CN110642945B

CN110642945B - 一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白抗体及其阻断elisa检测试剂盒

Info

Publication number: CN110642945B
Application number: CN201911022083.3A
Authority: CN
Inventors: 付元芳; 李坤; 卢曾军; 曹轶梅; 刘在新; 王省; 包慧芳; 李平花; 白兴文; 孙普; 马雪青; 张婧; 李志勇; 李冬; 陈应理
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2039-10-25
Also published as: CN110642945A

Abstract

本发明提供了通用型的口蹄疫病毒结构蛋白抗体及其阻断ELISA检测试剂盒，属于病毒检测技术领域。通用型口蹄疫病毒结构蛋白阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括以下组成：包被抗原的酶标板、浓缩生物素标记单抗；浓缩生物素标记单抗中的单抗为单克隆抗体E32；包被抗原的酶标板为通过单克隆抗体F104间接包被FMDV抗原。E32和F104抗体特异性结合在FMDV结构蛋白VP2蛋白中的型间保守抗原表位，灵敏度和特异性均高，适用于O、A与Asia1型FMDV感染或灭活疫苗免疫后结构蛋白抗体的检测，是一种FMD非免疫动物群体感染状况监测的新方法，为FMDV结构蛋白VP2表位缺失的标记疫苗提供配套鉴别诊断方法。

Description

一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白抗体及其阻断ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白抗体及其阻断ELISA检测试剂盒。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的一种烈性传染病。其发病率极高，对养殖业和国际畜产品贸易具有严重影响，因而各国高度重视对此病的预防与控制。预防与控制口蹄疫的关键是高效疫苗和准确诊断方法的应用。目前，我国口蹄疫的防治主要依靠灭活疫苗免疫，在此背景下，检测FMDV非结构蛋白(NSP)抗体是目前鉴别感染动物与免疫动物的有效方法，也是不区分血清型的FMDV感染状况监测评估方法，而基于结构蛋白的通用FMDV抗体检测方法，仍然未见报道。基于结构蛋白的通用检测方法的研究，对于非免疫背景下，FMDV感染状况的调查具有重要的应用价值，由于针对结构蛋白的抗体应答往往较非结构蛋白快而且应答水平高，因此，检测结构蛋白抗体可以更早的发现感染状况，对FMDV的防控具有重要的意义。同时，基于结构蛋白表位缺失的标记疫苗研究也仍然是空白，基于结构蛋白的表位缺失标识疫苗的研究，将可能促进廉价高效FMDV灭活疫苗的诞生，研究基于结构蛋白的表位缺失负标记疫苗及检测缺失表位抗体的ELISA方法，将为口蹄疫防控提供低成本与高效的防控技术与产品。

FMDV有七个血清型，分别为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和AsiaI型，各型之间无交叉保护，但是存在血清学上的交叉反应。目前，我国主要流行O型和A型FMDV。FMDV抗原结构复杂，不同血清型、基因型和分离株的抗原位点和抗原表位都不尽相同，存在广泛的抗原变异，同时也存在着决定病毒种属特性的保守抗原结构，开发广谱型的口蹄疫病毒抗体检测试剂盒，需要筛选到识别型间保守表位的广谱特异性单克隆抗体，但目前广谱特异性单克隆抗体稀少，这给建立广谱的FMDV抗体检测方法带来一定障碍。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白抗体，所述口蹄疫病毒结构蛋白抗体能识别型间保守表位的广谱特异性单克隆抗体，具有较高的特异性。

本发明的目的还在于基于上述通用型的口蹄疫病毒结构蛋白抗体制备的通用型口蹄疫病毒结构蛋白阻断ELISA抗体检测试剂盒，用于非免疫背景下动物FMDV感染状况的监测，具有特异性好，敏感性高的特点。

本发明提供了一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体E32，包括重链可变区HV1和轻链可变区LV1，所述重链可变区HV1的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述轻链可变区LV1的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明提供了一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体组合物，包括所述的单克隆抗体E32和通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体F104；

所述单克隆抗体F104包括重链可变区HV2和轻链可变区LV2；所述重链可变区HV2的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述轻链可变区LV2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了一种基于牛源单个B细胞抗体的通用型口蹄疫病毒结构蛋白阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括以下组成：包被抗原的酶标板、100×浓缩生物素标记单抗、100×浓缩酶标亲和素、25倍浓缩洗涤液、底物溶液、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清；

