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CN104428677A - 用于识别循环肿瘤细胞的设备、系统和方法 - Google Patents

用于识别循环肿瘤细胞的设备、系统和方法 Download PDF

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CN104428677A CN201280069331.XA CN201280069331A CN104428677A CN 104428677 A CN104428677 A CN 104428677A CN 201280069331 A CN201280069331 A CN 201280069331A CN 104428677 A CN104428677 A CN 104428677A
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P·昆
A·考拉特卡
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Abstract

提供用于识别各种对象、特别是循环肿瘤细胞的设备、系统和方法。在一个方面，该系统包括但不限于扫描系统、图像存储系统和分析系统。分析系统优选地基于各种标准(其可包括细胞核面积或体积、CD-45阴性状态和细胞角蛋白阳性状态)来识别预期对象、例如完整细胞。优选地包含的是用于在成像步骤期间包含细胞的载玻片，该孔包括：平坦底面；在孔的周边的边界，限定孔的侧面，该边界与孔的底面相邻，并且提供其之间的流体密封。本文中的本发明提供单个成像孔、基本上提供对象、例如细胞的单层。

Description

用于识别循环肿瘤细胞的设备、系统和方法
技术领域
一般来说，本发明涉及医疗诊断，以及更具体来说，涉及识别和分类循环肿瘤细胞(CTC)。
背景技术
循环肿瘤细胞研究领域响应对具有上皮性癌(癌)的患者的纵向疾病监测的重大未满足需要而迅速发展。由于对患者癌症过程的疾病的治疗响应性的变化，预测和监测治疗响应和疾病进展特别重要。在液体肿瘤、例如白血病中，恶性细胞能够易于在疾病期间的许多点从血流来取样，并且应用适当的疗法调整。但是，固体肿瘤、例如癌一般仅在初始诊断时取样，因为组织活检是具有已知风险的有创过程。偶尔在远转移首先变成显然时收集重复肿瘤取样，以确认远损害实际上表示来自患者的已知初生肿瘤的转移。
在癌症行为的当前理解中，虽然在其相应微环境中了解初生和转移性癌的固体组织形式方面取得进展，但是在了解它占据并且经由血流传播的液相期间的癌行为方面存在相当大的差距。对于主要作为固体出现的癌症，难捉摸和不足的循环成分在其中包含引起将来远转移的细胞，并且因此代表发明的竞争目标。
完全表征固体肿瘤的这个液相的临床意义由于缺乏用于识别循环肿瘤细胞(CTC)的易于访问和可靠实验工具而受到阻碍。血流中的CTC的未知特性和低频率结合区分癌症与正常上皮细胞的困难极大地阻碍对液相可在临床上的重要程度。理想液相活检发现大多数上皮性癌患者的大量CTC，以及按照不仅实现枚举而且还实现分子、形态和/或表型分析的格式来保存CTC并且向诊断病理学家和/或研究人员呈现。另外，它应当保存样本中的所有其它类似CTC的细胞群体供进一步分析。
当前，CTC检测的唯一FDA批准技术基于免疫磁珠富集。这种当前“黄金标准”测试称作并且采用免疫磁珠富集步骤来隔离表达上皮细胞粘附分子的细胞(EpCAM)[1]。另外，为了识别为CTC，细胞必须包含核子、表达细胞质细胞角蛋白并且具有大于5微米的直径。这种技术揭示了枚举和监测具有转移乳腺、前列腺和结肠癌的患者的CTC量的预后实用性；但是，这种系统的灵敏度较低，从而没有发现或者发现很少大多数患者的CTC[2、3]。大多数后续CTC技术已经公布更高灵敏度，并且追求富集策略的变化；但是，这些方式将可检测事件直接偏向于具有对初始富集步骤所选的蛋白质的充分表达的那些事件[4-8]。
缺陷大量存在于CTC生物学领域。在大多数难题之中是灵敏度和特异性。癌症患者的真正生物阳性率是未知的，以及健康人或者具有非恶性疾病的人的循环良性上皮细胞率同样不是肯定已知的。对于灵敏度—存在疾病(在本例中为CTC的生物存在)的情况下的阳性测试，常用于代替确切知识的是将细胞系细胞放入整个血液中的稀释实验或者来自使用可显著改变的技术的其它研究人员的发布数据。两种方式是有问题的，并且问题在本领域继续存在。特异性—在没有疾病的情况下的阴性测试—能够至少部分通过评估患者样本(按照我们当前对癌症的了解，其对循环癌细胞应当是阴性的)来解决。
为此，健康施体血液一般用作阴性控制，以及虽然发布数量改变，但是一般只有少量CTC存在于临床健康人体内。对于本文所述结果，健康施体群体由各种年龄的非实验室成员志愿者组成，其已知没有癌症，但是其没有经过潜伏癌的广泛医疗评估。由于所有癌症当然最初是无症状的，所以发现特异性确定的真阴性群体是高成本和长期努力，因为需要对外表健康受检者进行有创医疗测试，或者等待充分时间量以便确信他们对后续数年不会出现某种类型的癌。
各种格式在现有技术中用来呈现患者样本供检验。那些格式包括液体系统、例如基于流式细胞计的系统以及静态系统。图1示出如现有技术静态成像系统中使用的3孔板的平面图。载玻片包括3个相等大小的孔区。作为举例，各孔区10为1.45cm2。载玻片的所产生的总孔面积为6.3cm2。孔的周边为17.4cm。3个孔所占据的总载玻片的百分比为23.6％。每个载玻片的细胞的估计数量在从1.25至1.5百万个细胞的范围之内。
图2示出如现有技术中使用的12孔板的平面图。载玻片包括12个相等大小的孔区12。作为举例，各孔区为具有0.5cm直径的圆。载玻片的所产生的总孔面积为2.4cm2。孔的周边为19cm。最后，3个孔所占据的总载玻片的百分比为12.8％。每个载玻片的细胞的估计数量在从50至60万个细胞的范围之内。
尽管大量工作，但是CTC的检测迄今仍然是棘手的。所需的是一种灵敏、特定的系统，其能够有效、迅速和低成本地检测CTC。
发明内容
提供用于识别各种对象、特别是CTC的设备、系统和方法。
因此，在一个方面，本发明提供一种用于检验细胞的系统。该系统包括：本发明的孔；照明系统；成像系统；分析模块，具有用于分析细胞选择标准的功能性；以及用户输出。在实施例中，系统可包括但不限于扫描系统、图像存储系统和分析系统。分析系统优选地基于各种标准(其可包括细胞核面积或体积、CD-45阴性状态和细胞角蛋白阳性状态)来识别预期对象、例如完整细胞。优选地包含的是具有用于在成像步骤期间包含细胞的孔的载玻片，该孔包括：平坦底面；在孔的周边的边界，限定孔的侧面，该边界与孔的底面相邻，并且提供其之间的流体密封。
