CN104789585A - 一种在大肠杆菌中生产抗血管剂rt-x的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程及医药技术领域，具体涉及在大肠杆菌中生产可溶性、有生物活性的一种靶向性抗肿瘤血管抑制的融合蛋白RT-X的工艺和分离纯化方法，所述的融合蛋白RT-X包含RGD和Maspin蛋白。利用本发明表达和纯化的具有生物活性的抗血管剂RT-X能够特异性、剂量依赖性的抑制内皮细胞迁移，在鸡胚尿囊膜动物实验中具有抑制新生血管生成作用。本发明适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。

Description

一种在大肠杆菌中生产抗血管剂RT-X的方法及其应用

技术领域：

本发明涉及生物工程及医药技术领域，具体涉及在大肠杆菌中生产可溶性、有生物活性的一种靶向性抗肿瘤血管抑制的融合蛋白RT-X的工艺和分离纯化方法。

背景技术：

近年来随着肿瘤组织解剖学和分子生物学研究的深入，人们逐渐意识到血管生成对实体瘤生长和转移起到十分关键的作用。自1947年Algureza提出肿瘤诱导血管生成的概念，直到1971年，folkman明确提出肿瘤的生长和转移依赖于新生血管生成的理论，新生血管不仅为肿瘤生长提供所必须的营养和氧气，帮助排除代谢产物，还是其远处转移的途径(Folkman,J.What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent J.Natl.Cancer Inst.1990:82:4-6)。由此，阻断肿瘤诱导的血管生成成为抑制肿瘤生长和转移的潜在新策略。与传统的细胞毒性抗肿瘤疗法相比，血管生成抑制剂针对的是肿瘤血管相关细胞，与肿瘤细胞遗传不稳定的性质不同，血管细胞主要是血管内皮细胞不易变异，因此不容易产生耐药性。此外，由于在成人体内，除了少数生理病理过程如女性生理周期或伤口愈合等，很少发生血管新生的过程，靶向血管的抑制剂导致的毒性也很低。更重要的是，抑制血管生成能够阻断肿瘤转移的通道，而肿瘤的远处转移往往是其预后差的主要因素。这些优势极大的激发了人们研究靶向血管的抗肿瘤药物的热情，这方面的研究已经取得了一些进展，发现多种血管生成的抑制剂。这些抑制剂在临床上主要分为三大类：1、以替尼类为主的小分子酪氨酸激酶受体抑制剂；2、针对血管生成相关因子的抗体；3、内源性的血管生成抑制蛋白或者多肽。其中，小分子的抑制剂由于其特异性较低，容易引发较多的副作用，而抗体类的药物虽然特异性高，但由于其通过哺乳动物细胞表达，制备工艺复杂，致使价格昂贵。而内源性的血管抑制大分子不仅具有抗体药物特异性高的特点，并且可以通过基因工程的方法进行原核细胞 表达，实现大规模发酵，从而降低成本。此外，目前抗体类药物集中以血管生成因子及其受体为靶点开发一系列药物，局限性较大，而内源性的血管抑制剂的开发尚处于初步阶段，随着对血管调控机制研究的深入，越来越多的调控大分子被发现和开发为药物，如血管抑素(angiostatin)和内皮抑素(endostatin)等。因此，对于内源性血管抑制剂的开发具有广大的空间和良好的应用前景。

Maspin蛋白为非抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)，在哺乳动物上皮细胞中表达的二型肿瘤抑制蛋白(Zou et al.Maspin,a serpin with tumor-suppressing activity in human mammary epithelial cells.Science 1994.263,526-529；Berardi et al.Role of maspin in cancer.Clin Tran Med.2013.2(1),8)。目前针对Maspin抗癌作用的报道已有不少进展，数据显示maspin能够显著抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭并且在小鼠模型中显示抑制肿瘤转移的活性。新的研究发现maspin的具有血管生成调控功能，尤其是内皮细胞对该蛋白异常敏感(Li et al.Targeted expression of maspin in tumor vasculatures induces endothelial cell apoptosis.Oncogene.2005.24(12),2008-2019)，因此，maspin有希望开发为新的内源性抗血管生成药物(Bodestine et al.Maspin:molecular mechanisms and therapeutic implications.Cancer Meta Rev.2012.31(3),529-551)。但有个问题不容忽视：目前对于maspin功能的研究多基于细胞的maspin基因转染模型或制备包含重组maspin蛋白的细胞栓模型进行体内外活性评价，这些模型的特点是能够使的病灶处处于高浓度的maspin蛋白环境中，而由于maspin蛋白作用靶点不明确，对血管的专一性和选择性还不够好，因此系统给于重组maspin蛋白时，需要极大的提高剂量才能达到理想的体内抗癌活性，势必增加该类药物毒副作用发生的可能性，造成该类药物质量控制难度加大、生产规模和生产成本增加、药物价格居高。

因此，一个好的抗血管生产药物应该对新生血管的标记分子具有选择性，这样才能在有新生血管的病灶处富集，从整体上提高药物对血管生成的抑制作用，达到低剂量下就能高效的抑制血管生成的效果。

