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CN104356224A - 一种制备萨摩鲁泰的方法 - Google Patents

一种制备萨摩鲁泰的方法 Download PDF

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CN104356224A
CN104356224A CN201410573312.1A CN201410573312A CN104356224A CN 104356224 A CN104356224 A CN 104356224A CN 201410573312 A CN201410573312 A CN 201410573312A CN 104356224 A CN104356224 A CN 104356224A
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CN
China
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fmoc
och
resin
gly
coupling
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Pending
Application number
CN201410573312.1A
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English (en)
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张晓�
刘霁莉
周亮
沈柯
杨东晖
路杨
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HANGZHOU ADLAI NORTYE PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
HANGZHOU ADLAI NORTYE PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
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Publication date
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Abstract

本发明涉及多肽合成技术领域，特别涉及一种制备萨摩鲁泰的方法。本发明的具体步骤为：A）通过液相法合成五肽片段（化合物Ⅰ）；B）在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Gly-OH偶联得到Fmoc-Gly-树脂；C）通过固相合成法，按照萨摩鲁泰主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸采用五肽片段（化合物Ⅰ）；D）裂解，纯化，冻干后得到萨摩鲁泰。本发明提供了一种合成周期短、成本低、收率较高、适合规模化生产的萨摩鲁泰的合成工艺。

Description

一种制备萨摩鲁泰的方法
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，特别涉及一种萨摩鲁泰的固相合成方法。
背景技术
萨摩鲁泰，英名为：semaglutide，是主链含有31个氨基酸的多肽，肽序列为：
 萨摩鲁泰是由丹麦诺和诺德公司研制的产品，主要用于治疗II型糖尿病。II型糖尿病，又名非胰岛素依赖型糖尿病（NIDDM），特点是人体自身能够产生胰岛素，但细胞无法对其作出反应，使胰岛素的效果大打折扣。II型糖尿病主要通过口服或皮下注射降糖药治疗。针对Ⅱ型糖尿病的降糖药种类很多，胰高血糖样肽-1（GLP-1）的受体激动素是近年来研究的热点。其中，萨摩鲁泰（semaglutide）是GLP-1 的受体激动素之一，在分子结构、生物活性、作用靶点及免疫原性等方面与GLP-1相似。萨摩鲁泰作为一种每周服用一次的皮下注射长效制剂，能起到良好的降低血糖的作用，同时还具有减肥的功效。
现有技术CN103848910A报道了一种萨摩鲁泰的固相合成方法，此方法先将萨摩鲁泰的主链偶联在树脂上，然后脱除Lys 的侧链mmt（4-甲氧基三苯甲基）保护基团，经第二逐步偶联2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸，获得第二肽树脂，裂解后得到萨摩鲁泰粗肽。由于使用体积比为1-5%的TFA的DCM脱除Lys 的侧链mmt保护基团，会影响主链上对酸敏感的氨基酸保护基团，从而将导致杂质增加、纯度下降、收率不高、生产成本增加、不利于大规模生产。
综上所述，现有萨摩鲁泰的制备过程中，合成步骤较多，合成周期长，纯度和收率低，生产成本高，不利于大规模生产。
发明内容
本发明人用现有的合成方法，制备萨摩鲁泰，发现现有技术存在的技术问题是：合成步骤较多，合成周期长，纯度和收率低，生产成本高，不利于大规模生产。为此，本发明人对萨摩鲁泰的合成方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。
本发明的目的是提供一种制备萨摩鲁泰的方法。本发明的合成路线如图1所示：首先通过液相法合成五肽片段（化合物Ⅰ）；其次在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Gly-OH偶联得到Fmoc-Gly-树脂；然后通过固相合成法，按照萨摩鲁泰主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸采用五肽片段（化合物Ⅰ）；最后裂解，纯化，冻干后得到萨摩鲁泰。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义；
Fmoc ：芴甲氧羰基
Fmoc-AA ：芴甲氧羰基保护的氨基酸
DIC ：N，N′-二异丙基碳化二亚胺
PyBOP ：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
HATU ：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBt ：1- 羟基苯骈三唑
tBu ：叔丁基
Trt ：三苯甲基
Boc ：叔丁氧羰基
Mmt ：4-甲氧基三苯甲基
Pbf ： 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
Gly ：甘氨酸
Arg ：精氨酸
Val ：缬氨酸
Leu ：亮氨酸
Trp ：色氨酸
Ala ：丙氨酸
Ile ：异亮氨酸
Phe ：苯丙氨酸
Glu ：谷氨酸
Lys ：赖氨酸
Gln ：谷氨酰胺
Tyr ：酪氨酸
Ser ：丝氨酸
Asp ：天冬氨酸
Thr ：苏氨酸
His ：组氨酸
Aib ：2-甲基丙氨酸
DMF ：N,N′-二甲基甲酰胺
MeOH ：甲醇
DCM ：二氯甲烷
TFE ：三氟乙醇
NMP ：N-甲基吡咯烷酮
DMSO ：二甲基亚砜
TFA ：三氟醋酸
PhSMe ：苯甲硫醚
EDT ：1,2-乙二硫醇
Piperidine ：六氢吡啶
DMAP ：4-二甲氨基吡啶
DIEA ：N，N′-二异丙基乙胺
TMP ：2,4,6-三甲基吡啶
为此本发明提供一种萨摩鲁泰的合成方法，其步骤如下：
步骤1，通过液相法方法合成五肽片段（化合物Ⅰ）；
    步骤2，在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Gly-OH偶联得到Fmoc-Gly-树脂；
