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CN104211801A - 一种制备利西拉来的方法 - Google Patents

一种制备利西拉来的方法 Download PDF

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CN104211801A
CN104211801A CN201410357788.1A CN201410357788A CN104211801A CN 104211801 A CN104211801 A CN 104211801A CN 201410357788 A CN201410357788 A CN 201410357788A CN 104211801 A CN104211801 A CN 104211801A
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ser
tbu
fmoc
lixisenatide
gly
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CN201410357788.1A
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周俊
路杨
杨东晖
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HANGZHOU SINOPEP PHARMACEUTICAL Inc
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Abstract

本发明涉及一种制备利西拉来的方法。本发明的具体步骤为：A）通过液相合成片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH；B）采用固相合成法，以氨基树脂为起始树脂，按照利西拉来主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中32、33、34、35氨基酸偶联采用片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH偶联；C）肽树脂裂解、纯化、脱盐、冻干后可以得到利西拉来，其多肽杂质Di-Ser33-利西拉来和Di-Ala35-利西拉来含量都小于0.1%。本发明提供了一种纯度高、成本低，适合规模化生产的利西拉来的制备工艺，此工艺既能有效控制杂质Di-Ser33-利西拉来和Di-Ala35-利西拉来的含量又不影响利西拉来的收率。

Description

一种制备利西拉来的方法
技术领域
本发明涉及一种多肽类药物的制备方法，是一种合成的具有胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂的II型糖尿病的治疗特效药-利西拉来的制备方法。 
背景技术
利西拉来，英名为：Lixisenatide，是含有44个氨基酸的多肽，结构式如下： 
肽序列为：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
利西拉来（Lixisenatide）是由Sanofi-Aventis公司开发的1日1次皮下注射用胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂，主要用于治疗II型糖尿病，于2013年02月01日Sanofi-Aventis的利司那肽被EMEA批准，用于接受稳定剂量基础胰岛素（或联合二甲双胍）治疗不佳的II型糖尿病患者的辅助治疗以改善HbA1c和餐后血糖水平。
CN201210030151.2 中采用了纯固相顺序偶联的方法进行肽的合成。所述方法以氨基树脂为载体，采用常规顺序偶联，最终切割得到利西拉来。 
US6528486 为化合物专利，它提到的合成方法为Fmoc/tBu 策略的逐步缩合方法。 
WO2005058954 中的合成方法包括Fmoc/tBu 策略的逐步缩合方法、Boc 策略的逐步缩合方法及基因工程。 
WO2001004156 中的合成方法为Fmoc/tBu 策略的逐步缩合方法。 
由于利西拉来的合成国内外大多采用Fmoc固相合逐步缩合成法，逐步合成步骤较多，造成产物杂质种类比较多，US 20130284912特别报道了多肽杂质：Di-Ser33-利西拉来和Di-Ala35-利西拉来，Di-Ser33-利西拉来和Di-Ala35-利西拉来氨基酸序列如下： 
Di-Ser33-利西拉来氨基酸序列：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
Di-Ala35-利西拉来氨基酸序列：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
这两个杂质都是毒性较大的杂质之一，且与主峰分离十分困难，该杂质的存在严重影响利西拉来含量以及使用安全。因此需要找到有效的方法将其去除并使其达到优质标准级别0.1%以下。本发明人研究发现，该杂质用现有技术的手段很难除去，有些方法虽可以去除部分，但去除效果不理想，难以达到优质标准级别同时容易造成利西拉来本身收率降低。
综上所述，现有利西拉来的固相合成过程中，由于合成收率低，杂质多，特别是都不能很好控制杂质Di-Ser33-利西拉来和Di-Ala35-利西拉来，不适用于工业化生产。 
发明内容
本发明人用现有的Fmoc固相逐步合成方法，制备利西拉来，发现现有技术存在的技术问题是：合成收率低，杂质多，特别是都不能很好控制杂质Di-Ser33-利西拉来和Di-Ala35-利西拉来，不适于工业化规模生产。为此，本发明人采用片段法，对利西拉来的合成方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。 
本发明的目的是提供一种利西拉来的固相合成方法。本发明的合成路线如图1所示：A）通过液相合成片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH；B）采用固相合成法，以氨基树脂为起始树脂，按照利西拉来主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中32、33、34、35氨基酸偶联采用片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH偶联；C）肽树脂裂解、纯化、脱盐、冻干后可以得到利西拉来，其多肽杂质Di-Ser33-利西拉来和Di-Ala35-利西拉来含量都小于0.1%。本发明中一些常用的缩写具有以下含义； 
