CN1041537C

CN1041537C - 生产纳他霉素的发酵方法

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Publication number: CN1041537C
Application number: CN92110636A
Authority: CN
Inventors: M·A·艾森申克; P·T·奥尔森
Original assignee: BIO-TECHNICAL RESOURCES LP
Current assignee: DCV Inc
Priority date: 1991-08-05
Filing date: 1992-08-05
Publication date: 1999-01-06
Anticipated expiration: 2007-08-05
Also published as: DE69214955D1; EP0597988B1; IL102727A; ES2096095T3; NZ243828A; MX9204521A; EP0597988A1; TW213953B; US5231014A; AU2424092A; CN1072959A; CA2115042A1; ZA925870B; CA2115042C; WO1993003169A1; IL102727A0; DE69214955T2

Abstract

发酵能产生纳他霉素的链霉菌以生产纳他霉素。在预定的培养基中增殖链霉菌的孢子悬浮液以得到一定量的链霉菌细胞。在控制pH的预定的生产培养基中发酵该链霉菌细胞以产生可回收量的纳他霉素。

Description

生产纳他霉素的发酵方法

本发明涉及生产纳他霉素(natamycin)的方法，特征在于制备接种物，在pH大约为5．0至6．5的液体培养基中繁殖并发酵接种物。

纳他霉素是多烯家族抗真菌剂的一个成员。化合物纳他霉素是分子量约为666，经验结构式相当于C₃₃H₄₇NO₁₃的四烯，且该化合物含有葡糖苷连接的碳水化合物部分，即放线菌糖胺。纳他霉素的等电点约为pH6．5，其结构上存在两种典型构型：烯醇结构和酮结构。

多年前即已知道生产纳他霉素。美国人Cyanamid的英国专利846，933(1960)中公开了发酵生产纳他霉素的常规方法(该专利列为本文参考文献)。

尽管纳他霉素具有抗生素和抗真菌剂价值，但该产品几乎还没有商业用途。限制其使用的一个主要原因是它的生产成本太高。

本发明的一个目的是克服常规方法的无效性，并提供一种通过在控制pH的预定培养基中增殖并发酵接种物，以合理成本生产纳他霉素的方法。

本发明涉及微生物发酵生产纳他霉素。特别是涉及制备(如孢子形成)并增殖含有链霉菌属微生物的接种物，以在发酵期间产生纳他霉素。可使链霉菌属菌种暴露于一系列能改善纳他霉素之产生速率的预定环境和／或培养基。已发现通过向发酵培养基中加入足够量的碱性pH控制剂，使pH保持在大约5．0至6．5之间，即可提高纳他霉素发酵的速率及其产率。

适于接种物增殖的液体培养基包含：

a)含量约为2-16g／l，一般为大约8g／l的蛋白质氮源；

b)含量一般为5-30g／l，较好为大约15g／l，足以避免总氮耗竭的可代谢之碳源。

发酵期间用于诱导接种物产生纳他霉素的适当液体培养基包含：

a)大约80-250g／l的可代谢碳源；

b)含高比例蛋白质和微量成分的蛋白质氮源。蛋白质氮源一般包含非酵母蛋白氮成分和酵母蛋白氮成分。这两类蛋白氮成分的比例范围一般分别为大约5∶1至11∶1(基于蛋白质含量)，且最好是大约8∶1。

图1是显示用于本发明接种物增殖之方法的流程方块图。

图2是图解显示发酵期间发生之三个典型阶段。

图3是按照实施例4至6所述方法生产纳他霉素时以时间对纳他霉素生产率作图。

根据本发明，将能够产生纳他霉素的生物体放入预定的培养基中与之接触，以产生接种物，然后放入预定的发酵生产培养基中，用以支持生物体在进一步增殖和纳他霉素生产发酵期间发挥最大代谢活性。在发酵期间，生物体至少将一部分预定的生产培养基转化成纳他霉素。已经发现，向发酵培养基中加入足够量的碱性pH控制剂以维持pH在大约5．0和6．5之间，从而可提高纳他霉素的生产速率并改善纳他霉素产率。