其中对肿瘤血管生成相关的重要肿瘤血管内皮标记之一是整合素家族的部分成员。

整合素是由α亚基和β亚基组成的跨膜蛋白异二聚体，研究表明，肿 瘤细胞表明的整合素是肿瘤转移发生的关键所在，它们通过连接胞内细胞骨架蛋白和胞外基质分子的相互作用调控细胞的迁移、增殖和分化(Schoenwaelder SM.,et al.Bidirectional signalling between the cytoskeleton and integrins.Curr Opin Cell Biol.1999.11,274-286)。肿瘤细胞表面的整合素和正常细胞表达类型不同，尤其是整合素α5β1、αvβ5、αvβ3等表达上调，且与血管新生及细胞迁移有关。目前正在研究开发的αvβ3抗体有Vitaxin(LM609)，临床上用于抗血管生产治疗(Gutheil，JC.,et al.Targeted antiangiogenic therapy for cancer using Vitaxin:a humanized monoclonal antibody to the integrin alphavbeta3.Clin Cancer Res.2000.6,3056–3061)，但是资料报道效果并不令人满意(Posey,JA.,et al.A pilot trial of vitaxin,a humanized anti-vitronectin receptor(anti alphavbeta3)antibody in patients with metastatic cancer.Cancer Biother Radiopharmac.2001.16,125–132)。20多种整合素中大多数都识别RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的细胞外基质配体(Dennis MS.,et al.Platelet glycoprotein IIb-IIIa protein antagonists from snake venoms:evidence for a family of platelet-aggregation inhibitors.Proc Natl Acad Sci.1990.87,2471-2475)，RGD具有拮抗整合素作用，能减少细胞表面黏附分子表达，诱导细胞凋亡，但本身半衰期短，在体内会被快速清除，但RGD序列可以作为一种载体，与其他活性分子偶联从而达到靶向肿瘤血管内皮的效果，在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。

目前尚无文献报道对Maspin蛋白的序列进行改造以提高其靶向性和体内抗肿瘤活性，更无文献报道RGD和Maspin蛋白协同作用抑制血管生成。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种新的融合蛋白RT-X及其编码基因，该融合蛋白RT-X是包含RGD和Maspin蛋白。

本发明的另一目的在于提供上述融合蛋白RT-X的构建表达方法；特别是在大肠杆菌中生产可溶性的、有生物活性的抗血管生成抑制剂RT-X的工艺和分离纯化方法。

本发明为提高Maspin蛋白对血管的专一性和选择性，也为提高重组Maspin蛋白的体内抗癌活性，构建了一种新的融合蛋白，本发明是将抑制血管生成的Maspin的核苷酸序列5’端或氨基酸序列的N端通过一段铰链区 加上含有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的碱基序列或多肽序列，构建了一种对整合素具有结合作用和亲和性的血管生成抑制剂。

本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，也即一种靶向性抗肿瘤血管抑制的融合蛋白，所述的融合蛋白的氨基酸序列是Maspin蛋白的氨基酸序列的N端通过铰链区与含有RGD的多肽序列连接而成。

所述的Maspin蛋白，蛋白序列的GENBANK号AY18957.1，核苷酸序列的GENBANK号为AY893387.1。

所述的铰链区，为多聚组氨酸序列，(His)_m(m＝2,3,4……)，优选为6His，其取代了传统铰链多肽，更有利于后期产物的制备和纯化。

所述的RGD，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，(Arg-Gly-Asp)。

所述的含有RGD的多肽序列，即在RGD序列的前和/或后加上若干个氨基酸，其特征氨基酸序列为XRGDX，X可以无或被任意多个天然或非天然存在的氨基酸取代，可形成无或多个二硫键，较优的，X为Met，Met-Ala-Cys-Asp-Cys,Ala-Cys-Asp-Cys，Met-Cys-Phe-Cys，Cys-Phe-Cys等。(可以前面加后面不加，或前面不加后面加，或全部不加)

所述的融合蛋白的氨基酸序列，较优的，如SEQ ID NO:1所示。

XRGDXH_mDALQLANSAFAVDLFKQLCEKEPLGNVLFSPICLSTSLSLAQVGAKGDTANEIGQVLHFENVKDVPFGFQTVTSDVNKLSSFYSLKLIKRLYVDKSLNLSTEFISSTKRPYAKELETVDFKDKLEETKGQINNSIKDLTDGHFENILADNSVNDQTKILVVNAAYFVGKWMKKFPESETKECPFRNKTDTKPVQMMNMEATFCMGNIDSINCKIIELPFQNKHLSMFILLPKDVEDESTGLEKIEKQLNSESLSQWTNPSTMANAKVKLSIPKFKVEKMIDPKACLENLGLKHIFSEDTSDFSGMSETKGVALSNVIHKVCLEITEDGGDSIEVPGARILQHKDELNADHPFIYIIRHNKTRNIIFFGKFCSP(SEQ ID NO:1) 

