KR100461577B1 - 나타마이신의 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배양액 1L당 적어도 2.5 g/L, 바람직하게는 2.5 내지 10 g/L의 나타마이신이 함유된 배양액을 원심분리한 후 그 침전물을 회수하는 단계; 상기 침전물 가운데 들어있는 나타마이신 1 g에 대해 메탄올 0.5∼1.2 L을 넣고 현탁하여 추출하는 단계; 나타마이신이 녹아있는 현탁액에 염산을 첨가하여 pH를 2.5∼3.5로 낮추어서 나타마이신의 용해도를 높이는 단계; 상기 현탁액을 원심분리하여 상징액만을 모으는 단계; 상기 상징액에 NaOH를 첨가하여 pH를 7.0∼8.0정도로 높이고 10∼20분 교반한 후 이때 발생하는 침전물을 원심분리하여 제거하는 단계; 상기 침전물을 제거한 상징액을 진공감압농축 장치를 이용하여 원래 부피의 1/5∼1/6로 농축하는 단계; 실리카겔 60의 사용량을 나타마이신 100 mg에 대해 15∼30 g 사용하여 상기 농축액을 실리카겔 60에 결합시키는 단계; 실리카겔에 결합된 나타마이신 추출물 칼럼에 증류수와 30%(v/v) 메탄올을 순차적으로 이용하여 불순물을 용출시키는단계; 사용하는 60∼80%(v/v) 메탄올의 양을 나타마이신 100 mg에 대해 300 mL를 사용하여 60∼80%(v/v)메탄올로 실리카겔 60에 결합된 나타마이신을 용출하는 단계; 나타마이신이 함유된 용출액을 진공감압장치를 이용하여 나타마이신 결정을 획득하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 나타마이신의 정제방법에 관한 것이다.

Description

나타마이신의 정제방법 {Purification process of a natamycin}

본 발명은 나타마이신 배양액으로부터 나타마이신을 추출, 정제 및 회수하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 배양액 1L당 적어도 2.5 g/L, 바람직하게는 2.5 내지 10 g/L의 나타마이신이 함유된 배양액을 원심분리한 후 그 침전물을 회수하는 단계; 상기 침전물 가운데 들어있는 나타마이신 1 g에 대해 메탄올 0.5∼1.2 L을 넣고 현탁하여 추출하는 단계; 나타마이신이 녹아있는 현탁액에 염산을 첨가하여 pH를 2.5∼3.5로 낮추어서 나타마이신의 용해도를 높이는 단계; 상기 현탁액을 원심분리하여 상징액만을 모으는 단계; 상기 상징액에 NaOH를 첨가하여 pH를 7.0∼8.0정도로 높이고 10∼20분 교반한 후 이때 발생하는 침전물을 원심분리하여 제거하는 단계; 상기 침전물을 제거한 상징액을 진공감압농축 장치를 이용하여 원래 부피의 1/5∼1/6로 농축하는 단계; 실리카겔 60의 사용량을 나타마이신 100 mg에 대해 15∼30 g 사용하여 상기 농축액을 실리카겔 60에 결합시키는 단계; 실리카겔에 결합된 나타마이신 추출물 칼럼에 증류수와 30%(v/v) 메탄올을 순차적으로 이용하여 불순물을 용출시키는단계; 사용하는 60∼80%(v/v) 메탄올의 양을 나타마이신 100 mg에 대해 300 mL를 사용하여 60∼80%(v/v)메탄올로 실리카겔 60에 결합된 나타마이신을 용출하는 단계; 나타마이신이 함유된 용출액을 진공감압장치를 이용하여 나타마이신 결정을 획득하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 나타마이신의 정제방법에 관한 것이다.

