CN104690265B - 一种金纳米星及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金纳米星及其制备方法和应用，以氯金酸为金源、植物多酚为还原剂和稳定剂，通过调节氯金酸和植物多酚的浓度来控制合成金纳米星的尺寸、形貌及等离子共振吸收峰。该方法简单温和、无需晶种和表面活性剂、耗时少、低能耗、易规模化，只需一步反应即可快速合成金纳米星。本发明合成的金纳米星具有很强的近红外吸收、好的光热转换性能和生物相容性，且光热转换效率高、近红外光光热稳定性好、光声成像能力强，可应用于癌细胞的光热治疗和光声成像。在临床应用特别是成像指导的光热治疗方面，应用前景广阔。

Description

一种金纳米星及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米材料制备和生物医学领域，具体涉及一种金纳米星及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，开发多功能的诊断治疗纳米材料是癌症诊断与治疗应用中一个非常活跃的研究领域。这些诊疗纳米颗粒集成了多种成像模式用于成像指导下的药物递送和微侵袭性的治疗，大大提高了诊疗效率和减少多次给药所带来副作用风险。基于单一近红外光响应的纳米材料，可实时光响应成像（如光声成像、光学成像）且同时光响应治疗（如光热治疗、光动力治疗、光促发化学药物治疗），是一类很有前景的诊疗材料。近红外光具有深的组织穿透性和最小的组织损伤。当靶向肿瘤部位时，近红外光响应的诊疗试剂可将吸收的近红外光能转换为热能用于光热治疗或者可同时产生超声波用于肿瘤组织的实时成像。

金纳米结构材料因为其非凡的光学性质、高的光热转换性能、表面易修饰等特点使得它们在生物成像、传感、诊疗应用等有非常有效广泛的应用。金纳米颗粒的局域表面等离子共振（localized surface plasmon resonance ，LSPR）性质与其形貌、尺寸和结构密切相关。其中，各向异性的金纳米颗粒被证明可在其表面形成强的增强电磁场，因此很多研究者致力于设计各向异性金纳米材料，将金纳米材料的LSPR峰调节到近红外区范围。电磁场增强的各项异性金纳米材料在药物递送、表面增强拉曼光谱、光声成像、光热治疗等领域有提高的性能。

目前报道的分枝状的金纳米星颗粒的合成方法中，最常见一类合成方法是利用晶种介导的种子生长法。先制备小的金或银纳米种子，然后把晶种加入至含有氯金酸、表面活性剂、还原剂的生长液里，再经过一段长时间的生长和多次表面活性剂洗涤过程进而得到金纳米星[J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 11358-11361.]。因为在合成需要经过晶种合成和纳米星生长过程，且各个过程要求精确严格，使得该方法合成相对复杂和耗时。无晶种方法是另外一种更简单的合成分枝金纳米星的方法。文献报道了一种以十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）为稳定剂的分枝金纳米星合成方法。[J. Phys. Chem. B, 2006, 110, 19291-19294.]尽管可以合成支状金纳米星，但是由于反应中需加入CTAB为稳定剂，而CTAB是有高的细胞毒性的，在后续样品处理中很难完全除去。

为了解决以上提到的一些不足，以拓宽分枝状金纳米星的应用，发展一步法、简单、免表面活性剂的步骤来精确地可控地合成近红外光响应的分枝状金纳米颗粒依然是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金纳米星及其制备方法和应用，该方法免晶种、无需额外添加表面活性剂，制备反应时间短、低能耗、易规模化、只需一步反应即可快速合成出金纳米星。该金纳米星具有高的光热转换效率（达到η = 24.37%）和良好的光热稳定性。同时其生物相容性良好，具有低的细胞毒性，并成功应用癌细胞的近红外光光热治疗。在近红外光激发下，该金纳米星显示出很好的光声信号，并成功地被应用于癌细胞的光声成像。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种金纳米星：纳米金的形貌为多枝状星形，金纳米星具有可见区到近红外区的吸收，粒径为20-500 纳米。

制备方法包括以下步骤：

（1）将氯金酸溶解于水中，搅拌并升温至20-100℃；

（2）将还原剂溶解于水中，在快速搅拌下，加到氯金酸溶液中；

（3）反应至溶液不再变色为止，离心分离水洗3次，得金纳米星，重新分散于水中保存。

氯金酸与还原剂的摩尔比为0.1-1:1-10。

所述的还原剂为植物多酚。

所述的植物多酚为没食子酸（gallic acid，GA）、单宁酸（tannic acid，TA）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表没食子酸儿茶素（epicatechin gallate，ECG）、茶多酚、鞣花酸（ellagic acid，EA）、槲皮素（quercetin）、桑色素（morin）、柚皮素（naringenin）、芦丁（rutin）、柚苷（naringin）中的一种或多种。

