CN104558109B - 源于油菜花粉的具有ace抑制活性的多肽化合物及应用 - Google Patents
源于油菜花粉的具有ace抑制活性的多肽化合物及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种源于油菜花粉的具有抑制血管紧张素转换酶（angiotensin‑converting enzyme,ACE）活性的多肽化合物LAVNLIPFP，其氨基酸序列分别为Leu‑Ala‑Val‑Asn‑Leu‑IIe‑Pro‑Phe‑Pro。多肽LAVNLIPFP具有ACE抑制活性，作为高血压、心脏病和心血管病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及多肽LAVNLIPFP制备抑制血管紧张素转换酶（ACE）及降血压中的应用。
背景技术
高血压药物研究的一个靶点是抑制血管紧张素转化酶（angiotensin-convertingenzyme,ACE），ACE是存在于血管内皮细胞、上皮吸收细胞、神经上皮细胞、雄性生殖细胞中的一种含锌的二肽羧酶。在人体肾素－血管紧张素系统（RAS）和激肽酶释放酶－激肽系统（KKS）中，血管紧张素转换酶（ACE）对机体血压和心血管功能起着重要的调节作用（如图1）。在RAS中，ACE是起限速作用，ACE可将不具活性的十肽血管紧张素I转化为具有强烈收缩血管作用的八肽血管紧张素II，同时血管紧张素II还能刺激醛固酮的分泌进而促进肾脏对水、钠、钾的重吸收，引起钠贮量和血容量的增加，使血压升高。在KKS中，ACE还能催化与心血管系统具有相互作用的神经肽、脑啡肽和P物质等的降解。血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂是目前常规应用的六大类降压药物之一，ACE抑制剂不仅仅用于治疗高血压，同时已证实可以防止心力衰竭，减少心肌梗死、脑卒中、糖尿病和肾损害发生的危险。ACE抑制剂对心血管疾病的防治具有两个明显的特征：确切的降压疗效和独特的心脏及血管保护。ACE抑制剂可能通过阻止心房的电重构和解剖重构，预防了心房纤颤（房颤，AF）的发生。多肽是一类重要的ACE抑制剂，天然蛋白质的酶解肽是ACE抑制剂肽的主要来源（文献2：LieselotVercruysse,John Van Camp,Guy Smagghe,J.Agric.Food Chem2005,53:8106-8115）。血管紧张素转化酶对于机体血压和心血管功能起着重要的调节作用，因此抑制ACE活性的药物在心血管、心力衰竭等疾病的治疗中发挥重要作用。多肽类的ACE抑制剂在降血压的同时不会引起常见降压药物的干咳等副作用。
发明内容
本发明的目的是提供多肽LAVNLIPFP在抑制ACE活性中的应用；多肽LAVNLIPFP具有ACE抑制活性，作为高血压、心脏病和心血管病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明以所述多肽LAVNLIPFP为抑制ACE活性的有效成份。
其具有序列表SEQ ID NO：1中氨基酸序列；多肽LAVNLIPFP为ACE抑制剂的活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。
具有抑制ACE活性的多肽化合物LAVNLIPFP的氨基酸序列为Leu-Ala-Val-Asn-Leu-IIe-Pro-Phe-Pro。单链线性结构，分子量为983.2Da，白色粉末状，易溶于水，对ACE活性具有很强的抑制作用，IC50为23.3μM。
多肽LAVNLIPFP具备ACE抑制剂所要求的特征：
1.ACE倾向于C末端三肽的每个位置含有疏水性氨基酸的底物或抑制剂，C末端为Try，Phe，Tyr和Pro而N端为支链氨基酸的肽段具有较强的ACE抑制活性。多肽LAVNLIPFP的C末端三肽均为疏水性氨基酸分别为Pro、Phe和Pro，C末端为Pro，N末端为带有支链的氨基酸Leu，因此完全满足ACE抑制剂的构象要求。
2.肽的疏水性是影响其抑制活性的重要原因，抑制活性高的肽都含有较多的疏水氨基酸。多肽LAVNLIPFP的疏水氨基酸有Ala，Val，Leu，Phe，IIe，Pro,含有较多的疏水氨基酸。
经ACE抑制活性检测，多肽LAVNLIPFP的IC50为23.3μM。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明首次从油菜花粉中获得并确定了活性化合物的结构，化合物具有较好的抑制ACE的活性，因此作为治疗高血压、心脏病等心血管疾病药物和保健品的先导化合物具有良好的潜力和应用前景。
附图说明
图1ACE对血压的调节作用框图。
具体实施方式
实施例1多肽LAVNLIPFP的制备