所述100×浓缩生物素标记单抗中的单抗为所述的单克隆抗体E32；

所述包被抗原的酶标板的制备方法包括先在酶标板上包被所述单克隆抗体组合物中的单克隆抗体F104，再利用所述单克隆抗体F104捕获口蹄疫病毒抗原，加入固相抗原稳定液后，孵育，吸弃上清，吹干酶标板后，密封；所述口蹄疫病毒抗原包括O、A和/或Asia1型口蹄疫病毒抗原。

优选的，所述100×浓缩生物素标记单抗的工作浓度为1：8000～32000。

优选的，所述单克隆抗体F104的包被浓度为1μg/mL～10μg/mL。

优选的，所述口蹄疫病毒抗原的工作浓度为1：4～16。

优选的，所述O型口蹄疫病毒抗原的工作浓度为1：16；

所述A型口蹄疫病毒抗原的工作浓度为1：8；

所述Asia1型口蹄疫病毒抗原的工作浓度为1：4。

优选的，所述口蹄疫病毒抗原为Asia1型口蹄疫病毒抗原。

本发明提供了所述单克隆抗体E32或所述单克隆抗体组合物在制备非免疫背景下O、A或Asia1型口蹄疫病毒感染状况的检测试剂中的应用。

本发明提供了所述单克隆抗体E32或所述单克隆抗体组合物在制备O、A或Asia1型口蹄疫病毒感染或免疫动物后结构蛋白抗体的检测试剂中的应用。

本发明提供了一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体E32，包括重链可变区HV1和轻链可变区LV1，所述重链可变区HV1的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述轻链可变区LV1的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。所述单克隆抗体E32是利用单个B细胞抗体技术制备的一株FMDV通用性单抗，能够识别FMDVVP2蛋白表位，也是血清型间保守的抗原表位，因此，能够实现通用型的口蹄疫病毒的特异性识别和检测。

本发明提供了一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体组合物，包括所述的单克隆抗体E32和通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体F104。所述单克隆抗体F104是利用牛源单个B细胞抗体技术制备的一株O、A或Asia1型FMDV通用型单克隆抗体，所识别表位位于FMDVVP2蛋白，是血清型间保守的抗原表位，因此，所述单克隆抗体F104与单克隆抗体E32相同，均是FMDV结构蛋白通用型单克隆抗体。所述单克隆抗体组合物中单克隆抗体E32作为检测抗体，单克隆抗体F104作为捕获抗体应用于制备检测口蹄疫病毒抗体的试剂盒中。

本发明提供了一种基于牛源单个B细胞抗体的通用型口蹄疫病毒结构蛋白阻断ELISA抗体检测试剂盒，单克隆抗体F104包被在酶标板，作为捕获抗体，捕获FMDV灭活抗原，本发明采用间接捕获法包被抗原，既消除了直接包被抗原所产生的非特异性反应，又可以更好的展示抗原结构，有利于抗原与抗体的特异性结合；以生物素标记的单克隆抗体E32作为检测抗体，与待测样本中识别相同表位的抗体竞争结合抗原，然后以生物素与亲合素的特异结合作为指示系统，显示样本中抗体的丰度，具有特异好、敏感性高、试剂构成简单的特点，而且可以用于不同血清型病毒感染动物血清的检测。特异性及敏感性实验结果表明，采用本发明通过的试剂盒对121份来自感染后3～230天牛检测敏感性为100％；对感染后12天至1年的79份羊血清的检测敏感性达91.1％；对80份感染后3天～6个月的猪血清的检测敏感性达81.3％；对来自临床健康牛、羊与猪血清的特异性均为100％。

