CN104694431A - 一株植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)及其应用。本发明所提供的植物乳酸杆菌具体为植物乳酸杆菌Q5，保藏号为CGMCC No.10459。本发明还提供了利用所述植物乳酸杆菌Q5青贮柑橘皮渣的方法及制成的饲料，经奶牛饲喂试验证实本发明提供的饲料可有效提高奶牛的产奶量及所产牛奶中的乳蛋白和乳脂肪含量。本发明提供的所述植物乳酸杆菌Q5能环保、安全、高效地应用于青贮柑橘皮渣生产饲料，利用所述菌株青贮柑橘皮渣制成的饲料无毒环保、成本低廉、品质优良。
Description
技术领域
本发明属于微生物饲料技术领域，具体涉及一株植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)及其在青贮和/或发酵柑橘皮渣方面的应用。
背景技术
我国柑橘年产量位于世界第三，仅次于美国、巴西。柑橘加工行业的下脚料——柑橘皮渣含有丰富的营养物质、微量元素和大量的水分，极易腐烂变质，对环境造成极大的危害。因此，对柑橘皮渣进行综合利用，既是重要的环保举措，也能提高果汁加工业的经济效益。并且，近年来随着我国畜牧业发展迅速，但加工饲料的原料严重不足，养殖业和饲料加工业的矛盾日益突出，这些问题严重制约着我国畜牧业的发展，寻求“物美价廉”的饲料成为研究的一大热点。目前现有的柑橘渣做饲料的研究中主要集中在：一是是将柑橘皮渣直接干燥作为动物饲料，但直接干燥为饲料能耗高、成本高；二是添加化学添加剂再青贮，添加化学品本身就不环保且成本高，而且还要考虑反刍动物胃的耐受能力。
乳酸杆菌是常见的肠道益生菌，也是最近运用得较多较广的青贮微生物添加剂，乳酸杆菌可通过代谢发酵产生乳酸、乙酸等有机酸和细菌素，迅速降低pH，维持厌氧环境，抑制有害菌的活动，从而达到长期保存饲料营养品质的目的；同时产生的乳酸还可以促进多糖和粗纤维的转化，增加风味。
发明内容
基于本领域现有技术存在的上述缺陷和不足，本发明旨在克服直接添加化学青贮剂的问题，提供一株用于青贮柑橘皮渣的乳酸杆菌及其在发酵皮渣中的应用。
本发明是通过下述技术方案实现的：
一株植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株Q5，其保藏号为CGMCC No.10459。
用于青贮和/或发酵柑橘皮渣的制品，其特征在于，所述制品的活性成分包括所述植物乳酸杆菌菌株Q5。
用于青贮和/或发酵柑橘皮渣的制品，其特征在于，所述制品的活性成分是所述植物乳酸杆菌菌株Q5。
所述制品还包括用于青贮和/或发酵柑橘皮渣的常规成分。
所述植物乳酸杆菌菌株Q5在制备用于青贮和/或发酵柑橘皮的制品中的用途，其特征在于，所述制品的活性成分包括所述植物乳酸杆菌菌株Q5。
所述植物乳酸杆菌菌株Q5在制备用于青贮和/或发酵柑橘皮的制品中的用途，其特征在于，所述制品的活性成分是所述植物乳酸杆菌菌株Q5。
一种青贮和/或发酵柑橘皮渣的方法，其特征在于，在青贮和/或发酵柑橘皮渣的过程中添加和/或使用以所述植物乳酸杆菌菌株Q5为活性成分的产品。
一种饲料青贮和/或发酵添加剂，其特征在于，所述饲料青贮和/或发酵添加剂的活性成分包括所述植物乳酸杆菌菌株Q5。
一种饲料青贮和/或发酵添加剂，其特征在于，所述饲料青贮和/或发酵添加剂的活性成分是所述植物乳酸杆菌菌株Q5。
一种饲料，其特征在于，以所述植物乳酸杆菌菌株Q5作为青贮和/或发酵添加剂活性成分对柑橘皮渣进行青贮和/或发酵而成。
本发明通过恒温培养青贮成熟的柑橘皮渣的稀释物，并从中挑选出溶钙圈大且大小、形状、颜色等差异大的单菌落进行分离纯化并进一步培养，最终筛选出一株菌株，经鉴定为乳酸杆菌属植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌株的菌落形态学特征详见表1，菌株菌落成呈现乳白色，表面光滑，边缘整齐；短杆状，革兰氏阳性，无芽孢；接触酶阴性；无运动性；MRS液体培养24h后菌体浓度可达到108-109cfu/ml，pH≦3.5；耐酸耐碱耐盐，生长能力·，产酸速率快，主要产乳酸和乙酸；生理生化鉴定结果如表2所示；糖醇发酵结果如表3所示；16s rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了采用所述植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株Q5进行青贮柑橘皮渣并制备柑橘皮渣饲料的方法，包括将所述菌株Q5活化制备成菌悬液，并进一步扩繁培养制成含有所述菌株Q5发酵液用于青贮柑橘皮渣。经品质检测，上述方法制成的柑橘皮渣饲料可达到《饲料卫生标准》GB 13078-2001，适口性良好，适合多种动物喂养，尤其适合作为牛羊等反刍类动物的饲料使用。
