CN104666518A - 含有菊苣及枸桔的提取物的皮肤屏障强化用组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有菊苣及枸桔的提取物的皮肤屏障强化用组合物，具体地，菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)的混合提取物与菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)的个别提取物相比，增加皮脂腺细胞（sebocyte）的细胞生长，并显著增加从皮脂腺细胞（sebocyte）合成的脂质的量，而且显著增加作为皮肤内的重要保湿因子的透明质酸（hyaluronan）的量，因此作为脂质生合成能力不足的婴幼儿的皮肤屏障强化用组合物、特应性皮炎的预防及治疗用组合物而能够有效地使用。

Description

含有菊苣及枸桔的提取物的皮肤屏障强化用组合物

技术领域

本发明涉及皮肤屏障强化用组合物、特应性皮炎的预防及治疗用组合物。

背景技术

皮肤由表皮和真皮构成，位于皮肤的最外侧的角质层是保护活体不受外部环境的物理、化学刺激及微生物等的影响，并适当调节水分的蒸发，从而保持活体的稳态性的皮肤屏障。为了保持健康的皮肤状态，角质层需要含一定量的水分，角质细胞需要与脂质成分和氨基酸、尿素、有机酸等天然保湿因子及皮脂形成均衡，而如果这样的要素的均衡被打破或缺乏，则皮肤角质层的水分量下降，皮肤屏障功能发生障碍，导致皮肤干燥。

将未满三岁的儿童叫做婴儿，将从满三岁到小学入校之前的儿童叫做幼儿，将他们统称为婴幼儿。就婴幼儿的皮肤而言，分泌皮脂的皮脂腺的活动微弱，并且因汗腺未成熟而导致汗的分泌力较弱，因此在皮肤的最外层的表面一次性地保护皮肤的天然皮脂膜的形成微弱，表皮及真皮薄，因此水分保持及皮肤保护能力下降，从而导致皮肤干燥，对于内外因的反应敏感，且容易受到刺激和损伤。

当皮肤干燥时，因搔痒而进行抓挠，因此导致皮肤的损伤，最终导致特应性皮炎。实际上，根据疾病管理本部所发表的过敏性疾病调查，患上特应性皮炎的儿童的比例每年在增加，据说在患者当中的75%在满一岁之前发病。包括特应性皮炎在内的干癣和蛇皮癣等在干燥的皮肤所发生的疾病大部分显示出慢性的过程，因此持续地向皮肤供给水分和油分并恢复皮肤屏障功能是非常重要的，并且作为长期使用也没有副作用的辅助治疗剂，必须使用皮肤保湿产品。

为了提高皮肤屏障功能，目前所使用的皮肤外用剂的主要功能是通过涂抹该皮肤外用剂来保持皮肤表面的水分保持量，其中表现出保湿效果的成分被分为作为基本成分的湿润剂、密封剂和作为药剂成分的天然提取物、维生素以及神经酰胺。湿润剂作为水分较多的物质，根据成分本身所具有的含湿能力而表现出保湿效果，密封剂作为维持成分而在皮肤表面形成密封膜，从而防止水分的蒸发而在皮肤表现出保湿效果，或者利用维持成分剂不饱和脂肪酸的含湿能力而提供保湿效果。天然物和神经酰胺会进一步提高保湿效果，为了恢复角质层的皮肤屏障功能，目前使用各种来自天然物的保湿成分。此外，作为具备皮脂分泌促进作用的公知物质，还有胚芽菁华、泛酰巯基乙胺及脂肪酸酯等，但是因物质的性质而难以制造成剂型。

虽然，为了提高皮肤屏障功能而使用各种物质，但由于使用化学原料，反而引发皮肤刺激、过敏等，实际上对皮肤产生坏影响，为了解决这样的问题，急需开发来自大自然的天然成分。