附图说明

图1为各稀释度阳性标准血清阻断率进行对比分析结果图；

图2为各反应条件下的标准阳性血清阻断率进行对比分析结果图；

图3为牛的阴性血清与阳性血清检测结果图；

图4为羊的阴性血清与阳性血清检测结果图；

图5为猪的阴性血清与阳性血清检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体E32，包括重链可变区HV1和轻链可变区LV1，所述重链可变区HV1的氨基酸序列如MNPLWTLLFVLSAPRGVLSQVQLRESGPSLVKPSQTLSLTCTVSGFSLSNYALNWVRQAPGKALECLGGIGPSGHTDYNPALKSRLIITKDNSKNQVSLSVSSVTPEDTATYICARDSGIYGTSGWGCIGGFDDNYIDAWGHGLLVTVSS(SEQ ID No.3)所示；所述轻链可变区LV1的氨基酸序列如MSTMAWSPLFLTLVAVYTGSWAQAVLTQPSSVSGSLGQRVSITCSGSSNNIGAHGVGWYQQIPGSGLRTIIYNNSKRPSGVPDRFSGSKSGNTATLTISSLQAGDEADYFCATSDYSTRSSAFGSGTTLTVLGQPKSAPSVTLFPPSKEELSANK(SEQ ID No.4)所示。

在本发明中，所述单克隆抗体E32的制备方法，优选包括以下步骤：将所述抗体E32的重链可变区和轻链可变区的编码序列分别与牛IgG2重链和轻链的恒定区序列连接后分别插入pcDNA3.4真核表达载体中，重链和轻链表达质粒按比例混合转染CHO悬浮培养细胞，表达获得完整IgG2亚型抗体，抗体经亲合层析纯化得到。所述抗体E32的制备方法详见专利文献申请号为CN201810929067.1的专利中的描述。

本发明提供了一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体组合物，包括所述的单克隆抗体E32和通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体F104；所述单克隆抗体F104包括重链可变区HV2和轻链可变区LV2；所述重链可变区HV2的氨基酸序列如MNPLWTLLFVLSAPRGVLSQVQLRESGPSLVKPSQTLSLTCTVSGFSLSSYDVGWVRQAPGKGLECLGGIGNRGNTKYNPALKSRLSITKDNSKSQVSLSLSSVTSEDTATYYCTKSYGGNDVYDCYDSEYWGQGLLVTVSS(SEQ ID No.1)所示；所述轻链可变区LV2的氨基酸序列如MAWSPLFLTLVAVYTGSWAQAVLTQPSSVSGSLGQRVSITCSGSSNNIGRYSVGWYQQVPGSGLRTIIYISSSRPSGVPDRFSGSKSGNTATLTISSLQAEDEADYFCATNDYSSDTTIFGSGTTLTVLGQPKS(SEQ ID No.2)所示。

在本发明中，所述单克隆抗体F104的制备方法同上述单克隆抗体E32的制备方法。在单克隆抗体组合物中，所述单克隆抗体F104和单克隆抗体E32的配比没有特殊限制，根据制备试剂的实际使用浓度确定两种抗体的配合使用浓度。

本发明提供了一种基于牛源单个B细胞抗体的通用型口蹄疫病毒结构蛋白阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括以下组成：包被抗原的酶标板、100×浓缩生物素标记单抗、100×浓缩酶标亲和素、25倍浓缩洗涤液、底物溶液、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清。

在本发明中，所述100×浓缩生物素标记单抗中的单抗为上述记载的单克隆抗体E32。所述100×浓缩生物素标记单抗的工作浓度优选为1：8000～32000，更优选为1：16000。本发明对所述生物素标记单抗的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的标记方法即可。

在本发明中，所述包被抗原的酶标板的制备方法包括先在酶标板上包被所述单克隆抗体组合物中的单克隆抗体F104，再利用所述单克隆抗体F104捕获口蹄疫病毒抗原，加入固相抗原稳定液(含质量浓度5％蔗糖的PBS液)后，孵育，吸弃上清，吹干酶标板后，密封；所述口蹄疫病毒抗原包括O、A和/或Asia1型口蹄疫病毒抗原。

所述单克隆抗体F104的包被浓度优选为1μg/mL～10μg/mL，更优选为2～8μg/mL，最优选为5μg/mL。所述口蹄疫病毒抗原的工作浓度优选为1：4～16。根据口蹄疫病毒的血清型种类不同，工作浓度有所差异，具体如下：所述O型口蹄疫病毒抗原的工作浓度优选为1：16；所述A型口蹄疫病毒抗原的工作浓度为1:8；所述Asia1型口蹄疫病毒抗原的工作浓度为1：4。不同血清型的病毒抗原表现出不同的阻断率，以阳性检出率最高的抗原作为最佳捕获抗原，所述口蹄疫病毒抗原优选为Asia1型口蹄疫病毒抗原。