    步骤3，通过固相合成法，按照萨摩鲁泰主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸采用五肽片段（化合物Ⅰ）；
    步骤4，裂解，纯化，冻干，得到萨摩鲁泰。
其中，步骤1所述的固相合成方法，所述五肽片段（化合物Ⅰ）的液相法合成步骤为：（1）Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CO2H、HOSu和DCC偶联得到Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-OSu，然后Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-OSu和Fmoc-Lys-OH反应得到二肽片段Fmoc-Lys[Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH；(2)脱去Boc，得到Fmoc-Lys[NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH；（3）Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-OSu和Fmoc-Lys[NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH反应得到三肽片段Fmoc-Lys[Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH；（4）脱去Boc，得到Fmoc-Lys[NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH；（5）HO2C(CH2)16C(O)-OtBu、HOSu和DCC偶联得到tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-OSu，然后tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-OSu和H-Glu-OtBu反应得到二肽片段tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-Glu-OtBu；（6）tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-Glu-OtBu、HOSu和DCC偶联得到tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-Glu(OSu)-OtBu，然后tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-Glu(OSu)-OtBu和Fmoc-Lys[NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH反应得到五肽片段（化合物Ⅰ）。
其中，步骤2所述的固相合成方法，所述树脂固相载体采用2-CTC树脂，所述活化剂系统选自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-Gly-树脂为0.10~0.50mmol/g取代度的Fmoc-Gly-CTC树脂。
其中，步骤2所述的固相合成方法，所述树脂固相载体采用王树脂，所述活化剂系统由DIC、HOBt和DMAP组成，所述Fmoc-Gly-树脂为0.10~0.50mmol/g取代度的Fmoc-Gly-王树脂。
本发明中，所述的树脂的取代度是采用紫外吸光光度法测定的树脂的取代度，用20%哌啶/DMF溶液将偶联Fmoc保护型氨基酸的树脂上的Fmoc保护基脱保护下来，用紫外吸光光度法测定其浓度，然后采用含Fmoc的氨基酸标准化合物例如Fmoc-Leu-OH，以外标法标定树脂上的Fmoc的mmol数值，除以树脂重量，即得到树脂的取代度或称之为替代度。
其中，步骤3所述的固相合成方法包括如下步骤：
（1）采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除Fmoc-Gly-树脂上的Fmoc保护基，得到H-Gly-树脂；
（2）在偶联剂系统的存在下，H-Gly-树脂和Fmoc保护且侧链保护的精氨酸偶联得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
（3）重复步骤（1）、（2），按照萨摩鲁泰主链肽序依次进行氨基酸的偶联，其中赖氨酸采用五肽片段（化合物Ⅰ），偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、五肽片段（化合物Ⅰ）、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(Trt)-OH；所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或他们之间的任意组合。
优选地，步骤（3）中，氨基酸偶联过程中，其中当缩合剂选择HATU/HOBt/DIEA时，H-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂(以下简称AA-树脂):五肽片段（化合物Ⅰ）:HATU:HOBt:DIEA的摩尔比优选为：1:3:3:3:3~1:5:5:5:5，即所述五肽片段（化合物Ⅰ）和缩合剂HATU/HOBt/DIEA这4种物质的摩尔数相等，它们各自相对于所述AA树脂的摩尔比例为3/1~5/1，反应温度为25~35℃，反应时间为2~3小时；更优选，它们各自相对于所述AA树脂的摩尔比例为5/1，反应温度为35℃，反应时间为2小时。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
（1）摩尔比的选择：H-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂:五肽片段（化合物Ⅰ）:HATU:HOBt:DIEA的摩尔比为：1:3:3:3:3和1:5:5:5:5；
（2）反应温度的选择：
25oC和35oC；
（3）反应时间的选择：
2小时和3小时。
为此提出了8种实验条件：
实验条件1：取6.24g H-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂(1.0mmol)、3.59 g五肽片段（化合物Ⅰ）(3.0 mmol)、0.41g HOBt (3.0 mmol)和1.14g HATU (3.0 mmol)加入20ml DMF中搅拌溶解，冷却到0oC，将0.5ml DIEA (3.0 mmol)加入上述溶液中，在25oC反应2小时，然后依次偶联剩下的氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(Trt)-OH，裂解，纯化，冻干，得到萨摩鲁泰精肽；
实验条件2―8，实验操作如实验条件1所示，不同的实验条件及其实验结果如下面的表1所示：
                             表1
实验条件 摩尔比 温度 时间 总收率 纯度
实验条件1 1:3:3:3 25℃ 2小时 24% 99.11%
实验条件2 1:5:5:5 25℃ 2小时 28% 99.12%
实验条件3 1:3:3:3 35℃ 2小时 28% 99.24%
实验条件4 1:5:5:5 35℃ 2小时 31% 99.75%
实验条件5 1:3:3:3 25℃ 3小时 28% 99.53%
实验条件6 1:5:5:5 25℃ 3小时 29% 99.63%
实验条件7 1:3:3:3 35℃ 3小时 28% 99.12%
实验条件8 1:5:5:5 35℃ 3小时 26% 99.27%
以上结果表明，实验条件4的纯化效果最优。