上述氨基酸序列中，在的RGD序列前后的X可以无或被任意多个天然或非天然存在的氨基酸取代，H_m为多聚组氨酸铰链多肽(m＝2,3,4……)。Maspin结构的第187个氨基酸V(加方框部分)可以为Val、Leu等中性氨基酸取代。

在本发明的一个优选实施例中，本发明提供了一种靶向性抗肿瘤血管抑制的融合蛋白(RT-X)，其中X为甲硫氨酸，m＝6，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

MRGDHHHHHHDALQLANSAFAVDLFKQLCEKEPLGNVLFSPICLSTSLS  LAQVGAKGDTANEIGQVLHFENVKDVPFGFQTVTSDVNKLSSFYSLKLIKRLYVDKSLNLSTEFISSTKRPYAKELETVDFKDKLEETKGQINNSIKDLTDGHFENILADNSVNDQTKILVVNAAYFVGKWMKKFPESETKECPFRVNKTDTKPVQMMNMEATFCMGNIDSINCKIIELPFQNKHLSMFILLPKDVEDESTGLEKIEKQLNSESLSQWTNPSTMANAKVKLSIPKFKVEKMIDPKACLENLGLKHIFSEDTSDFSGMSETKGVALSNVIHKVCLEITEDGGDSIEVPGARILQHKDELNADHPFIYIIRHNKTRNIIFFGKFCSP(SEQ ID NO:2) 

进一步地，本发明提供了上述融合蛋白的编码基因。

所述的编码基因，其核苷酸序列是Maspin的核苷酸序列5’端通过一段铰链区加上含有RGD的碱基序列。 

所述的铰链区，为(cac)_m(m＝2,3,4……)，优选为(cac cac cac cac cac cac)。

所述的融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列，较优的，如SEQ ID NO:3所示。

其中Maspin结构基因的第559个核苷酸n(加框位置)可以被其他核苷酸替代，RGD结构域的核苷酸序列即cgtggtgat前后的核苷酸n(下划线位置)可以无或被其他核苷酸替代，可以表示为x _n (n＝0,3,6,9……)，m＝1,2,3……。

在本发明的一个优选实施例中，本发明提供了一种靶向性抗肿瘤血管抑制的融合蛋白(RT-X)的编码基因，其中n＝0，m＝6，由RGD序列基因(加框部分)和6个多聚组氨酸铰链序列基因(下划线部分)以及Maspin 全长蛋白序列基因构成，如SEQ ID NO:4所示。

ATG CACCACCACCACCACCACGATGCCCTGCAACTAGCAAATTCGGCTTTTGCCGTTGATCTGTTCAAACAACTATGTGAAAAGGAGCCACTGGGCAATGTCCTCTTCTCTCCAATCTGTCTCTCCACCTCTCTGTCACTTGCTCAAGTGGGTGCTAAAGGTGACACTGCAAATGAAATTGGACAGGTTCTTCATTTTGAAAATGTCAAAGATGTACCCTTTGGATTTCAAACAGTAACATCGGATGTAAACAAACTTAGTTCCTTTTACTCACTGAAACTAATCAAGCGGCTCTACGTAGACAAATCTCTGAATCTTTCTACAGAGTTCATCAGCTCTACGAAGAGACCCTATGCAAAGGAATTGGAAACTGTTGACTTCAAAGATAAATTGGAAGAAACGAAAGGTCAGATCAACAACTCAATTAAGGATCTCACAGATGGCCACTTTGAGAACATTTTAGCTGACAACAGTGTGAACGACCAGACCAAAATCCTTGTGGTTAATGCTGCCTACTTTGTTGGCAAGTGGATGAAGAAATTTCCTGAATCAGAAACAAAAGAATGTCCTTTCAGAGTCAACAAGACAGACACCAAACCAGTGCAGATGATGAACATGGAGGCCACGTTCTGTATGGGAAACATTGACAGTATCAATTGTAAGATCATAGAGCTTCCTTTTCAAAATAAGCATCTCAGCATGTTCATCCTACTACCCAAGGATGTGGAGGATGAGTCCACAGGCTTGGAGAAGATTGAAAAACAACTCAACTCAGAGTCACTGTCACAGTGGACTAATCCCAGCACCATGGCCAATGCCAAGGTCAAACTCTCCATTCCAAAATTTAAGGTGGAAAAGATGATTGATCCCAAGGCTTGTCTGGAAAATCTAGGGCTGAAACATATCTTCAGTGAAGACACATCTGATTTCTCTGGAATGTCAGAGACCAAGGGAGTGGCCCTATCAAATGTTATCCACAAAGTGTGCTTAGAAATAACTGAAGATGGTGGGGATTCCATAGAGGTGCCAGGAGCACGGATCCTGCAGCACAAGGATGAATTGAATGCTGACCATCCCTTTATTTACATCATCAGGCACAACAAAACTCGAAACATCATTTTCTTTGGCAAATTCTGTTCTCCTTAG(SEQ ID NO:4) 