在另一方面，本发明提供一种用于检验细胞的孔，其设置在基片的表面上。该孔包括平坦底面以及形成孔的周边的边界，该边界与底面相邻，并且提供其之间的流体密封。本发明的实施例提供单个成像孔、基本上提供对象、例如细胞的单层。该孔具有优选地大于7.5cm2、更优选地大于10cm2以及最优选地基本上为11.7cm2的面积。对应地，孔的周长优选地基本上为12.5cm、更优选地基本上为14.5cm以及最优选地基本上为15.7cm。由孔所覆盖的载玻片顶面的百分比优选地基本上为40％、更优选地为53％以及最优选地基本上为62％。孔确定大小成使得分别准许优选地为1.6至1.9百万个细胞、更优选地为2.1至2.6百万个细胞以及最优选地为2.5至3百万个细胞的单层的成像。优选成像孔具有总共4个侧面。通过减少侧面的数量(与现有技术相比，例如3孔载玻片具有12个侧面)及其周长，与侧壁边界关联的边缘效应为最小。
在一个实现中，本文中用来识别高清晰度的CTC(HD-CTC)的方式的独特之处在于，它不依靠任何单蛋白质富集策略。所有有核细胞而是保留并且免疫荧光地染色有单克隆抗体靶向细胞角蛋白(CK)、上皮细胞中排他地存在的中间丝、全白细胞特定抗体靶向CD45和核染剂DAPI。有核血细胞在多个荧光通道中成像，以产生高质量和高分辨率数字图像，其保留核子轮廓和细胞质分配的精细细胞学细节。这种无富集策略产生高灵敏度和高特异性，同时添加高清晰度细胞形态，以实现已知为异质的CTC群体的详细形态表征。这种方式的优点在于，能够追求多个分析参数，以识别和表征特定的感兴趣群体。
本发明的实施例用来使用转移性癌患者的“HD-CTC”来检验样本。这种检验的关键新方面是它的具有对血液标本的最小处理的简洁性以及它实现对诊断病理学/细胞病理学质量图像的专业形态解释的能力。
在又一方面，本发明提供一种用于执行细胞检验的方法。该方法包括将具有细胞群体的样本与本发明的孔相接触，并且经由本发明的系统来分析孔的群体，由此执行细胞检验。在实施例中，分析包括表征细胞群体中的细胞类型、例如CTC。
在又一方面，本发明提供一种检测样本中的CTC的方法。该方法包括将本发明的孔与样本相接触，经由本发明的系统来分析细胞群体；以及基于该分析来检测CTC，由此检测样本中的CTC。在实施例中，每毫升的样本检测多于2、5、7、10、15、20或50个循环肿瘤细胞。
在又一方面，本发明提供一种用于诊断癌症或者提供受检者的癌症的预后(prognosis)的方法。该方法包括将本发明的孔与包括来自受检者的细胞群体的样本相接触，经由本发明的系统来分析细胞群体，检测细胞群体中的CTC，表征CTC，并且基于该表征来确定诊断或预后，由此诊断或者提供受检者的癌症的预后。
在又一方面，本发明提供一种用于确定受检者对化学治疗方案的响应性的方法。该方法包括将本发明的孔与包括来自受检者的细胞群体的样本相接触，经由本发明的系统来分析细胞群体，经由该分析来检测CTC，并且表征CTC以确定化学治疗剂的注入的效能，由此确定受检者对治疗方案的响应性。
在又一实施例中，本发明提供一种套件。该套件包括本发明的至少一个孔、用于免疫地确定细胞中的细胞角蛋白或CD45的存在的试剂以及用于利用该套件检测样本中的CTC的指令。
本文所述的设备、系统和方法证明按照针对检验的可靠性和健壮的可控预期协议的HD-CTC检验的首次使用，将分离样本比较中的灵敏度与检验进行比较，并且建立具有转移乳腺、前列腺和胰腺癌的患者以及正常组的HD-CTC和HD-CTC群集的发生率。重要地，“HD-CTC”的定义优选地要求下列要求的一个或多个：(一个或多个)细胞具有完整核子，表达细胞角蛋白而没有CD45，与周围良性白血细胞(WBC)在形态上不同，并且具有符合用于下游分析的完整形态上异常上皮细胞的细胞学特征。
附图说明
图1是现有技术3孔板的平面图。
图2是现有技术12孔板的平面图。
图3是总体HD CTC系统的原理框图。
图4是系统的扫描和成像组件的组件级简图。
图5示出经过测量参数空间的可能图像层面，表示基于这些参数的细胞的过滤。
图6是典型载玻片和孔的平面图。
图7是典型载玻片和孔的透视图。
图8示出相对预计SKBR3所绘制的平均观测SKBR3。
图9示出对9个不同癌症患者样本的两个独立处理人员之间的CTC计数的比较，CTC/mL计数的范围从0至203。
图10示出这里所述的系统、设备和方法与产品的比较测试数据。
图11示出绘制前列腺、胰腺、乳腺癌的各种样本的CTC的数量以及与健康群体的比较的测试结果。
图12示出各种患者样本相对于乳腺癌的CTC的数量。
图13示出归一化核子面积与白血细胞(WBC)和CTC的核子面积，其中包括基线区的放大。
具体实施方式
在描述本组成和方法之前，要理解，本发明并不局限于所述的特定组成、方法和实验条件，因为这类组成、方法和条件可改变。还要理解，本文所使用的术语是仅为了便于描述具体实施例，而不是意在进行限制，因为本发明的范围将仅按照所附权利要求书来限制。
如本说明书和所附权利要求书所使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数引用，除非上下文另加明确说明。因此，例如，提到“该方法”包括一个或多个方法和/或通过阅读本公开将对本领域的技术人员是显而易见的本文所述类型的步骤等。
除非另加说明，否则本文所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域的技术人员普遍理解的相同的含意。虽然与本文所述的相似或等效的任何方法和资料能够用于本发明的实施或测试中，现在描述优选方法和资料。
一般来说，提到“循环肿瘤细胞”意在表示单个细胞，而提到“多个循环肿瘤细胞”或“循环肿瘤细胞群集”意在表示一个以上细胞。但是，本领域的技术人员会理解，提到“循环肿瘤细胞”(复数)意在包括一个或多个循环肿瘤细胞的循环肿瘤细胞的群体。
术语“循环肿瘤细胞”(CTC)或CTC“群集”意在表示受检者样本中存在的任何癌细胞或者癌细胞群集。通常，CTC从固体肿瘤来剥落。因此，CTC常常是从具有晚期癌的患者的循环中以极低浓度存在的固体肿瘤脱落的上皮细胞。CTC也可以是来自肉瘤的间皮或者来自黑素瘤的黑素细胞。CTC也可以是源自初生、次生或第三肿瘤的细胞。CTC也可以是循环癌干细胞。虽然术语“循环肿瘤细胞”(CTC)或CTC“群集”包括癌细胞，但是它还意在包括非肿瘤细胞，其不是普遍存在于循环、例如循环上皮或内皮细胞中。相应地，肿瘤细胞和非肿瘤上皮细胞包含在CTC的定义中。
如本文所使用的术语“癌症”包括本领域众所周知的多种癌症类型，包括但不限于发育不良、增生、固体肿瘤和造血癌。许多类型的癌症已知为转移和剥落循环肿瘤细胞或者是转移的，例如产生于已经转移的初生癌的次生癌。附加癌可包括但不限于下列器官或系统：脑、心脏、肺、胃肠、泌尿生殖道、肝脏、骨、神经系统、妇科的、血液的、皮肤、乳腺和肾上腺。附加类型的癌细胞包括神经胶质瘤(神经鞘瘤、神经胶母细胞瘤、星细胞瘤)、成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、节瘤、脑膜瘤、肾上腺皮质癌、成神经管细胞瘤、横纹骨肉癌、肾癌、各种类型的血管癌、成骨细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫肌瘤、唾腺癌、脉络丛癌、乳癌、胰腺癌、结肠癌和成巨核细胞癌；以及皮肤癌包括恶性黑素瘤、基细胞癌、鳞状细胞癌、Karposi瘤、结构异常痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、肉瘤(例如纤维肉瘤或血管内皮瘤以及黑素瘤)。