在金纳米星表面修饰生物相容性配体，避光保存于2-8℃下。

所述的生物相容性配体为巯基修饰聚乙二醇、壳聚糖、氨基修饰聚乙二醇、岩藻糖、透明质酸、二氧化硅、脂质体、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、葡聚糖、白蛋白中的一种或多种。

所述的金纳米星用于制备光声成像和光热治疗药物。

本发明的显著优点如下：

（1）金纳米星的制备方法简单、温和、绿色、快速、免晶种、无需额外添加表面活性剂、低能耗、易规模化；

（2）金纳米星所用还原剂为植物多酚，是自然可取的，成本低、绿色健康；

（3）金纳米星的尺寸、形貌、局域等离子吸收可以通过改变反应物浓度（氯金酸、还原剂）可控合成；

（4）金纳米星界面干净易于进一步修饰，修饰配体的金纳米星具有生物相容性好、水中分散性良好等优点；

（5）金纳米星具有高的光热转换效率（达到η=24.37%）和良好的光热稳定性，可用于疾病、肿瘤等的光热治疗；同时，金纳米星有良好的光声成像能力，可以用于细胞、组织的光声成像。

附图说明

图1实施例1中利用没食子酸为还原剂，可控合成金纳米星的吸收波长，图中金纳米星的吸收峰随着加入没食子酸（100 mM）体积增大而逐渐红移，其中没食子酸（100 mM）体积：(1) 20 μL、(2) 40 μL、(3) 60 μL、(4) 80 μL、(5) 100 μL、(6) 120 μL、(7) 160 μL、(8) 200 μL、(9) 300 μL、(10) 400 μL。

图2实施例1中利用没食子酸为还原剂，合成的金纳米星的透射电镜表征图，图中(a) AuNSs-1、 (b) AuNSs-2、(c) AuNSs-3、(d) AuNSs-4、(e) AuNSs-5 and (f) AuNSs-6分别为加入不同体积的没食子酸（100 mM）合成的金纳米星，分别为：20 μL、60 μL,、120 μL、160 μL、200 μL、400 μL。

图3 实施例2中利用单宁酸为还原剂合成金纳米星的透射电镜表征图。

图4不同浓度金纳米星溶液在2 W·cm^-2 808 nm 激光光照下温度变化曲线，光照时间为（0-10分钟）。

图5 HeLa 细胞与不同浓度的金纳米星（0、5、10、20、30 μg mL^-1） 孵育后加激光光照（808 nm、2 W·cm^-2）或者不光照的细胞活力结果。

图6 HeLa细胞与不同浓度金纳米星（10、20 μg·mL^-1）孵育12小时后，金纳米星在细胞内的光声成像图。

具体实施方式

下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是不能以此限制本发明的范围。

实施例1

（1）玻璃器皿首先经王水（盐酸：硝酸体积比为3:1配制）浸泡，之后再用超纯水洗涤多次后使用（注意：王水具有强腐蚀性，使用时需特别小心）。具体的合成步骤：80 μL 的20 mg·mL^-1 氯金酸溶液加入至19.6 mL的超纯水中磁力搅拌下加热至35℃。至温度恒定约1分后，快速加入400 μL 浓度为100 mM 的没食子酸溶液。反应开始时，溶液颜色为淡黄色，在约50秒后，可见溶液逐渐转变为蓝绿色，继续反应5分后停止。将反应产物于9000 rpm离心5分钟后，收集沉淀物，经超纯水洗3次后再重新超声分散于约1毫升超纯水中。

（2）为了使金纳米星更好地应用于细胞实验中，金纳米星用巯基聚乙二醇2000（SH-PEG2000）进行表面修饰，具体地，将100 μL新鲜配制的10 mM SH-PEG2000溶液加入至金纳米星溶液中在室温条件下低速振荡反应12小时。过量的巯基PEG通过离心、水洗3次除去，将获得金纳米星-PEG重新分散于超纯水中，于4℃冰箱中避光保存待用。