Fmoc ：芴甲氧羰基
Fmoc-AA-OH ：芴甲氧羰基保护的氨基酸
DIC ：N，N′-二异丙基碳化二亚胺
DCC ：N，N′-二环己基碳二亚胺
PyBOP ：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
HATU ：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBt ：1- 羟基苯骈三唑
HOSu ：N-羟基琥珀酰亚胺
tBu ：叔丁基
Trt ：三苯甲基
Boc ：叔丁氧羰基
Pbf ： 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
Ile ：异亮氨酸
Gln ：谷氨酰胺
Asn ：天冬酰胺
Pro ：脯氨酸
Leu ：亮氨酸
Gly ：甘氨酸
Arg ：精氨酸
Val ：缬氨酸
Trp ：色氨酸
Ala ：丙氨酸
Met ：甲硫氨酸
Phe ： 苯丙氨酸
Glu ：谷氨酸
Lys ： 赖氨酸
Ser ：丝氨酸
Asp ：天冬氨酸
Thr ：苏氨酸
His ：组氨酸
DMF ：N，N′-二甲基甲酰胺
MeOH ：甲醇
DCM ：二氯甲烷
NMP ：N-甲基吡咯烷酮
DMSO ：二甲基亚砜
TFA ：三氟醋酸
EDT ：乙二硫醇
Piperidine ：六氢吡啶
DIEA ：N，N′-二异丙基乙胺
为此本发明提供一种制备利西拉来的方法，其步骤如下：
步骤1，通过液相合成片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH；
步骤2，采用固相合成法，以氨基树脂为起始树脂，按照利西拉来主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中32、33、34、35氨基酸偶联采用片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH偶联；
步骤3，肽树脂裂解、纯化、脱盐、冻干后可以得到利西拉来，其多肽杂质Di-Ser33-利西拉来和Di-Ala35-利西拉来含量都小于0.1%。
其中，步骤1所述的片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH的液相合成步骤为：1）Fmoc-Ser(tBu)-OH、HOSu和DCC偶联得到Fmoc-Ser(tBu)-OSu，然后Fmoc-Ser(tBu)-OSu和H-Ser(tBu)-OH反应得到二肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH；2）Boc-Gly-OH、HOSu和DCC偶联得到Boc-Gly-OSu，然后Boc-Gly-OSu和H-Ala-OH反应得到Boc-Gly-Ala-OH，在体积比为1：1的TFA和DCM的混合溶液下去Boc保护基，得到H-Gly-Ala-OH；3）Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH、HOSu和DCC偶联得到Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OSu，然后Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OSu和H-Gly-Ala-OH反应得到四肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH。 
其中，步骤2所述的固相合成方法，1）采用0.10~0.40mmol/g 的氨基树脂为起始树脂；2）采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除氨基树脂上的Fmoc保护基；3）在偶联剂系统的存在下，氨基树脂和Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联得到Fmoc-Lys(Boc)-氨基树脂；4）重复步骤2）、3），按照利西拉来主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中32、33、34、35氨基酸偶联采用片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH偶联，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH；所述氨基树脂选自Rink Amide AM Resin、Rink Amide MBHA Resin 树脂，优选Rink Amide MBHA Resin树脂；其中所述氨基树脂的替代度为0.10~0.40mmol/g，优选为0.15~0.35mmol/g；所述活化剂系统由DIC、HOBt和DMAP组成；所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或他们之间的组合。 
优选地，步骤4）中，氨基酸偶联过程中，其中当缩合剂选择HATU/HOBt/DIEA时，H- H-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂(以下简称AA-树脂): Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH:HATU:HOBt:DIEA的摩尔比优选为：1:3:3:3:3~1:5:5:5:5，即所述Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH和缩合剂HATU/HOBt/DIEA这4种物质的摩尔数相等，它们各自相对于所述AA树脂的摩尔比例为3/1~5/1，反应温度为25~35℃，反应时间为2~3小时；更优选，它们各自相对于所述AA树脂的摩尔比例为5/1，反应温度为35℃，反应时间为2小时。 
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下： 
1）摩尔比的选择：H-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂(以下简称AA-树脂): Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH:HATU:HOBt:DIEA的摩尔比为：1:3:3:3:3和1:5:5:5:5；
2）反应温度的选择：