使用本文所述的设备和方法，CTC可从任何适当样本类型来检测和表征。如本文所使用的术语“样本”表示适合于本发明所提供方法的任何样本。样本可以是包括适合于检测的罕见细胞的任何样本。样本源包括整个血液、骨骼、胸膜液、腹膜液、中央脊髓液、尿液、唾液和支气管灌洗。在一个方面，样本是血液样本，包括例如整个血液或者其任何部分或成分。适合于与本发明配合使用的血液样本可从包括血细胞或者其成分的任何源来提取，例如静脉、动脉、周边、组织、索(cord)等。例如，样本可使用众所周知和例行临床方法(例如用于抽取和处理整个血液的过程)来得到和处理。在一实施例中，示范样本可以是从具有癌症的受检者所抽取的周边血。
图3是总体系统的原理框图。制备一个或多个载玻片20供分析。参见以下详细描述，例如样本收集、制备和处理描述。扫描仪22对一个或多个载玻片20进行成像。扫描仪22优选地是多通道扫描仪、例如4色扫描仪。把来自扫描仪22的数据提供给图像存储器24。图像存储器24可由存储装置、优选地为大容量存储装置组成，例如RAID系统，正如本领域的技术人员已知。把来自图像存储器的被扫描数据提供给技术分析模块26、技术分析报告模块32和/或输出34中的一个或多个，以便例如由专业人员的专业审查以供审查。技术分析模块26至少用来按照以下详细描述的方式分析来自图像存储器24的数据。分析包括但不限于分析核子面积或大小的细胞(例如通过分析蓝DAPI的强度)，分析CD-45的不存在(例如通过扫描与CD-45抗体关联的次生抗体的强度)，和/或分析与角蛋白关联的抗体的强度。优选地，技术分析报告包括具有数据的HTML文件，其中在文件中包括细胞或对象图像。自动化分析可采用医疗专业人员的分析来补充。
技术分析模块26的输出优选地提供给元数据数据库28。元数据数据库包括由所有各种形式的数据分析所生成的信息。返回回路控制通路30准许使用扫描数据和分析来控制载玻片20的再成像。在要求对象、例如细胞的进一步分析的情况下，该系统可引起对象的再成像。对象与载玻片的粘附程度或粘附性应当足以至少对再成像的时长保持载玻片上的对象的位置。在更长时帧中，对象与载玻片的粘附程度或粘附性应当足以准许通过分析所识别的特定对象的后续识别，例如以下所述，供对象的后续进一步处理，例如基因型或其它后续分析。存储副载玻片的时间长度以及关于细胞位置保持为静止的期望的范围可从数小时至数月。优选地，该系统包括例如用于数据和报告的合并存储器40。
来自元数据数据库28的信息优选地提供给数据清单管理系统38。该系统包括总体系统的管理系统。在其它数据之中，系统38保持患者标识与载玻片的相关性。
图4是扫描系统的一种可能实现的示意图。载物台42、例如x-y载物台支承一个或多个载玻片20。对于本文所述孔面积的大小，4个载玻片准许大约1千万个细胞的扫描，这是一个患者的典型大小样本。光路可采取符合本文所述实施例的任何形式。照明组件可包括光源46和可选的激励滤光轮48。光源优选地是广谱照明器。分色镜50用来将照明传递到载玻片，以及准许到照相装置54的返回照明。可选发射滤光轮52可放置在镜50与照相装置54之间。输出则如上所述来存储。
图5示出用于载玻片20所支承的对象的扫描的各种选项。扫描和成像可按照多维、优选地按照三维框架。优选地，对象设置在单层的载玻片上，其充分平坦以准许按照有效方式的对象的扫描和成像，优选地设置在单焦平面中。平面或平坦载玻片准许按照一致方式的单层的成像，因为图像平面的偏差为最小。平坦表面上的成像还实现更简易的图像的Z堆叠。如图5所示，成像平面可处于各种取向，其可按照非平面关系。如图5所示，CTC候选细胞的检测通常依靠从载玻片图像所测量的若干参数。例如，维1-3可以是核子面积、细胞角蛋白强度和CD-45强度。图5的平面表示定义CTC候选的测量参数的每个的取舍点极限。作为替代或补充，可利用光场照相装置系统，其中数码相机包括光传感器，其捕获甚至超出单个焦平面的光线，从而准许来自各种图像平面的图像的软件组装。透镜、例如微透镜可与数字光传感器结合使用。
图6和图7定义载玻片20的各种具体细节。载玻片可具有符合本文所述本发明的实施例的任何尺寸或几何结构。在一个实现中，载玻片20的形状一般为具有长度Ls、宽度Ws和厚度t的矩形。典型尺寸是基本上7.5cm的Ls、基本上2.5cm的Ws和7mm的厚度t。载玻片20优选地包括顶面72、平行底面74、侧缩进66、侧面68和端面70。载玻片标识60可例如经由条形码来提供。这类载玻片是从各种源可得到的，例如Marienfeld Laboratory Glassware。
提供孔62以包含和保持待成像材料。在本文详细描述的格式中，孔62为矩形，并且具有长度L和宽度W。作为举例，孔62的典型内径可以是基本上5.85cm的L和基本上2.5cm的W。孔62的周边或周长可由边界64(无论是否为特定结构边界)来限定，或者通过其它材料、例如通过疏水材料来限定。边界又可称作分界。边界或分界适合接收和包含细胞悬浮和所有其它试剂、溶液、缓冲剂或者该过程中使用的其它液体。边界或分界与载玻片的顶侧结合形成孔。对于这些尺寸，孔62的面积基本上为11.7cm2，以及孔62的周长基本上为15.7cm。孔62从载玻片20的边缘的缩进程度可基于系统的其它方面、例如扫描系统的具体细节来设置。一个实施例提供单个成像孔62，从而基本上提供待成像对象、例如细胞的单层，具有优选地大于7.5cm2、更优选地大于10cm2以及最优选地基本上为11.7cm2的面积。对应地，孔62的周长优选地基本上为12.5cm、更优选地基本上为14.5cm以及最优选地基本上为15.7cm。由孔所覆盖的载玻片顶面的百分比优选地基本上为40％、更优选地为53％以及最优选地基本上为62％。
优选成像孔62具有总共4个侧面。通过减少侧面的数量(与现有技术相比，例如3孔载玻片具有12个侧面(参见图1))及其周长，与侧壁边界关联的边缘效应为最小。孔确定大小成使得分别准许优选地为1.6至1.9百万个细胞、更优选地为2.1至2.6百万个细胞以及最优选地为2.5至3百万个细胞的单层的成像。
总之，下列参数定义在本文所述孔中按照基本上单层对细胞进行成像时的系统、设备和方法的各种量度：
面积 周长 ％覆盖 细胞数量
11.7cm2 15.7cm 62％ 2.5to3百万
10cm2 14.5cm 53％ 2.1to2.6百万
7.5cm2 12.5cm 40％ 1.6to1.9百万
载玻片可以可选地提供有参考标记。如果细胞充分地固定到位，则其它结构可用于对载玻片进行索引。作为举例，可利用边界，更具体来说，在孔角的90度角可用于参考。
本文所述的设备和系统提供最大化和优化细胞密度以及最小化边缘效应。在优选实施例中，单个细胞孔用来保持至少1.5百万个细胞，优选地甚至更多、例如3百万个细胞。在优选实施例中，4个侧孔用来包含那个细胞群体。相比之下，3个场载玻片用来代替单个场载玻片要求使用2至3倍的载玻片，并且处理各载玻片上的12(3×4)个边缘而不只是4个边缘。任何流体分布遭受边缘效应，无论边缘的疏水程度。细胞分布表明，边缘的细胞强度显著下降。虽然能够使用标准尺寸的显微镜载玻片，但是并不局限于此。可利用符合本文所述实施例的目标的较大玻璃载玻片。但是，通过与继续使用标准尺寸(对其存在安装机器的大基底，例如自动化、现有显微镜系统和存储系统，这里只列举几个)，使用常规尺寸的载玻片产生过程有益效果。