나타마이신(피마리신)은 4개의 공역 이중결합을 가진 다원환 락톤에 아미노당이 결합한 배당체로 화학구조상 폴리엔 메크롤라이드(polyene macrolide)계에 속하는 항진균성 물질로 염기와 산성기를 각각 하나씩 가지고 있다.(도 1 참조)

시판중인 나타마이신은 흰색 또는 노란색을 띄며 냄새와 맛은 거의 나지 않고 결정형은 아주 안정한 것으로 알려져 있다(REF). 또한 나타마이신은 물과 극성 유기용매에 대해 대체로 용해도가 낮고 비극성 용매에는 거의 녹지 않는 것으로 알려져 있다(REF). 이러한 특성 때문에 회수 과정에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있으나 보고된 방법들은 지적재산권에 의해 보호되어 있어 이용하기 어려울 뿐만 아니라 나타마이신의 정제방법에 관한 보고는 거의 없는 실정이다. 따라서 본 발명에서는 효율적으로 나타마이신을 회수하고 정제하는 방법을 개발하는 것을 목적으로 하고 있다.

본 발명에서 나타마이신 배양액을 4 와 실온에서 14일 동안 보관하였을 때, 4 에서는 나타마이신의 활성이 80% 이상 유지되었으나 실온에서는 27%로 급격하게 감소하였다. 또한 배양액을 60, 70, 80 및 100 에서 각각 10, 30 및 60분간 열처리하여 보관하는 동안의 나타마이신 잔존활성을 비교하였을 때 열처리한 배양액이 열처리하지 않은 배양액이 나타마이신 잔존활성이 감소하는 비율이 낮았으며, 배양액을 60 에서 10분간 열처리하여 보관하였을 때 가장 높은 나타마이신의 잔존활성을 유지하였다. 효율적인 나타마이신 정제과정을 개발하기 위해 추출 용매 및 레진의 사용량에 대해 조사한 결과 1g의 나타마이신을 추출하는데 1L의 메탄올을 사용하는 것이 가장 효율적이었으며 실리카겔 60을 이용한 칼럼 크로마토그래피에서 100mg의 나타마이신에 대해 30g의 레진을 사용하였을 때 가장 효율적인 것을 알 수 있었다. 확립된 나타마이신 추출에 필요한 메탄올량과 실리카겔 60을 이용한 칼럼크로마토그래피를 적용하여 4.2g의 나타마이신이 함유된 1,790mL의 배양액으로부터 2g의 나타마이신을 획득하였다. 본 발명에서 개발된 정제과정을 통해 순도가 96%이고 회수율이 47%인 나타마이신을 얻을 수 있었다.

도 1은 나타마이신의 구조식을 나타낸 것이다.

도 2는 나타마이신의 정제공정을 나타낸 것이다.

도 3은 시중에 판매되고 있는 나타마이신과 정제한 나타마이신의 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다.

도 4는 시중에 판매되고 있는 나타마이신 사카로미세스 세레비에 (Saccharomyces cerevisiae)를 사용하여 정제한 나타마이신의 항균활성을 비교한 것이다.

본 발명은 나타마이신 배양액으로부터 나타마이신을 추출, 정제 및 회수하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 나타마이신이 함유된 배양액으로부터 나타마이신을 추출하는 방법 및 추출한 나타마이신으로부터 불순물을 제거하고 회수하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 배양액 1L당 적어도 2.5 g/L, 바람직하게는 2.5 내지 10 g/L의 나타마이신이 함유된 배양액을 원심분리한 후 그 침전물을 회수하는 단계; 상기 침전물 가운데 들어있는 나타마이신 1 g에 대해 메탄올 0.5∼1.2 L을 넣고 현탁하여 추출하는 단계; 나타마이신이 녹아있는 현탁액에 염산을 첨가하여 pH를 2.5∼3.5로 낮추어서 나타마이신의 용해도를 높이는 단계; 상기 현탁액을 원심분리하여 상징액만을 모으는 단계; 상기 상징액에 NaOH를 첨가하여 pH를 7.0∼8.0정도로 높이고 10∼20분 교반한 후 이때 발생하는 침전물을 원심분리하여 제거하는 단계; 상기 침전물을 제거한 상징액을 진공감압농축 장치를 이용하여 원래 부피의 1/5∼1/6로 농축하는 단계; 실리카겔 60의 사용량을 나타마이신 100 mg에 대해 15∼30 g 사용하여 상기 농축액을 실리카겔 60에 결합시키는 단계; 실리카겔에 결합된 나타마이신 추출물 칼럼에 증류수와 30%(v/v) 메탄올을 순차적으로 이용하여 불순물을 용출시키는단계; 사용하는 60∼80%(v/v) 메탄올의 양을 나타마이신 100 mg에 대해 300 mL를 사용하여 60∼80%(v/v)메탄올로 실리카겔 60에 결합된 나타마이신을 용출하는 단계; 나타마이신이 함유된 용출액을 진공감압장치를 이용하여 나타마이신 결정을 획득하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 나타마이신의 정제방법을 제공한다.