25oC和35oC；
3）反应时间的选择：
2小时和3小时。
为此提出了8种实验条件： 
实验条件1：取3.43g H-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂(1.0mmol)、2.16g Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH (3.0 mmol)、0.41g HOBt (3.0 mmol)和1.14g HATU (3.0 mmol)加入20ml DMF中搅拌溶解，冷却到0oC，将0.5ml DIEA (3.0 mmol)加入上述溶液中，在25oC反应2小时，然后依次偶联剩下的氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH，裂解，纯化，冻干，得到利拉鲁肽精肽；
实验条件2―8，实验操作如实验条件1所示，不同的实验条件及其实验结果如下面的表1所示：
                                   表1 
以上结果表明，实验条件1-8的实验结果差别不大，由于实验条件1物料成本经济，选择实验条件1为较优方案。
本发明的方法和现有技术相比具有明显的优势，有关对比实验如下表2所示： 
                               表2 对比实验结果 
专利 Di-Ser33-利西拉来含量/% Di-Ala35-利西拉来含量/% 总收率/% 纯度/%
本发明技术 0.03 0.05 41 99.75
CN201310410018.4 0.23 0.35 29 98.5
本发明的有益效果是：选用片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH直接固相合成利西拉来，解决了现有技术存在的合成收率低，杂质多，特别是不能很好控制杂质Di-Ser33-利西拉来和Di-Ala35-利西拉来，不适用于工业化生产的问题；本发明提供了一种纯度高，适合规模化生产的利西拉来的制备工艺，此工艺既能有效控制杂质Di-Ser33-利西拉来和Di-Ala35-利西拉来的含量又不影响利西拉来的收率。
附图说明
图1本发明利西拉来的合成路线； 
图2四肽片段的HPLC谱图；
图3四肽片段的质谱谱图；
图4利西拉来粗肽的HPLC谱图；
图5利西拉来精肽的HPLC谱图；
图6利西拉来精肽质谱谱图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。 
具体地，关于下面实施例中涉及的各商购氨基酸以及氨基酸片段，以及各商购树脂，其生产厂家和商品型号如下： 
Fmoc保护基氨基酸原料、和王树脂均为常规的市售试剂（厂家：吉尔生化（上海）有限公司；化学纯）；四肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH是本专利描述合成的。
有机溶剂和其它原料来源均为市售品（厂家：国药集团化学试剂有限公司；化学纯）。 
另外，下面实施例中提到的“旋蒸浓缩”以及“冻干”以及测定HPLC和质谱的条件和所用设备型号及生产厂家说明如下： 
旋蒸浓缩设备：旋转蒸发仪R-200/205（瑞士Buchi(布奇)公司）；
旋蒸浓缩条件：30℃下，真空（-0.1Mpa）条件下旋蒸浓缩，浓缩后体积在旋蒸前总体积75%以下。
冻干设备：冻干机FD-3（北京博医康实验仪器有限公司）； 
冻干条件：将冻干盘放入冰箱冷冻室(-20℃) 中，预冻6小时。开启冻干机，打开制冷，预冷30 分钟以上，设置冻干曲线如下：
第一段：在-27℃运行16小时；第二段：在-5℃运行4小时；第三段：在5℃运行2小时；第四段：在30℃运行16小时。
HPLC：Dionex高效液相色谱仪；用十八烷基硅烷键合硅胶（5μm，250×4.6mm）为填充剂；以0.1%TFA溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；检测波长为220nm；柱温30℃。取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。 
质谱： MALDI-TOF-MS 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱；仪器型号为AUTO FLEX SPEED TOF-TOF。 
实施例一：Fmoc-Ser(tBu)-OSu活化酯的合成 
称取383.44g Fmoc-Ser(tBu)-OH（1.0mol），138.10g HOSu（1.2mol）加入2000ml THF中，冰水浴下加入247.59g DCC（1.2mol），反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加DCM溶解，过滤，饱和碳酸氢钠洗3遍，纯水2遍，反萃2遍，合并有机相，无水碳酸钠干燥，旋干，乙酸乙酯和石油醚重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到445.50g Fmoc-Ser(tBu)-OSu活化酯，收率89%。
实施例二：Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH的合成 
称取80.60g H-Ser(tBu)-OH（0.5mol）、250.28g Fmoc-Ser(tBu)-OSu（0.5mol）和79.50g Na2CO3（0.75mol）加入到500ml水和500ml THF的混合溶液中溶解，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节PH到7，旋蒸除去THF，之后调节PH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用乙酸乙酯和石油醚重结晶，得到286.47g Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH，收率89%。
实施例三：Boc-Gly-OSu活化酯的合成 
称取176.20g Boc-Gly-OH（1.0mol），138.10g HOSu（1.2mol）加入1000ml THF中，冰水浴下加入247.59g DCC（1.2mol），反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加DCM溶解，过滤，饱和碳酸氢钠洗3遍，纯水2遍，反萃2遍，合并有机相，无水碳酸钠干燥，旋干，乙酸乙酯和石油醚重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到258.12g Boc-Gly-OSu活化酯，收率88%。
