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CN103517990A - 癌症生物标志物 - Google Patents

癌症生物标志物 Download PDF

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CN103517990A
CN103517990A CN201180058942.XA CN201180058942A CN103517990A CN 103517990 A CN103517990 A CN 103517990A CN 201180058942 A CN201180058942 A CN 201180058942A CN 103517990 A CN103517990 A CN 103517990A
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satellite
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D.T.廷
D.A.哈伯
S.马休斯瓦兰
D.利普森
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Standard Biotools Corp
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General Hospital Corp
Fluidigm Corp
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Abstract

基于检测存在卫星重复和/或Line-1表达水平升高诊断癌症的方法。

Description

癌症生物标志物
优先权要求
本申请要求2010年10月7日提交的美国临时专利申请流水号61/390,956和2011年6月6日提交的61/493,800的权益。前述专利的全部内容在此通过提及而收录。
发明领域
本发明涉及基于检测存在卫星重复和/或Line-1表达水平升高诊断癌症的方法。
发明背景
全基因组测序方法已经揭示了越来越多的一批转录非编码序列，包括通过与转录沉默和染色体完整性联系的基因组异染色质区实现的“弥漫转录(pervasive transcription)”(J.Berretta,A.Morillon,EMBO Rep10,973(2009年9月);A.Jacquier,Nat Rev Genet10,833(2009年12月))。在小鼠中，异染色质由形成有丝分裂纺锤体复合物和可靠的染色体分离需要的着丝粒(次要)和臂间(pericentric)(主要)卫星重复构成(M.Guenatri,D.Bailly,C.Maison,G.Almouzni,J Cell Biol166,493(2004年8月16日))，而人卫星重复已经分成具有相似功能的多个类别(J.Jurka等,Cytogenet Genome Res110,462(2005))。酵母中卫星的双向转录经由切酶介导的RNA诱导的转录沉默(RITS)及经由最近鉴定的切酶依赖性途径维持着丝粒DNA的沉默(M.Halic,D.Moazed,Cell140,504(2月19日))，尽管哺乳动物中着丝粒卫星沉默机制限定得不太好(A.A.Aravin,G.J.Hannon,J.Brennecke,Science318,761(2007年11月2日))。小鼠和人细胞系中卫星转录物的积累源自切酶1缺陷(C.Kanellopoulou等,Genes Dev19,489(2005年2月15日);T.Fukagawa等,Nat Cell Biol6,784(2004年8月))及源自DNA去甲基化、热休克、或凋亡的诱导(H.Bouzinba-Segard,A.Guais,C.Francastel,Proc Natl Acad Sci U S A103,8709(2006年6月6日);R.Valgardsdottir等,Nucleic Acids Res36,423(2008年2月))。还已经将培养细胞中应激诱导的卫星转录与编码RNA聚合酶活性的反转录元件诸如LINE-1(L1TD1)激活联系起来(D.Ugarkovic,EMBO Rep6,1035(2005年11月);D.M.Carone等,Chromosoma118,113(2009年2月))。尽管有这些体外模型，尚未分析原发性肿瘤中重复ncRNA的全局表达，这是由于微阵列平台偏爱注释的编码序列及从标准分析程序明确排除重复序列所致。
发明概述
本发明至少部分基于鉴定肿瘤细胞中卫星重复的大规模表达，以及例如肿瘤细胞，包括循环肿瘤细胞(CTC)中Line-1的表达升高。本文中描述了基于存在卫星重复和/或Line-1的表达水平升高来诊断癌症，例如上皮起源的实体恶性，诸如胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌的方法。
在第一个方面，本发明提供了检测受试者中癌症存在的方法，例如体外方法，包括测定来自所述受试者的样品中的LINE-1水平以获得测试数值；并比较所述测试数值与参照数值，其中与所述参照数值相比的测试数值指示所述受试者是否具有癌症。
在一些实施方案中，参照数值代表LINE-1的阈值水平，其中所述受试者中存在高于所述参照数值的LINE-1水平指示所述受试者具有癌症，且所述受试者中存在低于所述参照数值的LINE-1水平指示所述受试者不太可能具有癌症。
在第一个方面，本发明提供了检测受试者中癌症存在的方法，例如体外方法，包括测定来自所述受试者的样品中卫星转录物的水平以获得测试数值；并比较所述测试数值与参照数值，其中与所述参照数值相比的测试数值指示所述受试者是否具有癌症。
在一些实施方案中，所述卫星转录物包含下列一种或多种：ALR、HSATII、GSATII、TAR1、和SST1。在一些实施方案中，所述卫星转录物是ALR和/或HSATII，且高于所述参照水平的ALR和/或HSATII卫星转录物水平的存在指示所述受试者具有肿瘤。
在一些实施方案中，所述卫星转录物是GSATII、TAR1和/或SST1，且低于所述参照水平的GSATII、TAR1和/或SST1卫星转录物水平的存在指示所述受试者具有肿瘤。
在另一个方面，本发明提供了评估受试者中癌症的治疗效力的方法，例如体外方法。该方法包括测定来自所述受试者的第一样品中的LINE-1水平以获得第一数值；对所述受试者施用癌症治疗；测定在后来的时间时自所述受试者获得的随后样品中的LINE-1水平，以获得治疗数值；并比较所述第一数值与所述治疗数值。低于所述第一数值的治疗数值指示所述治疗是有效的。
在又一个实施方案中，本发明提供了评估受试者中癌症的治疗效力的方法，例如体外方法。该方法包括测定来自所述受试者的第一样品中的卫星转录物水平以获得第一数值；对所述受试者施用癌症治疗；测定在后来的时间时自所述受试者获得的随后样品中的卫星转录物水平，以获得治疗数值；并比较所述第一数值与所述治疗数值，其中低于所述第一数值的治疗数值指示所述治疗是有效的。
在一些实施方案中，所述卫星转录物包含下列一种或多种：ALR、HSATII、GSATII、TAR1、和SST1。
在一些实施方案中，第一和第二样品已知或怀疑包含肿瘤细胞，例如，已知或怀疑包含循环肿瘤细胞(CTC)的血液样品，或已知或怀疑包含肿瘤细胞的活组织检查样品。在一些实施方案中，所述样品包含血清中游离的RNA或血液中外来体内的RNA。
在一些实施方案中，所述治疗包括施用手术干预、化学疗法、放射疗法、或其组合。
在本文中所描述的方法的一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人或兽医受试者，例如实验动物。
在本文中所描述的方法的一些实施方案中，癌症是上皮起源的实体瘤，例如胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌。
在一些实施方案中，本文中所描述的方法包括测量LINE-1转录物水平。
在本文中所描述的方法的一些实施方案中，使用分支DNA测定法测定LINE-1转录物或卫星的水平。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。本文中描述了本发明中使用的方法和材料；也可以使用本领域中已知的其它合适的方法和材料。材料、方法和例子仅是例示性，而并不意图为限制性的。通过提及将本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目、和其它出版物完整收录。在冲突的情况中，应当以本说明书(包括定义)为准。
本发明的其它特征和优点通过以下详细描述和图，以及通过权利要求书会是显而易见的。
附图简述
图1A是一幅柱形图，其显示了不同肿瘤、细胞系、和组织中占所有基因组比对阅读的百分比的主要卫星水平。每种肿瘤类型和细胞系下面标示原发性肿瘤和细胞系的基因型。(Kras=KrasG12D；Tp53、SMAD4、和APC代表缺失的基因)。
图1B是所有原发性肿瘤、癌细胞系、和正常组织中来自主要卫星的序列阅读分布的示意图。
图2A显示了对三种KrasG12D、Tp53lox/+胰腺原发性肿瘤(肿瘤1-3)和源自肿瘤3的稳定细胞系(CL3)的Northern印迹分析的结果。
图2B显示了用DNA低甲基化剂(hypomethylating agent)5-阿扎胞苷(azacitadine,AZA)处理之前(0)和之后(+)对CL3的Northern印迹分析的结果。