任何包含能产纳他霉素之链霉菌的生物体均可用于本发明。优选的链霉菌包括Streptomyces gilvosporeus，该菌种已保藏在American Type Culture Collection(ATCC)，Rockville，Maryland，U．S．A_保藏登记号为13326。

从适当孢子的孢子悬浮液制备接种物。然后发酵适当链霉素菌种的接种物，当将其加入本发明的发酵培养基中时即可产生高产率的纳他霉素。接种物一般要经历一系列的增殖步骤，其中每个步骤都能增加生产纳他霉素之链霉菌细胞的量。当链霉菌细胞的量达到足够之后，即可使链霉菌与链霉菌菌种发酵时能提高纳他霉素生产量的环境和／或培养基接触。

孢子悬浮液

收集得自Anerican Type Culture Collection之纳他霉素生产链霉菌菌种的孢子，以开始制备接种物。孢子发芽产生链霉菌菌种的活性生长培养物。用链霉菌菌种(即S．gilvosporeus或其他的纳他霉素生产菌种)的活性生长培养物培养灭菌(如高压灭菌)的琼脂斜面，并保温直到该斜面基本上完全被孢子复盖为止。将琼脂斜面上的孢子刮入小量水(如蒸馏水)或营养培养基等液体中，以产生孢子的水悬浮液，以得到用于发酵生产(即纳他霉素生产)过程的接种物。为获得最佳结果，用于制备接种物的孢子悬浮液所含孢子浓度应为大约10⁵-10¹⁰CFU／ml，一般至少为大约10⁸CFU／ml。

许多琼脂斜而培养基均可用于促进链霉菌菌种(如S．gilvosporeus)之培养物的孢子形成，进而用于形成孢子悬浮液。适当的琼脂斜面培养基一般至少包括下列的一种成分：酵母麦芽琼脂、Hickey-Turner琼脂、GYA琼脂、Pridham琼脂、马铃薯右旋糖、Bennett氏琼脂等。

孢子悬浮液内存在高浓度(如108CFU／ml)活孢子是本发明的一个重要特征。首先，如果孢子的浓度太低，为通过接种物增殖获得足可以较低成本发酵生产纳他霉素之链霉素孢子数所花费的时间就要长。第二，减低悬浮液内孢子的数量会延长接种物增殖的时间，并增加污染的机会(例如污染不需要的生物体)，再者，悬浮液内的低孢子浓度可促进大的、紧密压积之菌丝体饼的形成。由于存在与氧及营养素不便于向沉淀饼内转递有关的问题，故这些饼对于得到高产率纳他霉素是不适宜的。如果菌丝体沉淀饼达到不适当的大小，就应用物理方法如使用剪切力(如混合器)打碎之。

接种物增殖

使上面讨论的孢子悬浮液(如S．gilvosporeus)萌发并进行多次细胞复制，直到生物体的数目足可适于用作发酵生产纳他霉素的含水接种物为止。适宜的接种物细胞密度应为大约1-5g细胞干重／l，并以大约0．1-10％纳他霉素生产培养基的体积使用之。

用于接种物增殖的液体培养基决定了细胞密度和接种物的代谢状态(如需要有足够密度的健康细胞)。为使接种物具有所需的细胞密度和代谢状态，需要有足够量的蛋白氮，和通常包括于蛋白质氮源中的复合生产长因子(如维生素)、无机元素(如钾、钠、钙等)，及微量元素(如硼、钴、铁、铜、锌等)。蛋白质氮源可以是使孢子悬浮液增殖成接种物，进而使之产生高产率纳他霉素的任何氮源。

还必须向接种物液体培养基内提供可代谢的碳源，加入量应可以使接种物达到所需的细胞密度。为得到最好结果，在接种物增殖期间不应使碳源完全耗竭。碳源耗竭将可能对接种物的代谢状态造成不利影响，导致发酵期间纳他霉素产率降低。

