CN104569428B - 一种肠道病毒71型灭活疫苗抗原酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肠道病毒71型灭活疫苗抗原酶联免疫检测试剂盒，所述检测试剂盒包含：预包被抗肠道病毒71型多克隆抗体酶标板、样品稀释液、第二抗体、酶标抗体、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。酶标板预先包被由重组肠道病毒71型结构蛋白1作为免疫源制备得到的多克隆抗体，第二抗体为由钥孔血蓝载体蛋白偶联多肽序列FGEHKQEKDL作为免疫源制备得到的单克隆抗体；酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体；抗原标准品置于盒内。本发明在测定EV71病毒灭活疫苗抗原滴度时，具有较好的灵敏度，在5.9-750ng/ml范围内具有较好的线性，线性相关系数r2大于0.99。本发明所提供的试剂盒是一种特异性好、定量准确、灵敏度高、重复性好、简单方便的测定EV71病毒灭活疫苗抗原滴度的检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是用于肠道病毒71型（EV71）灭活疫苗抗原酶联免疫检测试剂盒。
背景技术
近年来，手足口疾病肆虐我国大部分地区，给人们带来了巨大的危害。大量的流行病学研究表明，肠道病毒71型是引发手足口病的主要病原体之一。EV71属于小RNA病毒科，肠道病毒属成员。该病毒的感染疾病，多发生于5岁以下的婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，具有较高的致残和致死率。因此研制安全、有效的EV71疫苗来防控手足口疾病的传播，具有非常重要的意义。目前，在市场上还未见有相关的疫苗，而在研发的疫苗主要包括甲醛灭活疫苗、类病毒颗粒（VLP）疫苗和核酸疫苗等，其中又以甲醛灭活疫苗的进展最快。
在EV71灭活疫苗的研制过程中，均需要进行EV71病毒抗原的检测，尽管EV71病毒能产生细胞病变（CPE），能够通过病毒感染组织培养细胞检测来进行EV71抗原含量的测定。但是该方法周期较长，往往需要数天时间才能得到结果，并且由于CPE只能检测有感染活性的病毒，使得其无法正确检测出灭活疫苗中的抗原含量，如空泡病毒，失活病毒等，因此无法在疫苗的生产过程中进行有效、即时、正确的监控。而采用酶联免疫法检测EV71抗原，往往由于抗体来源的原因对检测结果造成一定的影响，尤其疫苗中杂质的非特异性吸附对检测结果造成极大的干扰。
发明内容
本发明的目的是利用两种具有高特异性的抗体建立双抗体夹心酶联免疫法（ELISA），提供一种特异性好、灵敏度高、使用方便、检测快速的肠道病毒71型灭活疫苗抗原检测试剂盒，可以应用于肠道病毒71型灭活疫苗生产及质量检定。
本发明涉及一种肠道病毒71型灭活疫苗抗原酶联免疫检测试剂盒，所述检测试剂盒包含：预包被抗肠道病毒71型多克隆抗体酶标板、样品稀释液、第二抗体、酶标抗体、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液，酶标板预先包被由重组肠道病毒71型结构蛋白1作为免疫源制备得到的多克隆抗体，第二抗体为由钥孔血蓝载体蛋白偶联多肽序列FGEHKQEKDL作为免疫源制备得到的单克隆抗体；酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体，抗原标准品置于盒内。用大肠杆菌表达的肠道病毒71型衣壳结构蛋白（VP1）重组抗原作为免疫源获得的肠道病毒71型多抗，对肠道病毒71型灭活疫苗检测具有更好的特异性，可以极大地避免疫苗培养细胞基质所引起的非特异性反应，从而提高检测的准确性。而以肠道病毒71型特异性多肽FGEHKQEKDL作为免疫源获得的小鼠单克隆抗体，因所用多肽位点的特异性及其较强的免疫原性，使得所制备的单克隆抗体具有很好的特异性。本发明在测定EV71病毒灭活疫苗抗原滴度时，具有较好的灵敏度，在5.9-750ng/ml范围内具有较好的线性，线性相关系数r2大于0.99。本发明所提供的试剂盒是一种特异性好、定量准确、灵敏度高、重复性好、简单方便的测定EV71病毒灭活疫苗抗原滴度的检测试剂盒。