进一步地，本发明提供了上述融合蛋白的表达载体、重组菌。

所述的表达载体、重组菌，为一种含有如SEQ ID NO:3或4所示核苷酸序列的重组载体、重组菌。

所述的表达载体，可采用原核表达载体，也可采用真核表达载体构建，较优的为原核表达质粒pET22b。

本发明的重组菌为大肠杆菌DH5α，TOP10，BL21等，较优的为宿主菌BL21(DE3)。

本发明的第二方面，提供了上述融合蛋白的构建表达方法。

具体技术方案如下：

a)从人的肝脏组织提取总RNA，进行反转录，RT-PCR，克隆maspin基因，以此序列为模板，设计上下游引物，在引物序列的5’端和3’端加上合适的克隆酶切位点，PCR扩增，获得RT-X基因，将基因克隆于载体中，筛选阳性克隆，核苷酸序列分析鉴定。

b)RT-X基因与原核表达载体重组，形成表达质粒，转化大肠杆菌，IPTG 诱导表达RT-X，表达产物以包涵体形式存在。

c)进行包涵体蛋白分离、溶解，并进行Ni⁺亲和层析分离纯化RT-X蛋白产物，收集穿过液，透析，浓缩，冻存。

为获得可溶性的、有生物活性的抗血管生成抑制剂RT-X，在本发明的一个优选实施例中，本发明提供了一种含有如SEQ ID NO:3或4所示核苷酸序列的重组载体、重组菌；所述的表达载体为原核表达质粒pET22b；所述的重组菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

进一步地，本发明提供了一种在大肠杆菌中生产本发明的融合蛋白RT-X的方法，所述的方法包括如下步骤：

将人maspin基因克隆在大肠杆菌表达质粒中，转化大肠杆菌，将具有靶向肿瘤血管活性的RGD通过一段多聚组氨酸链与人maspin蛋白相连，通过低温和调整组氨酸的个数来达到促进可溶性RT-X表达产量的目的。

A、构建pET22b-RT-X表达载体； 

B、将步骤A获得的原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达，通过筛选和表达优化，获得RT-X高效表达的大肠杆菌细胞株以及最佳工艺，并进行纯化分析。

所述步骤A具体如下： 

A、构建pET22b-RT-X表达载体

设计并合成引物如下：

引物1：

5’TTTCATATG CACCACCACCACCACCACGATGCCCT GCAACTAG-3’(SEQ ID NO:6)

引物2：

5’CCCAAGCTTTTATTAAGGAGAACAGAATTTGC3’(SEQ ID NO:7)

其中，引物1编码了NdeI位点、含有Arg-Gly-Asp序列的基因(加框部分)、多聚His序列(下划线部分)和Maspin的部分序列的基因，引物2编码HindIII位点和Maspin的部分序列的基因。考虑到RT-X的可溶性，最佳融合序列片段为6个组氨酸与Arg-Gly-Asp序列串联。

本发明所利用的诱导型表达载体pET-22b(+)全长5493bp，含有T7启动子和质粒复制起点(ori)。

其中原核表达载体的构建方法为常规方法，可参见工具书(著[美]J.莎姆 布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》，科学出版社)。

较佳地，首先从人乳腺细胞中提取总DNA，然后通过PCR反应调取目的片段，再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的pET22b载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落先进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的pET22b-RT-X。将载体从克隆菌中提取出后转化表达菌体BL21(DE3)，对长出的单克隆菌落进行诱导表达RT-X，通过电泳选取高效表达可溶性RT-X的菌株(BL21-RT-X)。BL21-RT-X菌株在25℃-30℃低温以及0.3-0.6mM的IPTG诱导下，RT-X绝大部分在菌体中以可溶性形式存在。超声破碎后，通过一步亲和层析可以得到纯化的RT-X。

所述步骤B具体实施如下：

1.血管抑制剂RT-X的表达：将RT-X表达质粒pET22b转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Novagen公司)。0.3-0.6mM的IPTG诱导表达RT-X表达。表达菌体超声破碎细胞，8000rpm离心10min收集菌体。

2.RT-X的分离纯化：1L表达菌体用50mL超声液(50mMTris-Cl，pH7.5，20mM咪唑)悬浮，冰浴超声20min(5s超声，5s间隔)。超声后的混合物12000rpm，4℃离心30min。将表达上清直接进行Ni-NTA(上海生物工程公司)层析。柱床平衡洗涤用50mMNaCl，50mMTris-Cl，pH7.5，50mM咪唑，用50mMNaCl，50mMTris-Cl，pH7.5，150mM咪唑洗脱，将洗脱液透析后超滤浓缩。

3.RT-X表达分析：收获细胞并超声破菌，离心分离上清和沉淀，15％SDS-PAGE电泳分析，将考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE扫描(UVP White/Ultraviolet transilluminator)，分析结果并根据定量的分子量标准计算RT-X的产率(使用UVP公司的软件Grab-it 2.5和Gelwork)。用western blot分析确定RT-X纯化产物，实验使用PVDF western blotting膜(Roche)，鼠多克隆抗人maspin抗体(Santa Cruz)。