在本发明中，所述试剂盒包括100×浓缩酶标亲和素。所述100×浓缩酶标亲和素优选为辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素。HRP标记的亲和素的来源没有特殊限制采用本领域所熟知的HRP标记的亲和素即可。

在本发明中，所述试剂盒包括25倍浓缩洗涤液。所述25倍浓缩洗涤液的制备方法优选如下：每500mL超纯水中加NaCl 200g、KCl 5g、Na₂HPO₄·12H₂O 72.5g、KH₂PO ₄5g和12.5mL吐温20，补超纯水定容至1000mL，pH值调整为7.4，经高压灭菌，室温存放备用。

在本发明中，所述试剂盒包括底物溶液。所述底物溶液的种类根据酶标记亲和素中酶的种类确定。当HRP标记亲和素时，所述底物溶液为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物。

在本发明中，所述试剂盒包括终止液。所述终止液优选为0.3mol/L H₂SO₄溶液。

在本发明中，所述试剂盒包括阳性对照血清和阴性对照血清。所述阳性对照血清为采自口蹄疫病毒感染后1～3个月的牛、羊或猪，经检测，非结构蛋白抗体与结构蛋白抗体均为阳性，经无菌处理后加保存剂制备。所述阴性对照血清为采自非免疫健康牛、羊或猪，经检测口蹄疫病毒结构蛋白与非结构蛋白抗体均为阴性，经无菌处理后加保存剂保存。

在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选包括以下步骤：

A1.将待测血清用1×PBST稀释，吸取稀释后的待测血清加入捕获有抗原的酶标板中，每孔加入100μL，室温作用1h；所述血清的稀释度优选为1：1；

A2.用1×PBST洗涤液洗板，反复洗5次，最后一次拍干；

A3.将100×浓缩生物素标记单抗按1：100稀释至1×PBST中，加入酶标板，每孔加入100μL，室温(18～25℃)作用30min；

A4.同上洗涤，最后一次拍干，HRP标记亲和素按1：100稀释至1×PBST中，加入酶标板，每孔加入100μL，室温(18～25℃)作用15min；

A5.每孔加入100μL的底物溶液，室温(18～25℃)作用10～15min；

A6.加终止液，每孔100μL，轻振混匀，于10min内用酶标仪读450nm吸光值(OD_450nm)；

A7.阻断率计算：阻断率(PI)＝(1-样品OD_450nm值/阴性对照OD_450nm值)×100％；

A8.试验成立的条件：阴性对照OD_450nm值-阳性对照OD_450nm值≥1.0，且阳性对照阻断率应≥50％；

A9.判定标准：是否存在口蹄疫病毒抗体，通过计算每个血清样品的PI判定：PI值大于或等于50％，判为FMDV抗体阳性；PI值小于50％，判为FMDV抗体阴性。

本发明提供了所述单克隆抗体E32或所述单克隆抗体组合物在制备非免疫背景下O、A或Asia1型口蹄疫病毒感染状况的检测试剂中的应用。所述检测试剂包括上述记载的通用型口蹄疫病毒结构蛋白阻断ELISA抗体检测试剂盒。

本发明提供了所述单克隆抗体E32或所述单克隆抗体组合物在制备O、A或Asia1型口蹄疫病毒感染或免疫动物后结构蛋白抗体的检测试剂中的应用。所述检测试剂包括基于竞争法制备体外诊断试剂，例如包括胶体金体外诊断试剂、化学发光体外诊断试剂或ELISA检测试剂等。

下面结合实施例对本发明提供的一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白抗体及其阻断ELISA检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.材料

碳酸盐缓冲液(Na₂CO₃/NaHCO₃)及明胶购自SIGMA公司。

BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Beyotime公司。

EZ-Link Plus Activated Peroxidase试剂盒购自Thermo公司。

辣根过氧化物酶标记亲和素为购买的商品化试剂(Genscript产品)。

FMDV广谱型单克隆抗体F104和E32均由本实验室采用单个B细胞抗体制备技术研制并保存，抗体制备方法详见专利文献CN201810929067.1中的描述(已获专利号ZL201810929067.1)。