本发明的方法和现有技术相比具有明显的优势，有关对比实验如下表2所示：
                    表2 对比实验结果 
专利 总收率 纯度
本发明技术 31% 99.75%
CN103848910A 16% 99.26 %
本发明的有益效果是：选用五肽片段（化合物Ⅰ）直接固相合成萨摩鲁泰，解决了现有技术存在的合成周期长，成本高，纯度低，杂质多，不适用于工业化生产的问题；本发明提供了一种合成周期短、成本低、收率较高，适合规模化生产的萨摩鲁泰的合成工艺。
附图说明
图1：本发明萨摩鲁泰的合成路线；
图2 ：五肽片段的HPLC谱图；
图3：萨摩鲁泰粗肽的HPLC谱图；
图4：萨摩鲁泰精肽的HPLC谱图；
图5：五肽片段的质谱谱图；
图6：萨摩鲁泰精肽质谱谱图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
具体地，关于下面实施例中涉及的各商购氨基酸以及氨基酸片段，以及各商购树脂，其生产厂家和商品型号如下：
Fmoc保护基氨基酸原料、2-CTC树脂和王树脂均为常规的市售试剂（厂家：吉尔生化（上海）有限公司；化学纯）；五肽片段（化合物Ⅰ）是本专利描述合成的。
有机溶剂和其它原料来源均为市售品（厂家：国药集团化学试剂有限公司；化学纯）。
另外，下面实施例中提到的“旋蒸浓缩”以及“冻干”以及测定HPLC和质谱的条件和所用设备型号及生产厂家说明如下：
旋蒸浓缩设备：旋转蒸发仪R-200/205（瑞士Buchi(布奇)公司）；
旋蒸浓缩条件：30℃下，真空（-0.1Mpa）条件下旋蒸浓缩，浓缩后体积在旋蒸前总体积75%以下。
冻干设备：冻干机FD-3（北京博医康实验仪器有限公司）；
冻干条件：将冻干盘放入冰箱冷冻室(-20℃) 中，预冻6 h。开启冻干机，打开制冷，预冷30 min以上，设置冻干曲线如下：
第一段：在-27℃运行16 h；第二段：在-5℃运行4 h；第三段：在5℃运行2 h；第四段：在30℃运行16 h。
HPLC：Dionex高效液相色谱仪；用十八烷基硅烷键合硅胶（5μm，250×4.6mm）为填充剂；以0.1%TFA溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；检测波长为220nm；柱温30℃。取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。 
质谱： MALDI-TOF-MS 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱；仪器型号为AUTO FLEX SPEED TOF-TOF。
实施例一：Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-OSu活化酯的合成
称取263.29g Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-OH（1.0mol），138.10g HOSu（1.2mol）加入2000ml THF中，冰水浴下加入247.56g DCC（1.2mol），反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加DCM溶解，过滤，饱和碳酸氢钠洗3遍，纯水2遍，反萃2遍，合并有机相，无水碳酸钠干燥，旋干，冰乙醇重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到320.72g Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-OSu活化酯，收率89%。
实施例二：Fmoc-Lys[Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH的合成
称取184.21g Fmoc-Lys-OH（0.5mol）和79.50g Na2CO3（0.75mol）加入到500ml水和500ml THF的混合溶液中溶解，称取180.18g Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-OSu（0.5mol）加入到500ml THF，溶解后滴加上述混合溶液中，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节PH到7，旋蒸除去THF，之后调节PH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用冰乙醇重结晶。固体油泵拉干得到266.96g Fmoc-Lys[Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH，收率87%。
实施例三：Fmoc-Lys[NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH的合成
取上述实施例二的266.96g Fmoc-Lys[Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH加入到500 ml TFA和500 ml DCM中，加入乙醚沉降后，旋蒸除去溶剂，固体油泵拉干得到221.23g Fmoc-Lys[NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH，收率99%。 
实施例四：Fmoc-Lys[Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH的合成
称取205.48 g Fmoc-Lys[NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH（0.4 mol）和63.60g Na2CO3（0.60 mol）加入到500ml水和500ml THF的混合溶液中溶解，称取144.14g Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-OSu（0.4 mol）加入到500ml THF，溶解后滴加上述混合溶液中，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节PH到7，旋蒸除去THF，之后调节PH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用冰乙醇重结晶。固体油泵拉干得到264.05g Fmoc-Lys[Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH，收率87%。
实施例五：Fmoc-Lys[NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH的合成
取上述实施例四的264.05g Fmoc-Lys[Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH加入到500 ml TFA和500 ml DCM中，加入乙醚沉降后，旋蒸除去溶剂，固体油泵拉干得到226.96 g Fmoc-Lys[NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH，收率99%。
实施例六：tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-OSu活化酯的合成