本发明在低温25℃-30℃下，RT-X能够大量的在大肠杆菌中可溶表达。例如，在25℃，通过条件优化，RT-X可溶表达的产率约为40mg/L，每升培养液至少可纯化获得23mg的RT-X。

可溶性的RT-X经过大肠杆菌破碎，透析，亲和层析得以纯化。

纯化的RT-X能够特异性、剂量依赖性的抑制内皮细胞迁移，在鸡胚尿 囊膜(CAM)上，具有抑制新生血管生成的作用。

本发明的第三方面，提供了上述融合蛋白、编码基因、表达载体、重组菌在制备血管生成抑制剂和/或抗肿瘤药物中的应用。

本发明的第四方面，提供一种与整合素有亲和性或结合能力的高效血管生成抑制剂或抗肿瘤药物。

本发明所述的肿瘤，为黑色素瘤、乳腺癌等。

本发明提供的一种靶向肿瘤血管的血管生成抑制剂，本发明以肿瘤血管内皮细胞表达的标记分子整合素为治疗靶点，利用RGD多肽作为靶向分子，提高Maspin的体内抗癌活性，为一种高效的血管生成抑制剂或抗肿瘤药物

针对传统纯化标签如GST等的加入方式，可能导致Maspin结构改变或者封闭RGD多肽使之不能充分暴露于分子表面达到靶向的作用，也导致其后期切除纯化标签带来的制备工艺复杂化，成本增加的缺陷；本发明将具有极低免疫原性的多聚组氨酸设计为铰链区，保留了纯化标签的特点利于后期产物制备的简化，同时可以充分暴露RGD多肽，不影响其靶向作用，且由于铰链区的加入使得两个功能域不会相互干扰，保留了Maspin分子结构完整性。

本发明提供的一种靶向肿瘤血管的血管生成抑制剂进行内皮细胞迁移实验，结果发现本发明重组RT-X能够特异性抑制内皮细胞HUVEC细胞的迁移，抑制效果显著高于改造前的对照Maspin，本发明显著提高了改造前的Maspin蛋白抗血管作用的生物活性，在同等剂量下(100nM)，与对照相比，RT-X抑制细胞迁移率为71％，而Maspin的抑制效率为31％，RGD多肽在此剂量下未显示抑制活性，当浓度为5μM时，抑制率为45％。

本发明提供的一种靶向肿瘤血管的血管生成抑制剂进行鸡胚尿囊膜(CAM)分析，结果发现100nM，200nM和400nM的RT-X都能够显著抑制新生血管和血管生成，RT-X具有潜在的抑制血管生成作用。与maspin及RGD多肽相比具有显著差异。

本发明提供的一种靶向肿瘤血管的血管生成抑制剂进行小鼠体内抗肿瘤实验，结果发现在抗黑色素瘤实验中，在第9天时，RT-X的肿瘤抑制率为62％，而没有Arg-Gly-Asp序列的Maspin的肿瘤抑制率仅为25％。RGD 多肽组的肿瘤生长与阴性对照组未有显著性差异。在抗乳腺癌实验中，在第9天时，RT-X的肿瘤抑制率为70％，而没有Arg-Gly-Asp序列的Maspin的肿瘤抑制率仅为33％。RGD多肽抑制率为23％。以上实验均说明，本发明的血管生成抑制剂RT-X能够显著抑制小鼠体内的肿瘤生长。

本发明与现有技术相比其有益效果为：

本发明所述血管生成抑制剂在体内外实验中都能够大幅度改善和提高现有血管生成抑制剂内皮细胞生长和抗肿瘤效果，副作用小，并且用量小，降低了成本，说明本发明设计的高效血管生成抑制剂科学、合理，可行有效，能作为制备治疗人类新生血管生成有关疾病的药物及实体肿瘤在内的治疗药物。

本发明采用诱导型表达载体，可降低大规模培养时的成本，以利于规模化生产。本发明所述血管生成抑制剂可采用原核表达系统进行表达和纯化，根据需要也可采用酵母表达系统或哺乳动物细胞表达系统。

特别是，本发明提供了一种可行的、方便的生产可溶性的、具有生物活性的重组RT-X的方法，建立了与之相应的简便、经济的纯化工艺。本发明的工艺优势在于：

(1)本发明建立了一个简便、价廉、高效地在大肠杆菌体系中提高可溶性RT-X产量的方法。利用融合一段多肽序列和低温联合使用的方法，可以很容易地将原本几乎都以包涵体形式表达的重组人maspin转变为几乎全部可溶的RT-X。

(2)目前，常用的人maspin的分离纯化主要是通过加入GST分子标签进行亲和层析，鉴于GST的体内免疫原性较高，必须再通过酶切去除，后通过凝胶过滤层析的方法得到纯化蛋白。本发明中的RT-X通过加入一段具有极低免疫原性多聚组氨酸多肽可直接通过镍亲和层析一步得到纯化蛋白，避免了包涵体蛋白纯化需经过破碎、溶解、复性和层析纯化等多个步骤。方法简便、价廉，具有很好的适应性，推广方便，适于生产。