该系统进一步优选地每个载玻片包括单个盖玻片。该系统用来优化速度，同时产生充分质量。通过优选地避免非平坦表面、堆叠细胞、改变流体厚度和/或在各载玻片上使用多个盖玻片，成像设置以及数据收集速度和质量增加。单个并且极平坦同质单层是优选的。使用单个盖玻片的又一优点在于，呈现均匀表面供成像。更为均匀的安装介质分布使用单个盖片代替如标准3孔载玻片中需要的3个来提供。
在实施例中，如本文所述所处理的样本包括大于大约1、2、5、7、10、15、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或者甚至1000个罕见细胞或CTC。
虽然本发明所述的方法在检测CTC方面是有用的，如通篇所述，但是本发明在CTC的表征方面也是有用的。具体来说，可检测标记和计算方法的各种组合用于执行细胞成像和分析允许在评估癌症预后中以及在监测可导致疾病复发的治疗失败的早期检测的治疗效能中有用的有意义表征。另外，按照本发明的CTC分析实现已经完成治疗过程的症状发生前患者的早期复发的检测。这是可能的，因为CTC的存在与肿瘤进展和传播、对治疗的不良响应、疾病的复发和/或对某个时间段的降低生存关联和/或相关。因此，CTC的枚举和表征提供将患者的基线特性分层的方法，其中基线特性基于对治疗的响应来预测初始风险和后续风险。
如本文所使用的术语“受检者”表示对其执行主体方法的任何个体或患者。一般来说，受检者是人类，但是如本领域的技术人员将会理解，受检者可以是动物。因此，其它动物、包括诸如啮齿动物(包括耗子、老鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔子、包括牛、马、山羊、绵羊、猪等的家畜和灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)之类的哺乳动物包含在受检者的定义之内。
相应地，在另一个实施例中，本发明提供一种用于诊断或预后受检者的癌症的方法。该方法包括如本文所述检测CTC。CTC然后可分析，以诊断或预后受检者的癌症。因此，本发明的方法可例如用来评估癌症患者以及处于癌症风险的患者。在本文所述的诊断或预后的方法的任一个中，癌症的一个或多个指标、例如癌细胞或者任何其它失调的存在或不存在可用来生成诊断或预后。
在一个方面，血液样本从患者抽取，并且经处理以如本文所述检测CTC。使用本发明的方法，确定血液样本中的CTC的数量，并且CTC通过可检测标记以及从对细胞进行成像所采集的其它数据的分析来表征。例如，可执行分析以确定样本中的CTC的数量和表征，以及从这个测量，可确定初始血液样本中存在的CTC的数量。
在各个方面，受检者的CTC数量的分析和表征可在各种间隔对特定时间过程进行，以便评估受检者的进展和病理学。例如，分析在在常规间隔、例如一天、两天、三天、一周、两周、一个月、两个月、三个月、六个月或一年来执行，以便跟踪作为时间的函数的循环上皮细胞的水平和表征。在现有癌症患者的情况下，这提供疾病的进展的有用指示，并且协助开业医生基于循环上皮细胞的变化的增加、减小或缺乏、例如患者血流中的CTC的存在进行适当疗法选择。CTC的数量随时间的任何增加(作为2倍、5倍、10倍或更高)降低患者的预后，并且是患者应当改变疗法的早期指标。类似地，任何增加(作为2倍、5倍、10倍或更高)指示患者应当经过进一步测试、例如成像，以进一步评估预后以及对疗法的响应。CTC的数量随时间的任何降低(作为2倍、5倍、10倍或更高)表明疾病稳定化以及患者对疗法的响应，并且是不改变疗法的指标。对于处于癌症风险的患者，所检测的CTC数量的突然增加可提供关于患者已经形成肿瘤的早期告警，因而提供早期诊断。在一个实施例中，所提示CTC的检测增加癌症的升级。
在本文所提供方法的任一个中，还可执行附加分析，以表征CTC、提供附加临床评估。例如，除了图像分析之外，可采用基因表达分析和PCR技术，例如基因芯片分析并且与特定癌症标记特定的引物进行复用，以得到例如肿瘤类型等信息，由其得到CTC起源、转移状态和恶性程度。另外，可执行细胞大小、DNA或RA分析、蛋白组分析或代谢组(metabolome)分析，作为评估与患者癌症的表征有关的附加信息的手段。在各个方面，分析包括针对或者使用下列标记的一个或多个特定的引物的PCR复用的抗体：EGFR、HER2、ERCC1、CXCR4、EpCAM、E-Cadherin、Mucin-1、细胞角蛋白、PSA、PSMA、RRM1、雄激素受体、雌激素受体、孕酮受体、IGF1、cMET、EML4或白细胞关联受体(LAR)。
例如，附加分析可提供足以进行关于受检者对特定治疗方案的响应性的确定或者用于确定候选试剂在癌症治疗中的有效性。相应地，本发明提供一种通过如本文所述检测受检者的CTC并且分析所检测CTC来确定受检者对特定治疗方案的响应性或者确定候选试剂在癌症治疗中的有效性的方法。例如，一旦药物治疗注入患者，则有可能使用本发明的方法来确定药物治疗的效能。例如，在药物治疗之前从患者所获取的样本以及与药物治疗同时或之后从患者所获取的一个或多个细胞样本可使用本发明的方法来处理。通过比较各处理样本的分析结果，可确定药物治疗的效能或者患者对试剂的响应性。这样，可对失败化合物进行早期识别，或者可对有希望化合物进行早期验证。
提供对候选化合物的临床活动的认识的四个重要指标包括HER2、EGFR、CXCR4和EphB4 RTK。HER2通过确定mRNA稳定性和HER2转录本的亚细胞定位，来提供细胞的恶性的指标。除了可与候选化合物结合使用的可能备选化合物之外，EGFR对获取突变和/或所获取突变的抗性还提供候选化合物的活动的重要指标。采用铂所引起的DNA修复干涉的评估提供关于CXCR4标记和转移条件的状态的认识。另外，EphB4受体酪氨酸激酶的评估提供关于细胞的转移可能性的认识。相应地，使用本发明的方法，可通过获取血流的频繁样本并且确定作为时间的函数的各样本中的循环上皮细胞、例如CTC的数量，来监测服用这类候选药物的患者。Her2、EGFR、CXCR4和EphB4 RTK指标的进一步分析提供关于癌症的病理学和候选药物的效能的信息。类似地，ERRC1、细胞角蛋白、PSA、PSMA、RRM1、雄激素受体、雌激素受体、孕酮受体、IGF1、cMET、EML4等提供对候选化合物的临床活动的认识。临床活动的这些指标的分析可经过分析如本文所述的可检测标记(免疫组织化学及荧光原位杂合)或者经由诸如测序、基因型分型、基因表达或者其它分子分析技术之类的技术的进一步分析进行。
CTC的分析提供一种确定特定临床试验的候选受检者的方法。例如，可分析候选者的所检测CTC，以确定特定标记是否存在，以便确定临床试验的特定治疗方案是否可潜在地成功。相应地，在另一个实施例中，本发明提供一种用于确定临床试验的候选受检者的方法。该方法包括如本文所述检测受检者的CTC。然后可分析CTC，以确定候选受检者是否适合于特定临床试验。