菊苣(Cichorium intybus)是属于菊花科的寒带高山草本植物，原产地为北欧全域、中亚、西伯利亚的贝加尔湖附近，并且也生长在中国的西北部，它是耐寒性强的植物。来自菊苣的菊粉（chicory inulin）具有促进肠内矿物质的吸收的效果，并且有意地大大增加作为肠内有益菌的双歧杆菌（bifidobacteria）和乳酸杆菌（lactobacilli）的繁殖，并抑制肠内有害细菌的生长，使肠内微生物群的组合向有益的方向改善，因此早前就在益生菌（probiotics）领域中开展了各种研究。并且，菊苣提取物对于高脂血症及糖尿病这样的慢性衰退性疾病也有预防及治疗效果，更具体地，已证实菊苣提取物能够减少血糖的体内血糖的数值和总糖化血红蛋白的数值量。不仅如此，有报告指出，还具有抗氧化、抗炎、抗老化效果，并通过最近的研究结果表明了对于在基因的表达中起到重要作用的因子即PPAR-a（过氧化物酶体增殖物活化受体-a）的增量调控（up-regulation）也产生作用。

枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)在植物分类学上属于芸香科(Rutaceae)，被统称为柑桔类。枸桔的特征为耐寒性强，具有独特的香味，在中药中被称为枸桔，作为芳香苦味健胃剂而被广泛利用。特别是，多用于治疗胸满、胸痛、腹满、腹痛及炎症。枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)的主要成分为类黄酮（flavonoid）、橙皮苷（hesperidin）、新橙皮苷（neohesperidin）、柚皮苷（naringin）及邻吡喃酮（cumalin）类等，而关于这些成分与活体功能的相关性也进行了许多研究。自古，不仅被药用，而且还广泛利用于美容，最近有报告称对于抗炎症、抗过敏症、抗癌等也有疗效。更具体地，被指出对于在脂质的合成中起到重要影响的转录因子即SREBPs的活化产生作用。

皮肤屏障存在于在构成皮肤的结构中位于表皮的最外侧的角质层，防止水分蒸发和从外部的杂质侵入，从而保护人体。皮肤的适当的水分维持是由角质细胞间脂质、天然保湿因子及皮脂等而实现的，它与抑制皮肤老化及特应性皮炎、蛇皮癣、慢性湿疹、慢性肾衰竭症、糖尿病等疾病有密切的关系。因此，在皮肤的皮脂腺细胞中所分泌的脂质对于维持皮肤屏障功能起到重要的作用。脂质的合成(lipogenesis)是通过胆固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element-binding proteins(SREBPs)）和过氧化物酶体增殖物活化受体s（peroxisome proliferator-activated receptors(PPARs)）等的转录因子而调节的。PPAR作为细胞内核荷尔蒙受体的一种，是以与特定的配位子的结合而被活化，并促进对象蛋白质的表达的转录因子(transcription factor)，有报告称PPAR与皮肤中的细胞的生长和分化、脂质代谢调节、伤口治疗、炎症反应、皮脂生产及黑色素合成等有关系。在PPAR中存在a、β及γ这三种结构的异形体(isoform)，其中PPAR-γ调节表皮细胞的分化和脂质代谢，引导正常的表皮层的形成，从而维持表皮的稳态性。

对此，本发明人为了发明对于皮肤屏障起到重要作用，并能够从根本上提高脂质的合成的来自天然的外用剂，利用想必对此具有效力的菊苣及枳子的混合提取物而进行研究并努力的结果，确认了如下内容：该混合提取物不仅增强皮脂腺细胞（sebocyte）的生长及脂质的生合成，而且还提升作为主要保湿因子的透明质酸（hyaluronan）的生成，因此作为脂质分泌不够活跃的人群特别是婴幼儿的皮肤屏障强化外用剂而非常适合。

发明内容

因此，本发明的主要目的在于提供如下的皮肤屏障强化用组合物：其含菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)的混合提取物而作为有效成分，该混合提取物不仅促进生成脂质的皮脂腺细胞（sebocyte）的生长而引导实现皮肤屏障的主要功能的脂质的生合成，而且还具有促进脂质生成以及促进保湿因子的表达的效果。

本发明的另一目的在于提供利用了皮肤屏障强化用组合物的皮肤外用剂组合物，该皮肤屏障强化用组合物含所述菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliataRAFIN)的混合提取物，作为有效成分。