나타마이신 배양액을 4 와 실온에서 14일 동안 보관하였을 때, 4 에서는 나타마이신의 활성이 80% 이상 유지되었으나 실온에서는 27%로 급격하게 감소하였다. 또한 배양액을 60, 70, 80 및 100 에서 각각 10, 30 및 60분간 열처리하여 보관하는 동안의 나타마이신 잔존활성을 비교하였을 때 열처리한 배양액이 열처리하지 않은 배양액이 나타마이신 잔존활성이 감소하는 비율이 낮았으며, 배양액을 60 에서 10분간 열처리하여 보관하였을 때 가장 높은 나타마이신의 잔존활성을 유지하였다. 효율적인 나타마이신 정제과정을 개발하기 위해 추출 용매 및 레진의 사용량에 대해 조사한 결과 1g의 나타마이신을 추출하는데 1L의 메탄올을 사용하는 것이 가장 효율적이었으며 실리카겔 60을 이용한 칼럼 크로마토그래피에서 100mg의 나타마이신에 대해 30g의 레진을 사용하였을 때 가장 효율적인 것을 알 수 있었다. 확립된 나타마이신 추출에 필요한 메탄올량과 실리카겔 60을 이용한 칼럼크로마토그래피를 적용하여 4.2g의 나타마이신이 함유된 1,790mL의 배양액으로부터 2g의 나타마이신을 획득하였다. 본 발명에서 개발된 정제과정을 통해 순도가 96%이고 회수율이 47%인 나타마이신을 얻을 수 있었다.

실험예 1: 사용균주 및 나타마이신의 생산

나타마이신의 생산을 위해 사용한 균주는 스트렙토미세스 나탈렌시스(Streptomyces natalensis)ATCC 27448이며, 물질 생산용 배지조성은 1.4%(w/v) soy flour, 1%(w/v) 글루코스, 3%(w/v) 락토스 및 0.3%(w/v) 이스트 추출물(pH 7.0)이다. 나타마이신의 정제는 5L 발효조(Best Korea Co. Ltd., KOREA)를사용하여 30 에서 300 rpm의 교반속도로 7-8일간 배양하여 얻은 배양액을 4 서 보관해 두고 사용하였다.

실험예 2: 나타마이신의 정량분석

본 발명에서 이용된 모든 나타마이신의 정량분석은 아래와 같은 조건에서 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용하였다. 모든 시료는 메탄올(HPLC용, J. T. Baker, USA)로 추출 및 적절히 희석하여 4 에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리(MICRO 17R, Hanil Science industrial Co. Ltd., KOREA)한 후 HPLC에 의해 정량분석 하였다. 본 발명에 이용된 HPLC는 독일 KNAUER사의 HPLC 펌프 K-1001과 U. V. detector가 장착되어 있으며 TOSOH사(JAPAN)의 Φ 4.6x150 mm의 칼럼을 사용하였다. 용매는 80%(v/v)의 메탄올을 사용하였고 칼럼의 온도는 40 , 유속은 분당 1mL, 주입량은 20㎕로 하였다.