图2C显示了对来自多份成年和胎儿小鼠组织的总RNA的Northern印迹分析的结果。所有Northern印迹暴露于约30分钟。
图2D是一对显微照片，其显示了与1kb主要卫星重复探针杂交的正常胰腺(左侧)和原发性胰管腺癌(右侧)的RNA原位杂交(ISH)的结果。
图2E是一组三幅显微照片，其显示了对新生物前(preneoplastic)PanIN(P)损伤、其相邻的PDAC(T)和正常胰腺(N)的ISH分析的结果，显示PanIN中的正染色，整个癌瘤中表达升高。PanIN(左侧)和PDAC(右侧)损伤的较高放大率(40x)。
图2F是一组三幅显微照片，其显示了对肝(其自身不表达卫星)转移性的PDAC细胞中卫星的明显表达(左侧)。通过标准组织学评估和卫星染色容易地鉴定大的腺性转移性肿瘤沉积物(中间)。卫星ISH灵敏得足以检出通过标准组织学分析不容易察觉的肝实质中的微转移(右侧；箭头)。所有图像为20x放大率(比例尺=100μm)。
图3A是一幅柱形图，其显示了通过DGE定量的人胰管腺癌(PDAC)、正常胰腺、其它癌症(L：肺，K：肾，O：卵巢，P：前列腺)、和其它正常人组织(1：胎儿脑，2：脑，3：结肠，4：胎儿肝，5：肝，6：肺，7：肾，8：胎盘，9：前列腺，及10：子宫)中的总卫星表达。卫星表达以与人基因组比对的每百万的转录物显示。
图3B是一幅柱形图，其显示了作为占测序的人PDAC(黑色，n=15)和正常人组织(白色，n=12)中总卫星的百分比的卫星重复类别的分类。卫星从肿瘤中的最高绝对差异至正常组织中的最高绝对差异排序(左侧至右侧)。误差棒代表均值的标准误差。显示了顶部三种癌症(左侧，黑色柱形)和正常(右侧，白色柱形)组织卫星类别(柱形图，中心)的倍数差异。
图4A显示了所有小鼠肿瘤和正常组织中主要卫星与其它细胞转录物的多线性相关分析的结果，如通过热图(heat map)描绘的。x轴是根据主要卫星表达排序的样品，而y轴是根据与主要卫星表达的线性相关排序的基因。浅灰色(高)和暗灰色(低)颜色是log2(每百万的阅读)。主要卫星表达作为通过具有最高线性(R≥0.85)及卫星水平的顶部基因的展开图根据卫星阅读(x-轴)等级排序的百分比基因组比对阅读(y轴)。
图4B是一幅点图，其显示了所有基因的转录起始位点与Line-1元件的中值距离，其以与卫星表达的线性(暗灰色；左侧的最高线性)或随机(亮灰色)排序。通过在100s中二进制化(binned)的基因绘图
图4C是一幅显示了具有最高线性(R>0.85)的顶部基因的点图，其限定与这些基因的预期频率(亮灰色)相比通过针对转录起始位点与LINE-1元件的距离的频率(暗灰色)绘图的卫星相关基因或SCG。
图4D是一组四幅显微照片，其显示了小鼠PDAC(KrasG12D,Tp53lox/+)在神经内分泌标志物嗜铬粒蛋白A方面的免疫组织化学的结果。肿瘤以升高的嗜铬粒蛋白A染色(暗灰色)的函数描绘，其中在每幅图的底部对每个肿瘤记录主要卫星表达的相对水平(占所有转录物的百分比)。
图5是一幅柱形图，其标示CTC装置对对照装置中指定基因的倍数变化表达。受试者是新诊断的转移性胰腺腺癌患者。在某个点时在所有患者中看到LINE-1表达。
图6A是经福尔马林固定的经石蜡包埋的组织(顶部图像)中人新生物前PanIN(P)损伤及相邻的非癌性基质组织(N)和PDAC的细针抽吸活组织检查(T)和正常相邻白细胞(N)中人卫星HSATII的RNA原位杂交(RNA-ISH)图像。。(暗灰色点=HSATII)。比例尺=100μm。
图6B是使用HB-芯片上捕获的潜在人胰腺循环肿瘤细胞的AffymetrixViewRNA进行HSATII的RNA原位杂交的图像。HSATII(最亮的区域；最初为黄色)、DAPI核染色(中等灰色区域，最初为蓝色)。比例尺=20μm。
发明详述
本发明至少部分基于鉴定来自小鼠肿瘤模型中的主要卫星重复及来自人癌症中的ALR和HSATII卫星重复的LINE-1蛋白和双向ncRNA的大规模生成。这些癌症中卫星水平的异常幅度是无先例的。这可能源自影响卫星和LINE-1反转录转座子两者的染色体标志的一般性去阻抑，及接近潜在影响选定的细胞mRNA表达的LINE-1激活。总之，卫星的非常高的表达可以影响染色体完整性和遗传稳定性，而共脱调节(co-deregulated)的编码序列可以影响癌细胞的细胞命运和生物学行为。另外，人胰腺癌中特定卫星子集的大规模表达的发现为在癌症的早期检测中应用提供一种新颖的生物标志物。最终，LINE-1水平在来自具有新诊断的转移性胰腺腺癌的受试者的循环肿瘤细胞中是升高的。如此，本方法可用于早期检测癌症，并且可以用于预测临床后果。
使用转录物生物标志物诊断癌症
可以使用本文中所描述的方法在受试者中诊断癌症及监测癌症治疗效力，所述癌症例如上皮起源的实体瘤，例如胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌。
如本文中所使用的，术语“过度增殖性”指具有自主生长(即，以快速增殖细胞生长为特征的异常状态或状况)的能力的细胞。过度增殖性疾病状态可以分类为病理学的，即表征或构成疾病状态，或者可以表征为非病理学的，即偏离正常，但是与疾病状态没有联系。该术语意图包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织、或器官，而不管组织病理学类型或侵入性阶段。“肿瘤”是过度增殖细胞的异常生长。“癌症”指例如以恶性肿瘤生长为特征的病理学疾病状态。
如本文中表明的，癌症，例如上皮起源的实体瘤，例如如由ICD-O(国际疾病分类：肿瘤学)代码(修正版3)，部分(8010-8790)限定的，例如早期阶段癌症的存在与由于胰腺癌细胞中卫星重复的转录和加工升高所致的卫星大规模水平，及循环肿瘤细胞中LINE-1表达水平升高的存在有关。如此，所述方法可以包括检测样品中卫星重复的表达水平，所述样品包含已知或怀疑是肿瘤细胞的细胞，例如来自上皮起源的实体瘤的细胞，例如胰腺、肺、乳腺(breast)、前列腺、肾、卵巢或结肠癌细胞。或者/另外，所述方法可以包括例如使用如本文中所描述的微射流装置来检测样品中LINE-1的水平升高，所述样品例如是已知或怀疑包含肿瘤细胞，例如循环肿瘤细胞(CTC)的样品。
上皮起源的癌症可以包括胰腺癌(例如，胰腺腺癌或管内乳头状粘液癌(IPMN，胰腺块))、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、或结肠癌。例如，可以使用本方法来区别良性IPMN(对其监视是标准的处理)和恶性IPMN(其需要切除，即一种与显著的发病率且小的但是显著的死亡概率有关的规程)。在一些实施方案中，在诊断为IPMN的受试者中，可以使用本文中所描述的方法来监视/监测受试者，例如，可以在选定的时间间隔(例如，每3、6、12、或24个月)重复所述方法以检测良性IPMN是否已经变为准许手术干预的恶性IPMN。另外，在一些实施方案中，可以在来自怀疑具有非小细胞肺癌的受试者的样品中使用所述方法来区别细支气管肺泡癌与反应性过程(例如，肺炎后反应性过程)。在一些实施方案中，在来自怀疑具有乳腺癌的受试者的样品中，可以使用所述方法来区别导管增生与非典型性导管增生和原位管癌(DCIS)。后两种种类接受切除/放射；前一种不需要干预。在一些实施方案中，在怀疑具有前列腺癌的受试者中，可以使用所述方法来区别非典型性小腺泡增殖和恶性癌症。在一些实施方案中，在怀疑具有膀胱癌的受试者中，可以使用所述方法来检测例如尿样本中移行细胞癌(TCC)。在一些实施方案中，在诊断为巴雷特(Barrett)氏食管的受试者中(Sharma,N Engl J Med.2009,24;361(26):2548-56.Erratum in:N Engl J Med.2010年4月15日;362(15):1450)，可以使用所述方法来区别巴雷特氏食管中的发育异常与反应性过程。临床含意是重大的，因为发育异常的诊断要求治疗性干预。其它实施方案包括但不限于诊断充分分化的肝细胞癌、壶腹和胆管癌、胶质瘤对反应性神经胶质瘤病(reactive gliosis)、黑素瘤对皮肤痣、低度肉瘤、和胰腺内分泌肿瘤，等等。
因此，本文中包括用于诊断受试者中的癌症的方法，所述癌症例如是上皮起源的肿瘤，例如胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌。在一些实施方案中，所述方法包括自受试者获得样品，并评估样品中LINE-1或卫星的存在和/或水平，并与一种或多种参照比较所述存在和/或水平，所述参照物例如是代表LINE-1或卫星的正常水平的对照参照，例如不受影响的受试者或来自同一受试者的正常细胞中水平，和/或代表与癌症有关的LINE-1或卫星的水平的疾病参照，例如具有胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌的受试者中的水平。
也可以使用本方法来测定癌症的阶段，例如样品是否包含来自癌前损伤、早期阶段肿瘤、或晚期肿瘤的细胞。例如，可以使用本方法来测定受试者是否具有癌前胰腺、乳腺、或前列腺损伤。在使用的标志物是LINE-1、或卫星转录物ALR和/或HSATII的情况中，升高水平与晚期阶段相关联。对于卫星转录物GSATII、TAR1和/或SST1，降低水平与渐增的阶段相关联。另外，LINE-1和卫星ALR和/或HSATII的水平对于临床结果可以是预后的且预测的。
样品