本发明的又另一目的在于提供利用了皮肤屏障强化用组合物的化妆料组合物，该皮肤屏障强化用组合物含所述菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliataRAFIN)的混合提取物，作为有效成分。

根据本发明的一方式，本发明提供皮肤屏障强化用组合物，其含菊苣(Cichoriumintybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)的混合提取物，作为有效成分。

婴儿在出生后3个月之前，因胎儿时从母体带来的荷尔蒙即雄激素，皮脂分泌与成人类似，但是从出生后3个月开始到青春期为止，下降到成人的1/3，容易被细菌感染，并且由于直接暴露于周围环境，皮肤容易处于干燥状态。并且，在婴幼儿的情况下，虽然皮肤内的水分含有量高，但由于皮肤薄，无法防止水分的蒸发，其结果皮肤容易被干癣化，由此导致对外部环境敏感地反应。因此，需要积极地进行皮脂和水分的生合成，而在该生合成中起到重要的作用的是PPAR-γ。虽然并未指明准确的机制，但通过PPAR-γ被活化，从皮脂腺细胞（sebocyte）表达脂质的生合成所需的因子，其结果形成脂质而执行细胞屏障的作用。

菊苣(Cichorium intybus)作为双子叶植物风铃草目菊花科的多年生草本，具有关于促进消化、循环血液、抗癌、胆结石症、肝脏疾病、糖尿病的效能，并且由于菊粉（inulin）的含有量高，因此促进肠内有益细菌的生长而改善肠内环境，而且也是作为减肥材料及食品添加物而具有很高的利用价值的植物。

枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)作为芸香科的落叶阔叶乔木即枳子树的果实，自古，不仅用于治疗急性支气管炎症、哮喘、胃脏疾病，而且也作为美容材料而被利用。枸桔包含类黄酮（flavonoids）和生物碱（alkaloids），通过各种研究指明了其具有抗氧化功能、抗炎、以及美白的效果。

本发明的特征在于，由所述两种物质的混合提取物来引导皮脂腺细胞（sebocyte）的生长、促进脂质生合成及促进保湿因子的表达，从而显示出皮肤屏障强化效果。

根据本发明的实施例，通过MTT实验（assay）而确认了细胞生长引导功能，并通过红油O染色（oilred O staining）试验和总胆固醇含量测定试验，显示出有效地实现脂质的生合成，从而确认了能够引导皮肤屏障的强化。

根据本发明的实施例，通过RT-PCR而确认了作为细胞内核荷尔蒙受体的一种的PPAR-γ的表达增加，这表示本发明的菊苣及枸桔的混合提取物增加PPAR-γ的表达，从根本上能够引导脂质的生合成。

根据本发明的实施例，通过透明质酸（hyaluronan）表达试验，确认了在皮肤中起到主要的保湿因子的作用的透明质酸（hyaluronan）的量增加，这表示本发明能够实现增加皮肤内的水分保持量的效果。

在本发明中，所述提取物可通过以往公知的任何提取溶剂来提取，例如可通过从以下的组中选择出的一个以上的溶剂来提取：乙醇、甲醇、丁醇、乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷或它们的有机溶剂和水的混合溶剂，优选使用水、乙醇或丁二醇来提取。

关于所述溶剂的提取温度，在水的情况下，优选为18℃～80℃，在70%乙醇和丁二醇的情况下，优选为18℃～40℃，提取时间优选为6小时～168小时。如果脱离所述提取温度及提取时间，则可能导致提取效率下降或成分的变化。在上述内容中，在利用溶剂而获得提取物之后，通过本领域公知的一般的方法，在常温下冷浸、加热及过滤而得到液状物，或者还可进一步将溶剂蒸发、喷雾干燥或冻结干燥。

在本发明中，所述提取物可通过以往公知的任何提取方法来提取，优选为通过如下方法来提取：将经干燥的菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)放入到溶剂中，进行环流提取并使之沉积，之后，过滤沉积物而获得滤液，对滤液进行减压浓缩，由此进行提取。

