂交之前在固体载体上发生放大。
本发明的方法还提供了多重检测(mutiplex)两种或更多种目标核酸的多种方式。例如，所述样品可以包含细胞，所述细胞包含或怀疑包含两种或更多种不同的目标核酸。所述样品还可以包含两种或更多种不同的细胞，所述细胞中的每一种包含或怀疑包含不同的目标核酸。
可以使用双色显色原位杂交(CISH)或双色荧光原位杂交(FISH)检测两种不同的目标核酸。在一种实施方式中，使用两种不同的信号放大探针进行所述双色CISH，其中第一信号放大探针包含：酪胺-生物素、抗生蛋白链菌素-HRP和DAB，而第二信号放大探针包含：抗-DNP-AP和固红。
本发明包括试剂盒以实施本发明的方法。所述试剂盒可以包含试剂以进行核酸检测并提供实施本发明方法所必需的条件。所述试剂盒包括，例如，这样的试剂盒，其包含：目标核酸、能够与所述目标核酸杂交的一组的两个或更多个捕获探针、能够杂交至两个或更多个捕获探针的组的信号产生多聚体，其中所述信号产生多聚体包含标记探针，和能够结合至所述标记探针的信号放大探针，其中所述信号放大探针包含标记物。
在一种类型的所述试剂盒中，所述信号放大探针包含：能够结合至所述标记探针的生物素分子，能够结合至所述生物素分子的抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素分子，以及结合至HRP、AP或荧光团并且能够结合至抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素分子的另外的生物素分子。
在另一种类型的试剂盒中，所述信号放大探针包含：能够结合至所述标记探针的HRP、AP、DNP或荧光团分子，能够结合至所述HRP、AP、DNP或荧光团分子的一种或多种第一抗体，以及结合至HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或荧光团并且能够结合所述一种或多种第一抗体的一种或多种第二抗体。
在另一种类型的试剂盒中，所述信号放大探针包含：能够结合至所述标记探针的HRP分子、能够与所述HRP分子反应的多个酪胺-生物素或酪胺-荧光团分子、以及能够可见地检测所述酪胺-生物素分子的检测标记物。所述检测标记物可以是抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP和显色底物的组合或抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-AP和显色底物的组合。所述显色底物可以选自：DAB和固红。
在一种试剂盒中，所述信号产生多聚体包含能够杂交至两个或更多个捕获探针的组的标记探针。在另一种试剂盒中，所述信号产生多聚体包含标记探针和杂交至所述标记探针的扩增子。所述扩增子能够杂交至所述两个或更多个捕获探针的组。在一种优选的试剂盒中，所述信号产生多聚体包含标记探针、杂交至所述标记物的扩增子和杂交至一个或多个扩增子的预扩增子。
所述试剂盒中预扩增子:扩增子之比可以为1-16之间，或者优选地为2-10之间或2-5之间。
本发明所述的试剂盒能够在多个核酸放大的多重检测中起作用。所述试剂盒可以用于检测两种或更多种不同细胞中的核酸靶标，所述细胞中的每一种包含或怀疑包含不同的目标核酸，或者检测一种细胞中的两种或更多种核酸靶标。所述试剂盒中的信号放大探针可以是双色显色原位杂交(CISH)探针或双色荧光原位杂交(FISH)探针。在使用双色CISH探针的情况下，第一信号放大探针包含：酪胺-生物素、抗生蛋白链菌素-HRP和DAB，而第二信号放大探针包含：抗-DNP-AP和固红。
定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员一般所理解的相同的含义。以下定义补充了本发明中的那些定义并且涉及当前的发明申请，并且不转嫁给任何相关或非相关的情况，例如，任何共同拥有的专利或专利申请。尽管可以在用于本发明测试的实践中使用与本文所述那些相似或等同的任何方法和材料，但是在本文中描述了优选的材料和方法。因此，本文所使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，而不是意欲限制。
术语“核酸”(和等同术语“多核苷酸”)涵盖了可以对应于一列核苷酸的单体单元的任何物理列，其包括核苷酸的聚合物(例如，典型的DNA或RNA聚合物)、肽核酸(PNA)、修饰的寡核苷酸(例如，包含对生物RNA或DNA是非典型的核苷酸的寡核苷酸，如2'-O-甲基化寡核苷酸)等。多核苷酸的核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸类似物，可以是天然的或非天然的，并且可以是未取代的、未修饰的、取代的或修饰的。所述核苷酸可以通过磷酸二酯键或通过硫代磷酯键、膦酸甲酯键、硼烷磷酸酯键等连接。所述多核苷酸另外可以包含非核苷酸成份，如标记物、猝灭剂、保护基团等。所述多核苷酸可以是(例如)单链的或双链的。
“核酸靶标”或“目标核酸”是指要检测的核酸，或任选地它的区域。
根据上下文，“多核苷酸序列”或“核苷酸序列”是核苷酸的聚合物(寡核苷酸、DNA、核酸等)或表示核苷酸聚合物的字符序列。根据任何所指明的多核苷酸序列，可以确定给定的核酸或互补多核苷酸序列(例如，互补核酸)。
广义地使用术语“基因”以表示与生物学功能有关的任何核酸。基因通常包括编码序列和/或表达这些编码序列所需的调控序列。术语基因可以适用于具体的基因组序列和该基因组序列所编码的cDNA或mRNA。
在本文中广义地使用了术语“抗体”并且它包括完整组装的抗体、保留了特异性结合抗原(例如，Fab、F(ab')2、Fv和其他片段)的能力的抗体片段、单链抗体、双体抗体、抗体嵌合体、杂交抗体、双重特异性抗体、人源化抗体等。术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体两者。
如本文所使用的术语“生物样品”或“组织样品”是指获自生物受试者的样品，其包括体内或原位获得、触及或收集的生物组织或液体来源的样品。生物样品还包括来自具有癌前或癌细胞或组织的生物受试者的区域的样品。这些样品可以是，但不限于，分离自哺乳动物的器官、组织、部份和细胞。示例性生物样品包括，但不限于，细胞溶胞产物、细胞培养物、细胞系、组织、器官、细胞器、生物液体等。优选的生物样品包括，但不限于，皮肤样品、组织活检样品等。