在本方法的一些实施方案中，样品是或者包括血液、血清、和/或血浆、或其部分或亚级分，例如血清中游离的RNA或血液中外来体内的RNA。在一些实施方案中，样品包含(或怀疑包含)CTC。在一些实施方案中，样品是或者包含尿液或其部分或亚级分。在一些实施方案中，样品包含已知或怀疑的肿瘤细胞，例如是活组织检查样品，例如细针抽吸物(FNA)、内窥镜活组织检查、或芯针活组织检查；在一些实施方案中，样品包含来自受试者的胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠的细胞。在一些实施方案中，样品包含自痰样品或通过刷、清洗、支气管镜活组织检查、经支气管活组织检查、或FNA，例如支气管镜、荧光镜、或CT引导的FNA(也可以使用此类方法来自其它组织获得样品)自受试者的肺获得肺细胞。在一些实施方案中，将样品冷冻，固定和/或透化，例如是经福尔马林固定的经石蜡包埋的(FFPE)样品。
卫星表达水平
在一些实施方案中，例如在已知或怀疑包含肿瘤细胞的样品中检测卫星转录物的水平。在一些实施方案中，将已知或怀疑的肿瘤细胞(例如，测试细胞)中的卫星转录物水平与参照水平比较。
在一些实施方案中，所述方法包括检测alpha(ALR)卫星转录物(D.Lipson等,Nat Biotechnol27,652(2009年7月))或HSATII卫星转录物(J.Jurka等,Cytogenet Genome Res110,462(2005))的水平；在一些实施方案中，将那些水平与参照比较。在一些实施方案中，参照水平是正常(非癌性)细胞，例如来自同一受试者的正常细胞中的ALR和/或HSATII卫星转录物水平，或自正常细胞分组测定的参照水平；测试细胞中高于正常细胞中的ALR和/或HSATII水平的ALR和/或HSATII水平的存在指示测试细胞是肿瘤细胞(例如，测试细胞来源的受试者具有或可以诊断为癌症)。在一些实施方案中，ALR和/或HSATII转录物的参照水平是阈值水平，并且高于阈值水平的ALR和/或HSATII卫星转录物水平的存在指示细胞是肿瘤细胞(例如，测试细胞来源的受试者具有或可以诊断为癌症)。
在一些实施方案中，所述方法包括检测GSATII、TAR1和/或SST1转录物的水平；在一些实施方案中，将那些水平与参照比较。在一些实施方案中，参照水平是正常(非癌性)细胞，例如来自同一受试者的正常细胞中的GSATII、TAR1和/或SST1卫星转录物水平，或自正常细胞分组测定的参照水平；测试细胞中低于正常细胞中的GSATII、TAR1和/或SST1水平的GSATII、TAR1和/或SST1水平的存在指示测试细胞是肿瘤细胞(例如，测试细胞来源的受试者具有或可以诊断为癌症)。在一些实施方案中，GSATII、TAR1和/或SST1转录物的参照水平是阈值水平，并且低于阈值的GSATII、TAR1和/或SST1卫星转录物水平的存在指示细胞是肿瘤细胞(例如，测试细胞来源的受试者具有或可以诊断为癌症)。
在一些实施方案中，相对非变体转录物诸如GAPDH、肌动蛋白、或微管蛋白标准化卫星转录物水平，例如将卫星的表达水平与非变体转录物比较。例如，可以计算表达水平的比率，并且可以将该比率与正常(非癌性)细胞中的比率比较。例如，在一些实施方案中，超过10:1，例如超过50:1、超过100:1、或超过150:1的ALR:GAPDH比率的存在指示测试细胞是癌细胞；在一些实施方案中，约3:1或5:1的ALR:GAPDH比率的存在指示测试细胞是正常细胞。在一些实施方案中，超过10:1，例如20:1、30:1、40:1、或45:1的HSATII卫星:GAPDH转录物比率的存在指示测试细胞是癌细胞。在一些实施方案中，HSATII的显著(例如，比对的每百万的超过约100个转录物)水平的存在指示测试细胞是癌细胞。在一些实施方案中，HSATII的非常低的水平(例如，比对的每百万的小于约20个转录物)的缺乏或存在指示测试细胞是正常细胞。
下文是可以用于ALR(包括其变体)和HSATII转录物的例示性参照序列：
>ALR SAT 人
aattctcagtaacttccttgtgttgtgtgtattcaactcacagagttgaacgatcctttacacagagcagacttgaaacactctttttgtggaatttgcaagtggagatttcagccgctttgaggtcaatggtagaataggaaatatcttcctatagaaactagacagaat(SEQ ID NO:1)
>ALR1 SAT 人
tcattctcagaaactrctttgtgatgtgtgcrttcaactcacagagtttaacctttcttttgatagagcagtttggaaacactctgtttgtaaagtctgcaagtggatatttggacctctttgaggccttcgttggaaacgggatttcttcatataatgctagacagaaga(SEQ ID NO:2)
>ALR2 SAT 人
agctttctgagaaactgctttgtgatgtgtgcattcatctcacagagttaaacctttcttttgattcagcagtttggaaacactgtttttgtagaatctgtgaagggatatttgggagctcattgaggcctatggtgaaaaagaaaatatcttcagataaaaactagaaggaagctatc(SEQ ID NO:3)
>ALRa SAT 灵长类
ctatctgagaaactgctttgtgatgtgtgcattcatctcacagagttaaacctttcttttgattcagcagtttggaaacactgtttttgtagaatctgcgaagggacatttgggagctcattgaggcctatggtgaaaaagcgaatatccccagataaaaactagaaagaag(SEQ ID NO:4)
>ALRa_SAT 灵长类
ttgtagaatctgcgaagggacatttgggagctcattgaggcctatggtgaaaaagcgaatatccccagataaaaactagaaagaagctatctgagaaactgctttgtgatgtgtgcattcatctcacagagttaaacctttcttttgattcagcagtttggaaacactgttt(SEQ ID NO:5)
>ALRb SAT 灵长类
ttgtggaatttgcaagtggagatttcaagcgctttgaggccaawnktagaaaaggaaatatcttcgtataaaaactagacagaataattctcagtaacttctttgtgttgtgtgtattcaactcacagagttgaaccttcctttagacagagcagatttgaaacactcttt(SEQ ID NO:6)
>ALR_SAT 灵长类
ttgtagaatctgcaagtggatatttggasckctttgaggmcttcgktggaaacgggaatatcttcacataaaaactagacagaagcattctcagaaacttctttgtgatgtttgcattcaactcacagagttgaacmttccttttgatagagcagttttgaaacactcttt(SEQ ID NO:7)
>HSATII SAT 灵长类
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Line-1水平
长散在核苷酸元件(LINE)非LTR反转录转座子(Singer,Cell28(3):433–4(1982))是一组大量存在于真核基因组中，并且生成插入突变，促成基因组不稳定性及革新，并且可以改变基因表达的遗传元件。
规范的全长LINE-1元件是长度约6千碱基(kb)，并且包括具有内部RNA聚合酶II启动子的5’非翻译区(UTR)(Swergold,Mol Cell Biol.10(12):6718-29(1990))、两个可读框(称作ORF1和ORF2)和含有以可变长度的富含寡dA的尾部结束的多聚腺苷酸化信号的3’UTR(Babushok and Kazazian,Hum Mutat.28(6):527-39(2007))。虽然存在有人基因组中插入的超过500,000个L1元件，但是仅约80-100个拷贝是有反转录转座能力的(Brouha等,Proc Natl Acad SciU S A.100(9):5280-5.(2003))。关于更多详情，见Cordaux and Batzer,Nat RevGenet.10(10):691–703(2009))。
例示性LINE-1序列包括变体(1)的GenBank参照号(Ref.No.)NM_001164835.1(核酸)和NP_001158307.1(蛋白质)；和变体2(其是较短的转录物)的GenBank参照号NM_019079.4(核酸)和NP_061952.3(蛋白质)。变体2与变体1相比在5’UTR中有所不同，但是变体1和2两者都编码相同蛋白质。还可见Gene ID:54596。
在一些实施方案中，本文中所描述的用于诊断癌症的方法包括测定细胞(例如，在存在于受试者血液中的CTC中)中的LINE-1mRNA水平以获得LINE-1数值，并将该数值与合适的参照数值比较，所述参照数值例如是代表阈值水平的数值，高于所述阈值水平，受试者可以诊断为癌症。参照也可以是数值范围，例如其指示受试者中癌症的严重性或阶段。可以通过本领域中已知的方法测定合适的参照数值。
在一些实施方案中，参照水平是正常(非癌性)细胞，例如来自同一受试者的正常细胞中的LINE-1转录物水平，或者自正常细胞分组测定的参照水平；测试细胞中高于正常细胞中的LINE-1水平的LINE-1水平的存在指示测试细胞是肿瘤细胞(例如，测试细胞来源的受试者具有或可以诊断为癌症)。在一些实施方案中，LINE-1转录物的参照水平是阈值水平，并且高于阈值水平的LINE-1转录物水平的存在指示细胞是肿瘤细胞(例如，测试细胞来源的受试者具有或可以诊断为癌症)。
检测方法