尽管可按照本发明有效地使用多种液体接种物培养基，但为了获得高产率纳他霉素，最好使用预定量的培养基成分。

可在水(如含低矿物质的水及蒸馏水等)中制备适于接种物增殖的培养基，其中包含：

a)含量约为2-16g／l，一般为大约8g／l的蛋白质氮源；

b)含量一般约为5-30g／l培养基，正常为大约15g／l的，且足可防止总碳耗竭的可代谢碳源。

适于接种物增殖之培养基的两种特定组分如下：

组分1 量

Difco“Bacto”胨 5g／l

玉米浆液 3g／l

氯化钠 10g／1

葡萄糖 15g／l

组分2 量

Hormel胨PSR5 8g／l

氯化钠 10g／l

葡萄糖 15g／l

可采用常规技术(例如可在大约120-140℃的温度下分别或同时对碳和氮源进行消毒灭菌处理)制备可提供适于提高链霉菌细胞之生产率的接种物培养基。灭菌后的接种物培养基可望有大约为7的pH。将孢子悬浮液引入接种物培养基中并将接种物培养基加热到大约25-40℃，一般约28-35℃的温度。

为了得到大体积适于发酵生产纳他霉素的液体接种物，需进行几次接种物增殖步骤，每次均以大于前一步骤的体积进行。例如，可按使链霉菌细胞的量呈指数增加的方式进行接种物增殖。具体地说，可通过有效地增加各增殖步骤期间接种物的体积使培养物在增殖期间保持对数生长方式。此可通过减少各步骤的周期或减少步骤的数目达到。例如，一旦达到了接种物的预定细胞密度即可将接种物转移到一个大的环境(如容器)内，使之进一步增殖。由于有效地控制接种物增殖，使这一过程花费最少时间和成本，从而可增加发酵期间经济上合算的纳他霉素产率。

在一系列接种物增殖中，使各个步骤得以持续进行的时间长短取决于培养基的成分、所需链霉菌细胞的量及温度等因素。一般说来，单个增殖步骤要进行大约6至24小时。

在接种物增殖步骤过程中要给接种物通气。例如，可将装有接种物的培养瓶或容器放在旋转振荡器上以大约200rpm的速度搅拌。对于本发明，可用定位在装接种物之容器内的叶轮搅拌接种物，同时由容器的底部加压充入无菌空气。

现在参见附图1，该图以图解方式说明可用于产生发酵生产纳他霉素之接种物的方法。图1举例说明了为得到一定量的液体接种物，实现以经济上有价值的方式生产钠他霉素，以增殖方法达到的接种物的体积增加。例如，将25升接种物加到含有1225升接种物液体培养基的容器内，可使接种物的体积从25升增加到1250升。

纳他素生产

在能够容纳发酵过程的发酵容器内进行纳他霉素生产。已经发现，向发酵培养基中加入足够量的碱性pH控制剂，使pH保持在大约5．0和6．5之间即可提高纳他霉素的产生速率并改善产率。本发明的达到最大纳他霉素产率的另一个重要方面是液体发酵培养基的组成。发酵培养基必须含有适当量的可代谢碳和蛋白质氮。另外可期望培养基包含复合生长因子(如维生素)、无机元素(如钾、钠、钙等)及微量元素(如硼、钴、铁、铜、锌等)。

可在水(如低矿物质水、蒸馏水等)中制备适当的发酵培养基，它包含：

a)大约80-250g／l的可代谢碳源，和

b)至少大约15g／l，且正常大约20g／l至80g／l含有高水平蛋白质和微量成分的蛋白质。蛋白质氮源可包括非酵母蛋白质氮成分和酵母蛋白质氮成分。这两种蛋白质氮成分一般以基于蛋白质含量的分别为大约5∶1至11∶1的比例范围存在，且最好是约8∶1。