称取370.56g HO2C(CH2)16C(O)-OtBu（1.0mol），138.10g HOSu（1.2mol）加入2000ml THF中，冰水浴下加入247.56g DCC（1.2mol），反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加DCM溶解，过滤，饱和碳酸氢钠洗3遍，纯水2遍，反萃2遍，合并有机相，无水碳酸钠干燥，旋干，冰乙醇重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到416.13g tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-OSu活化酯，收率89%。
实施例七：tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-Glu-OtBu的合成
称取102.62g H-Glu-OtBu（0.5mol）和79.50g Na2CO3（0.75mol）加入到500ml水和500ml THF的混合溶液中溶解，称取233.82g tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-OSu（0.5mol）加入到500ml THF，溶解后滴加上述混合溶液中，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节PH到7，旋蒸除去THF，之后调节PH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用冰乙醇重结晶。固体油泵拉干得到241.77g tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-Glu-OtBu，收率87%。
实施例八：tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-Glu（OSu）-OtBu的合成
称取222.32g tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-Glu-OtBu（0.4mol），55.24g HOSu（0.48mol）加入1000ml THF中，冰水浴下加入99.02g DCC（0.48mol），反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加DCM溶解，过滤，饱和碳酸氢钠洗3遍，纯水2遍，反萃2遍，合并有机相，无水碳酸钠干燥，旋干，冰乙醇重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到232.40g tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-Glu（OSu）-OtBu活化酯，收率89%。
实施例九：五肽片段（化合物Ⅰ）的合成
称取65.88g Fmoc-Lys[NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH（0.1mol）和15.90g Na2CO3（0.15mol）加入到100ml水和100ml THF的混合溶液中溶解，称取65.29g tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-Glu（OSu）-OtBu（0.1mol）加入到100ml THF，溶解后滴加上述混合溶液中，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节PH到7，旋蒸除去THF，之后调节PH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用冰乙醇重结晶。固体油泵拉干得到101.70g五肽片段（化合物Ⅰ），其HPLC谱图如图2所示，HPLC纯度为97.40%，收率85%；其质谱如图5所示， [M+Na]+：1218.756、[M+K]+：1234.852，五肽片段（化合物Ⅰ）的理论精确分子量为：1195.72，样品质谱结果与理论分子量相符，结构正确。
实施例十：取代度为0.10mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的合成
称取取代度为0.40mmol/g的2-CTC树脂22.50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取13.37g Fmoc-Gly-OH(45mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入7.5ml DIEA(45mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入100ml无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩干燥，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.10mmol/g。
实施例十一：取代度为0.25mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的合成
称取取代度为0.95mmol/g的2-CTC树脂10g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取14.11g Fmoc-Gly-OH(47mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入8.0ml DIEA(47mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入100ml无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩干燥，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.25mmol/g。
实施例十二：取代度为0.50 mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的合成
称取取代度为1.20 mmol/g的2-CTC树脂10g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取17.83g Fmoc-Gly-OH(60mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入10ml DIEA(60mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入100ml无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩干燥，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.50mmol/g。
实施例十三：取代度为0.10mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂的合成
称取取代度为0.45mmol/g的王树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取13.37g Fmoc-Gly-OH(45mmol)、6.01g HOBt(45mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入7.0ml DIC(45mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，5分钟后加入2.75g DMAP(22.5mmol)，反应2小时后，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用100ml醋酸酐/吡啶封端过夜，甲醇收缩干燥，得到Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度为0.10mmol/g。