术语“标记探针”是指直接或间接与目标分子结合并且使得所述目标能够通过(例如)读数仪器检测的实体。标记探针(或“LP”)通常是包含一个或多个直接或间接提供可检测信号的标记物的单链多核苷酸。所述标记物可以共价连接到所述多核苷酸，或可以配置所述多核苷酸以结合所述标记物(例如，生物素化的多核苷酸可以结合抗生蛋白链菌素相关标记物)。所述标记探针可以(例如)直接杂交至目标核酸，或者它可以杂交至核酸，所述核酸反过来杂交至所述目标核酸或杂交至已杂交至所述核酸的一个或多个其它核酸。因此，所述标记探针可以包含与所述目标核酸的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列，或它可以包含与捕获探针、扩增子等中的多核苷酸序列互补的至少一种多核苷酸序列。
“标记物”是有利于分子检测的部分。在本发明的背景中，常规的标记物包括荧光、发光、光散射和/或比色标记物。适合的标记物包括酶和荧光部分以及放射性核素、底物、辅因子、抑制剂、化学发光部分、磁性颗粒等。示例性标记物包括：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、荧光团、二硝基苯基(DNP)等。教导这些标记物的使用的专利包括美国专利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。多种标记物是可商购的并且可以在本发明的背景中使用。
“捕获探针”是能够杂交至目标核酸并且将标记探针捕获至该目标核酸的多核苷酸。所述目标探针可以直接杂交至所述标记探针，或它可以杂交至一种或多种核酸，所述核酸反过来杂交至所述标记探针；例如，目标探针可以杂交至扩增子或预扩增子。因此，所述目标探针包含与所述目标核酸的多核苷酸序列互补的第一多核苷酸序列和与所述标记探针、扩增子、预扩增子等的多核苷酸序列互补的第二多核苷酸序列。优选地，所述目标探针是单链的。
“扩增子(amplifier)”是能够杂交至多个标记探针的分子，通常是多核苷酸。通常，所述扩增子杂交至多个相同的标记探针。所述扩增子还杂交至至少一个目标探针或杂交至与目标探针结合的核酸。例如，所述扩增子可以杂交至至少一个目标探针和多个标记探针，或结合至预扩增子和多个标记探针。所述扩增子可以是(例如)线性、分叉、梳状或分枝核酸。如对所有多核苷酸所提及的，所述扩增子可以包括修饰的核苷酸和/或非标准的核苷酸间键以及标准脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或磷酸二酯键。在(例如)USPN 5,635,352、USPN 5,124,246、USPN 5,710,264和USPN5,849,481中描述了适合的扩增子。
“预扩增子(preamplifier)”是起到一个或多个目标探针和扩增子之间的中间体作用的分子，通常是多核苷酸。通常，预扩增子同时杂交至一个或多个目标探针和多个扩增子。在(例如)USPN 5,635,352和USPN5,681,697中描述了示例性预扩增子。
“ISH”或“原位杂交”是指使用标记的互补DNA或RNA链(即探针)来(原位)定位组织的部分或切片中的特异性DNA或RNA序列的一类杂交。探针的类型为双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、单链互补RNA(sscRNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)和合成寡核苷酸。
“FISH”或“荧光原位杂交”是指使用荧光标记物的一类ISH。
“CISH”或“显色原位杂交”是指使用显色标记物的一类ISH。
“通用ISH信号放大”测定或系统是指可以通过所述方法放大所靶向的特定DNA或RNA序列的任何ISH基原位杂交测定或系统。它包括，但不限于，在本发明中公开的三种示例性常规ISH信号放大系统(即，生物素基ISH、抗体基ISH和TSA基ISH)。
附图说明
图1示出了测定的原理。目标核酸(如mRNA)与捕获探针组杂交。每组捕获探针包含两个或更多个捕获探针。所述捕获探针组与预扩增子杂交。每个预扩增子进一步与多个扩增子杂交。通过将扩增子与多个标记探针杂交进一步放大信号每个标记探针结合至一个或多个标记物，如荧光团或酶。使用标准明视野或落射荧光显微镜检测信号。
图2示出了+生物素/(抗生蛋白链菌素)抗生物素蛋白放大的原理。中的标记探针与生物素分子结合并进一步与抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素结合。每个抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素具有结合最多4个生物素分子的能力，所述生物素分子结合至酶或荧光标记物，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)或荧光团，从而导致每个标记探针的信号增加4倍。
图3示出了+抗体放大的原理。中的标记探针结合至HRP、AP、DNO或荧光团分子并被抗HRP、AP、DNP或荧光团分子的抗体(在A动物种中产生，如山羊)所识别。然后，可以通过抗A种第一抗体的HRP、聚合物-HRP、AP或聚合物-AP结合的第二抗体识别第一抗体，从而导致RNAscope信号的进一步信号放大。
图4示出了+TSA放大的原理。中的标记探针结合至HRP。HRP结合的标记探针促使酪胺-生物素或酪胺-荧光团的多个拷贝共价结合至邻近LP-HRP结合位点的蛋白质的富电子部分。随后，通过抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP或抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-AP以及对HRP或AP显色的底物(如DAB和固红)检测酪胺-生物素或酪胺-荧光团。由于酪胺-生物素的多个拷贝可以沉积在每个LP-HRP结合位点的周围，因此显著提高了作为RNAscope放大和TSA放大之和的最终信号的强度。
图5示出了使用RNAscope和RNAscope+TSA程序的人乳腺癌FFPE切片中低拷贝基因HPRT1的mRNA的检测。通过RNAscope+TSA所获得的信号(右侧)显著强于仅通过RNAscope所获得的信号(左侧)。
具体实施方式