实施例四：Boc-Gly-Ala-OH的合成 
称取146.66g Boc-Gly-OSu（0.5mol）、44.55g H-Ala-OH（0.5mol）和79.50g Na2CO3（0.75mol）加入到500ml水和500ml THF的混合溶液中溶解，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节PH到7，旋蒸除去THF，之后调节PH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用乙酸乙酯和石油醚重结晶，得到168.26g Boc-Gly-Ala-OH，收率88%。
实施例五：H-Gly-Ala-OH的合成 
称取168.26g Boc-Gly-Ala-OH，加入加入到500m lTFA和500ml DCM的混合溶液中溶解，室温下反应3小时，母液旋干，乙酸乙酯和石油醚重结晶，得到118.05g H-Gly-Ala-OH，收率95%。
实施例六：Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OSu的合成 
称取286.47g Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH（0.45mol）、62.15g HOSu（0.54mol）加入1000ml THF中，冰水浴下加入111.42g DCC（0.54mol），反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加DCM溶解，过滤，饱和碳酸氢钠洗3遍，纯水2遍，反萃2遍，合并有机相，无水碳酸钠干燥，旋干，乙酸乙酯和石油醚重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到291.04g Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OSu活化酯，收率85%。
实施例七：Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH的合成 
称取291.04gFmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OSu（0.38 mol）、107.32g H-Gly-Ala-OH（0.38 mol）和60.42g Na2CO3（0.57 mol）加入到500ml水和500ml THF的混合溶液中溶解，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节PH到7，旋蒸除去THF，之后调节PH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用乙酸乙酯和石油醚重结晶，得到319.48g，其HPLC谱图如图2所示，HPLC纯度为97.95%，收率82%；其质谱如图3所示，[M+Na]+：677.321、[M+K]+：693.255，四肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH的理论精确分子量为：654.33，样品质谱结果与理论分子量相符，结构正确。
实施例八：利西拉来-Rink Amide AM Resin 树脂的合成 
称取取代度为0.20mmol/g的Rink Amide AM Resin树脂50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，取14.06g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.05g HOBt(30mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入3.88g DIC(30mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中32、33、34、35氨基酸偶联采用片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH偶联，偶联完毕，用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护5分钟，然后用DMF洗涤3次，再用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护10分钟，然后用DMF洗涤6次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到129.92 g 利西拉来-Rink Amide AM Resin树脂。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-Met-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA。 
实施例九：利西拉来-Rink Amide MBHA Resin 树脂的合成 
称取取代度为0.20mmol/g的Rink Amide MBHA Resin树脂50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，取14.06g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.05g HOBt(30mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入3.88g DIC(30mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中32、33、34、35氨基酸偶联采用片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH偶联，偶联完毕，用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护5分钟，然后用DMF洗涤3次，再用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护10分钟，然后用DMF洗涤6次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到137.65g 利西拉来-Rink Amide MBHA Resin树脂。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-Met-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA。 