可由广泛来源提供蛋白质氮源。例如，大豆蛋白质产品可含有非酵母蛋白质氮源(如用含有80-95％蛋白质的大豆蛋白质源可获得理想的纳他维霉素产率)。蛋白质氮也可含有牛肉提取物和／或蛋白质水解物(如胨)。

如上所述，生产培养基还必须含有可被链霉菌代谢的碳源。碳源可以葡萄糖、多糖、玉米和马铃薯淀粉等的形式提供。

再者，就本发明的一个方面来说，作为纳他霉素生产培养基的初始成分，不必要在开始时就向培养基内引入生产纳他霉素所需要的全部量的碳源(如初始量的碳源不足以完成发酵)。在本发明的这个方面，可在纳他霉素生产期间加入碳源以将碳源的量保持在大约5-30g／l，通常在20g／l。因此，发酵开始后和／或发酵开始时加入适当量的适当碳源。例如，碳源可以以大约40-100g／l的量存在于发酵培养基中。然后，在主发酵阶段内向发酵器内连续加入碳源，进料速率至少等于发酵期间被链霉菌酶促消耗之碳源的速度(即使碳源浓度保持在最小水平或最小水平以上)。在接近发酵过程结束和主发酵阶段之后，间断地加入碳源，以便在发酵周期结束时只留下少量或没有碳源(即碳源的量等于完成发酵过程所必需之发酵培养基内的特定的碳源量)。

可用常规技术(如在大约120-140℃的温度下分别或同时消毒碳和氮源)制备为链霉菌发酵和纳他霉素生产提供营养素的纳他霉素生产培养基。灭菌后，希望生产培养基的pH为7左右。

引入接种物直到所得生产培养基中接种物的浓度为大约0．1-10％，通常为大约2％(体积比)(例如接种物的量可足以接种多个发酵罐)。发酵罐内的余留体积包括上述的发酵培养基。可使用任何一种技术将接种物引入发酵罐内的生产培养基中，借之转移呈活性代谢状态的接种物。

使发酵或生产培养基达到大约25-40℃，且正常约28-35℃的温度。使发酵过程继续进行的时间取决于发酵培养基的组成、温度、接种物中链霉素的量，所需的纳他霉素的量等因素。一般发酵过程要进行大约70到至少168小时。

发酵期间向纳他霉素生产培养基中供入氧气。在大部分发酵期间内，生产培养基中溶解氧的水平最好保持在大约20％-80％的空气饱和度。可通过适当调整通气和／或搅拌速率提高达到适当溶解氧水平的能力。例如，必须借助加压空气(如无菌空气)通过发酵培养基向发酵或生产培养基内通气，通气速率约为每体积发酵培养基0．3至至少1．0体积空气作为本发明的一个方面，可以在通气的同时搅拌发酵培养基。另外，可使通气速率足能搅动发酵培养基。

现参见图2，该图显示在三个阶段的各阶段内时间与纳他霉素生产速率的相互关系。笫一阶段包括向发酵培养基内加入碳源，使链霉菌生长并多倍复制。第一阶段还伴有纳他霉素产生。发酵培养基中纳他霉素的浓度随着链霉菌细胞的不断增殖而增加。在第一阶段，纳他霉素的浓度一般随时间呈指数增加。最后，纳他霉素的浓度将随时间持继增加，此表明纳他霉素，生产的第二阶段(即主发酵期)已完成。第三阶段的特征是纳他霉素的浓度出现平台(如可能由于链霉素的代谢速率减慢)。可在不同时间分析发酵罐内纳他霉素的浓度，以估计发酵过程所处的阶段。为了从总体上使纳他霉素的产生量达到最大值，可以使用某种培养基和／或环境以迅速达到发酵的第二阶段并维持之。