本发明通过下列技术方案完成：一种肠道病毒71型灭活疫苗抗原酶联免疫检测试剂盒，所述检测试剂盒包含：预包被抗肠道病毒71型多克隆抗体酶标板、样品稀释液、第二抗体、酶标抗体、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液、终止液和抗原标准品,酶标板预先包被由重组肠道病毒71型结构蛋白1作为免疫源制备得到的多克隆抗体，包被液为碳酸盐缓冲液，包被量为0.5-2微克/孔，包被后酶标板用1%-3%的牛血清白蛋白封闭；样品稀释液为含有1%-3%的牛血清白蛋白及0.1%吐温-20，pH7.2-7.4的10毫摩尔/升磷酸盐缓冲液；第二抗体为由钥孔血蓝载体蛋白偶联多肽序列FGEHKQEKDL作为免疫源制备得到的单克隆抗体，用样品稀释液稀释500-2000倍使用；酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体，用样品稀释液稀释500-2000倍使用；酶底物A溶液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.5g，丙酮3.5ml，乙醇46.5ml，氨基比林0.2g，柠檬酸2.1g，乙二胺四乙酸钠0.3g，加水定容到1000ml后混匀；酶底物B溶液为十二水磷酸氢二钠36.85g，30%双氧水155ul，加水定容到1000ml后混匀。浓缩洗涤液为含有1%吐温-20，pH7.2-7.4的100毫摩尔/升磷酸盐缓冲液；终止液为2摩尔/升的硫酸溶液；抗原标准品置于盒内。
肠道病毒71型灭活疫苗抗原酶联免疫检测试剂盒的制备方法，具体流程图
见图1,其具体步骤如下：
(1)抗肠道病毒71型多克隆抗体的制备：用大肠杆菌表达肠道病毒71型衣壳结构蛋白（VP1）重组抗原，经过柱层析得到较纯的重组抗原，得抗原免疫兔子，所得血清用层析柱（proteinA）层析，分离得到纯化后的抗肠道病毒71型多克隆抗体。
(2)小鼠抗肠道病毒71型单克隆抗体的制备：用合成的肠道病毒71型特异性多肽FGEHKQEKDL偶联钥孔血蓝载体蛋白作为免疫源免疫小鼠（品系为Balb/c），得到抗原刺激的小鼠脾细胞，将该脾细胞和小鼠的骨髓瘤细胞（SP2/0）融合，用间接ELISA法筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞阳性克隆，然后对其进行有限稀释法亚克隆并鉴定，获得稳定的单克隆杂交瘤细胞株。进一步将体外培养的单克隆杂交瘤细胞注射于Balb/c小鼠腹腔制备腹水，所得腹水用proteinA柱层析，分离得到纯化后的抗肠道病毒71型单克隆抗体。
(3)所述酶标抗体的制备为市售。
(4)所述溶液的配制：
A、样品稀释液：1%-3%的牛血清白蛋白及0.1%吐温-20，pH7.2-7.4的10毫摩尔/升磷酸盐缓冲液。
B、浓缩洗涤液为含有1%吐温-20，pH7.2-7.4的100毫摩尔/升磷酸盐缓冲液。
C、酶底物A溶液：取3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.5g，丙酮3.5ml，乙醇46.5ml，氨基比林0.2g，柠檬酸2.1g，乙二胺四乙酸钠0.3g，加水定容到1000ml后混匀。
D、酶底物B溶液：十二水磷酸氢二钠36.85g，30%双氧水155ul，加水定容到1000ml后混匀。
E、终止液：取98%浓硫酸100ml加入800ml水中混匀即得。
(5)所述抗原标准品是由肠道病毒71型疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融、离心提取和柱层析得到。用于肠道病毒71型灭活疫苗的抗原含量的标定。
本发明具有以下优点和效果：用大肠杆菌表达的肠道病毒71型衣壳结构蛋白（VP1）重组抗原作为免疫源获得的肠道病毒71型多抗，对肠道病毒71型灭活疫苗检测具有更好的特异性，可以极大地避免疫苗培养细胞基质所引起的非特异性反应，从而提高检测的准确性。而以肠道病毒71型特异性多肽FGEHKQEKDL作为免疫源获得的小鼠单克隆抗体，因所用多肽位点的特异性及其较强的免疫原性，使得所制备的单克隆抗体具有很好的特异性。本发明在测定EV71病毒灭