实施例十：利西拉来粗肽的制备 
称取137.65g 全保护的利西拉来-Rink Amide MBHA Resin树脂，加入到1000mL的三口圆底烧瓶中，按体积比为90:5:3:2的TFA、苯甲硫醚、苯甲醚和EDT混合溶液配置裂解液500mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到利西拉来粗肽44.70g，其HPLC谱图如图4所示，HPLC纯度83.98 %，粗肽收率80%。
实施例十一：利西拉来精肽醋酸盐的制备 
称取上述44.70g利西拉来粗肽用45L水溶解后，通过C18柱纯化，第一次纯化条件：流动相为：A相：0.1 %TFA；B相：乙腈；梯度程序为：15％B，60分钟内至60％B；检测波长220 nm；收集目的峰馏分。第二次纯化条件：流动相为：A相：0.3%HAC；B相：乙腈；梯度程序为：10％B，60分钟内至60％B；检测波长220 nm；收集目的峰馏分。脱盐的条件：流 动 相：A相：20 mmol/L乙酸铵的水溶液:乙腈=95:5；B相：水:乙腈=95:5；C相：0.03 %醋酸的水溶液:乙腈=95:5；D相：0.03 %醋酸的水溶液:乙腈=50:50；梯度程序为：以流动相A等梯度洗脱15分钟，转换成流动相B等梯度洗脱10分钟, 转换成流动相C等梯度洗脱10分钟, 转换成流动相D等梯度洗脱25分钟；检测波长220 nm；收集目的峰馏分；旋蒸浓缩，冻干得到利西拉来醋酸盐精肽22.65g，其HPLC谱图如图5所示，HPLC纯度99.75%（面积归一化法），Di-Ser33-利西拉来为0.03%（面积归一化法），Di-Ala35-利西拉来含量为0.05%（面积归一化法）。纯化总收率51%，总收率41%。其质谱如图6所示，[M+H]+＝4858.691，利西拉来的理论精确分子量为：4857.53，样品质谱结果与理论分子量相符。
以上内容是结合具体的修选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保户范围。 

Claims (6)

1.一种制备利西拉来的方法，提供了一种纯度高，适合规模化生产的利西拉来的制备工艺，此工艺既能有效控制杂质Di-Ser33-利西拉来和Di-Ala35-利西拉来的含量又不影响利西拉来的收率。
2.其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，通过液相合成片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH；
步骤2，采用固相合成法，以氨基树脂为起始树脂，按照利西拉来主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中32、33、34、35氨基酸偶联采用片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH偶联；
步骤3，肽树脂裂解、纯化、脱盐、冻干后可以得到利西拉来，其多肽杂质Di-Ser33-利西拉来和Di-Ala35-利西拉来含量都小于0.1%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤1所述的片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH的液相合成步骤为：1）Fmoc-Ser(tBu)-OH、HOSu和DCC偶联得到Fmoc-Ser(tBu)-OSu，然后Fmoc-Ser(tBu)-OSu和H-Ser(tBu)-OH反应得到二肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH；2）Boc-Gly-OH、HOSu和DCC偶联得到Boc-Gly-OSu，然后Boc-Gly-OSu和H-Ala-OH反应得到Boc-Gly-Ala-OH，在体积比为1：1的TFA和DCM的混合溶液下去Boc保护基，得到H-Gly-Ala-OH；3）Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH、HOSu和DCC偶联得到Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OSu，然后Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OSu和H-Gly-Ala-OH反应得到四肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤2所述的固相合成方法，1）采用0.10~0.40mmol/g 的氨基树脂为起始树脂；2）采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除氨基树脂上的Fmoc保护基；3）在偶联剂系统的存在下，氨基树脂和Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联得到Fmoc-Lys(Boc)-氨基树脂；4）重复步骤2）、3），按照利西拉来主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中32、33、34、35氨基酸偶联采用片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH偶联。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是：
所述氨基树脂选自Rink Amide AM Resin、Rink Amide MBHA Resin 树脂，优选Rink Amide MBHA Resin树脂；其中所述氨基树脂的替代度为0.10~0.40mmol/g，优选为0.15~0.35mmol/g。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征是：
所述活化剂系统由DIC、HOBt和DMAP组成；所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或他们之间的组合。
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