可以使用本领域中已知的任何方法来检测和/或量化生物标志物的水平，如本文中所描述的。例如，可以使用本领域中已知的方法，例如Northern印迹、RNA原位杂交(RNA-ISH)、RNA表达测定法，例如微阵列分析、RT-PCR、深度测序(deep sequencing)、克隆、Northern印迹、和定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)来评估卫星转录物或LINE-1mRNA(转录物)的水平。测定RNA表达的分析技术是已知的。见例如Sambrook等,Molecular Cloning:A  Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(2001)。
在一些实施方案中，检测LINE-1蛋白的水平。可以使用本领域中已知的方法，例如，使用定量免疫测定方法诸如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫沉淀、免疫荧光、免疫组织化学、酶免疫测定法(EIA)、放射性免疫测定法(RIA)、和Western印迹分析来评估蛋白质的存在和/或水平。
在一些实施方案中，所述方法包括使选择性结合生物标志物，例如卫星转录物或LINE-1mRNA或蛋白质(诸如寡核苷酸探针、抗体或其抗原结合部分)的药剂与样品接触，以评估样品中生物标志物的水平。在一些实施方案中，所述药剂携带可检测标记物。术语“标记的”就药剂而言涵盖通过将可检测物质与所述药剂偶联(即，物理连接)直接标记药剂，及通过与可检测物质的反应性间接标记所述药剂。可检测物质的例子是本领域中已知的，并且包括化学发光、荧光、放射性、或比色标记物。例如，可检测物质可以包括各种酶、非朊基(prosthetic)基团、荧光材料、发光材料、生物发光材料、和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、beta-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的非朊基基团复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和亲合素/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三吖嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯、量子点、或藻红蛋白；荧光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素、和水母发光蛋白，而合适的放射性材料的例子包括125I、131I、35S或3H。一般地，在要检测蛋白质的情况中，可以使用抗体。抗体可以是多克隆，或更优选的是单克隆。可以使用完整的抗体，或其抗原结合片段(例如Fab或F(ab’)2)。
在一些实施方案中，可以使用高通量方法，例如如本领域中已知的蛋白质或基因芯片(见例如第12章,“Genomics,”于Griffiths等编Modern genetic  Analysis,1999,W.H.Freeman and Company;Ekins and Chu,Trends inBiotechnology,1999;17:217-218;MacBeath and Schreiber,Science2000,289(5485):1760-1763;Simpson,Proteins and Proteomics:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press;2002;Hardiman,Microarrays Methods  and Applications:Nuts&Bolts,DNA Press,2003)来检测卫星或LINE-1的存在和/或水平。
在一些实施方案中，所述方法包括使用经修饰的RNA原位杂交技术使用分支链DNA测定法来直接检测并评估样品中的生物标志物mRNA的水平(见例如Luo等,美国专利No.7,803,541B2,2010;Canales等,NatureBiotechnology24(9):1115-1122(2006);Nguyen等,Single Molecule in situDetection and Direct Quantiication of miRNA in Cells and FFPE Tissues,告示在panomics.com/index.php?id=product_87可获得)。用于实施此测定法的试剂盒可购自Affymetrix(ViewRNA)。
CTC中LINE-1和卫星转录物的检测
在一些实施方案中，微射流(例如“芯片上的实验室(lab-on-a-chip)”)装置可以在本方法中使用。此类装置已经成功用于微射流流式细胞术、基于大小的连续分离、和层析分离。一般地，可以使用在循环肿瘤细胞(CTC)中检测卫星或LINE-1的表达的方法来早期检测癌症，例如早期检测上皮起源的肿瘤，例如胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌。
可以使用所述装置来从细胞混合物分离CTC，或者制备富集的CTC群体。具体地，可以使用此类装置来从复杂的混合物诸如全血分离CTC。
可以使用多种办法来从异质样品分离CTC。例如，所述装置可以包含在区块屏障上游的微射流通道中以六边形包装样式排列的多个立柱(post)的阵列。可以用不同结合模块使立柱和区块屏障功能化。例如，可以用抗EPCAM抗体功能化立柱以捕捉循环肿瘤细胞(CTC)；见例如Nagrath等,Nature450:1235-1239(2007)，任选地将下游区段屏障功能化以捕捉LINE-1核酸或蛋白质、或卫星。见例如(S.Maheswaran等,N Engl J Med.359,366(2008年7月24日);S.Nagrath等,Nature.450,1235(2007年12月20日);S.L.Stott等,SciTransl Med2,25ra23(3月31日))及本文中应用的申请和参考文献。
用于从样品富集特定颗粒的方法一般基于序贯加工步骤，每个所述步骤减少混合物中不想要的细胞/颗粒的数目，但是一个加工步骤在一些实施方案中可以足够。用于实施多个加工步骤的装置可以是分开的或者整合到一个微射流系统中。所述装置包括用于细胞/颗粒结合的装置、用于细胞裂解的装置、用于排列细胞的装置、和用于颗粒分离(例如基于大小、形状和/或变形性或其它标准进行)的装置。在某些实施方案中，使用加工步骤来减少细胞数目，之后将它们导入装置或系统中。在一些实施方案中，与初始样品混合物相比，装置保留至少75%，例如80%、90%、95%、98%、或99%期望的细胞，同时相对于一种或多种不想要的细胞类型，将期望细胞的群体富集至少100倍，例如1000、10,000、100,000、或甚至1,000,000倍。
用于分离颗粒的一些装置依赖于在有或没有同时细胞结合情况下基于大小的分离。一些基于大小的分离装置包括引起CTC和其它流体组分的侧向移位，由此提供富集或以其它方式加工此类组分的机制的一个或多个障碍物阵列。依照大小分离颗粒的障碍物阵列通常限定缺口网络，其中将通过缺口的流体不相等地分入随后的缺口中。基于筛和阵列大小的分离装置两者可以相对于细胞结合装置选择性并入如上文所描述的透性障碍物。
包含形成缺口网络的障碍物阵列的装置可以包括例如交错的二维障碍物阵列，例如使得每个连续行以前一行的时段的小于一半补偿。也可以以不同样式排列障碍物。可能的障碍物性状和样式的例子在WO2004/029221中更为详细地讨论。
在一些实施方案中，所述装置可以提供CTC的分离和/或富集，其使用基于阵列的大小分离方法进行，例如如记载于美国专利公开文本No.2007/0026413的。一般地，所述装置包括选择性透性障碍物的一个或多个阵列，所述选择性透性障碍物引起流体样品中悬浮的大颗粒诸如CTC和其它组分的侧向移位，由此提供富集或以其它方式加工此类组分的机制，同时还提供选择性结合其它较小的颗粒的可能性，所述其它较小的颗粒可以穿过构成障碍物的纳米管(nanotube)的密集矩阵中的空隙。采用此类选择性透性障碍物进行颗粒的基于大小、形状、或变形性的富集的装置，包括滤器、筛、和富集或分离装置记载于国际公开文本No.2004/029221and2004/113877,Huang等Science304:987-990(2004),美国公开文本No.2004/0144651,美国申请No.5,837,115和6,692,952,及美国申请No.60/703,833,60/704,067,和11/227,904；可用于亲和力捕捉的装置，例如那些记载于国际公开文本No.2004/029221和美国申请流水号11/071,679的；可用于优先裂解样品中的细胞的装置，例如那些记载于国际公开文本No.2004/029221,美国专利No.5,641,628,及美国申请No.60/668,415的；可用于排列细胞的装置，例如那些记载于国际公开文本No.2004/029221,美国专利No.6,692,952,及美国申请流水号10/778,831和11/146,581的；及可用于流体投递的装置，例如那些记载于美国申请No.11/071,270和11/227,469的。两种或更多种装置可以连续组合，例如如记载于国际公开文本No.WO2004/029221的。所有前述参考文献通过提及并入本文。