临床试验期间的CTC的分析将提供与患者是响应还是不响应实验药物有关的信息，其中没有所揭示CTC的实质变化或降低指示响应，以及所揭示CTC的增加指示不良响应。增加或降低可以是2倍、10倍或以上。这个信息是药物有效性的早期指标，并且可由研究人员用作临床试验中的次要终点。
以下示例意在进行说明而不是限制本发明。
示例1
CTC的检测和表征
实验结果
CTC对HD-CTC：定义细化。
该系统优选地定义将要用于分析中的细胞的一个或多个量度。各种方式基于具有上皮性癌的患者的大量候选事件的研究来定义完整CTC，其中具有与来自同一患者的同一肿瘤的固体形式的细胞的直接比较[9-12]。基于这些定义，并且利用HD-CTC检验来细化标准，建立HD-CTC的定义。这个定义形成为确保HD-CTC是具有作为源自患者体内的癌的固体沉积物的完整细胞的最高可能性的细胞。在分析中跟踪部分满足这些要求但是达不到以下所述的严格入选标准的所有其他群体，因为其中的许多可能表示分片或凋亡肿瘤细胞，其可能具有生物意义[13]，但是因其供其它下游方法的评估的不可预测适当性而在HD-CTC计数中排除。为了便于本申请，可使用满足这些的部分或全部的各种标准。
在乳腺、结肠和肺癌患者的研究的情况下，CTC可在形态上相对其初生肿瘤来表征和提供证书。经过患者的CTC的形态检查完全区分的肺腺癌，循环细胞采用符合这种类型的肿瘤的形态特征来识别，包括例如具有较低核-细胞质比的细胞。循环中识别的肿瘤细胞的形态模拟那个患者的初生肿瘤的细针吸活检中存在的形态[9]。在较大一批乳腺和结肠癌患者中所评估，CTC呈现符合常见于初生和转移肿瘤的形态异质性的的细胞学外观中的高程度的患者间和患者内异质性[10、11]。
这个平台允许具有采用具有与对象的大小和荧光强度有关的辅助半定量数据的逐个细胞注释所扩大的单独通道图像的荧光图像的同时细胞形态审查。HD-CTC分类为细胞，其是a)细胞角蛋白阳性；b)CD45阴性，其中完整未凋亡通过DAPI成像表现为核子。CK的阳性定义为荧光信号明显高于周围细胞的信号。阴性定义为相同等级或者低于周围细胞的信号。CD45的阴性定义为具有在所有细胞的99％是全局可检测的边界条件下低于视觉检测的强度。存在于癌症患者中的一批典型HD-CTC未示出，但是，HD-CTC是细胞角蛋白阳性、CD45阴性，包含DAPI核子，并且在形态上不同于周围白血细胞。
接受细胞质中的温和凋亡变化，例如在细胞角蛋白通道中视觉化的细胞质泡，只要核子没有表现为凋亡。除了这些半定量特性之外，HD-CTC还必须在形态上不同于正常WBC，并且必须具有根据主要体现为放大尺寸的标准诊断细胞病理学中使用的标准与恶性细胞相容、但是还包含诸如核子的架构组织以及细胞质、细胞质形状和核子形状之类的细胞形态特征的形态。可设置1.3倍于平均WBC核子尺寸的较低核子尺寸取舍点。虽然略微任意的，因为没有建立现代共识，并且生物真实性仍然未知，所以这个极限基于识别为健康施体中呈现与细胞角蛋白的假非特定染色(即，CD45阳性和细胞角蛋白阳性)的WBC的细胞的最大核子尺寸来设置。由于实际上所有可行上皮细胞均大于跨癌症诊断的临床谱的实际上例行固定和染色的人类组织的所有白细胞，所以这种方式被感知为保守假设。在谱的另一端，HD-CTC的共同形态特征是总共五倍于周围WBC核子的平均尺寸的较大核子。其它通常观测特征包括与周围WBC核子不同的核子轮廓(例如延长)、具有细胞质相对于核子的离心分布、多边形或延长细胞质形状和3个或更多HD-CTC的频繁双联体和群集的大细胞质域。
表1：具有血液的每1mL的HD-CTC的患者的百分比从转移前列腺、乳腺和胰腺癌患者以及正常组所得到。
具有转移性癌的患者的HD-CTC的发生。
HD-CTC按照一批30个转移乳腺癌患者、20个转移前列腺癌患者、18个转移胰腺癌患者和15个正常组来枚举。所研究的三种类型的癌症中的D-CTC的发生在表1中显示。使用这种方式，在前列腺癌的80％(平均＝92.2)、乳腺癌患者的70％(平均＝56.8)、胰腺癌患者的50％(平均＝15.8)以及正常组的0％(平均＝0.6)中发现≥5HD-CTC/mL。
图8示出相对预计SKBR3所绘制的平均观察SKBR3。正常组血液的四个可分量采用可变数量的SKBR2细胞来稀释，以产生每个载玻片大约10、30、100和300个癌细胞的4个载玻片。显示各四元组的平均数，以及误差棒记录标准偏差。
使用添入(spike-in)实验的检验线性度和灵敏度。
要测试检验线性度和灵敏度，各种数量的乳腺癌细胞系SKBR3按四份添入到正常组血液中，并且按照HD-CTC检验来处理。如图8所示，平均观察SKBRS相对预计SKBR3来绘制，并且显示0.9997的相关性系数(R2)。
具有癌的患者的HD-CTC计数的检验健壮性。
HD-CTC检验的检验健壮性针对多个处理人员和分离样本来测试。重复测试由两个独立处理人员对9个不同的患者样本来执行。图9示出使用分离样本的两个处理人员之间的CTC/mL计数的比较，从而给出这个比较的Y＝1.163x–4.3325的回归方程式，其中相关性系数(R2)为0.979。所有数据由看不见实验的单个操作人员来分析。线条的斜率比暗示两个处理人员之间的略微系统线性变化的要大。
图9是两个独立处理人员对9个不同的癌症患者样本之间的CTC计数的比较。CTC/mL计数的范围从0至203。
来自正常组的样本中的检验特异性。
来自公共机构健康施体库的15个健康施体作为由年龄范围从24至62岁的8个女性和7个男性所组成的控制群体来评估。在除一个以外的全部健康例中，在对体积所校正的这类事件的数量为1HD-CTC/ml或以下。异常值是HD-CTC计数为4/ml的健康女性施体。在她的细胞的每个的明确再审查时，其中的大约1/3易于满足所有入选标准，而其余2/3满足所有标准，但是接近供一个或多个标准包含的下限。四个其它健康施体落入非零类别，其中各具有1HD-CTC/ml。这些细胞的明确再审查揭示类似模式，因为大约1/3极大地满足所有标准，而其余2/3的细胞满足标准，但是接近供一个或多个标准包含的下限。后一种类型的事件的示例包括测量比周围WBC要大30％但是通过形态评估看起来不是明显要大的细胞、略微散焦并且可能具有不是肉眼可检测的凋亡核子变化的细胞以及最后具有高于取舍点的客观细胞角蛋白强度测量但是通过单通道荧光审查在主观上看起来不是比周围WBC明显要亮的偶发细胞。
HD-CTC检验与的比较。
对于采用和HD-CTC检验来评估总共15个患者(5个转移乳腺癌和10个转移前列腺癌)。从各患者收集两个试管血液。7.5mL的一个试管血液在CellSave试管(Veridex，Raritan NJ)中收集，并且发送给Quest Diagnostics(San Juan Capistrano，CA)，供使用检验的枚举。第二试管血液从各患者来收集，并且在血液抽取之后24小时按照标准HD-CTC过程、按照HD-CTC协议来处理，以便模拟在Quest Diagnostics处理样本的定时。表2示出来自并列比较的结果。检验所测试的5/15个患者的每7.5mL血液检测2个或更多CTC。相比之下，HD-CTC检验检测明显更多患者的明显更高数量的CTC(HD-CTC在所测试的14/15个患者中识别)。