本发明还提供了采用所述植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株Q5对原料柑橘皮渣进行青贮制备而成的饲料，将所述饲料按一定比例与常规普通饲料混合对奶牛进行饲喂试验，并采用只吃常规普通饲料的奶牛进行对照，结果证实，食用添加了利用本发明所述的所述植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株Q5进行青贮产生的柑橘皮渣饲料的奶牛 实验组在产奶量、乳蛋白和乳脂肪含量方面都明显优于只食用常规普通饲料的奶牛对照组，详细的数据结果见图4和图5。
本发明还请求保护活性成分为或包括本发明所述的植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株Q5的用于青贮和/或发酵柑橘皮渣的制品，理由是，本领域技术人员根据本发明公开的内容及本领域常规技术手段，可以用本发明所述的植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株Q5作为活性成分与用于青贮和/或发酵柑橘皮渣的常规成分一起制成用于青贮和/或发酵柑橘皮渣的制品，或用本发明所述的植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株Q5和其它用于青贮和/或发酵的活性成分共同作为用于青贮和/或发酵柑橘皮渣的活性成分，并连同青贮和/或发酵柑橘皮渣的常规成分，采取青贮和/或发酵柑橘皮渣的常规操作步骤，制成用于青贮和/或发酵柑橘皮渣的制品。所述制品优选为饲料青贮添加剂，或饲料发酵添加剂。采用所述制品、所述饲料青贮添加剂和/或饲料发酵添加剂青贮和/或发酵柑橘皮渣，同样可以制备出本发明所述的饲料并获得上述相同或类似的有益效果。
所述植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株已送保藏，其保藏信息如下：
菌种保藏名称：Q5
保藏号：CGMCC No.10459
拉丁名：Lactobacillus plantarum
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年1月29日
附图说明
图1为本发明所述菌株Q5的生长曲线图。
图2为本发明所述菌株Q5的产酸速率图。
图3为本发明所述菌株Q5较其他菌株产乳酸量的对比图。
图4为食用了按比例添加了本发明所述饲料的饲料混合物的奶牛与只吃普通饲料的奶牛在产奶量上的对比图谱。
图5为食用了按比例添加了本发明所述饲料的饲料混合物的奶牛与只吃普通饲料的奶牛在乳蛋白和乳脂肪含量上的对比图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，下述实施例只是说明性的，并不限制本发明保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
生物材料的来源及记载出处
本发明奶牛饲喂实验中使用的奶牛来自重庆开县地区。
试剂及耗材
MRS液体培养基：酵母提取物5g，蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，柠檬酸二铵2g，K2HPO42g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温1ml，MgSO4.7H2O 0.5g，MnSO40.25g，蒸馏水1000ml，pH6.2-6.8，121℃灭菌20min