在一些实施方案中，装置可以含有包含选择性结合特定细胞类型，例如上皮起源的细胞，例如肿瘤细胞的结合模块，例如单克隆抗EpCAM抗体或其片段的障碍物。装置的所有障碍物可以包含这些结合模块；或者，仅障碍物的亚组包含它们。装置还可以包含别的模块，例如细胞计数模块或检测模块，其与微射流通道装置处于流体通信中。例如，检测模块可以配置为显现装置的输出样品。
在一个例子中，检测模块可以与分离或富集装置处于流体通信中。检测模块可以使用本文中公开的任何检测方法，或本领域中已知的其它方法运行。例如，检测模块包括显微镜、细胞计数器、磁体、生物空腔(biocavity)激光器(见例如Gourley等,J.Phys.D:Appl.Phys.,36:R228-R239(2003))、质谱仪、PCR装置、RT-PCR装置、微阵列、RNA原位杂交系统、或超光谱(hyperspectral)成像系统(见例如Vo-Dinh等,IEEE Eng.Med.Biol.Mag.,23:40-49(2004))。在一些实施方案中，可以连接计算机终端与检测模块。例如，检测模块可以检测选择性结合感兴趣的细胞、蛋白质、或核酸，例如LINE-1DNA、mRNA、或蛋白质、或卫星DNA或mRNA的标志物。
在一些实施方案中，微射流系统包含(i)用于分离或富集CTC的装置；(ii)用于裂解富集的CTC的装置；和(iii)用于检测LINE-1DNA、mRNA、或蛋白质、或卫星DNA或mRNA的装置。
在一些实施方案中，使用如本文中所描述的微射流装置制备的CTC群体用于使用已知的分子生物学技术分析LINE-1和/或卫星的表达，例如如上文及在Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Cold SpringHarbor Laboratory Press;第3版(2001年1月15日));及Short Protocols in  Molecular Biology,Ausubel等编(Current Protocols;第52版(2002年11月5日))中描述的。
一般地，本文中描述了用于检测和/或量化富集的CTC群体中卫星或LINE-1表达的装置，并且可以用于早期检测癌症，例如上皮起源的肿瘤，例如早期检测胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌。
监测疾病进展或治疗效力的方法
在一些实施方案中，一旦测定出对象具有癌症，或者具有升高的形成癌症的风险，则可以施用治疗，例如如本领域中已知的。可以使用本文中所描述的方法来监测治疗的效力；可以治疗后(或期间)，例如在施用一剂或多剂治疗后评估别的样品，并且LINE-1、和/或ALR和/或HSATII卫星表达水平降低，或样品中表达LINE-1、和/或ALR和/或HSATII卫星的细胞数目减少会指示治疗是有效的，而LINE-1、和/或ALR和/或HSATII卫星表达水平或表达LINE-1、和/或ALR和/或HSATII卫星的细胞没有变化或升高会指示治疗不是有效的(相反的事物对于GSATII、TAR1和/或SST1卫星的水平当然会是正确的)。在治疗过程期间和/或已经终止治疗后可以将该方法重复几次，例如以监测潜在的疾病复发。
在一些实施方案中，例如，对于已经诊断为可导致癌症的良性状况的受试者，已经成功治疗癌症的受试者，或具有升高的癌症风险的受试者(例如由于遗传素因或环境暴露于癌症引起剂)，可以在选定的时间间隔，例如在3、6、12、或24个月时间间隔时重复所述方法，以监测受试者中的疾病，从而早期检测对恶性的进展或受试者中癌症的形成。
实施例
本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例没有限制权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例1：与细胞系和正常组织相比，主要卫星水平在肿瘤组织中大规 模升高
利用来自Helicos BioSciences的下一代数字基因表达(DGE)应用(D.Lipson等,Nat Biotechnol27,652(2009年7月))来比较原发性癌症及其衍生的转移前体中的肿瘤标志物的表达。我们首先测定经由组织靶向性表达激活的Kras和Tp53的丧失生成的原发性小鼠胰管腺癌(PDAC)(KrasG12D,Tp53lox/+)的DGE概况(N.Bardeesy等,Proc Natl Acad Sci U S A103,5947(2006年4月11日))。这些肿瘤是人PDAC的组织病理学和遗传模拟物，其展现出实质上普遍的突变体KRAS(>90%的病例)和TP53的损失(50-60%)。
将具有不同基因型的胰腺癌的小鼠繁殖，如先前记载于Bardeesy实验室(Bardeesy等,Proc Natl Acad Sci U S A103,5947(2006))的。正常的野生型小鼠购自Jackson laboratories。按照动物方案指南将动物实施安乐死。将胰腺肿瘤和正常组织在无菌情况下提取，然后用液氮快速冷冻。将组织于-80°C贮存。对于动物AH367和AH368生成新鲜的细胞系，如先前描述的(Aguirre等,Genes Dev17,3112(2003))，并将建立细胞系在RPMI-1640+10%FBS+1%Pen/Strep(Gibco/Invitrogen)中培养。来自结肠和肺的其它小鼠肿瘤由KevinHaigis(Massachusetts General Hospital)和Kwok-Kin Wong(Dana FarberCancer Institute)慷慨提供。
将新鲜冷冻的组织在干冰上在微量离心管中用无菌杵棒磨碎。将细胞系培养，并在液氮中快速冷冻，之后进行核酸提取。来自细胞系及快速冷冻的肿瘤和正常组织的RNA和DNA均以相同的方式加工。使用
Figure BDA00003316218400171
试剂(Invitrogen)按照制造商的用法说明书提取RNA。使用QIAamp微量试剂盒(QIAGEN)按照制造商的方案提取来自组织和细胞系的DNA。
将纯化的RNA进行数字基因表达(DGE)样品制备，并在来自HelicosBioSciences的HeliScopeTM单分子测序仪上分析。此方法先前已经描述过(Lipson等,Nat Biotechnol27,652(2009))。简言之，用dTU25V引物和Superscript III cDNA合成试剂盒(Invitrogen)从RNA逆转录单链cDNA。将RNA消化，并用磁珠使用固相可逆固定化(SPRI)技术纯化单链cDNA。将单链cDNA变性，然后，使用末端转移酶(New EnglandBiolabs)将多聚-A尾部添加至3’端。
将纯化的DNA进行来自Helicos的DNA测序样品制备方案，其先前已经描述过(Pushkarev,N.F.Neff,S.R.Quake,Nat Biotech27,847(2009))。简言之，用Covaris S2声学近距离声波定位器(sonicator)剪切基因组DNA，所述Covaris S2声学近距离声波定位器生成平均值200bp和范围为100-500bp的片段。然后，用SPRI清洁剪切的DNA。然后，将DNA变性，并使用末端转移酶将多聚A尾部添加至3’端。
然后，使加尾的cDNA或DNA与测序流动池杂交，接着是“填充和锁定(Fill and Lock)”和单分子测序。然后，使用DGE程序将基因表达序列阅读与已知的人或小鼠转录物组文库比对。将基因组DNA序列阅读与小鼠基因组比对，并计数以测定主要小鼠卫星(CNV)的拷贝数目。
分析的第一小鼠胰腺肿瘤AH284是值得注意的，因为与来自相同小鼠的正常肝转录物的3-4%差异相比，DGE序列与注释的小鼠转录物组展示48-52%差异。几乎所有差异的序列定位至臂间(主要)小鼠卫星重复。与正常胰腺或肝中的0.02-0.4%(196-4,115tpm)相比，卫星转录物占肿瘤中所有细胞转录物的约49%(495,421tpm)(表1)。
表1
总基因组比对阅读及主要卫星和转录物组阅读的分类。括号中为占总基因组比对阅读的百分比
Figure BDA00003316218400181
卫星序列阅读存在于有义和反义方向两者中，并且是经多聚A纯化的RNA缺乏的。因此，肿瘤AH284含有大量非多聚腺苷酸化的dsRNA元件，其定量测定为比存在于来自同一动物的正常组织中的dsRNA元件增加大于100倍。为了比较，肿瘤组织中的卫星转录物水平比丰富的mRNA Gapdh高约8,000倍。来自同一小鼠的第二独立的胰腺肿瘤节显示较低的、尽管仍然升高很大的、卫星转录物水平(占总细胞转录物的4.5%)。
对来自(KrasG12D,Tp53lox/+)小鼠的4个额外的胰腺肿瘤和4只具有备选胰腺致瘤性基因型(KrasG12D,SMAD4lox/lox)的小鼠分析揭示了6/8个额外的肿瘤中升高的卫星表达(占所有细胞转录物的范围1-15%)。在2/3小鼠结肠癌肿瘤(KrasG12D,APClox/+)和2/2肺癌(KrasG12D,Tp53lox/lox)中，卫星表达水平范围为占所有细胞转录物的2-16%。总共，与正常小鼠组织相比，12/15(80%)个独立的小鼠肿瘤具有极大升高的卫星表达水平(图1A,表2)。
表2
多种小鼠肿瘤、细胞系、和正常组织间总基因组阅读和与转录物组和主要卫星比对的阅读的百分比。
Figure BDA00003316218400191
Figure BDA00003316218400201
值得注意的是，编码、核糖体和其它非编码转录物中所有RNA阅读的复合分布显示了原发性肿瘤和正常组织之间的显著变化(图1A)，提示了全局细胞转录机器受到原发性肿瘤中卫星转录物的大规模表达影响。从3种原发性胰腺肿瘤建立的永生化细胞系展示卫星重复的最小程度表达，提示了体外增殖期间的负选择压力或体外培养物条件下稳定的卫星沉默机制的重新确立(图1A)。值得注意的是，在过表达卫星的原发性肿瘤中，编码、核糖体和其它非编码转录物中所有RNA阅读的复合分布显示了与正常组织的复合分布的显著变化(图1B)，提示了细胞转录机器受到这些肿瘤中卫星转录物的大规模表达影响。