附图说明

图1为纯化的RT-X的SDS-PAGE分析结果(A)和Western Blot分析结果(B)；

图2为血管抑制剂RT-X抑制内皮细胞迁移；其中A为显微镜观察视野图(400×)，B为细胞迁移抑制率柱状图；

图3为血管抑制剂RT-X抑制CAM的血管新生；其中A为尿囊膜组织图(直接用相机拍摄)，B为血管新生抑制率柱状图；

图4为RT-X显著抑制黑色素瘤和乳腺癌生长；其中A为抗黑色素瘤实验结果，B为抗乳腺癌实验结果；

图5为pET-22b-RT-X重组质粒构建图。

具体实施方式：

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

原核表达质粒pET22b和宿主菌BL21(DE3)购自Novagen公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶、pfu DNA聚合酶、dNTP均购自NEB公司。引物的合成和核苷酸序列测序均由上海生物工程公司完成。纯化用的层析柱及其填料购自Promoga公司。诱导用IPTG购自Sigma公司。

实施例1 血管抑制剂RT-X基因的克隆、表达、分离纯化

Maspin基因参照Maspin的cDNA序列(Genbank序列号：AY893387.1)，基因序列如SEQ ID NO:5所示；

ATGGATGCCCTGCAACTAGCAAATTCGGCTTTTGCCGTTGATCTGTTCAAACAACTATGTGAAAAGGAGCCACTGGGCAATGTCCTCTTCTCTCCAATCTGTCTCTCCACCTCTCTGTCACTTGCTCAAGTGGGTGCTAAAGGTGACACTGCAAATGAAATTGGACAGGTTCTTCATTTTGAAAATGTCAAAGATGTACCCTTTGGATTTCAAACAGTAACATCGGATGTAAACAAACTTAGTTCCTTTTACTCACTGAAACTAATCAAGCGGCTCTACGTAGACAAATCTCTGAATCTTTCTACAGAGTTCATCAGCTCTACGAAGAGACCCTATGCAAAGGAATTGGAAACTGTTGACTTCAAAGATAAATTGGAAGAAACGAAAGGTCAGATCAACAACTCAATTAAGGATCTCACAGATGGCCACTTTGAGAACATTTTAGCTGACAACAGTGTGAACGACCAGACCAAAATCCTTGTGGTTAATGCTGCCTACTTTGTTGGCAAGTGGATGAAGAAATTTCCTGAATCAGAAACAAAAGAATGTCCTTTCAGAGTCAACAAGACAGACACCAAACCAGTGCAGATGATGAACATGGAGGCCACGTTCTGTATGGGAAACATTGACAGTATCAATTGTAAGATCATAGAGCTTCCTTTTCAAAATAAGCATCTCAGCATGTTCATCCTACTACCCAAGGATGTGGAGGATGAGTCCACAGGCTTGGAGAAGATTGAAAAACAACTCAACTCAGAGTCACTGTCACAGTGGACTAATCC CAGCACCATGGCCAATGCCAAGGTCAAACTCTCCATTCCAAAATTTAAGGTGGAAAAGATGATTGATCCCAAGGCTTGTCTGGAAAATCTAGGGCTGAAACATATCTTCAGTGAAGACACATCTGATTTCTCTGGAATGTCAGAGACCAAGGGAGTGGCCCTATCAAATGTTATCCACAAAGTGTGCTTAGAAATAACTGAAGATGGTGGGGATTCCATAGAGGTGCCAGGAGCACGGATCCTGCAGCACAAGGATGAATTGAATGCTGACCATCCCTTTATTTACATCATCAGGCACAACAAAACTCGAAACATCATTTTCTTTGGCAAATTCTGTTCTCCTTAG(SEQ ID NO:5) 

以Maspin基因为模板：合成上游引物和下游引物，其中上游引物加入了含有Arg-Gly-Asp序列以及多聚His序列和NdeI酶切位点，下游引物含有HindIII酶切位点。进行PCR扩增，扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳回收、纯化后，进行NdeI和HindIII酶切，克隆到原核表达载体pET22b(Novagen)，PCR筛选阳性克隆，核苷酸序列分析证实序列发生了设计的突变(如SEQ ID NO:4所示)。

pET22b-RT-X的构建如图5所示。

设计并合成引物如下：

引物1：

5’TTTCATATG CACCACCACCACCACCACGATGCCCTGCAACTAG-3’(SEQ ID NO:6)

引物2：5’CCCAAGCTTTTATTAAGGAGAACAGAATTTGC3’(SEQ ID NO:7)

其中，引物1编码了NdeI位点、含有Arg-Gly-Asp序列的基因(加框部分)、多聚His序列(下划线部分)和Maspin的部分序列的基因，引物2编码HindIII位点和Maspin的部分序列的基因。