MRS固体培养基：为在MRS液体培养基中添加1.8％-2％(w/v)的琼脂。
本发明筛选菌株使用的柑橘皮渣购自重庆开县地区；
本发明奶牛饲喂实验中使用的常规普通饲料为：混合精饲料：青干草：青贮带包玉米：＝25％：15％：60％(w/w/w)的混合饲料；所述混合精饲料可以商购获得。
仪器设备
恒温摇床、显微镜、高效液相色谱仪、分光光度计
实施例1、本发明所述的植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)菌株Q5
1、菌株分离
取重庆开县地区青贮成熟的柑橘皮渣25g置于三角瓶中，用无菌生理盐水稀释至250mL，置于恒温摇床上36℃下震荡培养2h。进行10-1-10-6梯度稀释，取10-5和10-6各50uL涂布于含2％(w/v)CaCO3的MRS固体平板中，36℃下厌氧培养48h后，挑选溶钙圈大且大小、形状、颜色等差异大的单菌落，重复划线，直至纯培养。
2、菌株的形态学鉴定
将菌株Q5在MRS固体培养基中生长24h后，观察菌落大小、形状、颜色及边缘情况等，同时进行镜检和酶触实验，实验结果如下表1。
表1分离菌株形态学特征
3、菌株的生理生化特征分析
将分离筛选所得菌株进行运动性、明胶液化、吲哚、硝酸盐还原、H2S产生、pH4.5试验、pH9.6实验、葡萄糖产酸产气、10℃和45℃生长、6.5％(w/v)NaCl试验，实验结果如下表2所示。
表2乳酸杆菌Q5的生理生化特征
注：“﹢”为阳性，“﹣”为阴性。
4、将乳酸杆菌Q5进行糖醇发酵实验，实验结果如下表3所示。
表3植物乳酸杆菌Q5糖醇发酵实验结果
注：“﹢”为阳性，“﹣”为阴性，“±”为弱阳性。
5、16s rDNA同源性鉴定
将所述的乳酸杆菌Q5送至北京三博远志生物技术有限公司进行基因提取、PCR增广及16s rDNA全序列测定，其16s rDNA序列如SEQ ID No.1所示，经同源性分析可得，所述乳酸杆菌Q5为植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)。其中一个单株送保藏，保藏号为CGMCC No.10459。
6、成长情况分析
按5％的接种量接种过夜培养的乳酸杆菌Q5菌悬液于MRS液体培养基中，36℃分别在培养0、2、4、6、8、10、12、14、24、30和36h，取出培养物，用分光光度计测定600nm处的吸光度值(OD600)，同时测定其pH值。由OD值绘制的成长曲线，如图1所示，2h后菌株Q5变进入对数成长期，生长速度快。由pH绘制的产酸变化，如图2所示，10h后植物乳酸杆菌Q5的pH变下降到4以下，最终pH可下降到3.5以下，由此可以看出该菌产酸能力强。
7、产酸能力鉴定
将培养24h的菌悬液在8000rpm离心15min后，取上清液，用高效液相色谱仪测定其有机酸含量。色谱条件：流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾(pH2.6)和甲醇(体积比97：3)，柱温20℃，流速0.8ml/min，检测波长214nm，进样量5μl。测得乳酸和乙酸含量与其他菌株 的对比情况如图3所示，可以看出植物乳酸杆菌Q5代谢产物中，乳酸和乙酸含量较其他菌株高，进一步证明该菌产酸能力强。
实施例2、采用本发明所述菌株Q5青贮柑橘皮渣制备饲料
1、菌株活化：将冷冻保存的植物乳酸杆菌Q5接种在MRS液体培养基中，36℃下培养15-24h，如此传代培养2-3代即可得活化好的植物乳酸杆菌Q5。所述的MRS液体培养基组成如下：。
2、菌悬液的制备：将上述植物乳酸杆菌Q5接种于250mL的三角瓶中，瓶中装MRS液体培养基100mL,36℃下培养24h即可得菌悬液。
3、菌液的扩大培养：将上述菌悬液按5％的接种量接种于发酵液中，混匀后置于36℃下培养发酵36-48h，直至pH下降到4以下结束。发酵液的组成成分如下：葡萄糖10g，蛋白胨3g，牛肉浸粉1g，盐溶液10mL，蒸馏水1000mL。盐溶液成分：CaCL20.2g，MgSO4.7H2O 0.48g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaHCO310.0g，NaCL 2.0g，蒸馏水1000mL，配好后置于冰箱备用。