对照血清与O型、A型病毒灭活抗原均由国家口蹄疫参考实验室制备保存。

口蹄疫病毒Asia1型灭活抗原为2015年生产的贮备灭活抗原。

2、试剂的制备及酶标板的包被方法

1)包被抗原的酶标板的制备方法如下：

将单抗F104以1μg/mL包被酶标板，4℃过夜，添加O、A或Asia1型口蹄疫病毒抗原，加入固相抗原稳定液后，室温孵育1h，吸弃上清，吹干酶标板后，密封2～8℃冷藏保存。

每个试剂盒包括两块包被抗原的酶标板，真空密封保存，保存期可达1年。

2)生物素标记单克隆抗体E32的制备方法如下：

A1、首先使用截留量100KDa超滤管把单抗E32置换至PBS缓冲液中。4000rpm离心10min。

A2、取180μL超纯水加入到1mg生物素中，稀释至10mM；分别按1：32、1：64和1：128比例加入生物素，即分别添加1μL、2μL和4μL。

A3、4℃冰上放置2h。

A4、用超滤管置换至抗体存储缓冲液中。

A5、加入等体积100％甘油，-70℃保存。

每个试剂盒包括1管(300μL)生物素标记单克隆抗体E32。

3)100×浓缩辣根过氧化物酶标记的亲和素：1管(300μL)，为辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素，为购买的商品化试剂(BioFX，Freiburg,Germany)，通过将酶标亲和素稀释于抗体保存液(Sigma)中制备，保存期可达1.5年。

4)25倍浓缩洗涤液：2瓶(50mL)，向500mL超纯水中加NaCl 200g、KCl 5g、Na₂HPO₄·12H₂O 72.5g、KH₂PO₄ 5g和12.5mL吐温20，补超纯水定容至1000mL，pH值为7.4，高压灭菌(10pa，15min)，室温存放备用；

5)底物溶液：1瓶(25mL)，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液为购买的商品化试剂(BioFX，Freiburg,Germany)，直接分装使用，保存期4年。

6)终止液：1瓶(25mL)，配制0.3MH₂SO₄水溶液，利用超纯水稀释分析纯浓硫酸配制得到；

7)所述阳性对照血清：采自口蹄疫病毒感染后1～3个月的牛、羊或猪，经检测，非结构蛋白抗体与结构蛋白抗体均为阳性，经无菌处理后加保存剂制备得到；

8)所述阴性对照血清：采自非免疫健康牛、羊或猪，经检测口蹄疫病毒结构蛋白与非结构蛋白抗体均为阴性，经无菌处理后加保存剂保存。

9)其他物品：包括一次性封板膜4片与使用说明书。

制备的检测试剂盒的检测步骤如下：

S1、于血清稀释板中，将待测血清按1：1比例稀释于1×PBST中，吸取稀释好的样品液加入捕获了抗原的酶标板中，每孔加入100μL，室温作用1h；

S2、用1×PBST洗涤液洗板，反复洗5次，最后一次拍干；

S3、将100×浓缩生物素标记单抗按1：100稀释至1×PBST中，加入酶标板，每孔加入100μL，室温(18～25℃)作用30min；

S4、同上洗涤，最后一次拍干，辣根过氧化物酶(HRP)标记亲和素1：100稀释至1×PBST中，加入酶标板，每孔加入100μL，室温(18～25℃)作用15min；

S5、每孔加入100μL的底物溶液，室温(18～25℃)作用10～15min；

S6、加终止液，每孔100μL，轻振混匀，于10min内用酶标仪读450nm吸光值(OD_450nm)；

S7、阻断率计算：阻断率(PI)＝(1-样品OD_450nm值/阴性对照OD_450nm值)×100％；

S8、试验成立的条件：阴性对照OD_450nm值-阳性对照OD_450nm值≥1.0，且阳性对照阻断率PI应≥50％；

S9、判定标准：是否存在口蹄疫病毒抗体，通过计算每个血清样品的PI判定：PI值大于或等于50％，判为FMDV抗体阳性；PI值小于50％，判为FMDV抗体阴性。

实施例2

1.血清样本

临床健康动物血清样品包括：127份健康牛血清样品和30份健康猪血清样品，来自临床健康牛，经检测O、A、Asia1型结构蛋白抗体和非结构蛋白抗体均为阴性；87份羊血清样品和88份猪血清样品来自非疫区非免疫健康羊和猪。感染动物血清样品包括：O型或A型FMDV攻击感染后3～230天的牛血清样品共121份；O型攻击感染后7天至1年的羊血清样本79份；O型或A型攻击后7天至6个月猪血清样本80份。质控血清包括：O、A、Asia1型FMDV攻击感染猪、牛、羊血清各2份，经检测非结构蛋白抗体均为阳性。