表2：来自5个转移乳腺癌患者和10个转移前列腺癌患者的HD-CTC检验与的比较。值外推到每mL血液的CTC数量。
癌症类型 HD-CTCs/mL 细胞检索/mL
乳腺#1 49.3 0.1
乳腺#2 87 0
乳腺#3 33.4 0.1
乳腺#4 199.3 0.1
乳腺#5 5 3.1
前列腺#1 2.3 0
前列腺#2 8.4 0.4
前列腺#3 107.3 2.8
前列腺#4 1.3 0
前列腺#5 150.5 0.1
前列腺#6 0 0
前列腺#7 1.4 0.5
前列腺#8 1.5 0.1
前列腺#9 145.3 0.8
前列腺#10 57.6 0
HD-CTC的形态范围。
在患者之内并且跨患者发现HD-CTC的形态上异质群体。HD-CTC具有各种形状、尺寸和细胞角蛋白强度，在一些情况下，不同细胞学特征、例如大尺寸或多边形细胞质形状在患者的样本中相当不同和单调的。在其它情况下，在单个样本中的HD-CTC之间存在细胞形态可变性。细胞尺寸也改变；许多患者样本具有HD-CTC，其中具有均匀地三倍或四倍于相邻WBC核子的尺寸的核子，而其它患者具有细胞，其中具有均匀地仅1.3倍于相邻WBC核子的尺寸的核子。一些患者具有尺寸的范围。下限标准基于识别为表明与细胞角蛋白的假非特定染色的WBC的细胞(即，CD45阳性和细胞角蛋白阳性)的最大核子尺寸的评估、对1.3倍于平均WBC核子的HD-CTC核子尺寸来选择下限标准。
使用这个平台允许详细形态评估，HD-CTC双联体和群集在这一批的癌症患者的大多数(88％)中识别，范围从2个HD-CTC的群集至大于30个HD-CTC(数据未示出)。
在具有癌症的大多数患者中发现群集。范围从2至超过30个HD-CTC的群集。每个HD-CTC确定为细胞角蛋白阳性、CD45阴性，包含DAPI核子，并且在形态上与周围有核细胞。
‘其它’细胞类型的形态。
作为细胞角蛋白阳性、CD45阴性并且包含核子但不满足入选标准的其它类似细胞对象没有作为HD-CTC来计数，而是通过检验来跟踪。这种方式的目的是具有特定完整显型的CTC的严格入选/排除标准，同时保持对于仅部分满足这类标准但仍然可能是临床有意义的对象的访问，例如凋亡肿瘤细胞、肿瘤细胞分片或者经过上皮到间质细胞转变的细胞。
因此，除了跟踪HD-CTC之外，细胞角蛋白阳性细胞的多个不同类别在这一批患者中编目录，包括具有显示凋亡的核子的细胞、没有圆周细胞角蛋白的细胞、与周围WBC相同尺寸或者要小的细胞以及细胞角蛋白暗或阴性(数据未示出)的细胞。最后，除了各种类型的亮细胞角蛋白阳极细胞之外，许多患者还具有充分数量的细胞，其中具有在形态上不同于周围WBC、与那个样本中的HD-CTC的核子类似并且是CD45阴性但也是细胞角蛋白暗或阴性(数据未示出)的核子。
一些候选HD-CTC被排除，因为它们缺乏形态或形态度量入选标准。例如，观察细胞角蛋白强度过暗；核子尺寸过小；细胞角蛋白观察到不充分圆周(围绕少于核子的2/3)；观察细胞角蛋白过暗，即使群集看起来属于多个大细胞；核子表明凋亡碎裂变化；核子过小并且细胞质不充分圆周；看起来是晚期凋亡的细胞；核子过小(与周围WBC核子相同尺寸)；细胞角蛋白存在，但是没有圆周；以及细胞质不充分圆周，并且核子过小。
在单个前列腺患者中发现各种类型的可疑CTC。例如，一部分对于细胞角蛋白和CD45为阴性，但是具有较大并且反过来像患者中发现的其它HD-CTC的核子。还观察到典型HD-CTC，其中细胞为细胞角蛋白阳性、CD45阴性，具有DAPI核子。还观察到多个细胞、例如4个细胞的HD-CTC的群集。
根据与经过上皮-间质细胞转变的癌细胞的可能存在有关的当前辩论，这些细胞的外观和蛋白质表面模式将其识别为这种细胞类型的可能候选。备选地，这些细胞可能是剥掉其细胞质的大多数的较早肿瘤细胞。
流体活检分析保持揭示动作中的转移的前景。在这个难捉摸细胞群体中的是经过血流传播并且引起最终远转移的癌萌芽。但是，为了询问它们并且临床应用发现，细胞在癌症患者的大多数中必须是可靠地可恢复的。这里所述的设备、系统和方法产生最大包含、最小有损但细胞学上选择性平台，其在大量癌症患者中按照高清晰度产生高质量细胞。最初描述为前列腺癌患者的罕见发生[13]，首先识别具有转移性癌症的患者的大多数(88％)的这些细胞的群集。
使用检验的CTC的发生比采用许多技术所报告的要高许多，并且在与CTC芯片[6]所报告的相同范围。另外，与的直接比较表明在患者的较高比例中由HD-CTC检验所检测的明显更多的CTC。除了较高灵敏度之外，检验还证明细胞系和患者样本中的健壮性能。具有各事件的半定量表征的检验的再现性和健壮性对于细胞的下游分析是至关重要的。
在形态上，在患者之内并且跨患者发现CTC的异质群体。CTC具有各种形状、尺寸和细胞角蛋白强度。在一些情况下，不同细胞学特征、例如大尺寸或多边形细胞质形状在患者的样本中相当不同和单调。在其它情况下，在单个样本中的HD-CTC之间存在细胞形态可变性。细胞尺寸也不一致地改变；许多患者样本具有HD-CTC，其中具有均匀地三或四倍于相邻WBC核子的尺寸的核子，其它患者具有细胞，其中具有仅再次与相邻SBC核子的1/3的核子，并且其它患者具有高患者内尺寸可变性。
意外地，该批患者证明大多数患者中的HD-CTC的群集的共同发生。在这一批研究中评估的转移性癌患者的88％表明尺寸范围从2-30个HD-CTC的群集。多个问题围绕这类群集的存在发生，包括经过这种大聚合的循环系统的转变的流变，以及与这类群集是否表示传输其自己的具有它们的微环境基质的‘小肿瘤’有关的生物问题，因为它们传播并且因而可以是最或者仅真正亚稳的循环肿瘤细胞。当前研究在进行中，以进一步表征这批患者中的群集。
除了枚举HD-CTC之外，单独跟踪各种其它类别的类似CTC细胞，包括具有显示凋亡的核子的细胞、缺乏圆周细胞角蛋白的细胞、与周围WBC相同尺寸或者要小的细胞以及细胞角蛋白暗或阴性(数据未示出)的CD45阴性细胞。虽然这些事件的许多实际上可表示继发甚至平台中利用的最小处理的生物失巢凋亡或机械中断的各个阶段循环恶性上皮细胞，其它可能表示各种类型的假阳性。初始目标是识别具有包括适合于供辅助方法分析的所有潜在转移上皮细胞的极高可能性的细胞群体。分片、中断、固缩或损坏的癌细胞被认为对标准诊断病理学中的辅助分析不是可靠的，并且因而它们也为了便于这个液相活检平台中的‘计算可行循环肿瘤细胞’而被排除。这些实施例的系统、设备和方法定位、枚举和跟踪它们，因为认识到，通过反映总肿瘤负担或者通过反映涉及肿瘤负担和肿瘤血管分布和血管免疫监控的效率的至今错误理解的复方程，其存在可能将总体与患者的肿瘤生物相关。
在具有载玻片上的其它位置的HD-CTC的患者中常常看到的感兴趣非HD-CTC类别之一由具有一般根据尺寸标准在形态上不同于周围WBC并且CD45阴性但也是细胞角蛋白暗或阴性的核子的细胞组成。由于HD-CTC检验的最显著优点之一在于冷冻细胞的并行可分量、从而允许特定高产量患者样本中的回溯标记选择，所以进一步表征这类细胞的正进行研究正在进行。可能性包括具有变性的或剥落细胞质的上皮细胞、异常地表达或者异常地缺乏对其生物起因是典型的蛋白质的细胞或者可能地经过后形质体过程、例如上皮到间质细胞转变的细胞。检验和成像平台当前局限于固定细胞的分析；但是，工作正在进行中，以建立对于活体细胞枚举和成像的这种方式的潜在实用性。