实施例2：根据组织类型，主要卫星转录物是各种大小的，并且表达水 平与基因组甲基化和扩增相关联。
如下实施对小鼠原发性胰腺肿瘤的Northern印迹分析。使用NorthernMax-Gly试剂盒(Ambion)实施Northern印迹。将总RNA(10ug)与等体积的Glyoxal加载染料(Ambion)混合，并于50°C温育30分钟。在1%琼脂糖凝胶中电泳后，将RNA转移至BrightStar-Plus膜(Ambion)上，并用紫外线交联。将膜在ULTRAhyb缓冲液(Ambion)中于68°C预杂交30分钟。使用MAXIscript试剂盒(Ambion)制备小鼠RNA探针(1100bp)，并使用BrightStar Psoralen-生物素试剂盒(Ambion)依照制造商的用法说明书以非同位素标记。使用0.1nM探针，将膜在ULTRAhyb缓冲液(Ambion)中于68°C杂交2小时。用低严格性洗液于室温将膜清洗10分钟，接着于68°C的两次高严格性清洗，持续15分钟。对于非同位素化学发光检测，依照制造商的用法说明书使用BrightStarBioDetect试剂盒。
结果表明主要卫星衍生的转录物范围为100bp至2.5kb(图2A)，这与切酶1对由多个串联重复构成的大的初始转录物的预测切割一致(C.Kanellopoulou等,Genes Dev19,489(2005年2月15日);T.Fukagawa等,NatCell Biol6,784(2004年8月);H.Bouzinba-Segard,A.Guais,C.Francastel,ProcNatl Acad Sci U S A103,8709(2006年6月6日))，所述切酶1的表达在卫星表达高于中值的小鼠胰腺肿瘤中高2.6倍(p=0.0006,t-检验)。从具有高卫星表达的原发性肿瘤衍生的建立的胰腺癌细胞系具有非常小的卫星表达，确认我们的沉默结果(T3和CL3;图2A)。用5-氮杂胞苷处理CL3导致卫星转录物的大规模再表达，支持DNA甲基化作为体外稳定卫星沉默的机制(图2B)。除了肺之外，大多数正常的成年小鼠组织显示卫星重复的最小程度表达(图2B)。然而，未切割的5kb卫星转录物的表达在胚胎组织中是明显的(图2C)。如此，原发性胰腺肿瘤中卫星重复的异常表达不仅重演胚胎细胞命运，而且还反映对初始5kb卫星转录物的加工改变。单分子测序平台对于定量小重复ncRNA片段是异常灵敏的，每种所述小重复ncRNA片段以独特阅读评分。小鼠主要卫星的高水平表达在原发性肿瘤内的所有细胞中是明显的(图2D)，如通过RNA原位杂交(ISH)显示的。明显地，表达在早期新生物前损伤、胰腺上皮内新生物(PanIN)中已经是升高的，并且其在转变为完全胰腺腺癌后进一步升高(图2E)。对肝的清楚限定的转移性损伤根据RNA ISH呈强烈阳性，通过组织病理学分析否则不会检出的肝实质内的个别PDAC细胞亦然(图2F)。低水平弥散表达在肝和肺中是明显的，如通过整装胚胎分析显示的，但是没有正常的成年或胚胎组织表明与肿瘤细胞中明显的卫星表达相当的卫星表达。
为了测定卫星重复的基因组扩增是否也促成小鼠胰腺肿瘤中这些转录物的异常丰富，使用如上文所描述的下一代DNA数字拷贝数变化(CNV)分析来分析系数AH284肿瘤以进行基因组DNA测序。
表3中显示的结果指示与匹配正常肝中的2.3%的基因组序列相比，卫星DNA构成此肿瘤中所有基因组比对阅读的18.8%。主要卫星重复先前估计为占正常小鼠基因组的约3%(J.H.Martens等,EMBO J24,800(2005年2月23日))。如此，在卫星重复的表达升高大于100倍的此肿瘤中，重复的约8倍基因扩增可以促成其异常表达。
表3
对来自小鼠AH284的指数胰腺肿瘤和正常肝的CNV分析。作为占所有基因组比对阅读的百分比的主要卫星阅读(最后一栏)
Figure BDA00003316218400221
实施例3：人胰腺癌和其它上皮癌症中卫星转录物的过表达
为了测试人肿瘤是否也过表达卫星ncRNA，我们将DGE分析扩展到人胰腺癌标本。人胰腺肿瘤组织以过多的弃去人材料按照IRB方案从马萨诸塞州综合医院(Massachusetts General Hospital)获得。将大体肿瘤(gross tumor)切出，并在液氮中快速冷冻，之后进行核酸提取。正常的胰腺RNA获自两个商业供应商Clontech和Ambion。如上文在实施例1中所描述的，制备并分析样品。
对15种PDAC的分析显示了与正常胰腺相比总卫星转录物表达升高中值21倍。非小细胞肺癌、肾细胞癌、卵巢癌、和前列腺癌的分组也具有显著水平的卫星和HSATII卫星。其它正常人组织，包括胎儿脑、脑、结肠、胎儿肝、肝、肺、肾、胎盘、前列腺、和子宫具有稍高水平的总卫星表达(表4,图3A)。
表4
样品ID 基因组 总卫星(tpm) ALR(tpm) HSATII(tpm)
PDAC1 4,472,810 25,209 14,688 3,589
PDAC2 1,668,281 22,001 12,653 3,295
PDAC3 5,211,399 27,366 15,921 5,057
PDAC4 1,649,041 23,556 13,428 3,167
PDAC5 239,483 15,095 8,259 509
PDAC6 1,520,470 374 195 14
PDAC7 1,449,321 7,738 4,400 750
PDAC8 1,950,197 574 316 9
PDAC9 3,853,773 19,572 12,563 1,731
PDAC10 2,748,850 28,225 18,767 2,489
PDAC11 2,848,599 23,163 14,634 2,589
PDAC12 3,723,326 21,243 12,940 2,122
PDAC13 1,834,743 24,549 15,342 3,150
PDAC14 2,481,332 25,650 18,016 2,564
PDAC15 1,752,081 38,514 25,899 5,210
正常胰腺1 1,196,372 908 284 0
正常胰腺2 975,676 1,043 303 0
肺癌1 1,549,237 28,658 18,751 4,417
肺癌2 13,829,845 33,030 26,143 2,555
肾癌1 2,104,859 10,814 6,505 1,501
肾癌2 4,753,409 5,025 2,739 625
卵巢癌1 12,596,542 26,658 14,513 3,074
卵巢癌2 7,290,000 4,089 2,058 403
前列腺癌1 3,376,849 43,730 22,244 9,793
前列腺癌2 12,052,244 23,947 14,201 3,209
前列腺癌3 3,631,148 21,411 12,390 2,804
正常的胎儿脑 384,453 2,843 1,516 3
正常的脑 371,161 5,184 2,573 3
正常的结肠 183,855 13,059 7,229 5
正常的胎儿肝 147,977 11,218 5,879 7
正常的肝 117,976 7,968 3,730 25
正常的肺 208,089 15,027 7,857 5
正常的肾 144,173 15,218 8,094 7
正常的胎盘 207,929 13,990 7,815 0
正常的前列腺 263,406 8,409 2,228 19
正常的子宫 477,480 2,702 1,395 2
人卫星在多个类别间的细分揭示了肿瘤和所有正常组织之间的主要差异。虽然小鼠卫星重复广泛细分成主要和次要卫星，人卫星已经进行了更广泛地分类。在所有人卫星之中，最大的表达倍数差异对于臂间卫星HSATII是明显的(均值2,416tpm；占卫星阅读的10.3%)，其在正常人胰腺中是检测不到的(图3B)。比较而言，正常组织具有高得多的GSATII、Beta卫星(BSR)、和TAR1类别(分别占所有卫星阅读的21.1%、17.3%、和2.1%)呈现，而这些构成胰腺癌中少数卫星阅读。
通常表达的人卫星的最丰富的类别alpha(ALR)(Okada等,Cell131,1287(2007年12月28日))在正常人胰腺中以294tpm表达，但是在人胰腺腺癌中包含平均12,535tpm(43倍差异表达；占卫星阅读的60.3%)。如此，虽然人ALR阅读的过表达与小鼠主要卫星重复的过表达相当，但是它是不太丰富的HSATII(高于GAPDH的49倍)，这显示了对人PDAC的异常特异性。人胰腺肿瘤中LINE-1与卫星转录物的共表达也是突出的，具有均值16,089tpm(范围358-38,419)。
除了ALR重复外，正常胰腺和PDAC的卫星表达谱是明显不同的；例如，正常的胰腺组织具有高得多的GSATII、TAR1和SST1类别(占所有卫星阅读的26.4%、10.6%、和8.6%)呈现，虽然这些是胰腺癌中的少数卫星阅读。比较而言，癌症表达高水平的HSATII卫星(每106个转录物为4,000个；占卫星阅读的15%)，即其表达在正常胰腺中检测不到的亚型(图3B)。小鼠对人胰腺癌中卫星转录物的定量比较显示了小鼠主要卫星以高于丰富的Gapdh mRNA的466倍中值表达，而人ALR和HSATII卫星分别高于GAPDH的180倍和47倍表达。