本发明提供了以改善的灵敏度和特异性用于检测样品中目标核酸的存在性的方法和系统。本发明将方法与常规ISH信号放大方法(如基于TSA的信号放大方法、基于抗体的信号放大方法或基于生物素-抗生物素蛋白的信号放大方法)相结合。方法以其检测目标核酸的高特异性而著名。换言之，在测定中可以以高信噪比检测目标核酸。如将在以下第2部分中解释的，这种高特异性来源于“双Z”探针设计和预扩增子-扩增子-标记探针信号级联设计。常规ISH信号放大方法以其促进核酸分子的信号放大的能力而著名。然而，ISH信号放大方法还以其在放大测定中的高信噪比和缺乏一致性而著名。
本发明将方法与常规ISH信号放大方法相结合并进一步调节中扩增子和预扩增子的放大率(amplification ratio)。除了益处之外，本发明的方法和系统克服了以上所提及的常规ISH信号放大方法的缺点，同时保持了中背景噪声降低的独特机制。因此，本发明能够以高灵敏度和特异性可靠地检测核酸靶标。这种加强将核酸检测结果中的一致性提高到可以在诊断测定中实施的水平。
1.通过和常规ISH信号放大方法的组合的目标核酸的检测
本发明描述了用于检测样品中目标核酸的新型、简单并且超灵敏的原位杂交方法。该方法可以在荧光ISH(FISH)和显色ISH(CISH)测定中使用。该方法能够检测完整细胞、组织切片、组织微阵列和cDNA微阵列中固定化的核酸(DNA和RNA)。
1.1常规ISH信号放大方法
已发展了多种ISH信号放大方法来检测DNA或RNA目标。以下将描述三种示例性ISH信号放大方法：(1)基于生物素-(抗生蛋白链菌素)抗生物素蛋白的ISH信号放大；(2)基于抗体的ISH信号放大，和(3)基于酪胺信号放大(TSA)的ISH信号放大。技术人员清楚可以在本发明中结合使用任何ISH信号放大方法。因此，这些实例不应认为是对本发明的限制。
(1)RNAscope+生物素-(抗生蛋白链菌素)抗生物素蛋白系统(图2)。
在一种实施方式中，基于生物素-(抗生蛋白链菌素)抗生物素蛋白的ISH信号放大方法与结合使用。在一个方面，RNAscope包含一组两个或更多个捕获探针、多个标记探针、多个扩增子和多个预扩增子。目标核酸杂交至所述捕获探针组。然后，所述捕获探针组杂交至预扩增子。所述预扩增子进一步杂交至多个扩增子。然后，每个扩增子杂交至多个标记探针。然后，RNAscope复合结构的标记探针(LP)结合至ISH信号放大结构的生物素分子并形成LP-生物素复合物。LP-生物素复合物进一步与抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素分子结合。抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素分子具有结合最多4个生物素分子的能力，其中每个生物素分子进一步结合至HRP或AP。可以通过显色染料(如二氨基联苯胺、DAB或固红)可见检测HRP或AP。因此，将基于生物素-(抗生蛋白链菌素)抗生物素蛋白的ISH信号放大方法与结合使得每个标记探针的信号提高4倍。(2)RNAscope+抗体系统(图3)。
在另一种实施方式中，基于抗体的ISH信号放大方法与结合使用。在一个方面，RNAscope包含一组两个或更多个捕获探针、多个标记探针、多个扩增子和多个预扩增子。目标核酸杂交至所述捕获探针组。两个或更多个捕获探针杂交至核酸靶标。每个预扩增子杂交至所述两个或更多个捕获探针中的每一个，多个扩增子杂交至所述预扩增子中的每一个，并且多个标记探针杂交至所述扩增子。RNAscope复合结构的每个标记探针结合至HRP分子、AP分子、DNP分子或荧光团分子，并因此分别形成了HRP-LP复合物、AP-LP复合物、DNP-LP复合物或荧光团-LP复合物。分别通过抗HRP抗体、抗AP-LP抗体、抗DNP-LP抗体或抗荧光团-LP抗体识别HRP-LP、AP-LP、DNP-LP或荧光团-LP复合物。通过动物种A(如山羊)产生上述抗体。然后，通过抗种A的第二抗体识别该第一抗体。所述第二抗体与HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或荧光团结合并能够结合一个或多个第一抗体。可以通过显色染料(如二氨基联苯胺(DAB)或固红)可见地检测HRP或AP。本发明的结果为除RNAscope信号放大以外的进一步信号放大。
(3)RNAscope+TSA系统(图4)。
在另一种实施方式中，基于TSA的ISH信号放大方法与结合使用。在一个方面，RNAscope包含一组两个或更多个捕获探针、多个标记探针、多个扩增子和多个预扩增子。目标核酸杂交至所述捕获探针组。然后，所述捕获探针组杂交至预扩增子。所述预扩增子进一步杂交至多个扩增子。然后，每个扩增子杂交至多个标记探针。复合结构的每个标记探针结合至HRP分子，从而形成HRP-LP复合物。然后，HRP-LP复合物结合至多个酪胺-生物素或荧光团-生物素分子。在该步骤中，HRP-LP复合物促使酪胺-生物素或荧光团-生物素的多个拷贝共价结合至邻近LP-HRP结合位点的蛋白质的富电子部分。随后，通过检测标记物检测酪胺-生物素或荧光团-生物素。所述检测标记物是抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP和显色底物的组合或抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-AP和显色底物的组合。通过显色底物(如DAB或固红)可见地检测抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP或抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-AP复合物上的HRP或AP。由于酪胺-生物素或荧光团-生物素的多个拷贝可以沉积在每个LP-HRP结合位点的周围，因此显著提高了作为RNAscope放大和TSA放大之和的最终信号的强度。
在基于TSA的ISH信号放大方法的其他实施方式中，酪胺还可以结合至其他半抗原，如地高辛(DIG)、三硝基苯基(TNP)、二硝基苯基(DNP)和荧光染料。当在酪胺结合中使用荧光染料分子时，可以直接在RNAscope-TSA系统中将酪胺-染料结合物用于简单并且有效的荧光(FISH)检测。
1.2改善中的扩增子/预扩增子之比