虽然相应患者批的样本尺寸仍然过于适度而无法得出任何确定结论，但是要注意，使用方式(前列腺>乳腺>胰腺)的不同肿瘤类型之间的CTC的检测的频率和相对浓度平行于使用其它方法、例如所观察的发现。先前研究人员已经提出，肿瘤脉管形成中的生物或解剖差、转移的解剖部位以及肿瘤细胞是否经由入口循环来过滤可考虑这些差的一部分[1]。
图10示出这里所述的系统、设备和方法与产品的比较测试数据。最左列识别5个乳腺癌肿瘤以及10个前列腺癌肿瘤。第二列陈述mL/测试。第三列示出使用所述实施例的系统、设备和方法的所观察CTC。第四列提供计算CTC/mL。最右侧两列提供按7.5ml所报告的产品的比较数据(与第四列中的每mL相比)。
图11示出绘制前列腺、胰腺、乳腺癌的各种样本的CTC的数量以及与健康群体的比较的测试结果。从左到右是前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌以及假定健康群体的数据。这些结果提供CTC/ml的数量及使用本文所述实施例的系统、设备和方法的样本观察CTC。
图12示出各种患者样本相对于乳腺癌的CTC的数量。最左图表示出HER2-，不用Herceptin和HER2+，用Herceptin。中心图表示出不对Herceptin(左)与对Herceptin(右)的比较。最右图表示出HER2阴性(左)与HER2阳性(右)。
图13示出归一化核子面积与白血细胞(WBC)和CTC的核子面积，其中包括基线区的放大。基本图表的左轴是从0至700000。放大是从从0至400。多参数分析的使用的有益效果由图16和图17来支持。如图13所示，单个参数、例如核子面积可能在载玻片上不参数可跟踪量的候选数量。虽然可看来好像对核子尺寸的下限的使用会去除噪声(WBC)的大部分，但是放大表明，非CTC候选的数量与实际HD-CTC相比仍然较大。诸如CK强度和CD-45强度的更多参数的使用用来有效滤出非HD CTC事件。
总之，HD-CTC检验(i)发现具有转移性癌的大多数患者中的大量CTC，(ii)具有优于系统的改进灵敏度，(iii)按照供下游表征的理想格式来提供HD-CTC，(iv)实现能够冷冻存储长时间段并且然后当新检验或标记成为可用时回溯分析的样本的预期收集。
实验方法
患者和血液样本收集。
在Scripps Clinic.University of California(San Diego)、BillingsClinic和University of California(San Francisco)，在公共机构审查委员会(IRB)批准协议下，在防凝血液试管中从转移性癌患者收集样本。来自非本地地点(UCSF，Billings Clinic)的样本在前一夜运送，使得样本在24小时之内接收和处理。来自本地地点(Scripps Clinic和UCSD)在室温下保持16-24小时，以模拟来自非本地地点的样本。血液标本还从来自Scriips ResearchInstitute(“TSRI”)正常血液施体服务的正常组来抽取。
HD-CTC检测的血液样本处理。
在使用Hemocue白血细胞系统(HemoCue，Sweden)测量白血细胞(SBC)计数之前，将血液标本摇动五(5)分钟。基于WBC计数，血液的体积经过红血球溶解(氯化铵溶液)。在离心之后，有核细胞在醚酸缓冲盐溶液(PBS)中重新悬浮，并且作为单层附于定制玻璃载玻片上。玻璃载玻片是与标准显微镜载玻片相同尺寸，但是具有允许活体细胞的最大保持力的涂层。(一种类型的粘附载玻片至少可从Marienfeld LaboratoryGlassware(Germany)来得到。)各载玻片能够保持大约3百万个有核细胞，因此每个载玻片所装载的细胞数量取决于患者WBC计数。
对于这个研究的癌症患者中的HD-CTC检测，四(4)个载玻片用作测试。为各患者所创建的其余载玻片存储在-80℃供将来实验。从各患者解冻四个载玻片。细胞采用以冷甲醇所渗透的2％多聚甲醛来固定，以及非特定接合部位采用山羊血清来阻塞。载玻片随后采用单克隆广谱细胞角蛋白抗体(Sigma)和CD45-Alexa 647(Serotec)在37℃下培养40分钟。在PBS冲洗之后，载玻片采用Alexa Fluor 555山羊抗鼠抗体(Invitrogen)在37℃下培养20分钟。细胞采用DAPI复染10分钟，并且采用水安装介质来安装。
成像和技术分析
来自各患者的全部四(4)个载玻片使用定制荧光扫描显微镜(其研制并且优化用于快速可靠扫描)来扫描。各载玻片使用三(3)色10X物镜完全扫描，并且产生超过6900个图像。所产生的图像馈送到分析算法，其基于许多量度来识别可能的候选HD-CTC，包括细胞角蛋白强度、CD45强度以及核子和细胞质形状和尺寸。技术分析人员然后仔细检查算法生成的可能候选，并且去除显然不是细胞的命中、例如染料聚合物。
专业分析和解释。
所有可能候选CTC经过基于万维网的报告来提供给血液病理学家供分析和解释，其中病理学家能够包括或排除作为HD-CTC的各候选细胞。如果细胞为细胞角蛋白阳性、CD45阴性、包含完整DAPI核子而没有可识别凋亡变化(剥离、退化外观)或中断外观，并且在形态上不同于周围白血细胞(通常是基于形状的特征，但是偶尔完全基于尺寸)，则将其分类为HD-CTC。它们必须具有明显圆周的并且其中包含整个核子的细胞质。细胞质可显示凋亡变化、例如在周边细胞质边缘的剥离和不规则密度或适度中断，但是不必中断成使得它与核子的关联是有问题的。图像作为具有单独荧光通道查看能力的数字图像以及合成图像来提供。各细胞图像采用与相对核子尺寸、荧光强度和比较荧光强度有关的辅助统计数据来注释。每个HD-CTC候选在具有充分周围WBC的视场中呈现，以允许所述细胞的细胞形态特征与背景白血细胞之间的上下文比较。
HD-CTC检验特别是有鉴于临床环境以及对早期技术创新和将来自动化的需要而研制的。所有实验室过程遵循经过优化、测试和验证的严格标准操作规程。数据收集和候选标识使用特定接口来自动化，其实现病理学家的决策以及这些判定的后续跟踪。例行设定的完全自动化和自适应的规范将产生于这个早期研究框架。
细胞系实验。
来自施体四个可分量(各为2ml)采用可变数量的SKBR-3细胞来稀释，以产生四(4)个载玻片，其中每个载玻片具有大约300、100、30和10个癌细胞。16个载玻片然后由单个操作人员按照HD-CTC样本制备协议来处理和分析。单个估计器用来对全部16个载玻片进行成像。
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通过引用将本说明书中所述的所有发表物和专利结合到本文中，如同每个单独发表物或专利申请专门并且单独指示为通过引用来结合。虽然为了清楚和理解起见通过说明和示例略微详细地描述了本发明的上述实施例，但是本领域的技术人员根据本发明的理论可易于清楚地知道，可对其进行某些变更和修改，而没有背离本文所述本发明的精神或范围。相应地，本发明仅由以下权利要求书来限制。

Claims (51)

1.一种用于检验细胞的、设置于基底表面的孔，所述孔包括：
a)平坦底面；以及