作为本发明的一个方面，当需要控制发泡时，可向发酵培养基内加入大约占发酵或纳他霉素生产培养基0．01-1％体积的消泡剂(如硅消泡剂)。

加入接种物后，纳他霉素生产培养基的pH为7左右。如上所述，在相对短的第二发酵阶段中，主要活性表现在培养物的迅速增殖。此后以纳他霉素产生占优势，且pH下降。控制或维持发酵期间的pH是本发明的一个关键，如不控制pH，发酵期间pH将降至大约pH4．0。

纳他霉素生产的主阶段或第二阶段相当于pH已首先降到pH6．5以下至接近纳他霉素生产结束的阶段。在接近发酵终止时，可使pH降到大约pH5．0以下。根据本发明，当pH低于大约pH5．0时，主阶段并不包括这一低pH期。

可向培养液内加入pH控制剂以控制包括发酵培养基之发酵液的pH。用于本发明方法的pH控制剂包括可以控制pH，但又不会对纳他霉素生产和回收造成不利影响的氢氧化物及碱式盐。适用的pH控制剂至少包括氢氧化钠、氢氧化钾及氢氧化钙、柠檬酸一、二和三钠及一、二、三钾等中的一种。

根据本发明，最初(即在培养物增殖期间)可允许发酵循环的pH降低到大约pH6。到这一时间，正在进行有效的纳他霉素生产。pH降低到大约pH5．0至6．5之后，开始加入碱性pH控制剂，并以一定速率继续加入使之足以使发酵培养液的pH保持在5．0至6．5。一般情况下，可用含pH控制剂的水溶液经自动pH控制滴定法保持上述pH值。

可同时和／或依次使用各种pH控制剂组合物、掺合物、混合物等。例如，可向发酵液中引入柠檬酸盐和氢氧化物(例如，同时加入氢氧化物可更容易地使pH保持在5．0-6．5)。但在某些情况下，可将酸式柠檬酸与碱性pH控制剂联合加入。

本发明的一个关键方面包括使用含无机碱的pH控制剂以使pH保持在大约5．9-6．1。如上所述，本发明的pH控制可提高纳他霉素生产的速率并改善纳他霉素产率。例如，与在没有控制pH情况下产生的相等纳他霉素产率相比，本发明控制pH的方法可允许用更少时间发酵生产纳他霉素。一般生产时间可减少20-60％，普遍减少大约35％。

当恰当地实施本发明时(如有效地处理链霉菌接种物、选择培养基等)，所得发酵液一般将含有至少约5g／l的纳他霉素。

可从生产培养基中分离纳他霉素。在某些情况下，可从发酵液中提取纳他霉素并结晶之。得到结晶体纳他霉素的适用技术，如可参见英国专利846，933号。

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明的范围。另特别指出者外，均使用商业上可得到的试剂级材料完成下列实施例。

实施例

在下列试验中，使用蒸馏水制备有下列组分的琼脂斜面。

3g／l酵母浸膏(Difco“Bacto”酵母提取物)

5g／l麦芽提取物(Difco麦芽提取物)

5g／l胨(Difco“Bacto”胨)

10g／l葡萄糖

15g／l琼脂。

琼脂在大约121℃下灭菌处理约15分钟。

在蒸馏水中制备有下列组分的接种物培养基，并用氢氧化钾将pH调到7．0左右。

20g／l葡萄糖

10g／l氯化钠

6g／l玉米浆液(PPM(商标)，Corn Steep Liquid)

6g／l胨(Difco“Baocto”胨)

接种物培养基在121℃下灭菌15分钟。

作为冻干的孢子悬液从ATCC得了登记号为No．13326的Streptomyces gilvosporeus并用作培养物来源。将培养物接种在25℃的琼脂斜面上直到萌发孢子。