还可以微调本发明所公开的与常规ISH信号放大方法的组合以提高信号放大的灵敏度和特异性。在这种+常规ISH信号放大方法中，的主要贡献是测定特异性。还以高特异性提供了核酸靶标的适度信号放大。常规ISH信号放大方法的贡献之一是它们的信号增强能力(signal boosting power)。因此，除了所提供的适度信号放大能力之外，常规ISH信号放大方法还将目标核酸信号放大到高得多的水平。
一个潜在的问题是常规ISH信号放大方法不但放大真阳性信号，而且还放大假阳性信号。因此，与常规ISH信号放大方法的简单组合面临信号检测中背景噪声升高的问题。本发明公开了一种聪明的方法以降低假阳性信号的水平。
本发明所公开的与常规ISH信号放大方法的组合的一个平衡因素是中所使用的预扩增子的大小。如果设计结合多个扩增子，则的预扩增子可以是非常大的分子。例如，预扩增子可以具有杂交至多于20个扩增子的能力。这种大分子在原位杂交期间在细胞基质中倾向于非特异性结合。当预扩增子中的一个与样品非特异性结合时，它将多个相同扩增子和标记探针吸引至其上，如与目标核酸结合时一样。在单独使用的情况下，与少量非特异性结合预扩增子结合的标记探针的数目不会产生任何可观察到的信号。然而，如果通过来自连续的常规ISH信号放大的额外信号放大进一步提高这些标记探针的信号，则假阳性信号将足够高以从而被检测到。
降低这种假阳性信号的一种方法是降低预扩增子的大小，从而，首先它不太可能被截留在细胞基质中；第二，即使当它在样品中非特异性结合时，也仅有少量扩增子分子将会与之杂交。因此，即使通过常规ISH信号放大增强信号时，通过非特异性结合所产生的信号将可能过低而不能被检测到。在该方法的一种实施方式中，一个预扩增子设计与1至16个扩增子结合。在更优选的实施方式中，一个预扩增子设计与2至10个扩增子结合。在另一种优选的实施方式中，一个预扩增子设计与2至5个扩增子结合。
通过平衡测定中和TSA的放大能力和特异性，对于常规临床组织样品中的原位RNA检测已实现了最佳的信噪比(参见实施例1和图5)。
2.通过的目标核酸的检测
最近，Advanced Cell Diagnostics,Inc.开发出一种被称为的强大的原位杂交方法(美国专利No.7,709,198，该专利以其全部内容作为参考并入本文)。由于是在本发明中所公开的方法的一部分，因此以下将描述的工作原理以更好地理解本发明。
允许RNA直接原位显像。该方法使用了如下所述的寡核苷酸探针组和新型信号放大系统。该测定可以用于多种样品类型，包括培养的细胞、周围血液单核细胞(PBMC)、冷冻的组织和福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织。另外，该测定可以使用显色和荧光检测试剂。
测定技术提供了单细胞中的多重核酸测定(参见图1)。该技术的核心在于“双Z”探针设计，该设计允许特异性杂交信号的强力放大，同时不会放大非特异性事件。每个捕获探针(“Z”)具有与目标mRNA、间隔区和“尾”序列结合的目标特异性序列。两个捕获探针(双Z)连续杂交至目标mRNA，并且两个“尾”序列形成了预扩增子的28碱基杂交位点。双Z探针设计确保信号放大的高保真度，这是因为：1)一对目标探针彼此相邻地非特异性杂交以形成预扩增子的结合位点是非常不可能的；和2)在测定条件下，任一个尾单独可以有效地结合至预扩增子。预扩增子、扩增子和标记探针顺序杂交至每个捕获探针对，从而导致每1kb目标RNA多达8,000个标记分子的累积。标记探针可以结合至荧光团或显色酶(例如，HRP或AP)，从而使得能够分别在标准明视野或反射荧光显微镜(epifluorescentmicroscope)下观察杂交信号。使用荧光标记探针，信号可以含有比常规RNA荧光ISH法多至少100倍的荧光分子，并且在标准荧光显微镜下是容易地可见的。
另外，已构建了多重信号扩增子，其每一个识别目标探针上独特的尾序列，从而使得多个目标RNA同时显像。重要的是，该测定适合用于适合的FFPE组织中存在的部分降解的RNA，这是因为双Z探针对靶向长度为约50个核苷酸的短区域。
在一个实例中，用于检测目标核酸。在该方法中，提供了包含一个或多个细胞的样品。所测试的细胞包含或者怀疑包含目标核酸。在该测定中提供了：包含两个或更多个捕获探针的一组捕获探针，包含标记物的标记探针，以及可选地预扩增子和扩增子。
在该方法中，所述捕获探针组在细胞中杂交至目标核酸。所述标记探针被捕获至所述捕获探针组，借此将所述标记探针捕获至所述目标核酸。然后，检测来自所述标记物的信号。由于所述标记物通过捕获探针与目标核酸相连，因此细胞中标记物的存在表明细胞中相应核酸靶标的存在。所述方法是任选地定量的。因此，可以测量信号的强度，并且可以将信号强度与细胞中目标核酸的量相关联。作为另一个实例，可以对目标核酸的每个拷贝的信号点进行计数以对它们进行定量分析。
在一个方面，所述标记探针直接结合至所述捕获探针。在另一个方面，所述标记探针被间接捕获至所述捕获探针，例如，通过预扩增子和/或扩增子的结合。扩增子和预扩增子的使用在提高信号强度方面可以是有利的，这是因为它们可以辅助多个标记探针结合至每个核酸靶标。
尽管可以在本发明的技术中使用直接捕获方法和间接捕获方法两者，但是优选间接捕获方法，这是因为它使得所述标记探针能够成为不依赖于目标的，并且其他公开内容将显示该方法可以提供更好的特异性和灵敏度。
在测定中，所述捕获探针是专门设计的。在每个捕获探针中，存在至少一个与目标分子上的部分互补的部分T，和与标记探针上的部分互补的另一个部分L。T和L部分通过部分C连接。在间接捕获实施方式中，将两个相邻的捕获探针引入到靶向所关心基因的探针组中。T1和T2设计与目标核酸上的两个独特并且相邻的部分互补。L1和L2可以是不同的或相同的，并且它们与标记探针上的两个相邻部分互补。它们的结合部分T、L或两者的设计使得标记探针和目标之间的连接是不稳定的，并且当捕获探针中仅有一个就位时，它们在杂交温度下倾向于分离。这种设计应能够使其具有超常的特异性，这是因为当两个单独的捕获探针均识别目标并且与相邻序列结合或与目标基因非常接近时，信号产生标记探针仅可以连接到所关心的目标基因。在一种实施方式中，两个捕获探针的T部分的解链温度Tm设计显著高于杂交温度，同时L部分的Tm低于杂交温度。因此，在杂交期间T部分强烈并且稳定地结合至目标分子，而当捕获探针中只有一个存在时，L部分微弱并且不稳定地结合至标记探针。然而，当两个捕获探针均存在时，L1和L2的组合在杂交期间强烈并且稳定地保持标记探针。例如，T部分的长度上可以是20-30个核苷酸，而L部分的长度上是13-15个核苷酸；C的长度上可以是0至10个核苷酸，例如，5个核苷酸。在另一种实施方式中，T部分的Tm低于杂交温度，而L部分的Tm显著高于杂交温度。以同样的方式，只有当两个捕获探针以协作方式均杂交至目标时，标记探针和目标之间的连接才可以在杂交期间保留。对于捕获探针设计的其他详细内容，参见美国专利No.7,709,198。