4、青贮皮渣：一边将榨汁厂出来的新鲜柑橘皮渣堆压在青贮池或青贮袋中，一边按体积比为5‰(v/v)的喷洒量均匀地喷洒上述发酵液，压实，青贮池要求防水、气密性好，密封前，最上层泼洒少量食盐，最后用厚塑料膜封闭严实，自然发酵45-60天即可得柑橘皮渣青贮饲料。
5、青贮皮渣饲料品质检测：自然发酵成熟后，取样进行青贮柑橘皮渣饲料感官评定、微生物组成及发酵品质分析。
经检验，青贮柑橘皮渣饲料呈现甘酸香味，亮黄色，可达到《饲料卫生标准》GB13078-2001，适口性良好，适合多种动物喂养，尤其适合作为牛羊等反刍类动物的饲料使用。
实施例3、采用本发明所述的饲料进行奶牛饲喂实验
选用健壮乳牛40头，10头一组，分为A、B、C、D共4组。
A、B、C组：分别饲喂以重量比20％、30％、40％的实施例2所得的青贮饲料与常规普通饲料混合的饲料混合物；
D组为对照组，饲喂常规普通饲料，调查饲喂30天后，分别对这四组的奶牛的产奶量及所产牛奶中乳蛋白、乳脂肪的含量进行分析，详细的数据结果如图4和图5所示。
由上述奶牛饲喂试验可知，食用本发明所述饲料的奶牛可以明显提高产奶量，同时其所产的牛奶中的乳蛋白和乳脂肪也分别提高0.12％和0.22％。因此，可以得出；添加利用本发明所述植物乳酸杆菌Q5青贮而成的所述饲料，品质高，适合作为牛奶、肉牛、羊等反刍动物的配合饲料。
以上内容是结合具体的主要实施方式所作的说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。
Claims (10)
1.一株植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株Q5，其保藏号为CGMCC No.10459。
2.用于青贮和/或发酵柑橘皮渣的制品，其特征在于，所述制品的活性成分包括权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株Q5。
3.用于青贮和/或发酵柑橘皮渣的制品，其特征在于，所述制品的活性成分是权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株Q5。
4.根据权利要求2或3所述的制品，其特征在于，还包括用于青贮和/或发酵柑橘皮渣的常规成分。
5.权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株Q5在制备用于青贮和/或发酵柑橘皮的制品中的用途，其特征在于，所述制品的活性成分包括权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株Q5。
6.权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株Q5在制备用于青贮和/或发酵柑橘皮的制品中的用途，其特征在于，所述制品的活性成分是权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株Q5。
7.一种青贮和/或发酵柑橘皮渣的方法，其特征在于，在青贮和/或发酵柑橘皮渣的过程中添加和/或使用以权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株Q5为活性成分的产品。
8.一种饲料青贮和/或发酵添加剂，其特征在于，所述饲料青贮和/或发酵添加剂的活性成分包括权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株Q5。
9.一种饲料青贮和/或发酵添加剂，其特征在于，所述饲料青贮和/或发酵添加剂的活性成分是权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株Q5。
10.一种饲料，其特征在于，以权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株Q5作为青贮和/或发酵添加剂活性成分对柑橘皮渣进行青贮和/或发酵而成。
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