2.口蹄疫病毒结构蛋白抗体阻断ELISA检测方法最佳反应条件的确定

1)生物素标记单克隆抗体和口蹄疫病毒不同血清型抗原工作浓度的测定

方阵滴定法确定各血清型灭活抗原和生物素标记单克隆抗体的工作浓度，将单抗F104以1μg/mL包被酶标板，4℃过夜，加不同浓度(纵向梯度)稀释的A、O和Asia1型灭活抗原，室温反应2h，再加不同倍数稀释的(横向梯度)生物素标记单克隆抗体与之反应30min，再加工作浓度的HRP标记亲和素反应15min，加底物显色，终止，酶标仪读板，取OD₄₅₀值达2.0时的稀释度为最适工作浓度。

2)最佳捕获抗原的选择

将单抗F104以1μg/mL包被酶标板，4℃过夜，按上述方法中已确定的不同血清型抗原和生物素标记单克隆抗体的工作浓度，将1：1稀释的阴阳性对照血清及背景清楚的不同血清型感染动物血清，进行阻断ELISA检测。根据公式：阻断率(PI)＝(1-样品OD_450nm值/阴性对照OD_450nm值)×100％，计算每份样品的阻断率，取阳性检出率最高的抗原作为最佳捕获抗原。

3)最佳血清稀释度的确定

捕获抗原与生物素标记单克隆抗体的工作浓度确定之后，将标准阴、阳性血清做1：1，1：5，1：10三个稀释度，进行阻断ELISA检测。根据每个稀释度阴、阳性对照血清OD值，按照式I计算出阳性对照血清阻断率(PI)。

阻断率(PI)＝(1-样品或标准阳性血清OD_450nm值/阴性标准血清OD_450nm值)×100％式I

对获得的阻断率进行比较，取阴、阳性血清的阻断率差异最大的稀释度作为最佳血清稀释度。

4)加入血清后反应时间及反应温度的选择

设定了以下几个反应条件：①4℃反应过夜(16～20h)；②37℃反应60min；③37℃反应90min；④37℃反应120min；⑤室温(18～25℃)反应30min；⑥室温(18～25℃)反应60min。对各反应条件下的阳性对照血清阻断率进行对比分析，取阻断率达最大时的最短作用时间为最佳反应条件。

5)判定标准的确定

根据背景清楚的临床健康的非免疫动物血清与感染动物血清样本阻断率的检测结果，来确定本方法的判定标准；基于检测非免疫健康牛阴性血清127份，感染牛血清115份；健康羊阴性血清87份，感染羊血清87份；健康猪阴性血清88份，感染猪血清74份的结果，统计感染动物与健康动物血清样本阻断率分布区间，确定本阻断ELISA的判定标准。

6)本方法的特异性和敏感性检测

根据确定的判定标准，对来自非免疫健康牛、羊和猪的血清、临床健康牛血清与感染动物血清样本的检测结果进行分析，确定本方法的特异性和敏感性。

试验结果

1)生物素标记单抗和口蹄疫病毒不同血清型抗原最适工作浓度

通过方阵滴定法检测结果(见表1)，确定的生物素标记E32单抗的最适工作浓度为1：16000，口蹄疫病毒O、A和Asia1型抗原最适工作浓度分别为1：16、1：8和1：4。

表1口蹄疫病毒O型抗原与生物素标记单抗工作浓度测定结果

*注：(+)表示OD₄₅₀值大于3.5。

2)最佳捕获抗原的选择

根据对18份来自不同血清型感染动物血清阻断率统计结果(见表2)，使用O型抗原时，1份O型感染羊血清和1份A型感染猪血清出现漏检；使用A型抗原时，2份O型感染牛血清出现漏检；只有使用Asia1型抗原时，所有不同血清型感染动物血清均呈阳性结果；因此，确定取Asia1型抗原作为最佳捕获抗原。