实施例十四：取代度为0.25mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂的合成
称取取代度为0.75mmol/g的王树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取17.83g Fmoc-Gly-OH(0mmol)、8.01g HOBt(60mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入9.3 ml DIC(60mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，5分钟后加入3. 63g DMAP(30mmol)，反应2小时后，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用100ml醋酸酐/吡啶封端过夜，甲醇收缩干燥，得到Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度为0.25mmol/g。
实施例十五：取代度为0.50 mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂的合成
称取取代度为1.20 mmol/g的王树脂10g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取22.28g Fmoc-Gly-OH(75mmol)、10.13g HOBt(75mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入11.6 ml DIC(75mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，5分钟后加入4.5g DMAP(37.5mmol)，反应2小时后，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用100ml醋酸酐/吡啶封端过夜，甲醇收缩干燥，得到Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度为0.50mmol/g。
实施例十六：萨摩鲁泰CTC树脂的制备
取实施例十中4.46g取代度为0.10mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂(1mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30分钟后，用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，称取3.24g Fmoc-Arg(Pbf)-OH（5mmol）、0.68g HOBt（5mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入0.8ml DIC（5mmol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照萨摩鲁泰主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、五肽片段（化合物Ⅰ）、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。其中Fmoc-Leu-OH和Fmoc-Phe-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-Asp(OtBu)-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Boc-His(Trt)-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA，偶联完毕，将萨摩鲁泰CTC树脂用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到11.09g 萨摩鲁泰CTC树脂。
实施例十七：萨摩鲁泰王树脂的制备
取实施例十三种4.57g（1mmol）取代度为0.10mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-王树脂30分钟后，用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，称取3.24g Fmoc-Arg(Pbf)-OH（5mmol）、0.68g HOBt（5mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入0.8ml DIC（5mmol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照萨摩鲁泰主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、五肽片段（化合物Ⅰ）、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。
其中Fmoc-Leu-OH和Fmoc-Phe-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-Asp(OtBu)-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Boc-His(Trt)-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA，偶联完毕，将萨摩鲁泰王树脂用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到11.20g 萨摩鲁泰王树脂。
实施例十八：萨摩鲁泰王树脂的规模化制备
称取4570g（1mol）取代度为0.10mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-王树脂30分钟后，用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，称取3240g Fmoc-Arg(Pbf)-OH（5mol）、682g HOBt（5mol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入800ml DIC（5mol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照萨摩鲁泰主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、五肽片段（化合物Ⅰ）、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。其中Fmoc-Leu-OH和Fmoc-Phe-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-Asp(OtBu)-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Boc-His(Trt)-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA，偶联完毕，将萨摩鲁泰王树脂用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到11200g 萨摩鲁泰王树脂。
实施例十九：萨摩鲁泰粗肽的制备