在大约10天之内琼脂斜面上长出大量孢子，于10-20天后使用之。将这些琼脂斜面上的孢子刮入接种物培养基中，使孢子悬浮液的浓度达到大约108CFU／ml。向装有大约200ml接种物培养基的500ml带档板的烧瓶内加入约2ml孢子悬浮液。在大约29℃并在旋转振荡器以200rpm搅拌下，将烧瓶内的接种物保温约48小时。约48小时后，取大约4ml该培养物加入装在1000ml带档板烧瓶内的约200ml接种物培养基中，以增殖接种物。然后在29℃下将该接种物继续保温约24小时，同时在旋转振荡器上以大约200rpm搅拌之。用如此得到的接种物接种81生产培养基。

本实施例中使用的纳他霉素生产培养基具有下列起始组成：

19．5g／l大豆蛋白分离物(ADM，“Profam”S970)

4．5g／l酵母浸膏(Stauffer，Type KAT)

0．2ml消泡剂(Mazu，DF289)

在14．01发酵罐内蒸馏水中制备生产培养基，并用氢氧化钾将pH调到约7．6。然后于121℃下消毒处理约15分钟。作为在蒸馏水中的50％溶液，分别消毒处理葡萄糖。

接种前，将生产培养基加热到大约29℃，并加入葡萄糖使其初始浓度达到约40g／l。发酵罐内通气速率约为0．3V／V-min。(每分钟每体积培养基通空气的体积比)，搅拌速率约300rpm。

将上述含Streptomyces gilvosporeus(ATCC登记号No．13326)的接种物加入发酵器内使其中接种物含量达到约2％体积。发酵约40小时后向接种物内加入葡萄糖，以使发酵器内葡萄糖的浓度保持在大约20g／l。为此，以大约1g／小时的速率向发酵器内供入葡萄糖。必要时可提高发酵器的搅拌速度，以使溶解氧水平保持在大约50％空气饱和度。

试验1：该试验显示典型的高产率发酵工艺，而没有使用本发明的pH控制方法。如前所述，本工艺以大约8．0l生产培养基(pH约为7)的初始体积开始，并继续发酵约117小时(pH约为4．5)，其中总葡萄糖加入量为大约110g／l，在大约8．71发酵液中得到大约7．3g／l纳他霉素产率(总共64g纳他霉素)。

试验2：方法大致同试验1，但当18小时后pH降至约6．0时加入约20％KOH以使pH保持在约6．0，并在约92小时发酵过程中加入约155g／l葡萄糖，结果在大约10．1l发酵液中得到约7．4g／l纳他霉素(共75g纳他霉素)。可见，与1相比，本发明的这一试验在较短生产周期内提供了相等的纳他霉素产率。

借助基本相同的方法，但使用NaOH代替KOH，可达到相似的快速高产率纳他霉素生产。

试验3：继续试验2的生产并在约282小时的总发酵时间内加入约250g／l葡萄糖，结果在大约10．4l发酵液中得到约12．4g／l产率的纳他霉素(共129g纳他霉素)。因此，延长纳他霉素生产发酵时间有可能提高纳他霉素产率。

试验4：方法大致同试验2，但当pH降至约pH6时，用自动滴定法加入约20％氢氧化钾，以使pH保持在大约6．1-5．9。发酵约66小时后，在大约9．21发酵液中产生约6．6g／l纳他霉素(共61g纳他霉素)。

试验5：方法大致同试验2，但24小时后当发酵液pH为大约5．1时向发酵器加入约7g／l柠檬酸三钠。pH保持在大约5．0到6．5的范围内。在大约8．7l发酵液中约产生6．6g／l产率的纳他霉素(共57g纳他霉素)。

借助基本上相同的方法，但使用等摩尔量的柠檬酸三钾，结果达到相似的快速高产率纳他霉素生产。

试验6：方法基本上同试验6，但不完全使柠檬酸三钠pH控制剂。当发酵开始后约24小时时加入柠檬酸三钠，并柠檬酸将pH调到5．0左右(使其中含有大约5g／l柠檬酸根离子)；约45小时后，加柠檬酸使pH保持在约5．0以下。发酵约117小时后只产生了大约25．6g纳他霉素。