实施例4：与升高的卫星水平具有线性相关的细胞转录物对于与组蛋白 脱甲基化酶和RNA加工酶相联系的干细胞和神经元件是富集的。
不同组织学和遗传背景的25种不同小鼠组织的全面DGE谱的生成使得有可能将细胞转录物的表达与宽定量范围间卫星的表达相关联。为了鉴定此类共调节基因，将通过DGE量化的所有注释的转录物进行线性回归分析，并将与卫星表达具有最高相关系数的转录物进行等级排序。
将所有小鼠样品阅读与小鼠主要卫星的定制文库(来自UCSC基因组浏览器的序列)比对。将人样品与从Repbase文库生成的所有卫星重复和LINE-1变体的定制参照文库比对(Pushkarev等,Nat Biotech27,847(2009))。另外，将所有样品进行DGE程序处理以进行转录物组分析。对于所有样品每106个基因组比对阅读标准化阅读。
对于小鼠主要卫星与转录物组的线性相关，将所有组织和细胞系依照主要卫星水平进行等级排序。然后，将所有注释的基因在所有组织间进行线性回归分析。然后，将基因依照Pearson线性回归系数排序，并通过Matlab绘图。
对一组具有最高线性相关(R>0.85)的297种基因的分析揭示了190种注释的细胞mRNA和转座元件的子集(图4A)。
在具有高线性相关的分析的所有转录物之中，自主反转录转座子Line-1在多种多样的组织类型的小鼠样品中具有最高的表达水平。小鼠胰腺肿瘤具有均值Line-1表达30,690tpm(范围183-120,002)，代表与Gapdh相比高平均值330倍的水平(表5)。
表5
Figure BDA00003316218400261
人胰腺肿瘤中LINE-1与卫星转录物的共表达也是显著的，每106个转录物具有平均值6,091(比GAPDH高127倍)。Tigger转座元件3和4的表达升高也与小鼠肿瘤中升高的卫星转录物相关联，但是在人肿瘤中没有看到。
在逆转录元件外，细胞mRNA的子集在多种多样的小鼠肿瘤间显示了与卫星重复(本文中称为“卫星关联基因(SCG)”)表达水平非常高度关联。使用DAVID程序将具有R>0.85的线性相关基因定位(Dennis,Jr.等,Genome Biol4,P3(2003);Huang等,Nat Protoc4,44(2009))。然后，用功能注释聚簇程序和UP_TISSUE数据库分析这些基因以分类这些定位基因之每种。生殖/干细胞基因包括睾丸、卵、滋养层、和神经干细胞中高度表达的基因。神经基因包括脑、脊髓、和特化感觉神经元，包括嗅觉、听觉、和视觉感觉中高度表达的基因。使用INTERPRO数据库分类HOX和锌指蛋白。
使用DAVID基因肿瘤学程序对190种注释的转录物的分析将这些转录物中的120种(63%)鉴定为与神经细胞命运有关以及50种(26%)与生殖/干细胞途径相关联(表6)。
表6
生殖/干细胞 神经 HOX区 锌指域
总计数 50 120 10 16
%定位(190) 26% 63% 5% 8%
另外，显著富集对于转录调节物，包括HOX相关物(9,5%)和锌指蛋白(16,8%)是明显的。此基因集不能匹配GSEA数据库中的任何已知的基因标签(signature)(Subramanian等,Proc Natl Acad Sci U S A102,15545(2005年10月25日))，但是肿瘤学分析指向神经内分泌表型。神经内分泌分化已经在许多上皮恶性，包括胰腺癌中描述过(Tezel等,Cancer89,2230(2000年10月1日))，并且在前列腺中得到最佳表征，其中它与更具有攻击性的疾病相关联(Cindolo等,Urol Int79,287(2007))。观察到在特征性神经内分泌标志物嗜铬粒蛋白A方面染色的癌细胞数目的显著增加，作为小鼠PDAC中较高卫星表达的函数(图4D)，这支持全局改变的ncRNA表达与特定细胞分化程序之间的联系。
SCG在小鼠肿瘤中更容易鉴定，因为主要卫星表达中的较大动力学范围在卫星和蛋白质编码基因之间实现表达水平的线性相关。然而，对190种注释的小鼠SGC的138种(其中与正常胰腺相比，54(39%)在人PDAC中显示大于2倍升高的表达(q值<0.1))鉴定出人直向同系物。总之，这些观察结果提示了如在小鼠遗传模型中，肿瘤关联的对卫星衍生的重复的去阻抑与Line-1和细胞mRNA子集的表达升高高度相关。
与切酶1和Piwi相关蛋白介导的ncRNA加工(A.A.Aravin,G.J.Hannon,J.Brennecke,Science318,761(2007年11月2日))组合的组蛋白修饰，包括H3K9三甲基化(P.A.Cloos,J.Christensen,K.Agger,K.Helin,Genes Dev22,1115(2008年5月1日))已经与维持对卫星重复的阻抑联系起来。为了搜索原发性肿瘤标本中卫星去阻抑的候选调节物，我们首先测量小鼠肿瘤中已知的表观遗传(epigenetic)调节物和RNA加工基因的定量DGE，作为升高的主要卫星表达的函数。
在小鼠和人PDAC样品中实施对脱甲基化酶和RNA加工酶的靶向基因表达分析。通过两份最近的出版物生成一列脱甲基化酶和RNA加工酶(Cloos等,Genes Dev22,1115(2008);Aravin等,Science318,761(2007))。使用具有KrasG12D和Tp53丧失的小鼠PDAC进行此分析。使用中值卫星表达(7%)将小鼠肿瘤分成高对低卫星水平。在高和低卫星肿瘤之间评估总共37种基因，并计算倍数变化。假设等方差使用2尾学生(student)t-检验比较群体均值的分析。然后，使用具有显著性水平p<0.05(总共7种基因)的基因来评估人PDAC对人正常胰腺组织。然后，将倍数变化和具有等方差的2尾学生t-检验应用于人PDAC对正常胰腺组织以寻找牵涉卫星表达的潜在基因候选物。
在测试的37种候选基因中，具有高于中值的卫星表达的小鼠胰腺肿瘤具有较高的脱甲基化酶Hspbap1、Jmjd1B、Jmjd4、Jarid1d、Jmjd3、和Fbxl10及RNA加工酶切酶1表达。这些之中，在人胰腺腺癌中也观察到HSPBAP1、FBXL10和切酶1的过表达(表7,p<0.05,学生t-检验)。
表7
与人PDAC相比小鼠PDAC肿瘤中鉴定的候选脱甲基化酶和RNA加工酶的列表。
表达高对低主要卫星的小鼠肿瘤中富集的脱甲基化酶和RNA加工酶(前两栏)以最高显著性(最低p-值)排序。对这些中的每种基因显示了人PDAC对正常组织倍数变化和t-检验p-值(最后两栏)。以粗体突出显示以显著性数值p<0.05在人和小鼠肿瘤两者中差异表达的基因。
尚未广泛表征HSPBAP1和FBXL10脱甲基化酶的催化活性，尽管前一种在其对家族性肾癌DIRC3-HSPBAP1融合的贡献方面是值得注意的(D.Bodmer,M.Schepens,M.J.Eleveld,E.F.Schoenmakers,A.Geurts van Kessel,Genes Chromosomes Cancer38,107(2003年10月))，而后一种似乎对H3K36me2/me1和H3K4me3具有某种特异性，对核糖体RNA表达和细胞增殖有影响(D.Frescas,D.Guardavaccaro,F.Bassermann,R.Koyama-Nasu,M.Pagano,Nature450,309(2007年11月8日))。虽然目前对多组分染色质修饰剂复合物的了解排除在具有单一转录物异常表达的原发性肿瘤中联系卫星和Line-1上调，具有一致改变的表达的相对少量基因可以指向促成卫星和Line-1去阻抑的表观遗传调节物的关键子集。
虽然常见转录沉默机制的失败可以促成LINE-1和卫星重复的阻抑，但是不太容易解释多样多样的一批细胞转录物，其过表达与这些重复序列相关联。值得注意的是，最近的发现已经表明LINE-1可以驱动特定细胞mRNA的表达，这经由其在它们的转录起始位点上游的插入(T.Kuwabara等,NatNeurosci12,1097(2009年9月))或者经由侧翼染色质标志物的变化(J.A.Bailey,L.Carrel,A.Chakravarti,E.E.Eichler,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America97,6634(2000年6月6日,2000);D.E.Montoya-Durango等,Mutat Res665,20(2009年6月1日))来进行。为了测试此类机制是否也可以构成本文鉴定的297种细胞mRNA的共表达的基础，我们在基因组中分析其转录起始位点和LINE-1插入之间的基因组距离。
测定转录起始位点组织和细胞系(UCSC基因组浏览器(D.Karolchik等,Nucleic Acids Res32,D493(2004年1月1日)))及小鼠基因组中具有长度1Kbp的阈值的所有Line-1元件的位置。计算具有每百万为5个转录物的最小表达水平的所有注释基因的转录起始位点上游的Line-1最近距离。然后，将基因依照Pearson线性回归系数等级排序。将基因在100s中二进制化，并通过Excel绘图。完成所有基因的随机化、接着二进制化、以及绘图作为对照。
聚焦于顶部线性相关基因(R>0.85)，将这些基因相对于转录起始位点上游的Line-1元件的距离以频率图绘图。在5Kbp计算富集，并使用Fisher精确检验来计算测试统计。
明显地，LINE-1基因组距离与具有主要卫星的基因的表达具有明显关联(图4B)，并且在转录起始位点的5Kbp内的LINE-1元件存在方面我们的前297种基因存在有高度显著地富集(富集2.69,p=8.18x10-7,Fisher精确检验,图4C)。