本发明所利用的诱导型表达载体pET-22b(+)全长5493bp，含有T7启动子和质粒复制起点(ori)。

其中，引物1编码了NdeI位点、含有Arg-Gly-Asp序列的基因(加框部分)、多聚His序列(下划线部分)和Maspin的部分序列的基因，引物2编码HindIII位点和Maspin的部分序列的基因。考虑到RT-X的可溶性，最佳融合序列片段为6个组氨酸与Arg-Gly-Asp序列串联。

其中原核表达载体的构建方法为常规方法，可参见工具书(著[美]J.莎姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》，科学出版社)。

较佳地，首先从人乳腺细胞中提取总DNA，然后通过PCR反应调取目的片段，再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的pET22b载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落先进行PCR 鉴定，PCR鉴定阳性菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的pET22b-RT-X。

将载体pET22b-RT-X从克隆菌中提取出后转化表达菌体BL21(DE3)，对长出的单克隆菌落进行诱导表达RT-X，通过电泳选取高效表达可溶性RT-X的菌株(BL21-RT-X)。

BL21-RT-X菌株在25℃-30℃低温以及0.3-0.6mM的IPTG诱导下，RT-X绝大部分在菌体中以可溶性形式存在。超声破碎后，通过一步亲和层析可以得到纯化的RT-X。

RT-X的表达、分离纯化步骤如下：

血管抑制剂RT-X的表达：将RT-X表达质粒pET22b转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Novagen公司)。1mM的IPTG诱导表达RT-X表达。表达菌体超声破碎细胞，8000rpm离心10min收集菌体。

RT-X的分离纯化：1L表达菌体用50mL超声液(50mMTris-Cl，pH7.5，20mM咪唑)悬浮，冰浴超声20min(5s超声，5s间隔)。超声后的混合物12000rpm，4℃离心30min。将表达上清直接进行Ni-NTA(上海生物工程公司)层析。柱床平衡洗涤用50mMNaCl，50mMTris-Cl，pH7.5，50mM咪唑，用50mMNaCl，50mMTris-Cl，pH7.5，150mM咪唑洗脱，将洗脱液透析后超滤浓缩。

RT-X表达分析：收获细胞并超声破菌，离心分离上清和沉淀，15％SDS-PAGE电泳分析，将考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE扫描(UVP White/Ultraviolet transilluminator)，分析结果并根据定量的分子量标准计算RT-X的产率(使用UVP公司的软件Grab-it 2.5和Gelwork)。用western blot分析确定RT-X纯化产物，实验使用PVDF western blotting膜(Roche)，鼠多克隆抗人maspin抗体(Santa Cruz)。

纯化的RT-X的SDS-PAGE分析结果，如图1A所示，Western Blot分析结果，如图1B所示。

另外，为了比较本发明所设计的血管生成抑制剂RT-X的实际效果，用本实施例同样的方法同时克隆了Maspin基因。

实施例2 融合蛋白RT-X生物学活性分析

1.内皮细胞迁移分析

基质胶准备：将冻存于-80℃冰箱的matrigel放置4℃过夜，变成液态；取150μL Matrigel，包被Transwell上室(冰上操作)，放入37℃培养箱中，孵育1h；消化HUVEC细胞，无血清培养基洗3次，计数，配成2×10⁶细胞悬液；用无血清培养基洗包被Matrigel的Transwell一次；每孔加入100μL细胞悬液；Transwell下腔室中加入600μL含有20％FBS条件培养基；37℃培养箱中，孵育48h；取出用PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，中性甲醛固定10min；加入结晶紫(0.1％)染色10min，室温，PBS洗2遍，显微镜下观察拍照。计数Transwell膜上中下左右五个视野中阳性染色细胞数，比较药物处理对细胞迁移的影响。

结果如图2所示：重组RT-X能够特异性抑制内皮细胞HUVEC细胞的迁移，抑制效果显著高于改造前的对照Maspin。以上实验说明本发明所设计的高效血管生成抑制剂确实显著提高了改造前的Maspin蛋白抗血管作用的生物活性。在同等剂量下(100nM)，与对照相比，RT-X抑制细胞迁移率为71％，而Maspin的抑制效率为31％，RGD多肽在此剂量下未显示抑制活性，当浓度为5μM时，抑制率为45％。

2.鸡胚尿囊膜(CAM)分析

为了检测体内抗血管生成活性，进行CAM分析，所有实验在超净台中进行无菌操作，将消毒的6天龄鸡胚在37℃、90％湿度下进行培养。两天后，每个鸡蛋顶端打孔，将试剂滴加到whatman滤纸，放入CAMs上血管密集区，培养48h后，观察鸡胚和CAMs并拍照。

如图3所示，为了评价RT-X体内抗血管生成活性，采用了不同剂量RT-X来进行CAM实验，其中100nM，200nM和400nM的RT-X都能够显著抑制新生血管和血管生成，400nM下能导致血管完全抑制而导致鸡胚死亡。RT-X具有潜在的抑制血管生成作用。Maspin的剂量达到1μM时方显示抑制血管生成活性，而RGD多肽在为1μM时未能显示抑制活性。