b)形成所述孔的周边的边界，所述边界与所述底面相邻，并且提供其间的流体密封，
其中所述孔配置成接收所述边界之内的至少1.5百万个细胞的单层，并且所述孔的所述平坦底面具有至少7.0cm2的面积。
2.如权利要求1所述的孔，其中，所述孔配置成接收至少2.5百万个细胞的单层。
3.如权利要求1所述的孔，其中，所述孔配置成接收至少3百万个细胞的单层。
4.如权利要求1所述的孔，其中，所述孔的所述平坦底面具有至少10.0cm2的面积。
5.如权利要求1所述的孔，其中，所述孔的所述平坦底面具有至少11.7cm2的面积。
6.如权利要求1所述的孔，其中，所述孔具有至少12.0cm的周长。
7.如权利要求1所述的孔，其中，所述孔具有至少14.0cm的周长。
8.如权利要求1所述的孔，其中，所述孔具有至少15.0cm的周长。
9.如权利要求1所述的孔，其中，所述基底包括玻璃。
10.如权利要求1所述的孔，其中，所述基底是包括长度、宽度和厚度的平坦基底。
11.如权利要求1所述的孔，其中，所述长度大约为7至8cm，以及宽度大约为2至3cm。
12.如权利要求10所述的孔，其中，所述厚度大约为5至10mm。
13.如权利要求1所述的孔，其中，所述孔占据所述基底表面的至少40％、53％或62％。
14.如权利要求1所述的孔，其中，所述周边为矩形，并且所述基底为矩形。
15.如权利要求1所述的孔，其中，所述边界是结构边界或疏水涂层，其防止流体流经所述边界。
16.如权利要求15所述的孔，其中，所述边界是包括玻璃的结构边界。
17.如权利要求1所述的孔，其中，所述孔具有至少15cm的周长，并且所述孔的平坦底面具有至少10cm2的面积。
18.如权利要求1所述的孔，其中，所述基底包括受托标记。
19.如权利要求1所述的孔，其中，所述孔还包括盖片。
20.如权利要求1所述的孔，其中，所述平坦底面包括细胞粘附涂层。
21.一种用于检验细胞的系统，包括：
a)如权利要求1-20中的任一项所述的孔；
b)照明系统；
c)成像系统；
d)分析模块，包括用于分析细胞选择标准的功能性；以及
e)用户输出。
22.如权利要求21所述的系统，其中，所述照明和成像系统包括光源、激励滤光轮、镜、光发射滤光轮、照相装置、光场照相装置、数据存储模块或者其组合。
23.如权利要求22所述的系统，其中，所述光源是广谱照明器。
24.如权利要求21所述的系统，其中，所述分析模块包括可操作以耦合到通过所述分析模块所分析的数据所植入的元数据数据库的电路。
25.如权利要求21所述的系统，其中，所述细胞选择标准从细胞形态、核子面积或尺寸、细胞标记的不存在或存在、细胞标记的强度或者其组合中选取。
26.如权利要求25所述的系统，其中，所述细胞标记是细胞表面标记或核子标记。
27.如权利要求21所述的系统，还包括数据管理系统。
28.如权利要求27所述的系统，其中，所述数据管理系统包括数据存储模块。
29.一种用于执行细胞检验的方法，包括：
a)将包括细胞群体的样本与如权利要求1至20中的任一项所述的孔相接触；以及
b)经由如权利要求21至28中的任一项所述的系统来分析所述细胞群体，由此执行细胞检验。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述分析包括所述细胞群体中的细胞类型的表征。
31.如权利要求30所述的方法，其中，分析包括细胞角蛋白、CD45、核子面积或尺寸、细胞形态或者其组合的检测。
32.如权利要求29所述的方法，其中，所述样本是血液样本。
33.一种检测具有细胞群体的样本中的循环肿瘤细胞的方法，包括：
a)将如权利要求1至20中的任一项所述的孔与所述样本相接触；
b)经由如权利要求21至28中的任一项所述的系统来分析所述细胞群体；以及
c)经由(b)的所述分析来检测循环肿瘤细胞，由此检测所述样本中的循环肿瘤细胞。
34.如权利要求33所述的方法，其中，所述样本是血液样本。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述样本具有大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ml的体积。
36.如权利要求33所述的方法，其中，每毫升的样本检测多于2、5、7、10、15、20或50个循环肿瘤细胞。
37.如权利要求33所述的方法，其中，所述分析包括细胞角蛋白、CD45、核子面积或尺寸、细胞形态或者其组合的检测。
38.如权利要求37所述的方法，其中，所述循环肿瘤细胞的特征在于细胞角蛋白阳性、CD45阴性并且经由DAPI成像包含完整非凋亡核子。
39.一种用于诊断癌症或者提供受检者的癌症的诊断的方法，包括：
a)将如权利要求1至20中的任一项所述的孔与包含来自所述受检者的细胞群体的样本相接触；
b)经由如权利要求21至28中的任一项所述的系统来分析所述细胞群体；
c)经由(b)的所述分析来检测循环肿瘤细胞；
d)表征所述循环肿瘤细胞；以及
e)经由(d)的所述表征来确定诊断或预后，由此诊断或提供所述受检者的癌症的预后。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述样本是血液样本。
41.如权利要求40所述的方法，其中，所述样本具有大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ml的体积。
42.如权利要求39所述的方法，其中，每毫升的样本检测多于2、5、7、10、15、20或50个循环肿瘤细胞。
43.如权利要求39所述的方法，其中，所述分析包括细胞角蛋白、CD45、核子面积或尺寸、细胞形态或者其组合的检测。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述循环肿瘤细胞的特征在于细胞角蛋白阳性、CD45阴性并且经由DAPI成像包含完整非凋亡核子。
45.如权利要求39所述的方法，其中，表征所述循环肿瘤细胞包括确定所述细胞源自其中的癌症的类型。
46.如权利要求39所述的方法，还包括对所述受检者施用化学治疗方案。
47.如权利要求46所述的方法，其中，所述方案包括注入一个或多个化学治疗试剂。
48.一种用于确定受检者对化学治疗方案的响应性的方法，包括：
a)将如权利要求1至20中的任一项所述的孔与包含来自所述受检者的细胞群体的样本相接触；
b)经由如权利要求21至28中的任一项所述的系统来分析所述细胞群体；
c)经由(b)的所述分析来检测循环肿瘤细胞；以及
d)表征所述循环肿瘤细胞，以确定化学治疗试剂的注入的效能，由此确定所述受检者对所述治疗方案的响应性。
49.一种套件，包括：
a)如权利要求1-20中的任一项所述的孔；
b)用于免疫地确定细胞中的细胞角蛋白或CD45的存在的试剂；以及
c)用于利用所述套件检测样本中的循环肿瘤细胞的指令。
50.如权利要求46所述的套件，其中，所述试剂包括专门接合细胞角蛋白和CD45的抗体。
51.如权利要求46所述的套件，还包括用于执行DAPI染色的试剂。
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