（3）改变没食子酸加入的量，合成的金纳米星的吸收图如图1所示，可以看到金纳米星的在可见到近红外区有宽的吸收峰。

（4）改变没食子酸加入的量，对合成金纳米星的透射电子显微镜表征如图2所示，可以看到通过改变没食子酸加入的量达到控制金纳米星形貌和尺寸。

实施例2

（1）玻璃器皿首先经王水（盐酸：硝酸体积比为3:1配制）浸泡，之后再用超纯水洗涤多次后使用。具体的合成步骤：80 μL 的20 mg·mL^-1 氯金酸溶液加入至19.6 mL的超纯水中磁力搅拌下加热至35℃。至温度恒定约1分后，快速加入300 μL 浓度为100 mM 的单宁酸溶液。反应开始时，溶液颜色为淡黄色，在约50秒后，可见溶液逐渐转变为蓝绿色，继续反应5分后停止。将反应产物于9000 rpm离心5分钟后，收集沉淀物，经超纯水洗3次后再重新超声分散于约1毫升超纯水中。

（2）为了使金纳米星更好地应用于细胞实验中，金纳米星用壳聚糖进行修饰，具体地，将100 μL新鲜配制的10 mM 壳聚糖溶液加入至金纳米星溶液中在室温条件下低速振荡反应12小时。过量的壳聚糖通过离心、水洗3次除去，将获得金纳米星-壳聚糖重新分散于超纯水中，于4度冰箱中避光保存待用。

（3）对合成金纳米星的透射电子显微镜表征如图3所示，可见合成的金纳米形貌为分枝状星形。

实施例3

（1）测试金纳米星的NIR光照射光热性能：配制1 mL不同浓度的金纳米星溶液（0-20 μg·mL^-1）分别取于常量石英比色皿中，用近红外激光808 nm, 2 W·cm^-2照射10分钟。温度通过热电偶探针（直径0.5mm）浸入溶液中实时测量，探针放置位置应避免激光直接照射，且不要接触到比色皿。不同浓度金纳米星的光热升温曲线如图4所示，可见金纳米星在激光照射下可以使水溶液快速升温。

（2）HeLa细胞接种于96孔板，孵育24小时后，移去培养液后，加入含不同浓度的金纳米星溶液（0-30 μg·mL^-1）培养液再孵育4小时，随后再用808 nm激光以2 W·cm^-2功率密度光照5分钟。光照后HeLa细胞继续孵育24小时。对照组加入一样浓度金纳米星的细胞，但不加光照。用CCK-8实验来测试细胞的相对活率，以未加金纳米星且未光照组为细胞活率100%来计算。从图5可知，在没有激光光照时，金纳米星对HeLa 细胞基本是无细胞毒性的，细胞存活率大于95%；而当激光光照后，细胞的存活率随着金纳米星的浓度增加而逐渐减少，在金纳米星浓度为10 μg·mL^-1时，细胞存活率小于20%。说明金纳米星在光照下产生很高的热能使得细胞凋亡，且光热升温与金纳米星浓度相关。

实施例4

测试金纳米星在细胞中光声成像能力：先培养HeLa细胞约2×10⁵个于培养皿中24小时后，移去培养液后，再与含不同浓度的金纳米星的细胞培养液孵育12小时于37℃含5%CO₂湿润气氛下培养箱。移除培养液，PBS溶液洗3次，用胰蛋白酶将细胞消化下来，转移至离心管离心收集细胞，转移于0.2 mL的离心管中，808 nm激发光光声成像细胞。结果如图6所示，金纳米星在细胞中非常明显的光声信号，光声信号随着金纳米星的浓度增大而增强。说明了金纳米星是一个高效的近红外光光声成像造影剂，可望用于活体中光声成像。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1. 一种金纳米星的制备方法，其特征在于：纳米金的形貌为多枝状星形，金纳米星具有可见区到近红外区的吸收，粒径为20-500 纳米；其制备过程包括以下步骤：

（1）将氯金酸溶解于水中，搅拌并升温至20-100℃； （2）将还原剂溶解于水中，在快速搅拌下，加到氯金酸溶液中；

（3）反应至溶液不再变色为止，离心分离水洗3次，得金纳米星，重新分散于水中保存；所述还原剂为植物多酚，包括单宁酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子酸儿茶素、茶多酚、鞣花酸、槲皮素、桑色素、柚皮素、芦丁、柚苷中的一种或多种；所述氯金酸与还原剂的摩尔比为0.1-1:1-10。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在金纳米星表面修饰生物相容性配体，避光保存于2-8℃下。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的生物相容性配体为巯基修饰聚乙二醇、壳聚糖、氨基修饰聚乙二醇、岩藻糖、透明质酸、二氧化硅、脂质体、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、葡聚糖、白蛋白中的一种或多种。

4.一种如权利要求1所述方法制得的金纳米星的应用，其特征在于：所述的金纳米星用于制备光声成像和光热治疗药物。