称取112.00g 全保护的萨摩鲁泰CTC树脂或者萨摩鲁泰王树脂，加入到2000mL的三口圆底烧瓶中，按TFA:苯甲硫醚:苯甲醚:EDT=90:5:3:2的体积比配置裂解液1120mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到萨摩鲁泰粗肽36.53g，其HPLC谱图如图3所示，HPLC纯度83.03%，粗肽收率78%。
实施例二十：萨摩鲁泰精肽醋酸盐的制备
称取36.53g 萨摩鲁泰粗肽用50%乙腈+50%水的混合溶液34L溶解后，通过C18或C8柱2次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物。第一次纯化条件：流动相为：A相： 0.1%TFA；B相：乙腈，检测波长220nm，收集目的峰馏分。第二次纯化条件：流动相为：A相： 0.3%乙酸；B相：乙腈。检测波长220nm，收集目的峰馏分。转盐条件：流 动 相：A相：20mM乙酸铵-水溶液；B相：乙腈；检测波长220nm。收集目的峰馏分，旋蒸浓缩，冻干得到萨摩鲁泰醋酸盐精肽12.75g，其HPLC谱图如图4所示，HPLC纯度99.75%，纯化总收率40%，总收率31%。其质谱如图6所示， [M]+：4113.232，萨摩鲁泰的理论精确分子量为：4113.12，样品质谱结果与理论分子量相符。
以上内容是结合具体的修选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保户范围。

Claims (7)

1.一种制备萨摩鲁泰的方法，其特征在于，包括如下步骤：
    步骤1，通过液相法方法合成五肽片段（化合物Ⅰ）                                                ；
     步骤2，在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Gly-OH偶联得到Fmoc-Gly-树脂；
    步骤3，通过固相合成法，按照萨摩鲁泰主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸采用五肽片段（化合物Ⅰ）；
    步骤4，裂解，纯化，冻干，得到萨摩鲁泰。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤1所述的固相合成方法，所述五肽片段（化合物Ⅰ）的液相法合成步骤为：（1）Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CO2H、HOSu和DCC偶联得到Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-OSu，然后Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-OSu和Fmoc-Lys-OH反应得到二肽片段Fmoc-Lys[Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH；(2)脱去Boc，得到Fmoc-Lys[NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH；（3）Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-OSu和Fmoc-Lys[NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH反应得到三肽片段Fmoc-Lys[Boc-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH；（4）脱去Boc，得到Fmoc-Lys[NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH；（5）HO2C(CH2)16C(O)-OtBu、HOSu和DCC偶联得到tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-OSu，然后tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-OSu和H-Glu-OtBu反应得到二肽片段tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-Glu-OtBu；（6）tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-Glu-OtBu、HOSu和DCC偶联得到tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-Glu(OSu)-OtBu，然后tBuO-(O)C(CH2)16C(O)-Glu(OSu)-OtBu和Fmoc-Lys[NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)NHCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)]-OH反应得到五肽片段（化合物Ⅰ）。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤2所述的固相合成方法，所述树脂固相载体采用2-CTC树脂，所述活化剂系统选自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-Gly-树脂为0.10~0.50mmol/g取代度的Fmoc-Gly-CTC树脂。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤2所述的固相合成方法，所述树脂固相载体采用王树脂，所述活化剂系统由DIC、HOBt和DMAP组成，所述Fmoc-Gly-树脂为0.10~0.50mmol/g取代度的Fmoc-Gly-王树脂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤3所述的固相合成方法包括如下步骤：（1）采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除Fmoc-Gly-树脂上的Fmoc保护基，得到H-Gly-树脂；
（2）在偶联剂系统的存在下，H-Gly-树脂和Fmoc保护且侧链保护的精氨酸偶联得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
（3）重复步骤（1）、（2），按照萨摩鲁泰主链肽序依次进行氨基酸的偶联，其中赖氨酸采用五肽片段（化合物Ⅰ）。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是：
所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或他们之间的任意组合。
7.根据权利要求５所述的方法，其特征是：
优选地，步骤（3）中，五肽片段（化合物Ⅰ）偶联过程中，其中当缩合剂选择HATU/HOBt/DIEA时，H-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂(以下简称AA-树脂):五肽片段（化合物Ⅰ）:HATU:HOBt:DIEA的摩尔比优选为：1:3:3:3:3~1:5:5:5:5，即所述五肽片段（化合物Ⅰ）和缩合剂HATU/HOBt/DIEA这4种物质的摩尔数相等，它们各自相对于所述AA树脂的摩尔比例为3/1~5/1，反应温度为25~35℃，反应时间为2~3小时；更优选，它们各自相对于所述AA树脂的摩尔比例为5/1，反应温度为35℃，反应时间为2小时。
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