本发明所使用的菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)的混合提取物不仅包括对菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)进行浸出、煎煮而得到的浸出液，而且还包括对一部分或全部的浸出液再次浓缩而获得的浓缩物或将所述的浓缩物再次干燥而制造出的浸剂、煎剂、酊剂、流浸膏剂及含在菊苣及枸桔中而发挥主效果的化学物质以及植物本身。另外，在本发明中，可使用从菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)的所有部分提取出的提取物，不限定于某一特定部分的提取物。

关于在本发明中所使用的菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliataRAFIN)的混合提取物的制造方法，可使用公知的方法。例如可这样获得混合提取物：将发明的菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合物洗净并干燥之后放入水或有机溶剂中，在环流提取并进行沉积之后，通过进行滤布过滤和离心分离而分离出残渣和滤液，对分离出的滤液进行减压浓缩而获得提取物。

根据本发明的另一方式，本发明提供皮肤屏障强化用皮肤外用剂组合物，其含菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合提取物，作为有效成分。

本发明的特征在于，所述菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合提取物在组合物的总重量中占有0.001重量%～50重量%。因为当所述菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合提取物的含量小于0.001重量%时，根据所述提取物获得的效能、效果微弱，当超过50重量%时，存在皮肤安全性或剂型上的问题。

本发明的组合物可作为婴幼儿用皮肤屏障强化用外用剂组合物而使用，本发明考虑脂质的分泌不够活跃的婴幼儿的特性，从根本上引导分泌脂质的皮脂腺细胞（sebocyte）的生长及脂质生合成，改善作为皮肤屏障起到重要作用的脂质的分泌的效果显著。进而，因为引导保持水分的皮肤内因子即透明质酸（hyaluronan）的生合成，因此可作为强化皮肤屏障、预防及改善特应性皮炎、预防或改善皮肤干燥症、干癣等的皮肤外用剂组合物而有效地使用。

根据本发明的另一方式，提供皮肤屏障强化用化妆料组合物，其含菊苣(Cichoriumintybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合提取物，作为有效成分。

本发明的特征在于，所述菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)提取物在组合物总重量中占有0.001重量%～50重量%。

如上所述，本发明的菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合提取物显示皮肤屏障强化效果及保湿效果，因此可作为强化婴幼儿的皮肤屏障、预防及改善特应性皮炎、预防或改善皮肤干燥症、干癣等的外用剂或化妆料组合物而有效地进行商用化。

附图说明

图1是测定提取物在皮脂腺细胞（sebocyte）人皮脂腺细胞和成纤维细胞（fibroblast）人纤维细胞中的细胞生长效能而用图形来示出的图。

图2是通过红油O染色方法而测定提取物在皮脂腺细胞（sebocyte）人皮脂腺细胞中的脂质生合成效能而用图形来示出的图。

图3是通过总胆固醇含量测定试验方法来测定提取物在皮脂腺细胞（sebocyte）人皮脂腺细胞中的总胆固醇生合成效能而用图形来示出的图。

图4是通过RT-PCR方法来测定提取物在皮脂腺细胞（sebocyte）人皮脂腺细胞中的PPAR-γ的表达效能而用带的形态来示出的图。

图5是通过RT-PCR方法来测定提取物在皮脂腺细胞（sebocyte）人皮脂腺细胞中的PPAR-γ的表达效能而用图形来示出的图。

图6是通过透明质酸试验（Hyaluronan assay）方法而测定提取物在CCD986SK人纤维细胞中的保湿因子生成效能而用图形来示出的图。

具体实施方式

下面，通过实施例，更加详细地说明本发明。这些实施例仅仅是对本发明进行例示，因此本发明的范围不应该仅限于这些实施例。

实施例1:菊苣(Cichorium intybus)、枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)、菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合提取物的制造

利用粉碎机，将经干燥的50g的菊苣(Cichorium intybus)(大光药业)和枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)(大光药业)制造为粉末之后，用70%乙醇1L，在常温下提取3个小时，然后用Whatman NO.4过滤纸和Advantec NO.5C过滤纸来进行了过滤。利用减压旋转浓缩机来浓缩过滤液之后，菊苣获得21.76%的收益率，枳子获得了14.06%的收益率。对于菊苣+枸桔混合物，将两个天然物粉末以1:1的比例来混合，并通过上述方法来制造了提取物。