나타마이신의 HPLC에 의한 정량분석을 위해 나타마이신 표준물질(Minimum 95%, Sigma, USA)을 사용하여 표준곡선을 다음과 같이 작성하였다. 5 mg의 나타마이신을 5mL의 메탄올에 완전히 녹인 후 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 및 100 ㎍/mL의 농도가 되도록 각각 메탄올로 희석한 후 원심분리하고 HPLC를 통해 정량분석하여 표준곡선을 작성하였다.

실험예 3: 나타마이신의 생물학적 항균활성 시험

아가 확산(Agarr diffusion) 방법(Ref)을 이용하여 스트렙토미세스 나탈렌시스(Streptomyces natalensis)ATCC 27448이 생산하는 나타마이신의 항균활성을 측정하였다. 검정균인 사카로미세스 세레비에(Saccharomyces cerevisiae)를 YPD (1%(w/v) 이스트 추출물, 2%(w/v) 박토 펩톤, 2%(w/v) 글루코스, 1.5%(w/v) 아가) 한천 배지에 섞어 항균활성을 측정하기 플레이트로 사용하였다. 배양을 통해 생산된 나타마이신 생산량을 확인하기 위해 배양액을 메탄올로 적절히 희석한 후 6 mm 페이퍼 디스크에 20㎕씩 흡수시켜 이미 조제된 플레이트에 올려놓고 30 에서 24시간 배양하여 페이퍼 디스크 주변의 투명환 크기를 측정하였다. 이때 각 실험은 3회 반복하여 실험하였다.

실험예 4: 저장안정성 및 열안정성 실험

배양액의 보존과 정제과정 동안 발생할 수 있는 나타마이신의 활성 변화를 검토해보기 위해 저장안정성 및 열안정성 시험을 실시하였다. 저장 안정성 시험을 위해 나타마이신이 함유된 배양액과 그 배양액을 12,000 rpm, 4 에서 30분간 원심분리하여 얻은 침전물을 각각 4 와 실온에서 보관하고 0, 3, 8, 14, 21, 28, 35일째마다 나타마이신의 정량적인 분석을 실시하였다.

열안정성 시험을 위해 나타마이신이 함유된 배양액을 60, 70, 80, 100 에서 각각 10, 30, 60분간 열처리 후 실온에 보관하고 0. 3. 6, 9, 17일째마다 나타마이신의 정량분석을 실시하였으며 열처리를 하지 않은 실험구를 대조구로 사용하였다.

실시예 1: 나타마이신의 추출 및 정제

나타마이신 배양액 300 mL을 4 에서 12,000 rpm으로 30분간 원심분리(Hitachi CR21F, JAPAN)한 후 상징액은 버리고 남은 침전물에 메탄올을 300 mL 첨가하였다. 침전물을 메탄올에 완전히 현탁시킨 후 Conc. HCl로 pH를 3.0으로 맞추어 10분간 교반하여 추출하였다.

나타마이신을 추출한 메탄올 용액을 45 에서 결정이 생기지 않도록 적절하게 진공감압농축(EYELA, Rotary evaporator N-1000, JAPAN)하였다.

크로마토그라피(Silicagel 60 column chromatography)의 Silicagel 60의 평형화를 위해 50%(v/v) acetone을 첨가하고 10분간 천천히 교반한 후 4 에서 24시간 동안 정치하였다. 평형화 된 Silicagel 60에서 50%(v/v) 아세톤을 제거하고 증류수로 수세한 후 적절한 양의 증류수를 첨가하여 천천히 칼럼에 충진하였다. 실리카겔 60이 충진된 칼럼에 진공감압에 의해 농축된 시료를 로딩한 후 불순물을 제거하기 위해 증류수 600 mL, 30%(v/v) 메탄올 300 mL 및 50%(v/v)의 메탄올 300 mL를 순차적으로 칼럼에 주입하여 천천히 용출시켰다. 불순물이 제거된 칼럼에 80%(v/v)의 600 mL 메탄올로 나타마이신을 용출하였다. 용출액을 진공 감압 농축하여 생성된 나타마이신 결정을 가지고 정제수율과 순도를 조사하였다.