3.动物体内抗黑色素瘤实验

将培养的B16F10黑色素瘤细胞用0.05％胰蛋白酶消化，1000rpm离心5min，重悬于PBS，在C57BL/6(6-8周)小鼠体侧皮下接种5×10⁵细胞0.1mL。当肿瘤平均体积达到200mm³-300mm³，随机将小鼠分组，每组7只，其中一组接受RT-X治疗，剂量为10mg/kg/d，一组用Maspin治疗，剂量为10mg/kg/d，一组用RGD多肽治疗，剂量为10mg/kg/d，对照注射PBS。 治疗采用在接种肿瘤对侧皮下注射方法。每天用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积，采用公式：肿瘤体积＝长×宽²×0.52，治疗效果用给定时间内的肿瘤抑制率表示：(1-T/C)×100％，T＝治疗组肿瘤体积，C＝对照组肿瘤体积。

如图4A所示，结果表明，在第9天时，RT-X的肿瘤抑制率为62％，而没有Arg-Gly-Asp序列的Maspin的肿瘤抑制率仅为25％。RGD多肽组的肿瘤生长与阴性对照组未有显著性差异。以上实验本发明所设计的高效血管生成抑制剂能够显著抑制小鼠体内的肿瘤生长。

4.动物体内抗乳腺癌实验

将培养的EMT6乳腺癌细胞用0.05％胰蛋白酶消化，1000rpm离心5min，重悬于PBS，在Balb/c(6-8周)小鼠体侧皮下接种1×10⁶细胞0.1mL。当肿瘤平均体积达到200mm³-300mm³，随机将小鼠分组，每组7只，其中一组接受RT-X治疗，剂量为10mg/kg/d，一组用Maspin治疗，剂量为10mg/kg/d，一组用RGD多肽治疗，剂量为10mg/kg/d，对照注射PBS。治疗采用在接种肿瘤对侧皮下注射方法。每天用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积，采用公式：肿瘤体积＝长×宽2×0.52，治疗效果用给定时间内的肿瘤抑制率表示：(1-T/C)×100％，T＝治疗组肿瘤体积，C＝对照组肿瘤体积。

如图4B所示，结果表明，在第9天时，RT-X的肿瘤抑制率为70％，而没有Arg-Gly-Asp序列的Maspin的肿瘤抑制率仅为33％。RGD多肽抑制率为23％。以上实验本发明所设计的高效血管生成抑制剂能够显著抑制小鼠体内的肿瘤生长。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (8)

1.一种含有如SEQ ID NO:3或4所示核苷酸序列的重组载体，所述的表达载体为原核表达质粒pET22b。

2.一种含有如SEQ ID NO:3或4所示核苷酸序列的重组菌；所述的重组菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

3.一种在大肠杆菌中生产融合蛋白RT-X的方法，其特征在于，所述的融合蛋白RT-X的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的方法包括如下步骤：

A、构建含有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的重组载体，所述的表达载体为原核表达质粒pET22b；

B、将步骤A获得的重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，表达的融合蛋白RT-X进一步分离纯化。

4.根据权利要求3所述的一种在大肠杆菌中生产融合蛋白RT-X的方法，其特征在于，所述步骤A中，设计并合成引物如下：

引物1如SEQ ID NO:6所示；

引物2如SEQ ID NO:7所示。

5.根据权利要求3或4所述的一种在大肠杆菌中生产融合蛋白RT-X的方法，其特征在于，所述步骤B为：

将构建成功的重组载体从克隆菌中提取出后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，对长出的单克隆菌落进行诱导表达融合蛋白RT-X，通过电泳选取高效表达可溶性RT-X的菌株；将该菌株在25℃-30℃低温和0.3-0.6mM的IPTG诱导下表达；超声破碎后，通过一步亲和层析可以得到纯化的融合蛋白RT-X。

6.根据权利要求3或4所述的一种在大肠杆菌中生产融合蛋白RT-X的方法，其特征在于，所述步骤B中，0.3-0.6mM的IPTG诱导表达；表达菌体超声破碎细胞，8000rpm离心10min收集菌体。

7.根据权利要求3或4所述的一种在大肠杆菌中生产融合蛋白RT-X的方法，其特征在于，所述步骤B中，RT-X的分离纯化步骤如下：

1L表达菌体用50mL超声液悬浮，所述的超声液为50mMTris-Cl、pH7.5、20mM咪唑，冰浴超声20min、5s超声、5s间隔；

超声后的混合物12000rpm，4℃离心30min；

将表达上清直接进行Ni-NTA层析：柱床平衡洗涤用50mMNaCl，50mMTris-Cl，pH7.5，50mM咪唑，用50mMNaCl，50mMTris-Cl，pH7.5，150mM咪唑洗脱，将洗脱液透析后超滤浓缩。

8.一种如权利要求3至7任一所述的在大肠杆菌中生产融合蛋白RT-X的方法制备得到的血管生成抑制剂。