20g油菜蜂花粉加入液氮研磨破壁后，加入pH=7.4、50mM Tris-HCl缓冲液150ml,超声提取三次（一次：400W，超声4s，停4s，80个循环）；提取结束后于4℃、25000g离心1h，取上清液，加入上清液4倍体积的混合溶剂（丙酮：乙醇：乙酸=50:50:0.1（体积比））沉淀过夜；沉淀结束后将所有样品于4℃、25000g离心30分钟，弃去上清，取沉淀用丙酮洗涤脱色，然后于4℃、25000g离心15分钟，弃去上清，沉淀继续用丙酮反复洗涤直至上清无色，最后用体积浓度75%乙醇洗涤沉淀并于4℃、25000g离心10分钟，弃上清，取沉淀物冷冻干燥，得冻干蛋白。冻干蛋白用含有8M尿素的pH=7.4、100mM NH4HCO3缓冲液复溶，以酶：蛋白=1:25（w/w）比例加入胰蛋白酶，37℃酶解20小时。上述酶解产物经制备色谱分离，色谱柱为C18（20X250mm，10μm）,所用的流动相A为质量浓度0.1%甲酸/水溶液，流动相B为质量浓度0.1%的甲酸/乙腈溶液，流速为2mL/min，洗脱过程如下：5%B—35%B(V/V)—80%B(V/V)。将在280nm下所检测到的色谱峰分别收集得到的不同组分冷冻干燥，为乳白色粉末状样品。
所得样品经反相液相色谱-串联质谱系统（RPLC-MS/MS）分析：将冷冻干燥后的酶解样品用体积浓度0.1%甲酸溶液配制为0.4μg/μL，进样20μL进行LTQ线性离子阱质谱（配置纳升级电喷雾源）分析。利用Xcalibur软件(Thermo)进行系统控制和数据收集。实验得到的质谱数据结果分别在honeybee,Brassica campestris L.蛋白质数据库（http://www.uniprot.org/）中进行检索，技术重复3次，数据库检索软件为SEQUEST。获得序列为Leu-Ala-Val-Asn-Leu-IIe-Pro-Phe-Pro的多肽。
实施例2多肽LAVNLIPF的ACE抑制活性检测
ACE在37℃、PH8.3的条件下催化分解血管紧张素I的模拟底物Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)产生马尿酸，该物质在228nm处有特征紫外吸收峰。当加入ACE抑制物时，ACE对HHL的催化作用受到抑制，马尿酸的生成量会减少。通过测定加入抑制剂前后的马尿酸紫外吸收值可以计算出抑制活性的大小。
反应体系
缓冲液为0.05M，PH8.3硼酸盐缓冲液；底物为Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)，MW429.47，用上述缓冲液配成5mM；ACE（angiotensin-converting enzyme）用上述缓冲液配成0.1U/ml。
ODA（对照组，为不存在抑制剂但存在酶时的吸光值）：50μl缓冲液+50ulHHL+50μl缓冲液于37℃水浴5min，然后加入50μlACE，37℃水浴30min，加入200μl、1M的HCl终止反应，再加入1ml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取0.8ml上清，90℃水浴干燥15min,重溶于0.8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为ODA。
ODB（多肽样品组，为存在抑制剂和酶时的吸光值）:50μl样品+50μlHHL+50μl缓冲液于37℃水浴5min，然后加入50μl ACE，37℃水浴30min，加入200μl、1M的HCl终止反应，再加入1ml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取0.8ml上清，90℃水浴干燥15min,重溶于0.8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为ODB。
ODC（空白组，为不存在抑制剂和酶时的吸光值）：50μl缓冲液+50μlHHL+50μl缓冲液于37℃水浴5min，然后加入50μl缓冲液，37℃水浴30min，加入200μl、1M的HCl终止反应，再加入1ml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取0.8ml上清，90℃水浴干燥15min,重溶于0.8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为ODC。
ACE抑制率（%）=(ODA-ODB)/(ODA-ODC)×100%
分别用0.5mg/ml,0.1mg/ml,0.01mg/ml,0.001mg/ml,0.0001mg/ml的多肽浓度，按上述方法进行ACE抑制活性检测。结果如下表：
经IC50计算器计算该序列的IC50为22.95μg/mL，即23.3μM。
Claims (2)
1.一种具有ACE抑制活性的源于油菜花粉的多肽化合物在制备ACE抑制剂或心血管药物中的应用，其特征在于；所述多肽为LAVNLIPFP，具有序列表SEQ ID NO：1 中氨基酸序列；该多肽的氨基酸序列具体为，Leu-Ala-Val-Asn-Leu-IIe-Pro-Phe-Pro。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：所述ACE抑制剂或心血管药物是以多肽LAVNLIPFP为活性成份，其中添加药物学上可接受的载体或辅料。
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