在以上种类的实施方式中，捕获探针优选地杂交至它们相应的核酸靶标中不重叠的多核苷酸序列。捕获探针可以(但不需要)覆盖核酸靶标的邻接区域。可选地提供了作为杂交至未被目标探针占据的核酸靶标区域的多核苷酸的阻断探针，并且所述阻断探针杂交至所述目标。对于给定核酸靶标，相应的捕获探针和阻断探针优选地与核酸靶标中物理上分离的，不重叠的序列互补，所述不重叠的序列优选(但不必需)是邻接的。在一些实施方式中，使捕获探针和任选的阻断探针彼此邻接可以提高杂交强度，除去二级结构，并确保更一致并且可重复的信号。
在细胞中核酸靶标的检测中，通常在捕获探针的杂交之前将细胞固定并透性化以将所述核酸靶标保留在细胞中并允许捕获探针、标记探针等进入细胞。可选地，清洗细胞以除去未捕获至所述核酸靶标之一上的物质。在任意多个步骤之后，例如，在捕获探针与核酸靶标杂交以除去未结合的捕获探针之后，在预扩增子、扩增子和/或标记探针与捕获探针杂交后和/或等等，可以清洗细胞。
在一些实施方式中，对于所述方法的所有或大部分步骤，细胞处于悬液中以便于处理。然而，所述方法还适用于固体组织样品(例如，组织切片)中的细胞和/或固定在基底(例如，载玻片或其他表面)上的细胞。因此，在一种类型的实施方式中，细胞在包含所述细胞的样品中处于悬液中和/或所述细胞在杂交、捕获和/或检测步骤期间处于悬液中。例如，所述细胞在样品中和在杂交、捕获、可选的清洗和检测步骤期间可以处于悬液中。在其他实施方式中，所述细胞在包含所述细胞的样品中处于悬液中，并且所述细胞在杂交、捕获和/或检测步骤期间固定在基底上。例如，所述细胞可以在杂交、捕获和任选的清洗步骤期间处于悬液中，而在检测步骤期间固定在基底上。在其他实施方式中，所述样品包含组织切片。
3.核酸的多重检测
本发明的一个方面提供了多重核酸测定。因此，一种常规类型的实施方式包括检测两个或更多个目标核酸的方法。在以上部分中，已描述了使用检测单个目标核酸的方法。在本部分中，首先将描述使用和常规ISH信号放大方法的组合检测单个目标核酸的方法。接着将描述使用和常规ISH信号放大方法的组合检测两个或更多个目标核酸的方法。除了使用不同的目标特异性标记物和探针之外，可以通过与检测单个目标核酸相同的方式进行两个或更多个目标核酸的检测。
在本发明的一种实施方式中，提供了检测单个目标核酸的方法。在该方法中，提供了包含或怀疑包含所述目标核酸的样品。还提供了：一组两个或更多个捕获探针，其中所述捕获探针能够结合至目标核酸、信号产生多聚体和信号放大探针。
所述信号产生多聚体包含至少标记探针。在一种优选的实施方式中，所述信号产生多聚体包含标记探针和扩增子。所述扩增子能够杂交至所述标记探针，并且还能够杂交至所述一组两个或更多个捕获探针。在另一种优选的实施方式中，所述信号产生多聚体包含标记探针、能够杂交至所述标记物的扩增子和能够杂交至所述扩增子并且还能够杂交至所述一组两个或更多个捕获探针的预扩增子。
所述信号放大探针由在常规ISH信号放大测定中使用的组分组成。例如，在其中与基于生物素-抗生蛋白链菌素(抗生物素蛋白)的ISH测定结合的实施方式中，所述信号放大探针包含：能够结合至的标记探针的生物素分子，能够结合至所述生物素分子的抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素分子，和结合至HRP、AP或荧光团并且能够结合至所述抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素分子的另外的生物素分子。
在其中与基于抗体的ISH测定结合的实施方式中，所述信号放大探针包含：能够结合至所述标记探针的HRP、DNP、荧光团或AP分子，能够结合至所述HRP、DNP、荧光团或AP分子的一个或多个第一抗体，和与HRP、聚合物-HRP、AP或聚合物-AP结合并且能够结合至一个或多个所述第一抗体的一个或多个第二抗体。
在其中与基于TSA的ISH测定结合的实施方式中，所述信号放大探针包含：能够结合至所述标记探针的HRP分子、能够与所述HRP分子反应的多个酪胺-生物素或酪胺-荧光团分子、和能够结合至所述酪胺-生物素或酪胺-荧光团分子并因此可见地显示所述目标核酸的检测标记物。所述检测标记物是抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP和显色底物的组合或抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP和显色底物的组合。
在检测目标核酸的方法中，首先提供了包含或怀疑包含所述目标核酸的样品。然后，所述目标核酸杂交至所述一组两个或更多个捕获探针。然后，加入所述信号产生多聚体，并且所述信号产生多聚体杂交至所述一组两个或更多个捕获探针，借此将其捕获至所述目标核酸。然后，将所述信号放大探针的组分顺序加入到测定溶液中，并结合至所述信号产生多聚体，借此将其捕获至所述目标核酸。然后，通过流式细胞仪或其它显像装置来检测所述信号放大探针中的标记物。所述标记物的存在、不存在或量使得能够灵敏地检测和定位样品中的目标核酸。
在检测两个目标核酸的方法中，提供了包含或怀疑包含两个目标核酸的样品。还提供了两组或更多组捕获探针，每组捕获探针包含两个或更多个捕获探针。第一组捕获探针能够杂交至第一目标核酸但不能杂交至第二目标核酸，而第二组捕获探针能够杂交至第二目标核酸但不能杂交至第一目标核酸。另外提供了第一信号产生多聚体和第一信号放大探针，以及第二信号产生多聚体和第二信号放大探针。
第一信号产生多聚体可以杂交至第一组捕获探针，但不能杂交至第二组捕获探针。第二信号产生多聚体可以杂交至第二组捕获探针，但不能杂交至第一组捕获探针。第一信号产生多聚体具有第一标记探针，其直接或通过预扩增子和扩增子间接杂交至第一组捕获探针。第二信号产生多聚体具有第二标记探针，其直接或通过预扩增子和扩增子间接杂交至第二组捕获探针。所述第一标记探针不同于所述第二标记探针。
用不同的信号放大探针顺序标记第一信号产生多聚体和第二信号产生多聚体。所述两种信号放大探针可以是双色CISH或双色FISH。