실시예 2: 나타마이신의 정제수율 및 순도 조사

나타마이신의 정제수율은 각 정제과정마다 HPLC 분석에 의해 조사되었고 최종적으로 얻은 나타마이신 결정의 중량을 측정하여 수율을 계산하였다. 최종적으로 얻은 나타마이신 결정의 순도는 적정량의 나타마이신을 채취하여 메탄올에 적절히희석한 후 원심분리하여 HPLC 분석을 통해 결정하였다.

실시예 3: 나타마이신의 저장 안정성

배양액의 보존과 정제과정 동안 발생할 수 있는 나타마이신 활성의 변화를 검토하기 위해 배양액과 그 배양액을 원심분리하여 얻은 침전물을 각각 4 와 실온에 보관하여 저장안정성 시험을 하였다. 그 결과 표 1에서 보는 것과 같이 배양액과 침전물을 4 에서 보관하였을 때 나타마이신의 활성이 14일째까지 80% 이상 유지되었으나, 침전물의 나타마이신 활성은 보관 21일째에 43%까지 급격히 감소하였다. 반면 4 에서 배양액중의 나타마이신 활성은 보관 35일째까지 약 70%를 유지하였다. 실온에 보관하였을 때의 배양액과 침전물의 나타마이신 활성은 보관 8일째에 각각 60%와 35%정도로 급격히 감소하였다. 나타마이신은 4 에서 보다 실온에서 활성이 더 빨리 감소하였으며, 침전물 상태로 보관하는 것 보다 배양액상태로 보관하는 것이 더 높은 활성을 유지하였다.

실시예 4: 나타마이신의 열안정성

나타마이신이 함유된 배양액의 저장과 정제과정 중 발생할 수 있는 나타마이신의 손실을 최소화하기 위해 열안정성 시험을 통해 나타마이신의 열안정성과 배양액을 장기간 보관하였을 때 나타마이신의 활성 감소의 원인에 대하여 검토하였다. 그 결과 표 2에서 보는 것과 같이 열처리된 모든 배양액은 열처리되지 않은 배양액(대조구)에 비해 저장기간 동안 시간이 지남에 따라 나타마이신의 활성이 감소하는 비율이 낮아졌다. 그리고 배양액을 60 와 70 에서 60분간 열처리하였을 때 열처리되지 않은 배양액의 나타마이신 활성에 비해 83%이상 활성을 유지하였고,80 에서 10, 30, 60분간 열처리하였을 경우에는 대조군에 비해 나타마이신의 활성이 각각 86, 74, 60%까지 유지되었으며, 배양액을 끓는 물에서 10, 30, 60분간 열처리하였을 경우에는 각각 81, 54, 35%까지 활성을 유지하였다. 위의 결과들을 보면 열처리를 하였을 때 나타마이신의 활성이 감소하는 비율이 낮아지는 것은 열처리에 의해 나타마이신의 활성을 감소시키는 요인이 줄어들었기 때문이라고 추정된다. 배양액을 열처리했을 경우 나타마이신의 활성이 감소하는 비율을 낮출 수 있는 장점은 있으나, 보관 6일째에 대조군과 열처리된 배양액들의 나타마이신의 활성을 비교해 보면 대부분 대조군이 더 높은 나타마이신의 활성을 보였다. 따라서 배양액을 6일 이내로 보관하여 사용한다면 열처리를 해서 보관하는 것보다는 배양액을 그대로 보관하여 사용하고, 17일 이상 장기적인 보관이 필요시에는 배양액을 60 에서 10분간 열처리하여 보관하는 것이 더 경제적이다.