活疫苗抗原滴度时，具有较好的灵敏度，在5.9-750ng/ml范围内具有较好的线性，线性相关系数r2大于0.99。本发明所提供的试剂盒是一种特异性好、定量准确、灵敏度高、重复性好、简单方便的测定EV71病毒灭活疫苗抗原滴度的检测试剂盒。
附图说明
图1为本发明工艺流程图
图2为抗肠道病毒71型病毒多克隆抗体电泳图
图3为抗肠道病毒71型病毒小鼠单克隆抗体电泳图
图4为肠道病毒71型病毒抗原标准品电泳图,M:marker；1.纯化前；2.纯化后
图5为本试剂盒肠道病毒71型病毒抗原标准品检测标准曲线及回归方程。
具体实施方式
以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的
精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
实施例1抗肠道病毒71型病毒多克隆抗体的制备
1）将肠道病毒71型衣壳结构蛋白（VP1）表达基因通过基因克隆的方法获得表达肠道病毒71型衣壳结构蛋白的重组表达菌；
2）用所得重组菌表达菌表达肠道病毒71型衣壳结构蛋白（VP1）重组抗原，经过柱层析得到较纯的重组抗原；
3）所得抗原免疫兔子，间隔一周免疫、共免疫四次，每次免疫0.5毫克。于末次免疫四周后采集血清；
4）所得血清用proteinA柱层析，分离得到纯化后的抗肠道病毒71型多克隆抗体。所得纯化抗体见图2。
实施例2抗肠道病毒71型病毒小鼠单克隆抗体的制备
1)合成的肠道病毒71型特异性多肽FGEHKQEKDL,并与钥孔血蓝载体蛋白偶联；
2）所得偶联蛋白免疫Balb/c小鼠，得到抗原刺激的小鼠脾细胞；
3）将该脾细胞和小鼠的骨髓瘤细胞（SP2/0）融合，用间接ELISA法筛选分
泌特异性抗体的杂交瘤细胞阳性克隆，然后对其进行有限稀释法亚克隆并鉴定
IgG亚型，获得稳定的单克隆杂交瘤细胞株；
4）将体外培养的单克隆杂交瘤细胞注射于Balb/c小鼠腹腔制备腹水，所得腹水用proteinA柱层析，分离得到纯化后的抗肠道病毒71型单克隆抗体。所得纯化抗体见图3。
实施例3肠道病毒71型病毒抗原标准品的制备
1）肠道病毒71型抗原标准品是由肠道病毒71型疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融、离心提取和柱层析得到。用于肠道病毒71型灭活疫苗的抗原含量的标定。所得抗原见图4。
实施例4预包被抗肠道病毒71型多克隆抗体酶标板的制备
1）用碳酸盐缓冲液将抗肠道病毒71型多克隆抗体稀释至5～20微克/毫升，按50～100微升/孔的量，加入酶标板的空中，放于4℃孵育过夜，用磷酸盐缓冲液洗液洗板3～5次；
2）用封闭液按200微升/孔的量加入封闭液，37℃孵育1～2小时，磷酸盐缓冲液（PBS）洗液洗板3～5次，晾干。
所述溶液如下：
包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，PH9.6):碳酸钠1.59克，碳酸氢钠2.93克，加蒸馏水至1000毫升。
磷酸盐缓冲液洗液（PBS，PH7.4）：磷酸二氢钾0.2克，磷酸氢二钠2.9克，氯化钠8.0克，氯化钾0.2克，Tween-200.5毫升，加蒸馏水至1000毫升。
封闭液：100毫升PBS洗液中加入1克牛血清白蛋白，溶解混匀。
实施例5试剂盒其他溶液的制备
1）样品稀释液：1%-3%的牛血清白蛋白及0.1%吐温-20，pH7.2-7.4的10毫摩尔/升磷酸盐缓冲液。
2）浓缩洗涤液为含有1%吐温-20，pH7.2-7.4的100毫摩尔/升磷酸盐缓冲液。
3）酶底物A溶液：取3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.5g，丙酮3.5ml，乙醇46.5ml，氨基比林0.2g，柠檬酸2.1g，乙二胺四乙酸钠0.3g，加水定容到1000ml后混匀。
4）酶底物B溶液：十二水磷酸氢二钠36.85g，30%双氧水155ul，加水定容