在双重核酸检测中将进行至少三个步骤。在第一步中，用第一信号放大探针标记第一信号产生多聚体。在示例性实施方式中，第一信号放大探针是通过结合的LP-HRP复合物与放大的标记探针连接的TSA基ISH信号放大。在实施了法后，的标记探针首先与HRP结合。然后，通过酪胺-生物素、抗生蛋白链菌素-HRP和显色底物DAB的顺序培育来检测结合的LP-HRP复合物，从而导致对第一目标核酸产生棕色信号。在第二步中，阻断用于第一信号产生多聚体的残留标记试剂以防止标记物与将要在第三步中加入的第二信号产生多聚体反应。在第三步中，用第二信号放大探针标记第二信号产生多聚体。在示例性实施方式中，在实施了法后，的标记探针首先与二硝基苯基(DNP)结合。然后，通过抗DNP-AP和显色底物固红的顺序培育来检测结合的LP-DNP复合物，从而导致对第一目标核酸产生红色信号。
上述方法对于多重核酸检测也是有用的，包括三种以上的核酸靶标的顺序检测。因此，可以通过如上所述的类似方法分析可选地包含或怀疑包含第三种、第四种、第五种、第六种、第七种或甚至更多种核酸靶标的细胞。
4.试剂盒
另一种常规类型的实施方式提供了用于检测一种或多种目标核酸的试剂盒。在一个方面，所述试剂盒包含目标核酸、组分和常规ISH信号放大组分。在一种实施方式中，所述试剂盒包含目标核酸、能够杂交至所述目标核酸的捕获探针组、能够杂交至捕获探针组的信号产生多聚体和能够结合至所述标记探针的信号放大探针。所述信号产生多聚体包含标记探针和含有标记物的信号放大探针。在某些实施方式中，所述试剂盒中的信号产生多聚体可以包含适合的扩增子、预扩增子。所述试剂盒还可以包含固体载体。所述试剂盒的ISH信号放大组分可以是任何ISH信号放大系统。例如，它可以是本发明部分1.1中所述的三种ISH信号放大系统。所述试剂盒可以用于本发明申请之前所述的任何核酸的检测，其包括，但不限于，DNA、cDNA、RNA和mRNA。
在试剂盒的多重实施方式中，可以用两种或更多种不同的亚组来表示多种组分。例如，所述标记探针可以包含两种亚组，其分别杂交至第一和第二目标核酸。所述信号产生多聚体可以包含两种不同的标记探针，其每一个直接或间接杂交至第一和第二捕获探针。所述试剂盒还可以包含两种不同的信号放大探针，其每一个结合至第一和第二标记探针。通过与不同颜色的底物结合，不同信号放大探针彼此之间是可区分的。在另一个方面，所述试剂盒包含能够阻断残留的用于第一信号产生多聚体的标记试剂的封闭剂，并因此确保第二信号产生多聚体与第二目标核酸的特异性结合。
实施例
提供了下列实施例以说明(但不限制)所主张的发明。
下列实施例显示了通过优化的预扩增子/扩增子比值进一步提高的和常规ISH信号放大方法的组合如何实现对原位RNA检测的特异性和灵敏度的显著改善。
实施例1.+常规ISH信号放大测定
可以在一天之内完成基本测定程序，并且该程序通常包括以下步骤。提供了含有怀疑包含目标核酸HPRT1的多个细胞的样品。在固定并透性化后，将固定在固体载体上或处于悬液中的细胞杂交至下列一系列寡核苷酸探针。首先，将捕获探针组杂交至细胞内部的目标RNA。随后，将预扩增子分子杂交至捕获探针，从而提供用于扩增子分子杂交的桥。将多个扩增子分子进一步杂交至预扩增子，例如，多至20个扩增子杂交至每个预扩增子。然后，将多个标记探针杂交至扩增子，例如，多至20个标记探针杂交至每个扩增子。
通过TSA基ISH信号放大进一步增强信号强度。将HRP结合至每个标记探针然后，将含有酪胺-生物素分子的试剂加入到测定溶液中。HRP-结合的标记探针促使酪胺-生物素的多个拷贝共价结合至邻近HRP-标记探针结合位点的蛋白质的富电子部分。然后，通过抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP检测酪胺-生物素分子，其中抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP可以通过显示出棕色的标记物底物DAB显像。通过(例如)具有适合滤光器的常规荧光显微镜或通过多色流式细胞仪检测信号。比较了通过单独的或+TSA基ISH信号放大的人乳腺癌FFPE切片中低拷贝基因HPRT1基因的mRNA的检测。如图5所示，得自+TSA基ISH信号放大方法的信号比得自单独的的信号显著更强。
通过使用双“Z”探针设计来设计靶向特异性mRNA序列的探针组以防止或最大程度降低非特异性结合。双“Z”捕获探针的设计是基于HPRT1序列的并且对GenBank数据库进行预筛选以确保最大程度减少与非预期核酸序列的交叉杂交。在双“Z”设计中，两个相邻的探针分别含有目标杂交序列，例如，Tm显著高于测定温度，长度为20至30个碱基的序列，和预扩增子杂交序列，例如，Tm明显低于测定温度，长度仅为14个碱基的序列。因此，在杂交期间，单个捕获探针能够强烈并且稳定地结合至目标RNA，但由于14个碱基对同源性区具有明显低于测定温度的Tm而将与预扩增子微弱并且不稳定地结合。然而，当两个捕获探针在相邻位置存在时，例如，28个互补碱基对的合并的杂交强度在测定温度下强烈并且稳定地保持住预扩增子，从而使信号放大发生。这种双“Z”设计确保了高检测特异性，并且简化了多个目标同时检测的探针设计。
由于TSA基ISH信号放大方法的信号提高能力，可以放大原位杂交期间细胞基质中预扩增子的非特异性结合，并因此产生了假阳性信号。当预扩增子设计结合多个扩增子并因此尺寸较大时，该问题将是严重的。放大能力的提高是以结合特异性的损失为代价的。我们通过适当减少预扩增子设计结合的扩增子的个数解决了该问题。最终结果是提高了信噪比。通过ISH信号放大方法，具体地，TSA基ISH信号放大方法的信号放大能力来补偿放大能力的损失。
在本测定中，已设计并测试了几种扩增子。预扩增子PREAMP1设计结合20个扩增子。预扩增子PREAMP2设计结合16个扩增子。预扩增子PREAMP3设计结合10个扩增子。预扩增子PREAMP4设计结合5个扩增子。
实验结果显示，相对于PREAMP1，PREAMP2具有改善的信噪比。在所有测试的PREAMP中，PREAMP3和PREAMP4具有最好的信噪比(数据未示出)。
实施例2.多重+常规ISH信号放大测定
以下多重放大的预示性实施例示出了本发明所公开的方法如何可以以高灵敏度检测两种目标核酸。为了研究所公开的发明用于低拷贝RNA转录本的原位检测的可能性及其用于多重检测的能力，将18S和Her-2用作模式基因。