表2不同血清型感染动物血清阻断率统计结果

3)最佳血清稀释度的确定

通过对各稀释度阳性标准血清阻断率进行对比分析(见图1)，血清1：1稀释进行检测，获得的阴、阳性血清的阻断率差异最大，能够满足对检测敏感性的要求，因而确定血清最佳稀释度为1：1。

4)加入血清后反应时间及反应温度的确定

加入阳性血清后，对各反应条件下的标准阳性血清阻断率进行对比分析(见图2)，结果显示，在检测牛、羊血清时，室温30min阻断率低于其他条件，其他各条件下阻断率无明显差别。在检测猪血清时，室温30min阳性血清阻断率低于判定标准以下，出现漏检；4℃过夜反应18～24h的阻断率最高，但耗时较长，其他反应条件下阻断率无明显差别，且都在判定标准的阳性结果范围，可以保证检测敏感性；因而，确定最佳反应条件是，室温作用1h。

实施例3

经过实施例2中得到的最佳反应条件最终制定了通用型口蹄疫病毒结构蛋白阻断ELISA抗体检测方法的操作流程

①包被：用包被缓冲液(0.05mol/L pH值9.6的碳酸盐缓冲液)稀释单抗F104至1μg/mL，加入酶标板，每孔加100μL，4℃过夜。将此酶标板用PBST洗涤5遍，拍干。

②封闭：每孔加封闭液(含1％BSA的PBS溶液)100μL，室温封闭1h，用PBST洗涤3遍，拍干。

③用单抗F104捕获口蹄疫病毒Asia1型灭活抗原：将Asia1型抗原用PBS稀释至1：4的工作浓度，每孔100μL加入酶标板，室温反应2h，PBST洗涤5遍，拍干。

④捕获抗原板的稳定：将含5％蔗糖的PBS液加入酶标板，每孔100μL，室温反应30min，弃液，吹干保存。

⑤加待测血清：用1×PBST将阳性、阴性对照血清及待测血清样品1：1稀释，每孔100μL加入酶标板，室温反应1h，PBST洗涤5遍，拍干。

⑥加生物素标单抗：用1×PBST将生物素标单抗按1：100体积比稀释，每孔100μL加入酶标板，室温反应30min，PBST洗涤5遍，拍干。

⑦加酶标亲和素：用1×PBST将HRP标亲和素按1：100体积比稀释，每孔100μL加入酶标板，室温反应15min，PBST洗涤5遍，拍干。

⑧加底物显色：每孔100μL加入TMB底物溶液，室温避光反应10～15min。

⑨终止：每孔加入0.3mol/LH₂SO₄使反应终止；用酶标仪测定450_nm波长OD值。

⑩计算血清样品抗体阻断率，判定结果。

A.阳性及阴性判定标准(临界值)的确定

根据牛、羊和猪的阴性血清与阳性血清检测结果(图3、4、5)，确定判定标准为：阻断率大于或等于50％判为阳性，如阻断率小于50％判为阴性。非免疫背景下，样品阳性结果，说明该动物存在FMDV感染的情况，应该采取相应的防控措施。根据以下公式计算测试样本的阻断率(PI)，PI＝(1-测试样本OD_450nm值/阴性对照平均OD_450nm值)×100％。

B.特异性及敏感性判定结果

检测临床健康牛血清、非免疫健康羊血清、非免疫健康猪血清及感染动物血清后，以检测阴性血清数量与总健康血清数的比值计算特异性，以检测阳性血清数与感染动物血清总数的比值计算敏感性。从结果(表3)可以看出本方法对121份来自感染后3～230天牛检测敏感性为100％，对感染后12天至1年的79份羊血清的检测敏感性达91.1％，对80份感染后3天～6个月的猪血清的检测敏感性达81.3％。对来自临床健康牛、羊与猪血清的特异性均为100％。

表3通用型口蹄疫病毒结构蛋白阻断ELISA抗体特异性及敏感性检测结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白抗体及其阻断ELISA检测试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asn Pro Leu Trp Thr Leu Leu Phe Val Leu Ser Ala Pro Arg Gly

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys

20 25 30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Ser Ser Tyr Asp Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Cys Leu Gly Gly Ile Gly Asn Arg Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Pro