实验例1:细胞培养

[皮脂腺细胞（sebocyte），SZ95]

使用添加了10%胎牛血清（Fetal bovine serum(FBS)）、5ng/ml人表皮生长因子（human epidermal growth factor）、1mM CaCl₂的达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)）/F12(1:1)而在CO₂培养箱（incubator）(37℃，5%CO₂)中培养SZ95细胞，以2～3天为周期更换了培养基。

[成纤维细胞（fibroblast），CCD-986SK]

使用添加了10%胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)而在CO₂培养箱（incubator）(37℃，5%CO₂)中培养CCD-986或细胞，以2～3天为周期更换了培养基。

实验例2:细胞毒性评价(MTT assay)

为了评价在所述实施例1中制造的菊苣(Cichorium intybus)、枸桔(Poncirustrifoliata RAFIN)、菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合物提取物的细胞毒性，执行MTT assay而进行了确认。

将SZ95和CCD-986SK细胞以1×105细胞/ml的浓度分开种植到96-孔板（wellplate），在37℃、5%CO₂培养箱（incubator）中培养了24小时。培养之后，去除所有培养基，在每个孔（well）中处理利用未包含血清的培养基而稀释为适当浓度(25ug/ml～200ug/ml)的试料100ul之后，培养了24小时。在培养24小时之后，利用PBS而制造出溶解为5mg/ml的浓度的MTT试剂，并每次放入20ul而培养了4小时。将含MTT试剂和试料的培养基全部清除，在每个孔（well）中添加100ul的酸异丙醇（acid isopropanol），并在搅拌器（shaker）中搅拌10～15分钟，利用酶标仪（ELISAreader），在570nm下测定了吸光值。

[表1]

如所述表1所示，测定结果显示，提取物在所有浓度下未发现毒性，在该浓度中选定最高浓度即100ug/ml和200ug/ml的浓度而进行了以下实验。

实验例3:脂质生合成评价(红油O染色)

为了评价在所述实施例1中所制造的菊苣(Cichorium intybus)、枸桔(Poncirustrifoliata RAFIN)、菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合物提取物的脂质生合成功能，执行红油O染色而进行了确认。

将SZ95细胞，以3×104细胞/ml的浓度分开种植到12-孔板（well plate），在37℃、5%CO₂培养箱（incubator）中培养了24小时。在培养之后，去除所有培养基，在每个孔（well）中处理利用未含有血清的培养基而稀释为适当的浓度(100ug/ml～200ug/ml)的试料1ml之后，培养了48小时。在48小时之后，去除所有培养基，用PBS清洗（washing）之后，完整地清除了PBS。将10%甲醛水（formalin）每次放入2ml，在常温下培育（incubation）了10分钟。再次放入新的10%甲醛水而培育（incubation）了1小时或1小时以上。清除10%甲醛水，利用D.W而清洗（washing）了2次。清洗（washing）之后，放入60%异丙醇（isopropanol），在常温下培育（incubation）5分钟之后，清除异丙醇（isopropanol），对孔板（well plate）进行了干燥。使红油O工作溶液（Oil Red O working solution）反应10分钟之后，立刻用D.W清洗（washing）了4次。此时，可拍照。拍照之后放入100%异丙醇（isopropanol）而培育（incubation）10分钟，并在500nm下测定了吸光值。

[表2]

如所述表2所示，在全部试料中，脂质生合成功能与浓度成正比地增加，其中在菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合物提取物的混合物中效能最为突出。

实验例4:总胆固醇含量评价(Total cholesterol assay)

为了评价在所述实施例1中制造的菊苣(Cichorium intybus)、枸桔(Poncirustrifoliata RAFIN)、菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合物提取物的总胆固醇含量，执行总胆固醇含量评价而进行了确认。