在第一放大中，将18S基因捕获到设计用于18S的捕获探针上。用于18S的捕获探针的设计如实施例1中所述。然后，将捕获探针杂交的18S基因顺序杂交至预扩增子、扩增子和标记探针。然后，将标记探针结合至HRP。然后，通过酪胺-生物素、抗生蛋白链菌素-HRP和DAB的顺序培育来检测结合的LP-HRP复合物。杂交产物在检测目标基因18S的位置处产生棕色。
在开始第二放大之前，阻断来自第一放大的残留的HRP。在第二放大中，将Her-2基因捕获在设计用于Her-2的捕获探针上。用于Her-2的捕获探针的设计如实施例1中所述。然后，将捕获探针杂交的Her-2基因顺序杂交至预扩增子、扩增子和标记探针。然后，将标记探针结合至二硝基苯基(DNP)。然后，通过抗DNP-AP的培育检测结合的LP-DNP。然后，通过染料试剂固红检测抗DNP-AP复合物上的碱性磷酸酶(AP)分子。杂交产物对目标基因Her-2产生红色信号。
在本实施例中，我们已证明本发明所公开的方法可以用于检测两种RNA转录本。相对信号强度可以用于比较两种基因的基因表达水平。

Claims (60)

1.检测至少一种目标核酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含或怀疑包含所述目标核酸的样品；
(b)提供能够杂交至所述目标核酸的至少一组两个或更多个捕获探针；
(c)提供：
(i)能够杂交至标记探针的扩增子；
(ii)能够杂交至所述扩增子并且能够杂交至所述两个或更多个捕获探针的组的预扩增子，其中所述预扩增子:扩增子之比为1:1-16之间、1:2-10之间或1:2-5之间；
(iii)标记探针，其中所述标记探针结合至辣根过氧化物酶(HRP)分子；以及
(iv)多个酪胺-荧光团分子，或酪胺-生物素或酪胺-半抗原分子以及能够检测所述酪胺-生物素或酪胺-半抗原分子的检测标记物，其中所述酪胺能够与所述HRP分子反应；
(d)将所述两个或更多个捕获探针的组杂交至所述目标核酸；
(e)将所述预扩增子、扩增子和标记探针捕获至所述两个或更多个捕获探针的组，从而将所述标记探针捕获至所述目标核酸；以及
(f)检测所述荧光团的存在、不存在或量或者与所述被捕获的标记探针有关的检测标记物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP和显色底物或者抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶(AP)和显色底物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述显色底物选自：二氨基联苯胺(DAB)和固红。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标核酸选自：DNA、cDNA、RNA、mRNA、rRNA、miRNA和siRNA。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，进一步包括将所述目标核酸捕获到固体载体上的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品包含细胞，所述细胞包含或怀疑包含所述目标核酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品包含细胞，所述细胞包含或怀疑包含两种或更多种不同的目标核酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品包含两种或更多种不同的细胞，所述细胞中的每一种包含或怀疑包含不同的目标核酸。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，利用双色显色原位杂交(CISH)或双色荧光原位杂交(FISH)来检测两种不同的目标核酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，利用酪胺-生物素、抗生蛋白链菌素-HRP和DAB来实施所述双色CISH以检测所述第一目标核酸，以及利用结合至碱性磷酸酶(AP)和固红的抗-DNP抗体以检测所述第二目标核酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述半抗原选自二硝基苯基(DNP)、地高辛、三硝基苯基(TNP)或荧光团。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，提供多个酪胺-荧光团分子。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，提供多个酪胺-生物素分子和能够检测所述酪胺-生物素分子的检测标记物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素结合至HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或荧光团。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述检测标记物包含显色底物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述显色底物选自DAB和固红。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP和DAB。
20.根据权利要求16所述的方法，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-AP。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-AP和固红。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，提供多个酪胺-半抗原分子和能够检测所述酪胺-半抗原分子的检测标记物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述检测标记物包含抗-半抗原抗体。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述检测标记物进一步包含第二抗体，其中所述第二抗体能够结合于所述抗-半抗原抗体并且其中所述第二抗体结合至HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或荧光团。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述第二抗体结合至荧光团。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，所述检测标记物包含显色底物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述显色底物选自DAB和固红。