65 70 75 80

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

85 90 95

Val Ser Leu Ser Leu Ser Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

100 105 110

Tyr Cys Thr Lys Ser Tyr Gly Gly Asn Asp Val Tyr Asp Cys Tyr Asp

115 120 125

Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 2

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Trp Ser Pro Leu Phe Leu Thr Leu Val Ala Val Tyr Thr Gly

1 5 10 15

Ser Trp Ala Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser

20 25 30

Leu Gly Gln Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Asn Asn Ile

35 40 45

Gly Arg Tyr Ser Val Gly Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ser Gly Leu

50 55 60

Arg Thr Ile Ile Tyr Ile Ser Ser Ser Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Thr Asn Asp

100 105 110

Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Ile Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val

115 120 125

Leu Gly Gln Pro Lys Ser

130

<210> 3

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asn Pro Leu Trp Thr Leu Leu Phe Val Leu Ser Ala Pro Arg Gly

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys

20 25 30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Ser Asn Tyr Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu

50 55 60

Glu Cys Leu Gly Gly Ile Gly Pro Ser Gly His Thr Asp Tyr Asn Pro

65 70 75 80

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ile Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln

85 90 95

Val Ser Leu Ser Val Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

100 105 110

Ile Cys Ala Arg Asp Ser Gly Ile Tyr Gly Thr Ser Gly Trp Gly Cys

115 120 125

Ile Gly Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Leu

130 135 140

Leu Val Thr Val Ser Ser

145 150

<210> 4

<211> 155

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Thr Met Ala Trp Ser Pro Leu Phe Leu Thr Leu Val Ala Val

1 5 10 15

Tyr Thr Gly Ser Trp Ala Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val

20 25 30

Ser Gly Ser Leu Gly Gln Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser

35 40 45

Asn Asn Ile Gly Ala His Gly Val Gly Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly

50 55 60

Ser Gly Leu Arg Thr Ile Ile Tyr Asn Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala

100 105 110

Thr Ser Asp Tyr Ser Thr Arg Ser Ser Ala Phe Gly Ser Gly Thr Thr

115 120 125

Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe

130 135 140

Pro Pro Ser Lys Glu Glu Leu Ser Ala Asn Lys

145 150 155

Claims

1.一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体E32，包括重链可变区HV1和轻链可变区LV1，其特征在于，所述重链可变区HV1的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述轻链可变区LV1的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的单克隆抗体E32和通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体F104；

3.一种基于牛源单个B细胞抗体的通用型口蹄疫病毒结构蛋白阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括以下组成：包被抗原的酶标板、100×浓缩生物素标记单抗、100×浓缩酶标亲和素、25倍浓缩洗涤液、底物溶液、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清，其特征在于，所述100×浓缩生物素标记单抗中的单抗为权利要求1所述的单克隆抗体E32；

所述包被抗原的酶标板的制备方法包括先在酶标板上包被权利要求2所述单克隆抗体组合物中的单克隆抗体F104，再利用所述单克隆抗体F104捕获口蹄疫病毒抗原，加入固相抗原稳定液后，孵育，吸弃上清，吹干酶标板后，密封；所述口蹄疫病毒抗原为O、A和/或Asia1型口蹄疫病毒抗原。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述100×浓缩生物素标记单抗的工作浓度为1：8000～32000。

5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体F104的包被浓度为1μg/mL～10μg/mL。

6.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述口蹄疫病毒抗原的工作浓度为1：4～16。

7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述O型口蹄疫病毒抗原的工作浓度为1：16；

所述A型口蹄疫病毒抗原的工作浓度为1：8；

所述Asia1型口蹄疫病毒抗原的工作浓度为1：4。

8.根据权利要求3或7所述试剂盒，其特征在于，所述口蹄疫病毒抗原为Asia1型口蹄疫病毒抗原。

9.权利要求1所述单克隆抗体E32或权利要求2所述单克隆抗体组合物在制备非免疫背景下O、A或Asia1型口蹄疫病毒感染状况的检测试剂中的应用。

10.权利要求1所述单克隆抗体E32或权利要求2所述单克隆抗体组合物在制备O、A或Asia1型口蹄疫病毒感染或免疫动物后结构蛋白抗体的检测试剂中的应用。