试验7：方法基本上同试验1，但没有加入任何pH控制剂，发酵约66小时后在8．3l发酵液中只得到4．3g／l的纳他霉素(共36g纳他霉素)。将试验4与试验7比较，表明进行pH控制将会提高纳他霉素生产速率(即试验4中66小时发酵过程产生61g纳他霉素，而试验7号产生36g纳他霉素)。

下表总结了试验1-7中在纳他霉素生产之相对速度方面的结果。纵观下表可以证明，本发明的pH控制可改善通过发酵工艺所得纳他霉素的产率。

表实验序号 pH控制剂生产时间(hrs) 生成的纳他霉素量

(总量／浓度)

1 无 117 64g／7．3／l

2 KOH 92 75g／7．4g／l

3 KOH 282 129g／12．4g／l

4 KOH 66 61g／6．6g／l

5 柠檬酸三钠 69 57g／6．6g／l

6 柠檬酸三钠／

柠檬酸 117 25．6g／3．2g／l

7 无 66 36g／4．3g／l

现参见图3，该图显示按试验4、5、6和7完成的约115小时发酵过程中纳他霉素产生量(发酵液中的g／l数)。图3以图解方式表明本发明的pH控制方法可提高纳他霉素的产生速率。

虽然上文详细描述了本发明的几个实施方案，但本领域技术人员很容易理解到，基于本发明的许多组合和改动均包括于本发明范围内。

Claims

1．一种发酵制备纳他霉素的方法，该方法包括：

在预定的接种物培养基中增殖含有链霉菌gilvosporeus，ATCC13326的孢子悬浮液以得到接种物；

将接种物引入预定的发酵培养基中；

使接种物发酵并产生纳他霉素；

将发酵培养基的pH控制在5．0至6．5范围内，以及

回收纳他霉素。

2．根据权利要求1的方法，其中所说的孢子悬浮液含有至少为10⁵-10¹⁰CFU／ml的孢子悬浮液。

3．根据权利要求1或2的方法，其中所说的发酵培养基含有非酵母和酵母蛋白质氮成分，以蛋白质含量计，该非酵母和酵母成分之比为5∶1至11∶1。

4．根据权利要求1或2的方法，其中接种物培养基包含2-16g／l的蛋白质氮源和5-30g／l的碳源。

5．根据权利要求1或2的方法，其中发酵培养基包含80至250g／l的碳源和氮源，其中氮源进一步包括非酵母成分和酵母成分。

6．根据权利要求5的方法，其中所说蛋白质氮源的非酵母和酵母成分的比例以蛋白质含量计为5∶1到11∶1。

7．根据权利要求6的方法，其中所说蛋白质氮源的非酵母成分包括大豆蛋白质。

8．根据权利要求1或2的方法，其中在纳他霉素生产的主阶段内发酵培养基中碳源的浓度保持在5-30g／l。

9．根据权利要求1或2的方法，其中增殖和发酵是在25-40℃的温度下进行。

10．根据权利要求1或2的方法，其中发酵进行70小时到至少168小时。

11．根据权利要求1或2的方法，其进一步包括在增殖和发酵期间向接种物内通气。

12．根据权利要求1或2的方法，其中接种物和发酵培养基包括至少含有选自葡萄糖、多糖和淀粉中之一种的碳源。

13．根据权利要求1或2的方法，其中接种物和发酵培养基包括至少含有选自大豆蛋白质、酵母及蛋白质水解物中之一种的蛋白质氮源。

14．根据权利要求12的方法，其中蛋白质氮源包括至少含有选自分离物、粉和粗粉中之一种的大豆蛋白质。

15．根据权利要求12的方法，其中蛋白质氮源包括至少含有选自全酵母提取物和自溶产物中之一种的酵母。

16．根据权利要求1或2的方法，其进一步包括使用选自氢氧化物和柠檬酸盐中之至少一种的pH控制剂。