28.根据权利要求26所述的方法，其中，所述第二抗体结合至HRP。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述显色底物为DAB。
30.根据权利要求26所述的方法，其中，所述第二抗体结合至AP。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述显色底物为固红。
32.一种试剂盒，包含：
(a)能够杂交至目标核酸的至少一组两个或更多个捕获探针；
(b)能够杂交至标记探针的扩增子；
(c)能够杂交至所述扩增子并且能够杂交至所述两个或更多个捕获探针的组的预扩增子，其中所述预扩增子:扩增子之比为1:1-16之间、1:2-10之间或1:2-5之间；
(d)标记探针，其中所述标记探针结合至HRP分子；以及
(e)多个酪胺-荧光团分子，或酪胺-生物素或酪胺-半抗原分子以及能够检测所述酪胺-生物素或酪胺-半抗原分子的检测标记物，其中所述酪胺能够与所述HRP分子反应。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP和显色底物或者抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-AP和显色底物。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中，所述显色底物选自：DAB和固红。
35.根据权利要求32所述的试剂盒，其中，所述目标核酸选自：DNA、cDNA、RNA、mRNA、rRNA、miRNA和siRNA。
36.根据权利要求32所述的试剂盒，其中，进一步包含所述目标核酸。
37.根据权利要求32所述的试剂盒，其中，包含两组两个或更多个捕获探针，每组捕获探针能够杂交至不同的目标核酸。
38.根据权利要求36或37所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含用于双色显色原位杂交(CISH)或双色荧光原位杂交(FISH)的试剂以用于检测两种不同的目标核酸。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中，所述双色CISH试剂包含酪胺-生物素、抗生蛋白链菌素-HRP和DAB以用于检测所述第一目标核酸，以及结合至碱性磷酸酶和固红的抗-DNP抗体以用于检测所述第二目标核酸。
40.根据权利要求32所述的试剂盒，其中，所述半抗原选自二硝基苯基(DNP)、地高辛、三硝基苯基(TNP)或荧光团。
41.根据权利要求32所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含多个酪胺-荧光团分子。
42.根据权利要求32所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含多个酪胺-生物素分子和能够检测所述酪胺-生物素分子的检测标记物。
43.根据权利要求42所述的试剂盒，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素。
44.根据权利要求43所述的试剂盒，其中，所述抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素结合至HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或荧光团。
45.根据权利要求44所述的试剂盒，其中，所述检测标记物包含显色底物。
46.根据权利要求45所述的试剂盒，其中，所述显色底物选自DAB和固红。
47.根据权利要求45所述的试剂盒，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP。
48.根据权利要求47所述的试剂盒，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP和DAB。
49.根据权利要求45所述的试剂盒，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-AP。
50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-AP和固红。
51.根据权利要求32所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含多个酪胺-半抗原分子和能够检测所述酪胺-半抗原分子的检测标记物。
52.根据权利要求51所述的试剂盒，其中，所述检测标记物包含抗-半抗原抗体。
53.根据权利要求52所述的试剂盒，其中，所述检测标记物进一步包含第二抗体，其中所述第二抗体能够结合于所述抗-半抗原抗体并且其中所述第二抗体结合至HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或荧光团。
54.根据权利要求53所述的试剂盒，其中，所述第二抗体结合至荧光团。
55.根据权利要求53所述的试剂盒，其中，所述检测标记物包含显色底物。
56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中，所述显色底物选自DAB和固红。
57.根据权利要求55所述的试剂盒，其中，所述第二抗体结合至HRP。
58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中，所述显色底物为DAB。
59.根据权利要求55所述的试剂盒，其中，所述第二抗体结合至AP。
60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中，所述显色底物为固红。
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