将SZ95细胞，以3×104细胞/ml的浓度分开种植到12-孔板（well plate）中，并在37℃、5%CO₂培养箱（incubator）中培养了24小时。培养之后，去除所有培养基，在每个孔（well）中处理利用未包含有血清的培养基而稀释为适当浓度(100ug/ml～200ug/ml)的试料1ml之后，培养了48小时。在培养48小时之后，去除所有培养基，用PBS清洗（washing）之后，完全清除了PBS。使用RIPA缓冲液（buffer）(150mMNaCl，1.0%0.5%脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate），0.1%SDS，50mM Tris，pH8.0)而进行细胞裂解（cell lysis），并通过BCA法进行了蛋白质定量。进行定量之后，在细胞溶解液中添加三氯甲烷:甲醇（Chloroform:methaol）(2:1)溶液，并充分混合。在2000rpm下进行15分钟的离心分离（centrifuge），取出下层液而去掉之后，在剩余的溶液中分2次添加三氯甲烷:甲醇（Chloroform:methaol）(2:1)溶液，用同样的方法来分离下层液而去掉之后获得了脂质。在试料的脂质浓缩的情况下，放入乙醇（ethanol）300ul而溶解之后，利用总胆固醇盒（total cholesterol kit(AM202-K)）而进行了测定。在3ml的酶试剂中添加20ul的试料而混合，并在37℃下培养5分钟之后，在500nm的波长下，利用酶标仪（ELISA reader）而测定了吸光度。关于标准液的胆固醇（cholesterol），在3ml的酶试剂中放入20ul的标准液而作为3mg/ml值。

[表3]

如所述表3所示，在枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)和菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合物组中确认了比阳性对照组更突出的总胆固醇含量，并确认了菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合物组比枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)组效能更为突出。

实验例5:脂质生合成相关因子确认评价(RT-PCR[PPAR-γ])

为了确认在所述实施例1中所制造的菊苣(Cichorium intybus)、枸桔(Poncirustrifoliata RAFIN)、菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合物提取物的脂质生合成相关因子即PPAR-γ的表达，执行RT-PCR而进行了确认。

1)总RNA分离

将SZ95细胞，以1.5×105细胞/ml的浓度分开种植到6-孔板（well plate）中，并在37℃、5%CO₂培养箱（incubator）中培养了24小时。在培养之后，去除所有培养基，在每个孔（well）中处理利用未包含血清的培养基而稀释为适当的浓度(100ug/ml～200ug/ml)的试料2ml之后，培养了48小时。去除所有培养基，在每个样本（sample）中放入1ml的QIAzol之后，在常温下摇动（shaking）5分钟，以使分离出核蛋白质。用滴管（pipette）进行上下动作（up&down），在微型管（micro tube）中回收细胞（cell），并放入三氯甲烷（Chloroform）0.2ml而摇晃50次左右之后，在常温下培育（incubation）2～3分钟，并且在4℃12，000g中进行了20分钟的离心分离。将完成了离心分离的管（tube）的上层液300～400ul移到装有异丙醇（isopropanol）的管（tube）中，然后使其涡流（vortexing），在常温下培育（incubation）10分钟之后，在4℃12，000g下进行了15分钟的离心分离。注意使颗粒（pellet）不掉下，去除上层液，并添加75%乙醇（ethanol）(in0.1%DEPC)1ml而使其涡流（vortexing）之后，在4℃12，000g中进行了10分钟的离心分离。去除上层液，将微型管（micro tube）倒立并进行干燥之后，放入无RNA酶水（RNAase Free Water）而轻打（tapping）之后进行了缩径旋压（spin down）。

2)RNA定量

在微型管（micro tube）中分开种植0.1%DEPC998ul，将分离的RNA每次放入2ul而进行混合（mixing）。利用石英试管，在260nm中，将0.1%DEPC作为OA而测定了吸光度。通过[2ug/{吸光度×40(吸光系数)×500(稀释倍数)}]×1000(单位换算)来计算，求出了RNA和无核酸酶水（Nuclease free water）的量。

3)cDNA合成

在PCR管（tube）中放入热（Thermo）的5X反应缓冲液（Reaction buffer）4ul和Maxima酶（Enzyme）2ul，按照用RNA定量求出的量，放入RNA和无核酸酶水（Nuclease free water），以25℃10分钟-50℃15分钟-85℃5分钟-4℃8分钟的条件进行了RT-PCR。