실시예 5: 나타마이신의 추출용매 선택

배양액에서 나타마이신을 경제적으로 추출할 수 있는 용매를 선택하기 위해 50%(v/v) 아세트산, 메탄올, 부탄올, 증류수, 이소프로판올, 에탄올에 대해 용해도를 측정하였다. 나타마이신에 대한 용해도는 표 3에서와 같이 50% 아세트산 > 메탄올 > 에탄올 > H₂O > 이소프로판올 > 부탄올 순이었다. 다른 용매보다 나타마이신에대한 용해도가 훨씬 높은 50% 아세트산과 메탄올을 추출용매로 선정하여 정제과정의 효율성을 검토해 보았다. 그 결과 50% 아세트산은 용해도는 우수하나 메탄올보다 나타마이신에 대한 안정성이 떨어지고 정제과정에서 불순물이 증가하는 등의 문제점을 나타내었다. 따라서 본 발명에서는 배양액으로부터 나타마이신을 추출하는데 50% 아세트산에 비교하여 위의 문제점이 훨씬 적은 메탄올을 선정하였다.

실시예 6: 나타마이신 추출용매의 양 결정

배양액(300 ml)으로부터 메탄올을 사용하여 나타마이신을 가장 효율적으로 추출할 수 있는 양을 검토하기 위해 메탄올을 100 mL에서부터 800 mL까지 100 mL씩 첨가하여 각 단계별로 나타마이신의 함량을 조사하였다. 그 결과 표 4에서 보는 바와 같이 300 mL의 메탄올을 사용하여 추출한 경우가 83%의 나타마이신의 회수율을 보였고, 그 이상의 메탄올을 사용할 경우 이와 비슷한 회수율을 나타내거나 오히려 낮은 회수율을 보였다. 따라서 경제성을 고려하여 메탄올 300 mL를 나타마이신 추출을 위한 메탄올 양으로 결정하였다. 올센(Olson) 등은 메탄올에 용해된 상태로나타마이신이 존재할 경우 나타마이신과 메탄올이 메틸에스테르를 형성함으로 나타마이신이 함량이 줄어들며 추출액의 pH가 낮을수록 온도가 높을수록 메틸에스테르 화합물이 증진한다고 보고(REF)하고 있다. 그러므로 모든 정제과정에 사용되는 메탄올에 대한 나타마이신의 활성의 소실을 줄이기 위해서는 나타마이신이 메탄올에 용해되어 있는 시간을 최대한 줄이고 4 정도의 낮은 온도에서 보관하는 것이 필요하다. 또한 나타마이신의 추출에 있어 나타마이신 1g에 대해 1 L의 메탄올을 2회에 나누어 향류분배법에 의해 추출하는 것이 가장 효율적이었다.

실시예 7: 효율적인 실리카겔 60의 사용량 결정

실리카겔 60의 가장 효율적인 사용량을 알아보기 위해 100 ㎎의 나타마이신이 함유된 농축액을 가지고 각각 10, 15, 30, 40 g의 Silicagel 60 을 사용하여 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 각각의 정제수율과 순도를 알아보았다. 표 5에서 보는 바와 같이 Silicagel 60의 양을 달리하여 칼럼 크로마토그래피를 실시하였을 경우 모두 80% 메탄올로 용출하였을 때 가장 높은 나타마이신의 활성을 보였다. 따라서 80% 메탄올에 의해 용출된 구획만을 농축하여 각각의 정제수율과 순도를 알아본 결과 30 g의 Silicagel 60을 사용하였을 경우 나타마이신의 정제수율과 순도가 각각 99.2%와 96.4%로 가장 높았다. 따라서 나타마이신 100 ㎎에 대해 30 g의 Silicagel 60을 사용하는 것이 가장 효율적이었다.

실시예 8: Scale up을 통한 나타마이신의 정제

나타마이신의 정제과정을 바탕으로 산업적 적용이 가능한지 검토하기 위해scale up를 실시하였다. 약 4.2 g의 나타마이신이 함유된 배양액 1,790 mL를 원심분리를 통해 침전물을 회수하고 난 후 1 L의 메탄올을 사용하여 2회에 걸쳐 나타마이신을 추출한 후 적절히 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피에서 문제가 되는 이물질을 제거하기 위해 탈지면을 사용하여 농축된 시료를 여과한 후 Silicagel 60 칼럼 크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과 표 6에서 보는 바와 같이 순도가 96%고 정제수율이 47%인 약 2.0 g의 나타마이신을 얻었다.