到1000ml后混匀。
5）终止液：取98%浓硫酸100ml加入800ml水中混匀即得。
实施例6肠道病毒71型灭活疫苗抗原酶联免疫检测试剂盒
1）先将肠道病毒71型抗原标准品用稀释液进行倍比系列稀释，用微量移液器将稀释好的EV71病毒抗原样品和待测抗原样品依次加入预包被的酶标板孔中，100微升/孔，每个稀释样品加两孔，同时在酶标板的另外孔中设立阴性孔2个，并留2孔作空白调零孔，放入37℃水浴箱孵育1小时，用PBS洗液洗板4次；
2）在上述酶标板的各孔中加入稀释度为1：1000的小鼠抗EV71病毒单克隆抗体，100微升/孔，放入37℃水浴箱孵育1小时，用PBS洗液洗板4次；
3）在上述酶标板的各孔中加入稀释度为1：1500的酶标抗体，100微升/孔，放入37℃水浴箱孵育1小时，用PBS洗液洗板5次；
4）取显色液A液5ml与显色液A液5ml混匀，在上述酶标板的各孔中加入显色液，100微升/孔，放入湿盒中，于室温放置20分钟；
5）在上述酶标板的各孔中加入终止液，50微升/孔，置于酶标仪在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值。
6）结果计算：
以肠道病毒71型抗原标准品浓度对数为y轴，以所对应的OD450平均值为x轴，建立标准曲线，计算回归方程，标准曲线在5.9-750ng/ml范围内具有较好的线性，线性相关系数r2>0.99，结果见图5。
将待测抗原样品的吸光度（OD450平均值）代入回归方程中计算得到待测样品中肠道病毒71型抗原的含量。
Claims (4)
1.一种肠道病毒71型灭活疫苗抗原酶联免疫检测试剂盒，所述检测试剂盒包含：预包被抗肠道病毒71型多克隆抗体酶标板、样品稀释液、第二抗体、酶标抗体、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液、终止液和抗原标准品,其特征在于酶标板预先包被由重组肠道病毒71型结构蛋白1作为免疫源制备得到的多克隆抗体，包被液为碳酸盐缓冲液，包被量为0.5-2微克/孔，包被后酶标板用1%-3%的牛血清白蛋白封闭；样品稀释液为含有1%-3%的牛血清白蛋白及0.1%吐温-20，pH7.2-7.4的10毫摩尔/升磷酸盐缓冲液；第二抗体为由钥孔血蓝载体蛋白偶联多肽序列FGEHKQEKDL作为免疫源制备得到的单克隆抗体，用样品稀释液稀释500-2000倍使用；酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体，用样品稀释液稀释500-2000倍使用；酶底物A溶液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.5g，丙酮3.5mL，乙醇46.5mL，氨基比林0.2g，柠檬酸2.1g，乙二胺四乙酸钠0.3g，加水定容到1000mL后混匀；酶底物B溶液为十二水磷酸氢二钠36.85g，30%双氧水155μL，加水定容到1000mL后混匀。
2.根据权利要求1所述肠道病毒71型灭活疫苗抗原酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述浓缩洗涤液为含有1%吐温-20，pH7.2-7.4的100毫摩尔/升磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述肠道病毒71型灭活疫苗抗原酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述终止液为2摩尔/升的硫酸溶液。
4.根据权利要求1所述肠道病毒71型灭活疫苗抗原酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述抗原标准品是由肠道病毒71型疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融、离心提取和柱层析得到。
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| GR01 | Patent grant |