4)PCR确认

利用Promega的GoTaq Green Master Mix而执行了PCR。制造1.5%agarose gel而进行电涌，并确认了群。

[表4]

如所述表4所示，在菊苣(Cichorium intybus)和枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)提取物中确认了150%以上的表达，在菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliataRAFIN)混合物组的100μg/ml的浓度下确认了将近200%的表达。

实验例6:保湿效能评价(透明质酸评价)

为了评价在所述实施例1中制造的菊苣(Cichorium intybus)、枸桔(Poncirustrifoliata RAFIN)、菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合物提取物的保湿效能，执行透明质酸评价而进行了确认。

将HaCaT和CCD-986SK细胞，以1×105细胞/ml的浓度每次2ml地分开种植到6-孔板（well plate），并在37℃、5%CO₂培养箱（incubator）中培养了24小时。培养之后，去除所有培养基，在每个孔（well）中处理利用未含有血清的培养基而稀释为适当的浓度(100ug/ml～200ug/ml)的试料2ml之后，培养了48小时。在各个孔（well）中分别回收培养基1.2ml而移到微型管（micro tube）中，并在4℃、12,000rpm下进行10分种的离心分离，并将上层液中的1ml移到了新的微型管（micro tube）中。将化验盒（assay kit）(echelon，K-1200)的样品（standard）100ul和回收的样本（sample）100ul分别放到黄板（yellow plate），并分别放入50ul的working detector而密封（sealing），然后在37℃下培育（incubation）了1小时。在培育（incubation）之后，在所有孔（well）中分别取100ul而移到检波板（detector plate）而轻打（tapping）之后密封（sealing），并在4℃下培育（incubation）了30分种。在检波板（detection plate）中去除所有溶液（solution），用1X相关浓缩液（wash concentrate）清洗（washing）了3次。在各个孔（well）中放入工作酶（working enzyme）并密封（sealing），在37℃下培育（incubation）了30分种。再次清洗（washing）3次，并放入基质溶液（substratesolution）之后，在常温阴暗条件下使之反应。在进行反应之后，以15分种为单位，在405nm下测定了吸光度。

[表5]

如所述表5所示，在此确认到与所有试料相比，在菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合物提取物中透明质酸含量（Hyaluronan content）的量增加最多。

如上所述，本发明的菊苣(Cichorium intybus)及枸桔(Poncirus trifoliata RAFIN)混合提取物增强皮脂腺细胞（sebocyte）的生长，并促进脂质的生合成以及促进保湿因子的生合成，并不是从外部人为地形成细胞屏障，而是从根本上生成脂质和保湿因子，从而能够自行形成细胞屏障，因此可有效利用于婴幼儿用细胞屏障强化外用剂、化妆料的开发及产品生产中。

Claims (8)

1.一种皮肤屏障强化用组合物，其含菊苣及枸桔的混合提取物，作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的皮肤屏障强化用组合物，其特征在于，

所述提取物不仅引导脂质生合成，还具有保湿效果。

3.根据权利要求1所述的皮肤屏障强化用组合物，其特征在于，

所述提取物是使用乙醇溶剂而提取出的。

4.根据权利要求1所述的皮肤屏障强化用组合物，其特征在于，

所述提取物通过如下方法提取：将菊苣及枸桔的混合物放入溶剂中，进行环流提取并使之沉积，然后过滤沉积物，由此获得滤液，对该滤液进行减压浓缩而进行提取。

5.一种皮肤屏障强化用皮肤外用剂组合物，其含菊苣及枸桔的混合提取物，作为有效成分。

6.根据权利要求5所述的皮肤屏障强化用皮肤外用剂组合物，其特征在于，

所述菊苣及枸桔的混合提取物在组合物总重量中占有0.001重量％～50重量％。

7.一种皮肤屏障强化用化妆料组合物，其含菊苣及枸桔的混合提取物，作为有效成分。

8.根据权利要求7所述的皮肤屏障强化用化妆料组合物，其特征在于，

所述菊苣及枸桔的混合提取物在组合物总重量中占有0.001重量％～50重量％。