실시예 9: 정제된 나타마이신의 항균활성 실험

본 발명에서 정제된 나타마이신과 표품으로 사용된 Sigma사 제품과의 생물학적인 항균활성을 페이퍼 디스크를 사용한 아가 확산(agar diffusion) 방법을 이용하여 비교하였다. 두 시료를 메탄올을 사용하여 100 ㎍/mL의 농도로 희석하고 각각의 시료를 6 ㎜의 paper disc에 20 ㎕씩 흡수시켜 검정균인 사카로미세스 세레비에(Saccharomyces cerevisiae)가 혼합된 YPD 한천배지 위에 올려놓고 24시간 배양한 후 플레이트 상에 나타난 투명환의 크기를 측정하였다. 도 3에서 보는 바와 같이 두 가지 시료 모두 사카로미세스 세레비에(Saccharomyces cerevisiae)에 대해 비슷한 항균활성을 가졌다.

본 발명은 추출 용매 및 레진의 사용량에 대해 조사한 결과 1g의 나타마이신을 추출하는데 1L의 메탄올을 사용하는 것이 가장 효율적이었으며 실리카겔 60을 이용한 칼럼 크로마토그래피에서 100mg의 나타마이신에 대해 30g의 레진을 사용하여 효율적인 나타마이신 정제과정을 개발하고 확립된 나타마이신 추출에 필요한 메탄올량과 실리카겔 60을 이용한 칼럼크로마토그래피를 적용하여 4.2g의 나타마이신이 함유된 1,790mL의 배양액으로부터 2g의 나타마이신을 획득하여 개발된 정제과정을 통해 순도가 96%이고 회수율이 47%인 나타마이신을 수득하여 나타마이신의 생산성을 증진시킴으로써 나타마이신의 인체에 무해하고 항진균제로서의 기능이 탁월한 성질을 이용하여 식품산업, 의약품산업, 생물농약 등에 광범위하게 이용할 수 있는 매우 유용한 발명이다.

Claims (1)

1. 배양액 1L당 2.5 내지 10 g/L의 나타마이신이 함유된 배양액을 원심분리한 후 그 침전물을 회수하는 단계; 상기 침전물 가운데 들어있는 나타마이신 1 g에 대해 메탄올 0.5∼1.2 L을 넣고 현탁하여 추출하는 단계; 나타마이신이 녹아있는 현탁액에 염산을 첨가하여 pH를 2.5∼3.5로 낮추어서 나타마이신의 용해도를 높이는 단계; 상기 현탁액을 원심분리하여 상징액만을 모으는 단계; 상기 상징액에 NaOH를 첨가하여 pH를 7.0∼8.0정도로 높이고 10∼20분 교반한 후 이때 발생하는 침전물을 원심분리하여 제거하는 단계; 상기 침전물을 제거한 상징액을 진공감압농축 장치를 이용하여 원래 부피의 1/5∼1/6로 농축하는 단계; 실리카겔 60의 사용량을 나타마이신 100 mg에 대해 15∼30 g 사용하여 상기 농축액을 실리카겔 60에 결합시키는 단계; 실리카겔에 결합된 나타마이신 추출물 칼럼에 증류수와 30%(v/v) 메탄올을 순차적으로 이용하여 불순물을 용출시키는단계; 사용하는 60∼80%(v/v) 메탄올의 양을 나타마이신 100 mg에 대해 300 mL를 사용하여 60∼80%(v/v)메탄올로 실리카겔 60에 결합된 나타마이신을 용출하는 단계; 나타마이신이 함유된 용출액을 진공감압장치를 이용하여 나타마이신 결정을 획득하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 나타마이신의 정제방법.