如此，细胞转录物附近内的LINE-1序列的激活可以促成其在原发性肿瘤中的过表达，其与LINE-1和卫星重复两者的表达明显相关联。这些细胞转录物的表达升高的后果仍然要限定。然而，与干样和神经源性命运关联的基因的高流行以及HOX和锌指转录调节物的频率提高如下的可能性，即这些中的至少一个子集可以促成肿瘤相关表型。
实施例5：LINE-1是CTC的一种特异性且灵敏性标志物
卫星水平与自主反转录转座子Line-1的表达(其最近已经显示为正常和肿瘤组织的基因组变异的一项主要原因)最强烈相关联(J.Berretta,A.Morillon,EMBO Rep10,973(2009年9月);A.Jacquier,Nat Rev Genet10,833(2009年12月);M.Guenatri,D.Bailly,C.Maison,G.Almouzni,J Cell Biol166,493(2004年8月16日))。与干细胞和神经组织相关联的细胞转录物的异常表达与卫星转录物水平也是高度相关联的，提示了经由去阻抑协调的表观遗传程序来改变细胞命运。
使用称为鲱骨式芯片(herringbone chip,HB)的CTC装置(其组合针对上皮细胞粘附分子(EpCAM)的特异性抗体介导的捕捉和微射流学的高通量优点)评估新诊断的转移性胰腺腺癌患者中循环肿瘤细胞(CTC)中的LINE-1表达(Stott等,Proc Natl Acad Sci U S A,107(43):18392–183972010)。从已经给予知情同意的癌症患者收集血液。将约3mL血液在CTC装置和对照装置上加工超过2小时。使用Qiagen RNeasy微量洗脱试剂盒从该装置提取RNA。然后，使用Superscript III第一链合成试剂盒(invitrogen)用随机引物将RNA进行cDNA合成。用RNA酶除去RNA，并使用人LINE-1Taqman测定法(AppliedBiosystems)对cDNA进行qRT-PCR。相对于CTC和对照装置中的GAPDH标准化LINE-1表达。然后，通过qPCR的标准Ct计算来计算CTC装置和对照装置之间的倍数差异。如图5中显示的，一致得多得多地且以与角蛋白(Krt)(其是典型的CTC标志物)相比更高的频率看到LINE-1表达(S.Maheswaran等,NEngl J Med.359,366(2008年7月24日);S.Nagrath等,Nature.450,1235(2007年12月20日))。HSATII阳性细胞的初步数据提示CTC检测灵敏度改善10倍。这表明LINE-1是一种用于检测CTC的特异性且灵敏性标志物。卫星提高检测胰腺CTC的灵敏性的能力不仅为癌症治疗监测提供更稳健的基于血液的诊断剂，而且使用CTC作为早期检测形态的能力显著改善。这提供了一种用于癌症的筛选工具，改善早期监测的机会，其可以改善提供医疗疗法的能力。
实施例6：使用分支DNA检测技术的HSATII RNA原位技术
如上文记录的，HSATII卫星在胰腺癌中过表达，并且使用分支DNA检测测定法
Figure BDA00003316218400301
ViewRNA测定法,Affymetrix)确认为在人新生物前胰腺损伤中过表达(图6A)。还使用此方法对乳腺癌样品测试HSATII，并且发现与正常的乳腺组织相比具有显著的表达。已经实现了将此技术延伸到HB-芯片上捕获的潜在的循环肿瘤细胞(图6B)，指示可以使用HSATII作为上皮癌的机遇血液的诊断剂。
实施例7：血清中的卫星水平
通过使用Ficoll血沉棕黄层(buffy coat)方法从8名转移性胰腺癌患者的血液提取血清。将血清RNA(细胞游离RNA)(其包含外来体)使用Trizol法纯化，然后使用Qiagen RNA微量洗脱柱试剂盒纯化。然后，将RNA进行Helicos DGE测序准备，并在HeliScope下一代测序仪上测序。表1中汇总了此数据的结果。如上文所描述的，HSATII对于癌症是特异性的，并且发现GSATII与正常组织相关联。因此，将HSATII与GSATII的比率作为鉴定癌症负荷的标志物以及潜在地早期检测标志物评估。在此情况中，一名具有稳定疾病的患者具有最低的HSATII/GSATII比率，如预测的(见表8)。这些结果提示了可以使用外周血血清中卫星(细胞游离RNA)的检测作为疾病对疗法响应的预测标志物。
表8.
Figure BDA00003316218400311
表8：总共8名转移性癌症患者及临床状态、总卫星、与基因组比对的每百万的转录物(tpm)中的HSATII、和GSATII和测序的细胞游离RNA中的HSATII/GSATII比率。
然而，在健康供体血清(细胞游离)RNA(n=4)的初步评估中，HSATII和GSATII没有与预期一样好地运行，尽管存在。然而，与“非癌症”状态相比，其它卫星如TAR1似乎是更好的“癌症”预测物，如表9中显示的。TAR1在两个群体间是显著不同的，p值=0.025。
表9：
Figure BDA00003316218400312
表9：总共8名转移性PDAC患者和4名健康供体中的平均总卫星、HSATII、GSATII、HSATII/GSATII、和TAR1(tpm)及测序的细胞游离RNA。使用学生t-检验来计算显著性。
其它实施方案
应当理解，虽然本发明已经结合其详细描述进行了描述，但是前述描述意图例示而不限制本发明的范围，其以所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点、和修改在所附权利要求书的范围内。

Claims (23)

1.一种检测受试者中癌症存在的体外方法，该方法包括：
测定来自所述受试者的样品中的LINE-1水平以获得测试数值；并
比较所述测试数值与参照数值，
其中与所述参照数值相比的测试数值指示所述受试者是否患有癌症。
2.权利要求1的方法，其中所述参照数值代表LINE-1的阈值水平，其中所述受试者中存在高于所述参照数值的LINE-1水平指示所述受试者患有癌症，且所述受试者中存在低于所述参照数值的LINE-1水平指示所述受试者不太可能患有癌症。
3.一种检测受试者中癌症存在的体外方法，该方法包括：
测定来自所述受试者的样品中卫星转录物的水平以获得测试数值；并
比较所述测试数值与参照数值，
其中与所述参照数值相比的测试数值指示所述受试者是否患有癌症。
4.权利要求2的方法，其中所述卫星转录物包含下列一种或多种：ALR、HSATII、GSATII、TAR1、和SST1。
5.权利要求4的方法，其中所述卫星转录物是ALR和/或HSATII，且高于所述参照水平的ALR和/或HSATII卫星转录物水平的存在指示所述受试者具有肿瘤。
6.权利要求4的方法，其中所述卫星转录物是GSATII、TAR1和/或SST1，且低于所述参照水平的GSATII、TAR1和/或SST1卫星转录物水平的存在指示所述受试者具有肿瘤。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述样品已知或怀疑包含肿瘤细胞。
8.权利要求7的方法，其中所述样品是已知或怀疑包含循环肿瘤细胞(CTC)的血液样品，或已知或怀疑包含肿瘤细胞的活组织检查样品。
9.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述样品包含血清中游离的RNA或血液中外来体内的RNA。
10.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述受试者是人。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述癌症是上皮起源的实体瘤。
12.一种评估受试者中癌症的治疗效力的体外方法，该方法包括：
测定来自所述受试者的第一样品中的LINE-1水平以获得第一数值；
对所述受试者施用癌症治疗；
测定在后来的时间时自所述受试者获得的随后样品中的LINE-1水平，以获得治疗数值；并
比较所述第一数值与所述治疗数值，
其中低于所述第一数值的治疗数值指示所述治疗是有效的。
13.一种评估受试者中癌症的治疗效力的体外方法，该方法包括：
测定来自所述受试者的第一样品中的卫星转录物水平以获得第一数值；
对所述受试者施用癌症治疗；
测定在后来的时间时自所述受试者获得的随后样品中的卫星转录物水平，以获得治疗数值；并
比较所述第一数值与所述治疗数值，
其中低于所述第一数值的治疗数值指示所述治疗是有效的。
14.权利要求12或13的方法，其中所述卫星转录物包含下列一种或多种：ALR、HSATII、GSATII、TAR1、和SST1。
15.权利要求12至14中任一项的方法，其中所述第一和第二样品已知或怀疑包含肿瘤细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述样品是已知或怀疑包含循环肿瘤细胞(CTC)的血液样品，或已知或怀疑包含肿瘤细胞的活组织检查样品。
17.权利要求12至16中任一项的方法，其中所述样品包含血清中游离的RNA或血液中外来体内的RNA。
18.权利要求12至17中任一项的方法，其中所述治疗包括施用手术干预、化学疗法、放射疗法、或其组合。
19.权利要求12至18中任一项的方法，其中所述受试者是人。
20.权利要求12至19中任一项的方法，其中所述癌症是上皮起源的实体瘤。
21.权利要求1、2、或12的方法，包括测量LINE-1转录物水平。
22.权利要求13至21中任一项的方法，其中使用分支DNA测定法测定所述水平。
23.权利要求11或20的方法，其中所述上皮起源的实体瘤是胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌。
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